Luận án Tiến sĩ Hóa học: Tổng hợp và đánh giá hiệu quả mang thuốc và tiêu diệt tế bào ung thư của một số hệ nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép các copolymer tương hợp sinh học

Chia sẻ: ViSteveballmer ViSteveballmer | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:181

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tổng hợp và đánh giá các đặc tính của chất mang nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép với các pluronic khác nhau với mục tiêu khảo sát hiệu quả mang thuốc chống ung thư cisplatin và cisplatin hydrate. Từ đó, ứng dụng điều chế hệ nanogel trong dẫn truyền thuốc kết hợp cisplatin hydrate và nanocurcumin nhằm mục đích giảm thể tích khối u ung thư vú trên mô hình chuột (Mus musculus var. Albino) mang khối u ghép dị loài từ người.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Tổng hợp và đánh giá hiệu quả mang thuốc và tiêu diệt tế bào ung thư của một số hệ nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép các copolymer tương hợp sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN NGỌC THỂ TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MANG THUỐC VÀ TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỆ NANOGEL TRÊN CƠ SỞ POLYSACCHARIDE SULFATE (HEPARIN, FUCOIDAN) GHÉP CÁC COPOLYMER TƯƠNG HỢP SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC TP. HỒ CHÍ MINH – 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN NGỌC THỂ TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MANG THUỐC VÀ TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỆ NANOGEL TRÊN CƠ SỞ POLYSACCHARIDE SULFATE (HEPARIN, FUCOIDAN) GHÉP CÁC COPOLYMER TƯƠNG HỢP SINH HỌC Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 9 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS TRẦN NGỌC QUYỂN 2. TS. NGUYỄN THỊ THANH THỦY TP. HỒ CHÍ MINH – 2021
LỜI CAM ĐOAN Công trình được thực hiện tại phòng Hóa dược - Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Trần Ngọc Quyển và TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong luận án này là trung thực, được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả này chưa được dùng cho bất kỳ luận án cùng cấp nào. Nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Thể
LỜI CÁM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Ngọc Quyển và TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy đã định hướng khoa học, giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin gởi đến Thầy và Cô những lời biết ơn chân thành nhất. Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của các anh chị và các em trong Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án. Sau cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận án này.
i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CÁM ƠN MỤC LỤC................................................................................................................ ..i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT................................................vi DANH MỤC CÁC BẢNG..................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.................................................................................. ix MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ MICELLE VÀ NANOGEL ....................................................3 1.1.1. Giới thiệu micelle............................................................................................3 1.1.1.1. Cơ chế hình thành micelle .......................................................................3 1.1.1.2. Ưu điểm và nhược điểm của micelle .......................................................4 1.1.1.3. Sự đóng gói thuốc vào trong micelle .......................................................5 1.1.2. Giới thiệu nanogel...........................................................................................6 1.1.2.1. Sự hình thành nanogel .............................................................................6 1.1.2.2. Ưu điểm và nhược điểm của nanogel ....................................................10 1.1.2.3. Sự đóng gói thuốc vào trong nanogel ....................................................12 1.1.2.4. Phương cách phân phối thuốc của chất mang nano và nangel ..............14 1.1.2.5. Sự giải phóng thuốc của nanogel ...........................................................16 1.2. POLYSACCHARIDE SULFATE ....................................................................19 1.2.1. Heparin..........................................................................................................19 1.2.2. Fucoidan.........................................................................................................20 1.3. PLURONIC ......................................................................................................22 1.3.1. Cấu tạo...........................................................................................................22 1.3.2. Tính chất........................................................................................................23 1.3.3. Ứng dụng.......................................................................................................23 1.4. UNG THƯ VÀ THUỐC CHỐNG UNG THƯCISPLATIN .............................24 1.4.1. Tổng quan về bệnh ung thư...........................................................................24 1.4.2. Cisplatin.........................................................................................................25
ii 1.5. CURCUMIN .....................................................................................................26 1.6. NHỮNG NGHIÊN CỨU TRƯỚC ĐÂY ..........................................................27 1.6.1. Nghiên cứu kết hợp thuốc chống ung thư cisplatin và chất mang nano.......29 1.6.2. Nghiên cứu kết hợp curcumin với thuốc chống ung thư cisplatin................32 CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU ...................................................................................33 2.1. HÓA CHẤT ......................................................................................................33 2.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ .................................................................................34 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................................35 2.3.1. Phương pháp tổng hợp các copolymer ghép trên cơ sở polysacchride sulfate (heparin, fucoidan) liên hợp pluronic........................................................................35 2.3.2. Phương pháp đánh giá cấu trúc, hình thái các copolymer ghép....................35 2.3.3. Phương pháp tổng hợp hệ nanogel mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate36 2.3.4. Phương pháp khảo sát khả năng nhả thuốc của các hệ nanogel mang thuốc36 2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tính tế bào (dòng tế bào MCF-7 và tế bào thường)37 2.3.6. Thí nghiệm trên động vật..............................................................................38 2.3.6.1. Phương pháp ghép tế bào MCF-7 tạo mô hình chuột mang khối u .......38 2.3.6.2. Phương pháp tính thể tích khối u ...........................................................39 2.3.6.3. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch bằng kháng thể SOD2............39 2.3.6.4. Phương pháp nhuộm Hemaoxylin - Eosin (H&E) ................................40 2.4. THỰC NGHIỆM ..............................................................................................40 2.4.1. Tổng hợp và khảo sát nanogel Hep-P123......................................................40 2.4.1.1. Tổng hợp Hep-P123...............................................................................40 2.4.1.2. Tổng hợp nanogel Hep-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate ...............................................................................................................................43 2.4.1.3. Khảo sát khả năng nhả thuốc cisplatin hydrate của Hep-P123..............46 2.4.1.4. Đánh giá độc tính tế bào (dòng tế bào MCF-7 và tế bào thường ..........46 2.4.2. Tổng hợp và khảo sát nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68.................46 2.4.2.1. Tổng hợp Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 ..........................................46 2.4.2.2. Tổng hợp nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate ...............................................................................................47 2.4.3. Tổng hợp và khảo sát nanogel Fud-P123 .....................................................47
iii 2.4.3.1. Tổng hợp Fud-P123 ...............................................................................47 2.4.3.2. Tổng hợp nanogel Fud-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate ...............................................................................................................................49 2.4.3.3. Khảo sát khả năng nhả thuốc cisplatin hydrate của Fud-P123 ..............50 2.4.3.4. Đánh giá độc tính tế bào (dòng tế bào MCF-7 và tế bào thường) .........50 2.4.4. Ứng dụng tổng hợp và đánh giá nanogel Hep-F127 mang thuốc cisplatin hydrate kết hợp nanocurcumin (Hep-F127-CisOH-Cur) lên chuột mang khối u......50 2.4.4.1. Tổng hợp Hep-F127-CisOH-Cur ...........................................................50 2.4.4.2. Đánh giá cấu trúc, hình thái Hep-F127-CisOH-Cur ..............................52 2.4.4.3. Đánh giá độc tính dòng tế bào MCF-7 ..................................................52 2.4.4.4. Khảo sát khả năng nhả thuốc của Hep-F127-CisOH-Cur .....................52 2.4.4.5. Quy trình tạo mô hình chuột suy giảm miễn dịch và ghép khối u dị loài ...............................................................................................................................52 2.4.4.6. Quy trình thử nghiệm thuốc ...................................................................53 2.4.4.7. Quy trình đánh giá hiệu quả của thuốc ..................................................55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................................................56 3.1. KẾT QUẢ TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT NANOGEL HEP-P123 ...................56 3.1.1. Kết quả xác định thành phần, cấu trúc các copolymer Hep-P123.................56 3.1.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC- P123-NPC và NPC-P123-Ami .............................................................................56 3.1.1.2. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian Hep- DAB ......................................................................................................................60 3.1.1.3. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm Hep-P123 ....62 3.1.1.4. Kết quả phân tích TGA của Hep-P123 ..................................................65 3.1.1.5. Kết quả phân tích giá trị CMC của Hep-P123 .......................................66 3.1.1.6. Kết quả phân tích TEM và DLS của Hep-P123 ....................................68 3.1.2. Kết quả tổng hợp nanogel Hep-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate.......................................................................................................................70 3.1.2.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH 70 3.1.2.2. Kết quả phân tích ICP-OES của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH ..73 3.1.3. Kết quả đánh giá khả năng nhả thuốc của Hep-P123....................................74
iv 3.1.4. Kết quả độc tính tế bào (trên dòng tế bào MCF-7 và nguyên bào sợi) .........77 3.2. KẾT QUẢ TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT NANOGEL HEP-F127, HEP-F87 VÀ HEP-F68 ....................................................................................................................78 3.2.1. Kết quả xác định thành phần, cấu trúc các copolymer Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68....................................................................................................................78 3.2.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC- F127-NPC, NPC-F127-Ami, NPC-F87-NPC, NPC-F87-Ami, NPC-F68-NPC, NPC-F68-Ami .......................................................................................................78 3.2.1.2. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 ................................................................................................................80 3.2.1.3. Kết quả phân tích TGA của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68..............81 3.2.1.4. Kết quả phân tích giá trị CMC của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 ..82 3.2.1.5. Kết quả phân tích TEM của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 .............84 3.2.2. Kết quả tổng hợp nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate......................................................................................86 3.2.2.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-F127-Cis, Hep-F127-CisOH, Hep- F87-Cis, Hep-F87-CisOH và Hep-F68-Cis, Hep-F68-CisOH .............................86 3.2.2.2. Kết quả phân tích ICP-OES của Hep-F127-Cis, Hep-F127-CisOH, Hep- F87-Cis, Hep-F87-CisOH và Hep-F68-Cis, Hep-F68-CisOH .............................87 3.3. SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC NANOGEL HEP-P123, HEP-F127, HEP-F87 VÀ HEP-F68 MANG CISPLATIN VÀ CISPLATIN HYDRATE ...........89 3.4. KẾT QUẢ TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT NANOGEL FUD-P123 ..................91 3.4.1. Kết quả xác định thành phần, cấu trúc copolymer Fud-P123.......................92 3.4.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian Fud- DAB ......................................................................................................................92 3.4.1.2. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của Fud-P123 .....................94 3.4.1.3. Kết quả phân tích TGA của Fud-P123 ..................................................97 3.4.1.4. Kết quả phân tích giá trị CMC của Fud-P123 .......................................98 3.4.1.5. Kết quả phân tích TEM và DLS của Fud-P123 .....................................99 3.4.2. Kết quả tổng hợp nanogel Fud-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate.....................................................................................................................100
v 3.4.2.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH .............................................................................................................................100 3.4.2.2. Kết quả phân tích ICP-OES của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH .102 3.4.3. Kết quả quả đánh giá khả năng nhả thuốc của Fud-P123............................102 3.4.4. Kết quả độc tính tế bào (trên dòng tế bào MCF-7 và nguyên bào sợi) .......103 3.5. SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CỦA NANOGEL HEP-P123 VÀ FUD- P123 MANG CISPLATIN VÀ CISPLATIN HYDRATE ......................................104 3.6. KẾT QUẢ TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ NANOGEL HEP-F127 HEP-F127 MANG THUỐC CISPLATIN HYDRATE KẾT HỢP NANOCURCUMIN (HEP- F127-CISOH-CUR) LÊN CHUỘT MANG KHỐI U .............................................106 3.6.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-F127-CisOH-Cur...........................107 3.6.2. Kết quả phân tích TEM của Hep-F127-CisOH-Cur....................................108 3.6.3. Kết quả phân tích ICP-OES và UV-Vis của Hep-F127-CisOH-Cur...........109 3.6.4. Kết quả khảo sát khả năng nhả thuốc của Hep-F127-CisOH-Cur..............109 3.6.5. Kết quả độc tế bào trên dòng tế bào MCF-7 của Hep-F127 và Hep-F127- CisOH-Cur bằng phương pháp nhuộm SRB............................................................110 3.6.6. Kết quả thử nghiệm nanogel Hep-F127-CisOH-Cur lên mô hình chuột mang khối u ......................................................................................................................112 3.6.6.1. Kết quả tạo mô hình chuột mang khối u ..............................................112 3.6.6.2. Kết quả đánh giá kích thước khối u chuột trong thời gian điều trị ......113 3.6.6.3. Kết quả nhuộm mô khối u đánh giá hiệu quả điều trị..........................116 KẾT LUẬN .............................................................................................................119 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................121 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ...............................................122 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................123 PHỤ LỤC ................................................................................................................140
vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Ý nghĩa Hep Heparin Plu Pluronic Fud Fucoidan Cur Curcumin Plu Pluronic Cis Cisplatin CisOH Cisplatin dạng hydrate NPC p-nitrophenyl chloroformate EDC 1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide NHS N-hydroxysuccinimide DAB 1,4-diaminobutane Ami 3-amino-1-propanol Da Dalton DLS Dynamic Light Scattering: máy đo phân tán động học laser Transmission Electron Microscopy: Kính hiển vi điện tử truyền TEM qua Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng 1 H-NMR hưởng từ hạt nhân TGA Thermogravimetric Analyzer: Phân tích nhiệt trọng lượng Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry: ICP-OES quang phổ plasma phát xạ nguyên tử FT-IR Fourier Transform Infrared spectroscopy IU international unit Low Molecular Weight Heparin: Heparin khối lượng phân tử LMWH thấp EPR Enhanced Permeability and Retention Effect poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene PEO-PPO-PEO oxide)
vii PEG Polyethylene glycol CMC Critical Micelle Concentration HLB Hydrophilic-lipophilic balance: Cân bằng ưa nước - ưa béo FDA Food and Drug Administration SRB Sulforhodamine B colorimetric assay PBS Phosphate buffered saline DI Deionized MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 MWCO Molecular weight cut-off
viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần của fucoidan ở các loài rong nâu .......................................... 21 Bảng 1.2. Thông số đặc trưng của một số pluronic .................................................. 24 Bảng 2.1. Danh mục hóa chất ................................................................................... 33 Bảng 2.2. Số liệu tổng hợp Hep-DAB theo 4 tỉ lệ mol khác nhau ............................ 42 Bảng 2.3. Số liệu tổng hợp Hep-P123 theo 4 tỉ lệ mol khác nhau ............................ 43 Bảng 2.4. Số liệu Cis, AgNO3 dùng để tổng hợp Hep-P123 mang thuốc................. 45 Bảng 2.5. Số liệu tổng hợp NPC-F127-NPC, NPC-F87-NPC, NPC-F68-NPC ....... 47 Bảng 3.1. Kết quả phổ FT-IR của P123, NPC-P123-NPC, NPC-P123-Ami............ 57 Bảng 3.2. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami ............. 59 Bảng 3.3. Kết quả phổ FT-IR của NPC-P123-Ami, Hep-DAB và Hep-P123 .......... 63 Bảng 3.4. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-P123-Ami, Hep-DAB và Hep-P123 ..... 65 Bảng 3.5. Kích thước của nanogel Hep-P123 bởi TEM và DLS .............................. 68 Bảng 3.6. Kết quả FT-IR của heparin, Hep-P123, Hep-P123-Cis, Hep-P123- CisOH ........................................................................................................................ 72 Bảng 3.7. Phần Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%) ......................... 77 Bảng 3.8. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F127-Ami, Hep-DAB và Hep-F127. .... 80 Bảng 3.9. Phần trăm khối lượng pluronic được ghép vào heparin ........................... 82 Bảng 3.10. Kích thước của các nanogel Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68 .................. 85 Bảng 3.11. Kết quả phân tích các hệ nanogel mang thuốc trên cơ sở heparin liên hợp pluronic P123, F127, F87 và F68 .............................................................................. 89 Bảng 3.12. Kết quả phổ FT-IR của NPC-P123-Ami, Fud-DAB, Fud-DAB ............ 95 Bảng 3.13. Kết quả phân tích 1H-NMR của NPC-P123-Ami, Fud-DAB, Fud- P123 ........................................................................................................................... 97 Bảng 3.14. Kết quả phổ FT-IR của Fud-P123; Fud-P123-Cis; Fud-P123-CisOH . 101 Bảng 3.15. Hiệu quả mang thuốc Cis và CisOH của hệ nano Fud-P123 ................ 102 Bảng 3.16. Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%) .............................. 103 Bảng 3.17. Kết quả phân tích hệ nanogel Hep-P123 và Fud-P123 mang thuốc ..... 105 Bảng 3.18. Phần trăm ức chế MCF-7 của nanogel Hep-F127 ................................ 111
ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc micelle ......................................................................................... 3 Hình 1.2. Các cấu trúc micelle polymer ...................................................................... 4 Hình 1.3. Sự kém ổn định của micelle do tương tác với protein huyết thanh. A. Phóng thích thuốc; B. Hấp phụ protein; C. Thâm nhập protein ................................. 4 Hình 1.4. Các phương pháp tổng hợp nanogel ........................................................... 7 Hình 1.5. Tương tác kỵ nước ...................................................................................... 8 Hình 1.6. Tương tác ion .............................................................................................. 8 Hình 1.7. Sự hình thành nanogel từ polymer lưỡng tính ............................................ 9 Hình 1.8. Sự hình thành nanogel từ các polymer qua tương tác tĩnh điện.................. 9 Hình 1.9. Sự giải phóng thuốc từ nanogel ................................................................ 11 Hình 1.10. Các tương tác liên phân tử thúc đẩy tiến trình tự lắp ráp gồm tương tác tĩnh điện và tương tác kỵ nước .................................................................................. 14 Hình 1.11. Sự hướng đích thụ động theo cơ chế EPR .............................................. 15 Hình 1.12. Quá trình giải phóng thuốc do sự thủy phân liên kết cholesteryl vinyl ete ở pH 4,0 của nanogel acL-CHP ................................................................................ 17 Hình 1.13. Mô hình giải phóng thuốc của nanogel Gal-CS-g-PNIPAm .................. 17 Hình 1.14. Sự thay đổi cấu dạng của polymer PNIPAM theo LCST (32oC) trong nước (nhiệt độ dưới 32oC polymer ở dạng trương nở, khi nhiệt độ lớn hơn 32oC polymer NIPAM trở nên kỵ nước và co lại) ............................................................. 18 Hình 1.15. Cấu tạo heparin ....................................................................................... 19 Hình 1.16. Cấu trúc pluronic ..................................................................................... 22 Hình 1.17. Các chất phức hợp chứa platin: (A)-cisplatin; (B)-carboplatin; (C)- oxaliplatin; (D)-ormaplatin; (E)-enloplatin ............................................................... 25 Hình 1.18. Cấu trúc curcumin ................................................................................... 27 Hình 1.19. Phức giữa cisplatin hydrate và carboxylate PAMAM G3.5 ................... 29 Hình 2.1. Tiêm tế bào MCF-7 trên lưng chuột đã suy giảm miễn dịch .................... 38 Hình 2.2. Hoạt hóa pluronic bằng NPC .................................................................... 41 Hình 2.3. Khóa một đầu sản phẩm hoạt hóa pluronic với Ami ................................ 41 Hình 2.4. Biến tính heparin với DAB ....................................................................... 42
x Hình 2.5. Tổng hợp copolymer ghép Heparin-Pluronic ........................................... 43 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình đưa CisOH vào Hep-P123 ............................................... 44 Hình 2.7. Tổng hợp Fud-DAB .................................................................................. 48 Hình 2.8. Tổng hợp copolymer ghép Fud-P123 ....................................................... 49 Hình 2.9. Nanogel Hep-F127 mang cisplatin hydrate kết hợp curcumin ................. 51 Hình 2.10. Mô hình thử thuốc trên chuột .................................................................. 54 Hình 2.11. Khối u được thu nhận sau khi kết thúc thí nghiệm ................................. 55 Hình 3.1. Phổ FT-IR của P123, NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami...................... 56 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC ........................................................... 58 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-Ami ........................................................... 59 Hình 3.4. Phổ FT-IR của heparin và Hep-DAB ........................................................ 60 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của Hep-DAB ..................................................................... 61 Hình 3.6. Phổ FT-IR của Hep-DAB, NPC-P123-Ami và Hep-P123........................ 62 Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của Hep-P123 ..................................................................... 64 Hình 3.8. Kết quả TGA của P123, heparin và các copolymer ghép Hep-P123 ........ 65 Hình 3.9. Kết quả đo CMC của các copolymer ghép Hep-P123 .............................. 67 Hình 3.10. Kết quả TEM của pluronic P123............................................................. 69 Hình 3.11. Kết quả TEM và DLS của (a): P123; (b): Hep-P123 (1:3); (c): Hep-P123 (1:7); (d): Hep-P123 (1:10); (e): Hep-P123 (1:14) ................................................... 70 Hình 3.12. Sự hình thành phức Hep-P123-CisOH và nanogel của nó...................... 71 Hình 3.13. Phổ FT-IR của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH .............................. 72 Hình 3.14. Hiệu quả mang thuốc của hệ chất mang Hep-P123 ................................ 73 Hình 3.15. Sự giải phóng CisOH từ nanogel platinum ở pH 5,5 và 7,4 ................... 75 Hình 3.16. Độc tính tế bào MCF-7 của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH .......... 77 Hình 3.17. Kết quả TGA của F127, F87, F68, heparin và copolymer ghép ............. 81 Hình 3.18. Kết quả đo CMC của các pluronic F127, F87 và F68 ............................ 83 Hình 3.19. Kết quả CMC các copolymer Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68 ................ 84 Hình 3.20. Hình thái và kích thước của các nanogel bởi TEM................................. 85 Hình 3.21. Phổ FT-IR của Hep-F127, Hep-F127-Cis, Hep-F127-CisOH ................ 87 Hình 3.22. Hiệu quả mang Cis và CisOH của các hệ chất mang Hep-Plu ............... 88 Hình 3.23. Phổ FT-IR của fucoidan và Fud-DAB .................................................... 92
xi Hình 3.24. Phổ 1H-NMR của Fud-DAB ................................................................... 93 Hình 3.25. Phổ FT-IR của Fud-DAB, NPC-P123-Ami và Fud-P123 ...................... 94 Hình 3.26. Phổ 1H-NMR của Fud-P123 ................................................................... 96 Hình 3.27. Kết quả TGA của P123, fucoidan và Fud-P123 ..................................... 97 Hình 3.28. Kết quả CMC của Fud-P123 ................................................................... 98 Hình 3.29. Kết quả TEM và DLS của Fud-P123 ...................................................... 99 Hình 3.30. Phổ FT-IR của Fud-P123, Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH............ 100 Hình 3.31. Sự giải phóng CisOH từ nanogel Fud-P123 ở pH 5,5 và 7,4................ 102 Hình 3.32. Độc tính tế bào MCF-7 của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH ......... 104 Hình 3.33. Phổ FT-IR của Hep-F127, Hep-F127-CisOH, Hep-F127-CisOH-Cur . 107 Hình 3.34. Kết quả đo TEM của Hep-F127 (a) và Hep-F127-CisOH-Cur (b) ....... 108 Hình 3.35. Kết quả nhả thuốc CisOH và Cur của Hep-F127-CisOH-Cur .............. 110 Hình 3.36. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của Hep-F127-CisOH, Hep-F127-Cur và Hep-F127-CisOH-Cur ............................................................................................. 111 Hình 3.37. Chuột mang khối u ................................................................................ 112 Hình 3.38. Hình thái tế bào trong mô khối u cắt lát được nhuộm hóa mô miễn dịch bằng kháng thể SOD2 ............................................................................................. 113 Hình 3.39. Khối lượng chuột theo quá trình thử nghiệm ........................................ 114 Hình 3.40. Sự thay đổi thể tích khối u theo thời gian ............................................. 115 Hình 3.41. Kết quả phân tích mô học H&E mô các khối u sau thời gian điều trị: Hep-F127 (a), NaCl (b), nanogel Hep-F127-CisOH (c) và Hep-F127-CisOH-Cur (d) ............................................................................................................................ 117
1 MỞ ĐẦU Cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum (II)) là hợp chất bạch kim đầu tiên được FDA phê chuẩn đưa vào điều trị ung thư tinh hoàn và ung thư buồng trứng vào năm 1978 [1-2]. Đây là một trong những thuốc chống ung thư chủ lực được sử dụng rộng rãi và hiệu quả để điều trị nhiều loại khối u rắn. Tuy nhiên, nghiên cứu tác dụng lâm sàng của cisplatin về sau bị hạn chế bởi tính chọn lọc kém của thuốc giữa mô bình thường và mô khối u. Đồng thời, độc tính của thuốc cũng đã gây ra nhiều tác dụng phụ trên thận, suy tủy, nhiễm độc thần kinh mãn tính,… từ đó dẫn đến tình trạng kháng thuốc và hạn chế liều lượng trong quá trình điều trị [2-4]. Vì vậy, để khắc phục những hạn chế trên, các chất mang thuốc dạng hạt nano đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước phát triển mạnh mẽ, trên cơ sở làm tăng sự tích tụ thuốc tại tế bào ung thư và từ đó giảm được các tác dụng phụ bất lợi của thuốc. Nanogel là hệ chất mang nanopolymer đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Nanogel có nhiều đặc điểm nổi bật hơn so với các hệ chất mang nano khác như: có hình dạng và kích thước nano linh hoạt, có khả năng đáp ứng đồng thời với nhiều kích thích từ môi trường ngoài như nhiệt độ, pH, cường độ ion, góp phần tăng cường hiệu quả trong việc giải phóng thuốc có kiểm soát [5-7]. Một số nanogel từ poly(lactide-co-glycolide)-polyethylene glycol, alginate, heparin- polyethyleneimine đã được phát triển cho vận chuyển cisplatin. Các chất mang nanogel này đã cho thấy khả năng mang thuốc tốt và có hiệu quả cao trong tiêu diệt nhiều dòng tế bào ung thư [8-10]. Do đó, hướng nghiên cứu điều chế các chất mang nanogel nhằm tạo ra sự tương thích sinh học cao của chất mang, giảm độc tính của thuốc, góp phần nâng cao hiệu quả mang thuốc và điều trị sẽ có nhiều ý nghĩa khoa học và ứng dụng. Ngoài ra, việc sử dụng cisplatin dạng hydrate tạo phức với chất mang cũng có thể làm tăng khả năng mang thuốc và tiêu diệt hiệu quả tế bào ung thư. Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Tổng hợp và đánh giá hiệu quả mang thuốc và tiêu diệt tế bào ung thư của một số hệ nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép các copolymer tương hợp sinh học”.
2 Mục tiêu của luận án: Tổng hợp và đánh giá các đặc tính của chất mang nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép với các pluronic khác nhau với mục tiêu khảo sát hiệu quả mang thuốc chống ung thư cisplatin và cisplatin hydrate. Từ đó, ứng dụng điều chế hệ nanogel trong dẫn truyền thuốc kết hợp cisplatin hydrate và nanocurcumin nhằm mục đích giảm thể tích khối u ung thư vú trên mô hình chuột (Mus musculus var. Albino) mang khối u ghép dị loài từ người. Để đạt được những mục tiêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau: 1. Tổng hợp và đánh giá cấu trúc, hình thái các nanogel trên cơ sở heparin liên hợp pluronic P123, F127, F68 và F87 với các tỉ lệ ghép khác nhau. 2. Tổng hợp và khảo sát hiệu quả mang thuốc cisplatin và cisplatin dạng hydrat của các nanogel tổng hợp được. 3. Khảo sát khả năng nhả thuốc cũng như hiệu quả tiêu diệt dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ nanogel Hep-P123 mang thuốc. 4. Tổng hợp và đánh giá cấu trúc, hình thái của nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate fucoidan liên hợp pluronic P123. 5. Khảo sát khả năng nhả thuốc cũng như hiệu quả tiêu diệt dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ nanogel Fud-P123 mang thuốc. 6. Tổng hợp và khảo sát khả năng nhả thuốc cũng như hiệu quả tiêu diệt dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ nanogel Hep-F127 mang thuốc kết hợp cisplatin hydrate và nanocurcumin. 7. Đánh giá hiệu quả tiêu giảm thể tích khối u ung thư vú trên mô hình chuột mang khối u ghép dị loài từ người của hệ nanogel mang thuốc kết hợp. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: Đề tài có giá trị trong việc nghiên cứu các hệ chất mang nano mới mang thuốc chống ung thư kém tan trong nước. Và cho đến nay chưa có công bố nào dùng nanogel từ heparin để mang cisplatin dạng hydrate kết hợp với nanocurcumin và cũng chưa có bất kỳ công bố nào về nanogel từ fucoidan. Kết quả của đề tài đã được ứng dụng thử nghiệm trên mô hình chuột mang khối u ghép dị loài sẽ làm nền tảng ứng dụng cho các nghiên cứu sâu hơn trong lâm sàng.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về micelle và nanogel 1.1.1. Giới thiệu micelle 1.1.1.1. Cơ chế hình thành micelle Micelle được hình thành từ sự tự lắp ráp của các đơn vị lưỡng tính, bằng cách kết hợp các phần kỵ nước hình thành lõi trung tâm và định vị các đầu cực ưa nước của chúng với môi trường nước xung quanh tạo thành phần vỏ. Lớp vỏ ngoài của micelle có thể giúp tăng độ hòa tan và khả năng tương thích sinh học cho hệ thống, trong khi lõi bên trong có thể được sử dụng để chứa các thuốc kỵ nước [11-12]. Hình 1.1. Cấu trúc micelle [12] Sự tương tác giữa các nhóm ưa nước và môi trường nước xung quanh, dẫn đến sự tách biệt giữa phần ưa nước và kỵ nước, điều này làm cho các micelle có cấu trúc xốp hơn. Vì thế các micelle được sử dụng như là mô hình cho các ứng dụng sinh học và hệ phân phối thuốc. Kích thước các micelle dao động từ 5-100 nm, tùy thuộc vào loại nhóm ưa nước và chiều dài chuỗi kỵ nước tự lắp ráp thánh cấu trúc với nhiều hình thái khác nhau như: hình cầu, hình tấm, hình trụ, hình túi đơn lớp, … Gần đây, micelle được nghiên cứu rộng rãi bằng cách sử dụng các copolymer lưỡng tính di-block (hydrophilic-hydrophobic), tri-block (hydrophilic-hydrophobic- hydrophilic) hoặc các copolymer ghép để hình thành các micelle polymer tự lắp ráp giúp phân phối thuốc tốt hơn. Các copolymer ghép lưỡng tính tự lắp ráp thành các micelle với cấu trúc vỏ - lõi hình cầu, có đường kính khoảng 10 - 80 nm, bao gồm một lõi kỵ nước để nạp thuốc và phần vỏ ưa nước hoạt động như một rào cản vật lý ngăn chặn gắn kết với protein, và sự oposin hóa trong quá trình tiêm tĩnh mạch [12].
4 Hình 1.2. Các cấu trúc micelle polymer [12] 1.1.1.2. Ưu điểm và nhược điểm của micelle a. Ưu điểm của micelle Micelle có cấu trúc lõi - vỏ, có thể giữ được các thuốc kỵ nước trong phần lõi kỵ nước, giúp tăng độ hòa tan của thuốc lên gấp 10 - 500 lần và kéo dài thời gian lưu thông của thuốc trong máu. Hầu hết các micelle ít độc hại và dễ dàng được đào thải qua thận. b. Nhược điểm của micelle Hiệu quả mang thuốc của micelle khá thấp, do phần lớn các micelle thông thường dựa trên tương tác kỵ nước để mang các thuốc kém tan. Để tối ưu hóa hàm lượng thuốc trong micelle, ngoài tương tác kỵ nước cần nghiên cứu phát triển tổng hợp các micelle dựa trên cơ sở tương tác giữa polymer và thuốc như liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, …. [13]. Hình 1.3. Sự kém ổn định của micelle do tương tác với protein huyết thanh. A. Phóng thích thuốc; B. Hấp phụ protein; C. Thâm nhập protein [13]
5 Micelle kém ổn định trong môi trường sinh học, phần lớn các micelle được hình thành từ sự lắp ráp vật lý các polymer. Nồng độ của micelle bị giảm bởi sự pha loãng trong dòng máu, các micelle dễ phân rã thành các unimer, dẫn đến sự giải phóng thuốc không kiểm soát và giảm thời gian bán thải của thuốc. Savic cùng cộng sự cho thấy micelle của poly(caprolactone)-b-poly(ethylene oxide) không ổn định trong môi trường nuôi cấy chứa huyết thanh có hoặc không có tế bào [14]. Hơn nữa, các micelle polymer thông thường dễ tương tác với các thành phần có trong máu như protein, tế bào, ... sự hình thành phức giữa PEG và protein có thể gây ra sự kết tụ micelle hoặc phân rã micelle thành các unimer, từ đó ảnh hưởng đáng kể đến sự ổn định của micelle trong in vivo [15]. Do đó, việc cải thiện sự ổn định của micelle trong máu là mục tiêu hàng đầu để tăng hiệu quả điều trị. Sự tương tác giữa micelle và tế bào vẫn chưa được làm rõ, một số nghiên cứu cho thấy cả tương tác tĩnh điện và kỵ nước đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển thuốc qua trung gian micelle vào các tế bào. Việc gắn thêm các phần tử hướng đích trên bề mặt micelle như: biotin, folate, antibodies, growth factors,… hoặc kết hợp với các yếu tố nhạy cảm kích thích là một trong những giải pháp có thể làm tăng sự hấp thu tế bào của micelle [16]. 1.1.1.3. Sự đóng gói thuốc vào trong micelle Thuốc có thể được đóng gói vào trong micelle trên cơ sở các tương tác vật lý hoặc liên kết hóa học. Thuốc được đóng gói bởi sự liên hợp hóa học sẽ được giải phóng khỏi micelle bởi sự suy thoái phần lớn khối lượng của polymer, trong khi thuốc được đóng gói bằng tương tác vật lý sẽ được giải phóng bằng cách khuếch tán [12]. Một số phương pháp được sử dụng rộng rãi để đóng gói thuốc vào bên trong các micelle gồm: kỹ thuật nhũ tương dầu trong nước (O/W); kỹ thuật nhũ tương nước trong dầu (W/O/W); thẩm tách; bay hơi đồng dung môi; và đông khô. Trong số các phương pháp nêu trên, kỹ thuật nhũ tương dầu trong nước (O/W), thẩm tách và bay hơi đồng dung môi phù hợp cho việc đóng gói các thuốc kỵ nước, trong khi kỹ thuật nhũ tương nước trong dầu (W/O/W) thường được ưu tiên cho việc đóng gói các hợp chất ưa nước. Nhờ vào tính chất đặc trưng của micelle là có kích thước nhỏ, giúp chúng dễ xâm nhập vào mạch máu của khối u một cách hiệu quả, do đó chúng được sử dụng