Luận án Tiến sĩ Hoá học: Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa một số cây thuốc An giang và nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa của Tetrastigma erubescens Planch. và Nauclea orientalis (L.) L

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:355

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung của luận văn này là tiến hành sàng lọc các cây thuốc An Giang nhằm lựa chọn ra các cây thuốc có hoạt tính mạnh, phục vụ cho nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của chúng. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hoá học: Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa một số cây thuốc An giang và nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa của Tetrastigma erubescens Planch. và Nauclea orientalis (L.) L

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN THỊ ANH ĐÀO SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH. VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L. LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHAN THỊ ANH ĐÀO SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH. VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L. Chuyên ngành: Hóa Phân Tích Mã số chuyên ngành: 62 44 01 18 Phản biện 1: TS. Tôn Thất Quang Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương Phản biện 3: TS. Mai Đình Trị Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Trần Khắc Vũ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1.PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Mai 2. PGS.TS. Trần Lê Quan TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015 Tp. Hồ Chí Minh - Năm Phản biện độc lập 2:
LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến: PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS. TS. Trần Lê Quan, người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu. Cô Thầy luôn động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. PGS.TS. Nguyễn Trung Nhân và các Quý Thầy Cô trong Bộ môn Hóa Phân Tích đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các môn học phần bổ sung. Thạc sỹ Nguyễn Xuân Hải và các bạn cùng phòng thí nghiệm đã luôn chia sẻ những kinh nghiệm cũng như tạo cho tôi những giây phút vui vẻ giữa những tháng ngày miệt mài với công việc. TS. Trương Thị Huỳnh Hoa cùng các kỹ thuật viên phòng máy NMR và HPLC-MS thuộc phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm-ĐH Khoa học Tự nhiên- ĐH Quốc gia TP. HCM. PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương cùng các anh chị thuộc Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. HCM- ĐH Y Dược TP. HCM. Phòng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi giải quyết các thủ tục hành chính. Ban Giám hiệu và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm- Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện về thời gian, cũng như các đồng nghiệp đã gánh vác công việc, hỗ trợ tôi trong thời gian tôi đi học. Con xin cám ơn Ba Mẹ và Bố Mẹ đã hỗ trợ, động viên con yên tâm hoàn thành việc học. Cảm ơn Anh và hai Con đã cho em một gia đình êm ấm để em vững tin tiếp tục học tập và công tác.
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận án Tiến sĩ Hóa học “Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa một số cây thuốc An giang và nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa, bảo vệ gan của Tetrastigma erubescens Planch. và Nauclea orientalis (L.) L.” là do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS.TS. Trần Lê Quan. Những kết quả nghiên cứu trong luận án này chưa được các tác giả khác công bố ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Điều này đã được kiểm tra bằng cách tra cứu tài liệu tham khảo cung cấp bởi phần mềm SciFinder. Tôi xin cam đoan danh dự về công trình khoa học này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 09 năm 2015 Tác giả luận án Phan Thị Anh Đào
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 2 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA ........................................................ 2 1.1.1 Khái niệm về gốc tự do .................................................................................... 2 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể .................................................... 3 1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể ................................................................... 7 1.1.4 Khái niệm về chất kháng oxy hóa ................................................................. 10 1.1.5 Phân loại ........................................................................................................ 11 1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa..................................... 16 1.2 TỒNG QUAN VỀ CÁC CÂY THUỐC SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA...............................................................................................................................20 1.3 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH. .......... 21 1.3.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Tetrastigma erubescens Planch. ................................................................................................................................ 21 1.3.2 Nghiên cứu về dược học của cây T.erubescens ............................................. 22 1.3.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây T.erubescens ............................ 23 1.3.4 Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetrastigma ............................... 24 1.4 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L............................. 28 1.4.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Nauclea orientalis (L.) L. ....... 28 1.4.2 Nghiên cứu dược học của cây N. orientalis................................................... 30 1.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây N. orientalis .................................. 31 1.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Nauclea ........................................ 34 1.5 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 39
1.5.1 Những vấn đề còn tồn tại ............................................................................... 39 1.5.2 Định hướng nghiên cứu ................................................................................. 40 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 42 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ............................................................................. 42 2.1.1 Hóa chất ......................................................................................................... 42 2.1.2 Thiết bị ........................................................................................................... 42 2.2 ĐIỀU CHẾ MẪU CAO SÀNG LỌC, TRÍCH LY VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT ..................................................................................................... 44 2.2.1 Nguyên liệu .................................................................................................... 44 2.2.2 Điều chế các mẫu cao methanol .................................................................... 51 2.2.3 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây T.erubescens ......................... 51 2.2.4 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây N.orientalis ........................... 55 2.3 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC .......................................................... 59 2.3.1 Nguyên tắc ..................................................................................................... 59 2.3.2 Chuẩn bị mẫu ................................................................................................. 59 2.3.3 Điều kiện chạy HPLC .................................................................................... 59 2.3.4 Điều kiện chạy MS ........................................................................................ 60 2.3.5 Dựng đường chuẩn ........................................................................................ 60 2.3.6 Xử lý kết quả ................................................................................................. 61 2.3.7 Nơi thực nghiệm ............................................................................................ 61 2.4 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA ............................................... 61 2.4.1 Thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH .............................................. 61 2.4.2 Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ................................. 63 2.4.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan trên chuột nhắt bị suy giảm hệ miễn dịch bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo) ............................................ 65 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................... 67 3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA .......................... 67 3.1.1 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH....................................... 67 3.1.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid .................... 70 3.1.3 Bàn luận kết quả nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa ................... 71
3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY T.ERUBESCENS VÀ THÂN CÂY N.ORIENTALIS ..................................................... 73 3.2.1 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của thân cây T. erubescens ............. 73 3.2.2 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của thân cây N. orientalis ............... 74 3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH. ............................................................................................. 75 3.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất phenol đơn vòng ............................. 75 3.3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất stilbene ........................................... 86 3.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất flavonoid ........................................ 93 3.3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất benzopyranoid ....................... 112 3.3.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan ........................................... 116 3.3.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất steroid .................................... 119 3.3.7 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất norisoprenoid ............................... 130 3.4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.) L. .................................................................................................... 133 3.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất phenol đơn vòng ........................... 134 3.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất benzopyranoid .............................. 138 3.4.3 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất triterpenoid ................................... 147 3.4.4 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất monoterpenoid ............................. 157 3.4.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất anthraquinone............................... 170 3.4.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan ........................................... 172 3.5 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC ........................................................ 174 3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA................................................... 175 3.6.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ............................... 175 3.6.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ............. 181 3.6.3 Kết quả nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm miễn dịch ở chuột nhắt bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo) .................................................................... 183 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 187 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AO (AH) : Antioxidant (chất kháng oxy hóa) Asc : Ascorbic acid (vitamin C) BHA : Butylated hydroxyanisole br : Broad (rộng) BHT : Butylated hydroxytoluene CHCl3 : Chloroform CTPT : Công thức phân tử CY : Cyclophosphamide d : Doublet (mũi đôi) DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide DNA : Acid deoxyribonucleic DPPH : 2,2-diphenylpicrylhydrazyl EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ET : Electron transfer methods GSH : Glutathione HAT : Hydrogen atom transfer methods HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HR-ESI-MS : High resolution electro spray ionization mass spectroscopy HSQC : Heteronuclear single quantum coherence IC50 : Nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do J : Hằng số ghép m : Multiplet (mũi đa) MDA : Malonyldialdehyde NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NMR : Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) NOS : Nitrogen oxygen species NP : Nomal phase (pha thường) PBS : Phosphate buffered saline PG : Propyl gallate Pr : Protein
PTLC : Preparative thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế) quin : quintet (mũi năm) RNS : Reactive nitrogen species ROS : Reactive oxygen species s : Singlet (mũi đơn) SEM : Standard error of the mean (sai số chuẩn của giá trị trung bình) SKC : Sắc ký cột TBA : Acid thiobarbituric TBHQ : tert-Butylhydroquinone TCA : Acid Trichloroacetic TLC : Thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng) Trolox : Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic UV : Ultraviolet (tử ngoại) XO : Xanthine oxidase YHCT : Y học cổ truyền
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp .......................................................... 12 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của acid L-ascorbic và acid dehydro ascorbic ......... 14 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của vitamin E ............................................................... 14 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của β-carotene.............................................................. 15 Hình 1.5 Công thức cấu tạo của taurine và hypotaurine .......................................... 15 Hình 1.6 Công thức cấu tạo của acid α-lipoic ........................................................... 15 Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc DPPH .................................................................. 17 Hình 1.8 Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và acid thiobarbituric .......... 19 Hình 1.9 Ảnh minh họa cây và quả của T. erubescens............................................. 21 Hình 1.10 Cấu trúc các hợp chất béo phân lập từ chi Tetrastigma ............................ 25 Hình 1.11 Cấu trúc các hợp chất steroid phân lập từ chi Tetrastigma ....................... 25 Hình 1.13 Cấu trúc các hợp chất phenol phân lập từ chi Tetrastigma ....................... 26 Hình 1.14 Cấu trúc các hợp chất flavonoid phân lập từ chi Tetrastigma ................... 27 Hình 1.15 Cấu trúc hợp chất trans-reveratrol phân lập từ chi Tetrastigma ............... 27 Hình 1.16 Cấu trúc các hợp chất chứa nitrogen phân lập từ chi Tetrastigma ............ 28 Hình 1.17 Cấu trúc một số hợp chất khác phân lập từ chi Tetrastigma ..................... 28 Hình 1.18 Ảnh minh họa cây, hoa và lá của N. orientalis .......................................... 29 Hình 1.19 Cấu trúc một số hợp chất alkaloid phân lập từ cây N. orientalis .............. 33 Hình 1.20 Cấu trúc một số hợp chất steroid và chất béo phân lập từ cây N. orientalis33 Hình 1.21 Cấu trúc một số hợp chất terpenoid phân lập từ cây N. orientalis ............ 34 Hình 1.22 Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ cây N. orientalis ......... 34 Hình 1.24 Cấu trúc một số hợp chất steroid, terpenoid phân lập từ chi Nauclea ....... 38 Hình 1.25 Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ chi Nauclea ................. 39 Hình 3.1 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-2................................................. 77 Hình 3.2 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-4................................................. 79 Hình 3.3 Tương quan HMBC của hợp chất DR-5 ................................................... 81 Hình 3.4 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-9 ................................ 85 Hình 3.5 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-10 .............................. 88 Hình 3.6 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-11 .............................. 90 Hình 3.7 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-12 .............................. 92
Hình 3.8 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-13............................................... 94 Hình 3.9 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-14............................................... 96 Hình 3.10 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-15............................................... 98 Hình 3.11 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-17 ............................ 101 Hình 3.12 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-18 ............................ 104 Hình 3.13 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-19 ............................ 107 Hình 3.14a Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần thứ nhất của hợp chất DR-20............. ................................................................................. 109 Hình 3.14b Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần thứ hai của hợp chất DR-20............. ......................................................................................... 110 Hình 3.14c Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-20 ............................ 110 Hình 3.15 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-21 ............................ 113 Hình 3.16 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-22 ............................ 115 Hình 3.17 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-23 ............................ 118 Hình 3.18 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-25............................................. 122 Hình 3.19 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-26............................................. 124 Hình 3.20 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-27............................................. 126 Hình 3.21 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-28............................................. 128 Hình 3.22 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-29 ............................ 131 Hình 3.23 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-30 ........................... 133 Hình 3.24 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-5 .............................. 135 Hình 3.25 Tương quan HMBC trong hợp chất GV-6 .............................................. 137 Hình 3.26 Tương quan HMBC trong hợp chất GV-8 .............................................. 140 Hình 3.27 Tương quan HMBC trong hợp chất GV-9 .............................................. 141 Hình 3.28 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-10 ............................ 143 Hình 3.29 Tương quan HMBC trong hợp chất GV-12 ............................................ 146 Hình 3.30 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-13 ............................ 148 Hình 3.31 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-14 ............................ 151 Hình 3.32 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-15 ............................ 153 Hình 3.33 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-16 ............................ 156 Hình 3.34 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-17 ............................ 158
Hình 3.35 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-18 ............................ 160 Hình 3.36 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-19 ............................ 162 Hình 3.37 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-20 ............................ 164 Hình 3.38a Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần aglycone của hợp chất GV-21...... ........................................................................................ 167 Hình 3.38b Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần đường của hợp chất GV-21............. ......................................................................................... 168 Hình 3.38c Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-21 ............................ 169 Hình 3.38d Tương quan NOESY trong hợp chất GV-21 ........................................... 169 Hình 3.39 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-22 ............................ 171 Hình 3.40 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-23 ............................ 173 Hình 3.41 Tổng kết các hợp chất phenolic đơn vòng có hoạt tính kháng oxy hóa ........ .............................................................................................................178 Hình 3.42 Tổng kết các hợp chất benzopyranoid có hoạt tính kháng oxy hóa ........ 179 Hình 3.43 Tổng kết các hợp chất stilbene có hoạt tính kháng oxy hóa .................... 179 Hình 3.44 Tổng kết các hợp chất flavonoid có hoạt tính kháng oxy hóa ................. 180 Hình 4.1 Cấu trúc của 30 chất phân lập từ thân cây T. erusbescens ...................... 189 Hình 4.2 Cấu trúc của 23 chất phân lập từ thân cây N. orientalis .......................... 190
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitrogen ................................................................ 2 Bảng 1.2 Các dạng hoạt động của oxygen .................................................................. 2 Bảng 1.3 Các chất được phân lập từ các cây thuộc chi Tetrastigma ........................ 24 Bảng 1.4 Các hợp chất được phân lập từ các cây N. orientalis ................................ 31 Bảng 1.5 Các hợp chất phân lập từ chi Nauclea ....................................................... 35 Bảng 2.1 Danh mục, tiêu chí lựa chọn, độ ẩm nguyên liệu và thu suất điều chế cao chiết methanol của các cây thuốc nghiên cứu sàng lọc ............................. 45 Bảng 2.2 Khối lượng và thu suất các loại cao từ thân cây T.erubescens .................. 51 Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây T. erubescens .............. 53 Bảng 2.4 Khối lượng và thu suất các loại cao từ thân cây N.orientalis .................... 55 Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây N. orientalis ................ 57 Bảng 2.6 Chương trình gradient pha động ................................................................ 59 Bảng 2.7 Khối lượng các mảnh ion phân tử được phân tách trên cột C18 ............... 60 Bảng 2.8 Điều kiện chạy MS .................................................................................... 60 Bảng 2.9 Dữ liệu đường chuẩn của các hợp chất cần định lượng ............................ 61 Bảng 2.10 Đường chuẩn của các hợp chất .................................................................. 61 Bảng 2.11 Bố trí thử nghiệm ....................................................................................... 65 Bảng 3.1 Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương, trolox thử nghiệm bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH.................................. 67 Bảng 3.2 Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của 82 mẫu cao sàng lọc theo phương pháp ức chế gốc tự do DPPH ..................................................................... 67 Bảng 3.3 Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của tám mẫu cao thử nghiệm bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH ..................................................................... 69 Bảng 3.4 Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương, trolox thử nghiệm bằng phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid ............... 70 Bảng 3.5 Thu suất, phần trăm ức chế và giá trị IC50 của tám mẫu cao thử nghiệm bằng phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid ............................ 71 Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn trích ly từ thân cây T. erubescens ...................................................................... 73
Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ cao ethyl acetate của thân cây T. erubescens ................................................... 73 Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn từ thân cây N. orientalis ................................................................................. 74 Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ cao ethyl acetate của thân cây N. orientalis ..................................................... 75 Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-1 so sánh với acid 4-hydroxybenzoic 76 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-2 so sánh với methyl 4- hydroxybenzoate ........................................................................................ 77 Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-3 so sánh với acid protocatechuic .... 78 Bảng 3.13 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-4 so sánh với methyl protocatechuate80 Bảng 3.14 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-5 so sánh với acid vanillic................ 81 Bảng 3.15 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-6 so sánh với acid gallic ................... 82 Bảng 3.16 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-7 so sánh với methyl gallate ............ 83 Bảng 3.17 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-8 so sánh với catechol ...................... 84 Bảng 3.18 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-9 so sánh với của mallonanoside B.. 86 Bảng 3.19 Số liệu phổ của hợp chất DR-10 so sánh với (E)-resveratrol .................... 88 Bảng 3.20 Số liệu phổ của hợp chất DR-11 so sánh với (E) 2,3,5,4’- tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside .................................................. 90 Bảng 3.21 Số liệu phổ của hợp chất DR-12 so sánh với trans-polydatin ................... 92 Bảng 3.22 Số liệu phổ của hợp chất DR-13 so sánh với 6-demethoxytangeretin ...... 94 Bảng 3.23 Số liệu phổ của hợp chất DR-14 so sánh với tangeretin ........................... 96 Bảng 3.24 Số liệu phổ của hợp chất DR-15 so sánh với 6-demethoxynobiletin ........ 98 Bảng 3.25 Số liệu phổ của hợp chất DR-16 so sánh với nobiletin ........................... 100 Bảng 3.26 Số liệu phổ của hợp chất DR-17 so sánh với catechin và epicatechin .... 102 Bảng 3.27 Số liệu phổ của hợp chất DR-18 so sánh với (-)-epigallocatechin-3-O- gallate....................................................................................................... 104 Bảng 3.28 Số liệu phổ của hợp chất DR-19 so sánh với phlorizin ........................... 107 Bảng 3.29 Số liệu phổ của hợp chất DR-20 so sánh với phổ tham khảo.................. 111 Bảng 3.30 Số liệu phổ của hợp chất DR-21 so sánh với bergenin ........................... 113 Bảng 3.31 Số liệu phổ của hợp chất DR-22 so sánh với 4-O-galloylbergenin ......... 115
Bảng 3.32 Số liệu phổ của hợp chất DR-23 so sánh với (+)-lyoniresinol ................ 118 Bảng 3.33 Số liệu phổ của hợp chất DR-24 so sánh với -sitosterol ....................... 120 Bảng 3.34 Số liệu phổ của hợp chất DR-25 so sánh với stigmast-4-en-3-one ......... 122 Bảng 3.33 Số liệu phổ của hợp chất DR-26 so sánh với 3β-hydroxystigmast-5-en-7- one ........................................................................................................... 124 Bảng 3.36 Số liệu phổ của hợp chất DR-27 so sánh với stigmast-4-ene-3β,6β-diol ...... ...........................................................................................................129 Bảng 3.37 Số liệu phổ của hợp chất DR-28 so sánh với β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranoside ....................................................................................... 129 Bảng 3.38 Số liệu phổ của hợp chất DR-29 so sánh với loliolide ............................ 131 Bảng 3.39 Số liệu phổ của hợp chất DR-30 so sánh với (+)-dehydrovomifoliol ..... 133 Bảng 3.40 Số liệu phổ của hợp chất GV-5 so sánh với acid 3-(2,4- dihydroxylphenyl)propanoic ................................................................... 135 Bảng 3.41 Số liệu phổ của hợp chất GV-6 so sánh với methyl 3-(2,4 dihydroxylphenyl)propanoate .................................................................. 137 Bảng 3.42 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-7 so sánh với acid trans-p-coumaric ... ..........................................................................................................141 Bảng 3.43 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-8 so sánh với umbelliferone........... 140 Bảng 3.44 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-9 so sánh với skimmin ................... 141 Bảng 3.45 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-10 so sánh với adicardin ................ 143 Bảng 3.46 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-11 so sánh với esculetin ................. 145 Bảng 3.47 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-12 so sánh với scopoletin............... 146 Bảng 3.48 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-13 so sánh với acid quinovic 3β-O-β- D-glucopyranoside................................................................................... 148 Bảng 3.49 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-14 so sánh với acid quinovic 3β-O-β- D-quinovopyranoside .............................................................................. 151 Bảng 3.50 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-15 so sánh với acid quinovic-3β-O-β- D-glucopyranosyl-(28→1)-β-D-glucopyranosyl ester ........................... 153 Bảng 3.51 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-16 so sánh với acid quinovic-3β-O-β- D-quinovopyranosyl-(28→1)-β-D-glucopyranosyl ester ........................ 156 Bảng 3.52 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-17 so sánh với loganetin ................ 159
Bảng 3.53 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-18 so sánh với loganin ................... 159 Bảng 3.54 Số liệu phổ hợp chất GV-19 so sánh với sweroside ............................... 162 Bảng 3.55 Số liệu phổ hợp chất GV-20 so sánh với grandifloroside ....................... 165 Bảng 3.56 Số liệu phổ hợp chất GV-21 .................................................................... 168 Bảng 3.57 Số liệu phổ của hợp chất GV-22 so sánh với aloe emodin ..................... 171 Bảng 3.58 Số liệu phổ của hợp chất GV-23 so sánh với (+)-pinoresinol ................. 173 Bảng 3.60 Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các hợp chất phân lập trên hai cây176 Bảng 3.61 Hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid của 18 hoạt chất lựa chọn....3 Bảng 3.62 Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở các lô ............................................ 183 Bảng 3.63 Hàm lượng malonyl dialdehyde trong gan chuột ở các lô....................... 184 Bảng 3.64 Hàm lượng glutathione trong gan chuột ở các lô .................................... 185 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Các bộ phận cơ thể và các bệnh lý liên quan tới gốc tự do ............................ 7 Sơ đồ 1.2 Phân loại các chất kháng oxy hóa tự nhiên................................................... 12 Sơ đồ 2.1 Quá trình trích ly ............................................................................................ 51 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ điều chế các loại cao từ thân cây T. erubescens .................................. 52 Sơ đồ 2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ thân cây T.erubescens ................................. 54 Sơ đồ 2.4 Sơ đồ điều chế các loại cao từ thân cây N.orientalis ..................................... 56 Sơ đồ 2.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ thân cây N. orientalis .................................. 58 Sơ đồ 2.6 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ............................................ 62 Sơ đồ 2.7 Quy trình khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ................. 64
MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến các vấn đề gốc tự do, chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy hóa. Trong cơ thể con người, khi lượng gốc tự do quá lớn, vượt qua mức kiểm soát của hệ thống miễn dịch, gốc tự do sẽ tấn công vào các đại phân tử như DNA, protein, lipid và gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể.[26,86] Gốc tự do được biết là thủ phạm có liên quan tới nhiều căn bệnh mà trong đó phải kể tới các bệnh nguy hiểm hiện nay như ung thư, viêm khớp, huyết áp, tim mạch, Alzheimer, Parkinson ….[26,86] Chất kháng oxy hóa được đưa vào cơ thể con người thông qua thực phẩm, dược phẩm có khả năng ngăn ngừa, ức chế và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Nhu cầu và thị hiếu của con người ngày càng cao, đòi hỏi sự tìm tòi, nghiên cứu của các nhà khoa học càng sâu rộng, hiệu quả và kịp thời. Ngày này, xu hướng nghiên cứu mới là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm thay thế cho các chất kháng oxy hóa tổng hợp hiện vẫn còn sử dụng nhiều trong thực phẩm, y học và cuộc sống hằng ngày. Vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, An Giang có hệ thực vật phong phú và đa dạng, được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền (YHCT).[2,5,6,7] Có nhiều cây thuốc được sử dụng trong dân gian để điều trị nhiều bệnh lý liên quan tới gốc tự do như ung thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp…Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có bất kỳ một nghiên cứu quy mô và hệ thống nào về các cây thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa. Do đó, luận án thực hiện với mục tiêu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các cây thuốc An Giang, từ đó lựa chọn các cây thuốc có hoạt tính mạnh làm đối tượng nghiên cứu phân lập và định danh các hoạt chất kháng oxy hóa. Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa được sử dụng trong luận án bao gồm phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và ức chế quá trình peroxide hóa lipid (mô hình in vitro) và mô hình thử nghiệm khả năng bảo vệ gan trên chuột trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo). 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.1.1 Khái niệm về gốc tự do Gốc tự do (free radical) được định nghĩa là những phân tử, nguyên tử, nhóm nguyên tử có chứa một hay nhiều electron tự do (electron độc thân) ở lớp ngoài cùng.[26,33,36] Gốc tự do gồm hai dạng hoạt động chính là: dạng hoạt động của nitrogen (RNS- reactive nitrogen species) (bảng 1.1) và dạng hoạt động của oxygen (ROS- reactive oxygen species) (bảng 1.2). Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitrogen [26] Các dạng hoạt Thời gian Ký hiệu Hoạt động động tồn tại Vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh Nitric oxide NO● 1s trung ương và ngoại biên. Nitrogen dioxide NO2● 1s Hình thành trong quá trình ô nhiễm không khí Acid Được hình thành khi ONOO─ nhận thêm một ONOOH Khá ổn định peroxynitrous proton. Peroxynitrite ONOO─ 10-3 s Hoạt tính cao, hình thành từ NO● và O2●─ Bảng 1.2 Các dạng hoạt động của oxygen [26] Các dạng hoạt Ký Thời gian Hoạt động động hiệu tồn tại Tạo ra trong ty thể (mitochondria), hệ thống tim mạch Superoxide O2●─ 10-6s và các bộ phận khác Gốc hydroxyl Hoạt tính cao, được tạo ra trong tình trạng cơ thể dư HO● 10-9s chất sắt (phản ứng Fenton) Alkoxyl RO● 1s Hoạt tính cao, được hình thành khi các đại phân tử bị Gốc peroxyl ROO● 1s gốc tự do tấn công Hydroperoxide Phản ứng với các ion kim loại chuyển tiếp để tạo ra ROOH Ổn định hữu cơ các dạng hoạt động. Hydrogen Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận một electron H2O2 Bền peroxide để chuyển hóa thành gốc tự do HO● Hoạt tính cao, hình thành trong quá trình quang học Oxygen đơn bội 1 O2 10-6s (photosensitization) và phản ứng hóa học Là một chất gây ô nhiễm trong khí quyển, có thể phản Ozon O3 1s ứng với các phân tử khác nhau để tạo ra 1O2. Các gốc tự do thường kém bền và có năng lượng cao, dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng polymer hóa…. Gốc 2
tự do có hoạt tính cao nên thời gian tồn tại của chúng thường rất ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố: cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp.[83] Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO-, trong đó NO• là gốc tự do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp. Nếu như các dạng hoạt động của nitrogen có ý nghĩa trên lâm sàng thì các dạng hoạt động của oxygen lại là tác nhân nguy hiểm gây ra nhiều bệnh lý.[26,86] Các dạng oxygen hoạt động này có năng lượng cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như protein, lipid, DNA… gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.[26,86] 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể 1.1.2.1. Nguồn nội sinh Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý (quá trình hô hấp ở tế bào), quá trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm), hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy hóa (prooxidant enzyme) và sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể. a) Quá trình hô hấp của tế bào [27,41,101] Quá trình hô hấp ở tế bào là một chuỗi những phản ứng oxy hóa-khử và gốc tự do là các sản phẩm trung gian được sinh ra trong quá trình này. Ví dụ: quá trình khử oxygen tạo nước trong quá trình hô hấp tạo các gốc tự do như O2●-, HO● thông qua những phản ứng như sau: O2 + 4 H+ + 4e  2H2O (1.1) O2 + e  O2●- (1.2) H2O2  O2●- + 2H+ + e (1.3) H2O2 + H+ + e  HO● + H2O (1.4) HO● + H+ + e  H2 O (1.5) 3
Bên cạnh đó, phản ứng phụ giữa các gốc tự do trong quá trình hô hấp cũng sẽ hình thành những gốc tự do mới, độc hại hơn. Một phản ứng phụ đáng chú ý là phản ứng Haber-Weiss (phản ứng 1.6), xảy ra giữa gốc O2●- và H2O2 tạo nên gốc HO● và oxygen đơn bội: O2●- + H2O2  1O 2 + HO● + HO- (1.6) Phản ứng 1.6 sẽ xảy ra nhanh hơn khi được xúc tác bởi các ion kim loại chuyển tiếp như sắt, đồng, coban,… Oxygen đơn bội và gốc hydroxyl hình thành là những gốc tự do có khả năng phản ứng mạnh và rất độc hại. Chúng là nguyên nhân chính gây ra các quá trình peroxide hóa màng lipid. b) Hội chứng viêm nhiễm [27,78] Hội chứng viêm nhiễm là một phản ứng tự vệ của cơ thể sống nhằm chống lại sự tấn công của các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ từ bên ngoài xâm nhập vào cơ thể hoặc sinh ra ngay trong cơ thể. Khi các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính (neutrophil) bao kín để làm nhiệm vụ thực bào. Lúc này, enzyme NADPH oxidase ở màng bạch cầu được hoạt hóa, xúc tác phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên gốc tự do O2●- (phản ứng 1.7), từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm phân hủy các sinh vật lạ. Một phần các gốc tự do bị thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng viêm. NADPH oxidase 2O2 + NADPH 2O2●- + NADP + H+ (1.7) [27,34,86] c) Các enzyme thân oxy hóa Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do như xanthine oxidase (XO), nitric oxide synthase, myeloperoxidase … Gốc O2●- và NO● là hai gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzyme thân oxy hóa này. - Xanthine oxidase là một enzyme quan trọng trong quá trình thoái hóa của các hợp chất purine. XO dùng O2 như một chất chuyển electron trong quá trình phản ứng và kết quả dẫn đến là hình thành gốc O2●-. Điều này được minh họa bằng phản ứng 1.8 như sau: 4