Luận án Tiến sĩ Hóa học: Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở vùng Bắc Trung Bộ

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:152

Thêm vào BST

Báo xấu

125
lượt xem 40
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án: Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ các loài nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) 3 Pat.); phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất. - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở vùng Bắc Trung Bộ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ NÂM TỔ ONG LÔNG THÔ (HEXAGONIA APIARIA (PERS.) FRIES), LOÀI NẤM LINH CHI (GANODERMA PFEIFFERI BRES.) VÀ NẤM LINH CHI ĐEN BÓNG (GANODERMA MASTOPORUM (MONT) PAT.) Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC VINH- 2015
2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ NÂM TỔ ONG LÔNG THÔ (HEXAGONIA APIARIA (PERS.) FRIES), LOÀI NẤM LINH CHI (GANODERMA PFEIFFERI BRES.) VÀ NẤM LINH CHI ĐEN BÓNG (GANODERMA MASTOPORUM (MONT) PAT.) Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ Chuyên ngành : HOÁ HỮU CƠ Mã số: 62.44.27.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS TRẦN ĐÌNH THẮNG PGS. TS PING CHUNG KUO Vinh - 2015
1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Vinh, ngày 15 tháng 07 năm 2015 Ký tên
1 LỜI CẢM ƠN Luận án được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu cơ - khoa Hoá, phòng thí nghiệm Trung tâm Phân tích thực phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh, Viện Hoá học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, khoa Công nghệ sinh học, Đại học quốc gia Formosa, khoa Hóa-Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS TS Trần Đình Thắng - Trường Đại học Vinh, PGS. TS Ping-Chung Kuo-Đại học quốc gia Formosa (Đài Loan) là người những thầy đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất, giúp tôi từng bước trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Nguyễn Hoa Du, PGS. TS Hoàng Văn Lựu đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình làm luận án. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn GS. TS Tian-Shung Wu-Đại học Quốc gia Cheng-Kung, Đài Loan giúp đánh giá kết quả. PGS. TS. Ngô Anh khoa Sinh, Đại học Khoa học Huế giúp định danh mẫu nấm. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các phòng ban chức năng, các thầy cô, cán bộ khoa Đào tạo Sau đại học, khoa Hoá học Trường Đại học Vinh, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Vinh, ngày 15 tháng 07 năm 2015 Nguyễn Thị Bích Ngọc
1 MỤC LỤC Trang Mở đầu 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Đối tượng nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 4. Phương pháp nghiên cứu 3 5. Những đóng góp mới của luận án 3 6. Cấu trúc của luận án 4 Chương 1: Tổng quan 5 1.1. Chi Ganoderma (Linh chi) 5 1.1.1. Đặc điểm hình thái cơ bản và phân loại nấm linh chi 5 1.1.2. Các hợp chất có hoạt tính sinh học được phân lập từ nấm linh chi 6 (Ganoderma lucidum) 1.1.2.1. Lanostanoit tritecpenoit 7 1.1.2.2. Ganoderma polysaccarit 15 1.1.2.3. Peptit và protein 17 1.2. Chi Hexagonia 22 1.2.1. Đặc điểm chung về hình thái 22 1.2.2. Thành phần hóa học 23 1.3. Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria) 24 1.3.1. Đặc điểm hình thái và phân bố 24 1.3.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học 25 1.4. Nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi) 25 1.4.1. Đặc điểm hình thái và phân bố 25 1.4.2. Thành phần hóa học 26 1.4.3. Hoạt tính sinh học 28 1.5. Nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum) 28 1.5.1. Đặc điểm hình thái và phân bố 28 1.5.2. Thành phần hóa học 29 1.5.3. Hoạt tính sinh học 29
2 Chương 2: Phương pháp và thực nghiệm 30 2.1. Phương pháp nghiên cứu 30 2.1.1. Các phương pháp xử lý mẫu và chiết 30 2.1.2. Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 30 2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 30 2.2. Hóa chất và thiết bị 30 2.2.1. Hoá chất 30 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 31 2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria) 31 2.3.1. Thu mẫu 31 2.3.2. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 31 2.3.3. Các dữ liệu vật lý và phổ 33 2.3.3.1. Hexagonin A (HAM 1) 33 2.3.3.2. Hexagonin B (HAM 2) 35 2.3.3.3. Hexagonin C (HAM 3) 35 2.3.3.4. Hexagonin D (HAM 4) 36 2.3.3.5. Hexagonin E (HAM 5) 37 2.3.3.6. Hexatenuin A (HAM 6) 37 2.3.3.7. Axit ursolic (HAM 7) 38 2.3.3.8. Ergosterol (HAM 8) 39 2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ nấm linh chi (Ganoderma pfeiferi) 40 2.4.1. Thu mẫu 40 2.4.2. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 40 2.4.3. Các dữ liệu vật lý và phổ 41 2.4.3.1. Ergosterol (GPM 1) 41 2.4.3.2. Ergosterol peroxit (GPM 2) 41 2.4.3.3. Axit 3β-hydroxy-5α-lanosa-7,9,24(E)-trien-26-oic (GCM3) 41 2.4.3.4. Ganodermadiol (GPM 4) 41 2.4.3.5. Axit 7-oxo-ganoderic Z (GPM 5) 42 2.4.3.6. Cerevisterol (GPM 6) 44 2.5. Nghiên cứu các hợp chất phân lập từ nấm linh chi đen bóng 44 (Ganoderma mastoporum)
3 2.5.1. Thu mẫu 44 2.5.2. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các họp chất phân lập được 45 2.5.3. Các dữ liệu vật lý và phổ 45 2.5.3.1. ∆1-Lupenon (GCM 1) 45 2.5.3.2. Ergosta -7,22-dien-3β-ol (GCM 2) 46 2.5.3.3. Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on (GCM 3) 46 2.5.3.4. Ergosterol peroxit (GCM 4) 47 2.5.3.5. Ganodermanondiol (GCM 5) 47 2.5.3.6. Lucidumol B (GCM 6) 47 2.5.3.7. Ergosta-7,22-dien-3-on (GCM 7) 48 2.5.3.8. 3β,5α-dihydroxy-(22E,24R)-Ergosta-7,22-dien-6-on (GCM 8) 48 Chương 3: Kết quả và thảo luận 50 3.1. Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria) 50 3.1.1. Phân lập hợp chất 50 3.1.2. Xác định cấu trúc 50 3.1.2.1. Hợp chất HAM 1 (Hexagonin A) 50 3.1.2.2. Hợp chất HAM 2 (Hexagonin B) 58 3.1.2.3. Hợp chất HAM 3 (Hexagonin C) 66 3.1.2.4. Hợp chất HAM 4 (Hexagonin D) 71 3.1.2.5. Hợp chất HAM 5 (Hexagonin E) 74 3.1.2.6. Hợp chất HAM 6 (Hexatenuin A) 79 3.1.2.7. Hợp chất HAM 7 (Ergosterol) 86 3.1.2.8. Hợp chất HAM 8 (Axit ursolic) 88 3.1.2.9. Hợp chất HAM 9 (Ergosterol peroxit) 91 3.1.3. Thử hoạt tính sinh học 93 3.2. Nấm linh chi (Ganoderma pfeiferi) 95 3.2.1. Phân lập một số hợp chất 95 3.2.2. Xác định cấu trúc 95 3.2.2.1. Hợp chất GPM1 95 3.2.2.2. Hợp chất GPM2 95 3.2.2.3. Hợp chất GPM3 95 3.2.2.4. Hợp chất GPM4 97
4 3.2.2.5. Hợp chất GPM5 99 3.2.2.6. Hợp chất GPM6 102 3.2.3 Thử hoạt tính sinh học 104 3.3. Nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum) 105 3.3.1. Phân lập một số hợp chất 105 3.3.2. Xác định cấu trúc 106 3.3.2.1. Hợp chất GCM1 106 3.3.2.2. Hợp chất GCM2 107 3.3.2.3. Hợp chất GCM3 108 3.3.2.4. Hợp chất GCM4 109 3.3.2.5. Hợp chất GCM5 109 3.3.2.6 Hợp chất GCM6 110 3.3.2.7. Hợp chất GCM7 112 3.3.2.8. hợp chất GCM8 113 3.3.3. Thử hoạt tính sinh học 114 Kết luận 119 Danh mục công trình liên quan đến luận án 120 Tài liệu tham khảo 121 Phụ lục 136
1 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1. Các hợp chất được tách ra từ loài nấm tổ ong lông thô 50 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất HAM1 56 Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của hợp chất HAM2 64 Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H-NMR của chất HAM3 69 Bảng 3.5: Số liệu phổ 1H-NMR của chất HAM4 72 Bảng 3.6: Số liệu phổ NMR của chất HAM5 78 Bảng 3.7: Số liệu phổ NMR của hợp chất HAM6 84 Bảng 3.8: Số liệu phổ NMRcủa hợp chất HAM7 87 Bảng 3.9: Số liệu phổ NMR của hợp chất HAM8 89 Bảng 3.10: Số liệu phổ NMR của hợp chất HAM9 92 Bảng 3.11: Tác dụng ức chế của hợp chất từ (H. apiaria) 94 Bảng 3.12: Các hợp chất được tách ra từ nấm linh chi (G. pfeiferi) 95 Bảng 3.13: Số liệu phổ 13C-NMR, DEPT của hợp chất GPM3 96 Bảng 3.14: Số liệu phổ của hợp chất GCM4 98 Bảng 3.15: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GPM5 100 Bảng 3.16: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GPM6 103 Bảng 3.17: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng viêm 104 Bảng 3.18: Các hợp chất được tách ra từ nấm linh chi đen bóng 105 Bảng 3.19: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM1 106 Bảng 3.20: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM2 107 Bảng 3.21: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM3 108 Bảng 3.22: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM5 110 Bảng 3.23: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM6 111 Bảng 3.24: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM7 112 Bảng 3.25: Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất GCM8 113 Bảng 3.26: Tác dụng ức chế của hợp chất từ nấm linh chi đen bóng 114
2 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1. Nấm H.apiaria mặt trước và mặt sau 22 Hình 1.2. G. pfeifferi non 26 Hình 1.3. G. pfeifferi lâu năm 26 Hình 1.4. Bề mặt dưới của quả thể G. pfeifferi 26 Hình 1.5. Nấm linh chi đen bóng (G. mastoprum) 28 Hình 3.1: Phổ khối lượng của hợp chất HAM1 51 Hình 3.2: Phổ IR của hợp chất HAM1 51 Hình 3.3: Phổ 13C-NMR của hợp chất HAM1 52 Hình 3.4: Phổ DEPT của hợp chất HAM1 53 Hình 3.5: Phổ HSQC của hợp chất HAM1 53 Hình 3.6: Phổ HSQC của hợp chất HAM1 54 Hình 3.7: Phổ 1H-NMR của hợp chất HAM1 55 Hình 3.8: Phổ HMBC của hợp chất HAM1 56 Hình 3.9: Công thức HMBC của hợp chất HAM1 56 Hình 3.10: Phổ khối lượng HR-ESI-MS của hợp chất HAM2 59 Hình 3.11: Phổ IR của hợp chất HAM2 59 Hình 3.12: Phổ 13C-NMR của hợp chất HAM2 60 Hình 3.13: Phổ DEPT của hợp chất HAM2 61 Hình 3.14: Phổ 1H-NMR của hợp chất HAM2 62 Hình 3.15: Phổ HSQC của hợp chất HAM2 62 Hình 3.16: Phổ HSQC dãn của hợp chất HAM2 63 Hình 3.17: Phổ HMBC của hợp chất HAM2 63 Hình 3.18: Phổ COSY của hợp chất HAM2 64 Hình 3.19: Phổ khối lượng của hợp chât HAM3 66 Hình 3.20: Phổ 13C-NMR của hợp chất HAM3 67 Hình 3.21: Phổ 13C-NMR của hợp chất HAM3 67
3 Hình 3.22: Phổ HSQC của hợp chất HAM3 68 Hình 3.23: Phổ HMBC của hợp chất HAM3 68 Hình 3.24: Phổ khối lượng của HAM4 71 Hình 3.25: Công thức phân tử HMBC của hợp chất 4 72 Hình 3.26: Phổ khối lượng của hợp chất HAM5 74 Hình 3.27: Phổ 1H-NMR của hợp chất HAM5 75 Hình 3.28: Phổ 13C-NMR của hợp chất HAM5 76 Hình 3.29: Phổ DEPT của hợp chất HAM5 76 Hình 3.30: Phổ HSQC của hợp chất HAM5 76 Hình 3.31: Phổ HMBC của hợp chất HAM5 77 Hình 3.32: Công thức phân tử HMBC của hợp chất HAM5 77 Hình 3.33: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất HAM6 80 Hình 3.34: Phổ IR của hợp chất HAM6 80 Hình 3.35: Phổ 13C-NMR của hợp chất HAM6 81 Hình 3.36: Phổ DEPT của hợp chất HAM6 81 Hình 3.37: Phổ 1H-NMR của hợp chất HAM6 82 Hình 3.38: Phổ 1H-NMR của hợp chất HAM6 82 Hình 3.39: Phổ HMBC của hợp chất HAM6 83
4 DANH SÁCH SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1. Phân lập các hợp chất từ nấm tổ ong lông thô 34 Sơ đồ 2.2. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi 43 Sơ đồ 2.3. Phân lập các chất từ quả thể nấm linh chi đen bóng 49
1 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT GC-MS: Gas Chromatography-Mass Spectrometry (Sắc ký khí-khối phổ liên hợp) CC: Column Chromatography (Sắc kí cột) FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) HPLC: High Performance Liquid Chromatography(Sắc ký lỏng cao áp) IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng) EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron) ESI-MS: Electron Spray Ionzation-Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phun mù electron) HR-ESI-MS: High Relution-Electron Spray Impact Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phân giải cao phun mù electron) 1 H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer. HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy s: singlet br s: singlet tù t: triplet d: dublet dd: dublet của duplet dt: dublet của triplet
2 m: multiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide Đ.n.c.: Điểm nóng chảy. EC50: Giá trị 50% các tế bào hoặc gốc tự do bị chết hoặc được tạo ra bởi DPPH được trung hòa RT: retention time (Thời gian lưu)
1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Nấm là sinh vật không thể thiếu trong đời sống, không có nấm, chu trình tuần hoàn vật chất sẽ bị mất một mắt xích quan trọng trong việc phân hủy chất bã hữu cơ. Nấm là nguồn thực phẩm giàu đạm, đầy đủ các axit amin thiết yếu, hàm lượng chất béo ít và đó là những axit béo chưa bão hòa, giá trị năng lượng cao, giàu khoáng chất và các vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe con người. Ngoài ra, trong nấm còn chứa nhiều hoạt chất có tính sinh học, góp phần ngăn ngừa và điều trị bệnh cho con người. Ngày nay các nhà khoa học đang nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài nấm và phát hiện một số hoạt chất có dược tính mạnh đối với các căn bệnh nan y như viêm gan, ung thư, HIV.. Việc đưa vào sử dụng rộng rãi các chế phẩm được tách chiết từ nấm sẽ giúp con người khỏe mạnh và phòng chống được nhiều căn bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm. Trong khi đó, Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, những kiểu sinh thái khác nhau… đã góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam. Đến năm 2010, có khoảng 2500 loài nấm đã được ghi nhận cho lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn [3, 4, 9]. Các loài nấm lớn của Việt Nam có giá trị tài nguyên rất đáng kể về nhiều mặt, có khoảng 50 loài là nấm ăn quý như: các loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hương (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis Bull.), Nấm chàm (Boletus aff. felleus Bull.), Nấm bào ngư (Pleurotus spp.), Nấm mào gà (Cantherellus cibarius Fr.), Nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), Nấm kim châm (Flammulina velutipes) ... [4, 6]. Có khoảng hơn 200 loài nấm dùng làm dược liệu, trong đó có rất nhiều loài là dược liệu quý như: linh chi một năm (G.lucidum), linh chi sò (G.capense); cổ Linh chi (G.applanatum), nấm vân chi (Trametes versicolor), nấm phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hương (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), mộc nhĩ, ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris)… [8]. Những nghiên cứu bước đầu về các hợp chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn như polysaccharit, polysaccharit-peptit, lectin, các chất có trọng lượng phân tử nhỏ như các flavonoit, steroit, terpenoit… có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, suy giảm miễn dịch, tiết niệu, tim
2 mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả năng sinh enzym và một số hoạt chất quý có thể được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường. Các loài nấm độc ở Việt Nam cũng khá phong phú, những nghiên cứu bước đầu đã chỉ ra danh lục của hơn 30 loài. Trong số các loài nấm độc của Việt Nam, nhóm nguy hiểm nhất là các loài gây ngộ độc chết người như: nấm độc xanh đen (Amanita phalloides), nấm độc tán trắng (Amanita verna), nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa)... đã gây ra rất nhiều vụ ngộ độc, đặc biệt là ở các vùng núi nơi có nhiều đồng bào các dân tộc thiểu số sinh sống. Một số loài nấm độc khác gây ngộ độc thần kinh, tiêu hóa, gây ảo giác khác cũng rất nguy hiểm, như: nấm ruồi, nấm độc đỏ (Amanita muscaria), nấm độc nâu (Amanita pantherina), nấm độc rỉ sắt, nấm phân … [8]. Nghệ An là tỉnh có vườn Quốc gia Pù Mát, khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt. Đây là những vùng được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm… Các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam nói chung và Nghệ An nói riêng vẫn còn là một vấn đề khá mới, chưa nhận được sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học. Do vậy, việc nghiên cứu về nấm ở Nghệ An là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn quan trọng, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dược liệu thiên nhiên của nước ta nói chung và tỉnh Nghệ An nói riêng. Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở vùng Bắc Trung Bộ”. 2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là dịch chiết từ loài nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở vùng Bắc Trung Bộ. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ các loài nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont)
3 Pat.). - Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất. - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được. 4. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô ở 400C. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm. - Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên các pha đảo và pha silica gel. - Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: Cấu trúc hoá học các hợp chất được phân lập được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã được sử dụng. - Cấu trúc lập thể tương đối và tuyệt đối của các hợp chất này được xác định bằng các phản ứng hoá học và các phương pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY . - Thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư, kháng viêm và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. 5. Những đóng góp mới của luận án Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học quả thể nấm nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), quả thể nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở Việt Nam, chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau: 1. Từ dịch chiết quả thể nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria) đã phân lập và xác định cấu trúc 9 hợp chất: - 07 hợp chất triterpenoit: hexagonin A, hexagonin B, hexagonin C, hexagonin D, hexagonin E; hexatenuin A; axit ursolic. Trong đó hexagonin A, hexagonin B, hexagonin C, hexagonin D, hexagonin E là các hợp chất mới.
4 - 02 hợp chất sterol: ergosterol, ergosterol peroxit. Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này. - Sáu hợp chất hexagonin A, hexagonin B, hexagonin C, hexagonin D, hexagonin E, hexatenuin A đều có khả năng kháng viêm. 2. Từ dịch chiết quả thể nấm linh chi (G. pfeifferi.) phân lập được 6 hợp chất: - 03 hợp chất triterpenoit: axit 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic; ganodermadiol; axit 7-oxo-ganoderic Z; - 03 hợp chất sterol: ergosterol, ergosterol peroxit, cerevisterol. - Hợp chất ergosterol có khả năng ức chế sự tạo thành NO trong khoảng nồng độ 2,5-20 μg/mL, với IC50 là 19,61 μg/mL. 3. Từ dịch chiết quả thể nấm linh chi đen bóng (G. mastoporum (Mont) Pat.) phân lập được 8 hợp chất: - 03 hợp chất triterpenoit: Δ1-lupenon, ganodermanondiol, lucidumol B; - 05 hợp chất sterol: ergosta-7,22-dien-3β-ol; ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on; ergosterol peroxit; ergosta-7,22-dien-3-on; 3β,5-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22- dien-6-on; - Các hợp chất Δ1 –lupenon, ganodermanondiol, lucidumol B, ergosta-7,22-dien- 3b-ol, ergosta -4,6,8(14),22-tetraen-3-on, ergosterol peroxit, ergosta -7,22-dien-3-on; 3β,5-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-on có khả năng ức chế sự sản sinh các anion superoxit trên bạch cầu trung tính của người theo cơ chế tác động liên quan đến sự ức chế con đường dẫn truyền tín hiệu của p38 MAPK. 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 135 trang với 26 bảng số liệu, 39 hình và 3 sơ đồ với 150 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phương pháp và thực nghiệm (20 trang), kết quả và thảo luận (69 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (14 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 60 phổ của một số hợp chất chọn lọc.
5 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Chi Ganoderma (linh chi) 1.1.1. Đặc điểm hình thái cơ bản và phân loại nấm linh chi Các loại nấm thuộc chi Ganoderma (đặc biệt là G. lucidum) đã được sử dụng trong y học cổ truyền phương Đông để điều trị và phòng ngừa một số bệnh như ung thư, cao huyết áp, viêm phế quản mãn tính, bệnh hen suyễn, thuốc bổ và thuốc an thần [78]. Gần đây, đã có các chế phẩm thực phẩm chức năng làm từ sợi nấm, quả thể và bào tử của G. lucidum đã có trên thị trường nhằm bổ sung vào chế độ ăn uống hỗ trợ điều trị kháng u, tăng khả năng miễn dịch và khả năng chống oxi hóa [91, 132, 137]. Thị trường thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ G. lucidum ước tính doanh thu khoảng 5-6 tỷ USD/năm, trong đó thị trường Hoa Kỳ tiêu thụ khoảng 1,6 tỷ USD [154]. Một số loài khác như G. tsugae, G. applanatum, G. colossum, G. concinna, G. pfeifferi… cũng có tác dụng hỗ trợ điều trị và chăm sóc sức khỏe con người [47, 52, 71, 78, 91, 96, 154]. Điểm đặc biệt có ở nhóm nấm này là màng bào tử đảm 2 lớp - một dấu hiệu di truyền nổi bật, cho nên nhiều nhà khoa học đề nghị xếp chúng thành một họ độc lập là họ Linh chi (Ganodermataceae Donk). Nấm linh chi (Ganoderma) mọc trên cây gỗ sống hay đã chết, thích hợp ở nhiệt độ thấp từ 21- 260C, ở các vùng đồi núi cao trên 1000m so với mực nước biển, như các vùng ở Tam Đảo, Pù Mát, Thừa Thiên Huế, Trường Sơn... gặp nhiều vào mùa mưa (từ tháng 5 -11) [3, 8, 10, 11, 14]. Các loài nấm Linh chi được phát hiện ở Việt Nam khá sớm. Dựa theo màu sắc mũ nấm, y học phương Đông phân biệt 6 loại linh chi với tên gọi tương ứng: linh chi trắng (bạch chi hay ngọc chi), linh chi vàng (hoàng chi hay kim chi), linh chi xanh (thanh chi hay long chi), linh chi đỏ (xích chi hay hồng chi), linh chi tím (tử chi), Linh chi đen (Hắc chi hay huyền chi). Ngoài ra, còn có nhiều cách phân loại khác [10, 11, 12, 14, 16]. Ganoderma là chi nấm dược liệu. Trong hơn 40 năm, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành phần hóa học của các loài nấm thuộc chi này, đã phân lập được 431 các hợp chất chuyển đổi bậc hai. Cấu trúc của các hợp chất chuyển đổi bậc hai phân lập được bao gồm: (a) các hợp chất lanostan chứa 30 nguyên tử cacbon (axit ganoderic), (b) các hợp chất lanostan chứa 30 nguyên tử cacbon (andehyt, ancol, este, glycosit, lacton,
6 xeton), (c) các hợp chất lanostan chứa 27 nguyên tử cacbon (axit lucidenic), (d) các hợp chất lanostan chứa 27 nguyên tử cacbon (ancol, lacton, este), (e) các hợp chất lanostan chứa 24, 25 cacbon (f) các hợp chất triterpen pentacyclic chứa 30 cacbon (g) meroterpenoit, (h) farnesyl hydroquinon (meroterpenoit), (i) C15 các sesquiterpenoit, (j) các steroit, (k) các alkaloit, (l) prenyl hydroquinon, (m) các benzofuran, (n) các dẫn xuất của benzopyran-4-on và (o) dẫn xuất của benzenoit. G. lucidum là loài được nghiên cứu sâu và rộng về thành phần các hợp chất chuyển hóa bậc hai và hoạt tính sinh học. Ngoài ra, một số loài đã được nghiên cứu như G. applanatum, G. colossum, G. sinense, G. cochlear, G. tsugae, G. amboinense, G. orbiforme, G.resinacem, G. hainanense, G. concinna, G. pfeifferi, G.neojaponicum, G. tropicum, G. australe, G. carnosum, G. fornicatum, G. applanatum, G. mastoporum, G. theaecolum, G. boninense, G. capense và G. annulare. 1.1.2. Các hợp chất có hoạt tính sinh học đuợc phân lập từ nấm linh chi (Ganoderma lucidum) Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) là loài được nghiên cứu nhiều nhất của họ Ganodermataceae Donk. Loài nấm này được đặt tên linh chi Nhật Bản hay ling-zhi ở Trung Quốc, đã được biết đến từ thời cổ đại và đã được đề cập trong cuốn sách y khoa nổi tiếng Thần nông bản thảo (viết trong thời Đông Hán) và Bản thảo cương mục (viết vào khoảng năm 1590 AC). Nấm linh chi (G. lucidum) được dùng để điều trị nhiều loại bệnh như: viêm gan, tăng cholesterol máu, tiểu đường, ung thư, suy giảm miễn dịch, giảm bạch cầu, xơ vữa động mạch, bệnh trĩ, mệt mỏi mãn tính, mất ngủ và chóng mặt do suy nhược thần kinh, viêm phế quản và cao huyết áp [24, 45, 49, 56, 89, 115, 147]. Nấm linh chi (G. lucidum) là chứa một lượng lớn các hợp chất đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học. Hầu hết các chất chuyển hóa bậc hai có hoạt tính sinh học được phân lập từ G. lucidum bao gồm hai nhóm chính: lanosterol (axit ganoderic và các dẫn xuất của chúng) và các polysaccarit [35, 103]. Ngoài ra, loài nấm này còn chứa các peptit có khối lượng phân tử thấp và các protein có hoạt tính sinh học đa dạng [118, 121, 134]. Dịch chiết nước của G. lucidum đặc biệt hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của ung thư ác tính có nguồn gốc từ mô mềm. Còn các dịch chiết không phân cực là không có khả năng này, chúng có hoạt tính mạnh chống sự oxi hóa lipit, cũng như thu gom hydroxyl và các gốc tự do [67, 89].