Luận án Tiến sĩ Hóa học: Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất mới của Artemisinin

Chia sẻ: Hương Hoa Cỏ Mới | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:134

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là nghiên cứu tổng hợp các dãy hợp chất mới chứa khung artemisinin; Đánh giá hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất mới của Artemisinin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ TUẤN KIÊN TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ARTEMISININ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ TUẤN KIÊN TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ARTEMISININ Ngành: Hóa học Mã số: 9440112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS TRẦN KHẮC VŨ 2. PGS.TS VŨ ĐÌNH HOÀNG Hà Nội – 2022
LỜI CAM ĐOAN Tác giả cam đoan rằng: Luận án tiến sĩ “Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất mới của Artemisinin” là công trình nghiên cứu được hoàn thành dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Khắc Vũ và PGS.TS. Vũ Đình Hoàng- Bộ môn công nghệ Hóa dược và BVTV -Viện kỹ thuật hóa học - trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Các kết quả trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tác giả luận án Vũ Tuấn Kiên Vũ Tuấn Kiên i
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Trần Khắc Vũ , PGS.TS.Vũ Đình Hoàng đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án này tại bộ môn Hóa dược – Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Hóa Dược và Hóa chất bảo vệ thực vật, các thầy cô giáo trong trường, và ban lãnh đạo viện Kỹ thuật Hóa học, đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cùng các thầy cô ở trường đã tạo điều kiện về thời gian và hỗ trợ khác giúp tôi thực hiện luận án. Cuối cùng tôi muốn cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã cổ vũ động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Vũ Tuấn Kiên ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ................................................................. v DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ................................................................................. viii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ..................................................................................... viii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỒNG QUAN .................................................................................... 2 1.1. Giới thiệu về cây thanh hao hoa vàng và artemisinin ......................................... 2 1.1.1. Vài nét về cây thanh hao hoa vàng ................................................................... 2 1.1.2. Vài nét về artemisinin ....................................................................................... 3 1.2. Sinh tổng hợp artemisinin.................................................................................... 7 1.3. Ung thư và hoạt tính kháng ung thư của artemisinin .......................................... 8 1.3.1. Khái niệm ung thư ............................................................................................ 8 1.3.2. Artemisinin trong điều trị ung thư .................................................................... 9 1.3.3. Cơ chế tác dụng của artemisinin..................................................................... 12 1.3.4. Vai trò của sắt liên quan đến cơ chế kháng u của artemisinin ....................... 12 1.3.5. Artemisinin và sự kháng thuốc ....................................................................... 14 1.4. Một số dẫn xuất của artemisinin có hoạt tính kháng ung thư............................ 14 1.4.1. Dẫn xuất acetal của artemisinin ...................................................................... 14 1.4.2. Dẫn xuất non-acetal của artemisinin .............................................................. 17 1.5. Dẫn xuất dimer của artemisnin .......................................................................... 24 1.6. Dẫn xuất 11-aza-artemisinin.............................................................................. 26 1.7. Histone deaceylase ............................................................................................ 27 1.7.1. Histon acetyltransferase (HAT) ...................................................................... 27 1.7.2. Histon deacetylase (HDAC) ........................................................................... 27 1.7.3. Cấu trúc của enzyme HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa ..................... 28 1.7.4. Mối liên hệ giữa ung thư và HDAC ............................................................... 29 iii
1.8. Chất ức chế enzym histone deacetylase (HDACi) ............................................ 29 1.8.1. Định nghĩa HDACi ......................................................................................... 29 1.8.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC .................................................. 31 CHƯƠNG 2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 33 2.1. Thiết bị, dụng cụ dùng trong tổng hợp .............................................................. 33 2.2. Hóa chất dùng trong thực nghiệm ..................................................................... 33 2.3. Các phương pháp sử dụng trong tổng hợp và tinh chế sản phẩm ..................... 35 2.4. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc sản phẩm .............................................. 35 2.5. Các phương pháp tổng hợp................................................................................ 35 2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học.......................................................... 35 2.6.1. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) .................. 35 2.6.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme histone deacetylases (HDAC) trên dòng tế bào MCF7 ............................................................................................. 37 2.7. Phương pháp mô hình docking .......................................................................... 38 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ............................................................................. 39 3.1. Tổng hợp các dẫn xuất triazole của artemisinin ................................................ 39 3.2. Tổng hợp các dẫn xuất dime artemisinin .......................................................... 62 3.2.1. Tổng hợp chất trung gian 10β-aminoartemisinin (64) ................................... 62 3.2.2. Quy trình chung tổng hợp chất 65a-e ............................................................. 63 3.2.3. Tổng hợp chất 65f, g....................................................................................... 67 3.4. Tổng hợp các dẫn xuất artemisinin chứa nhóm axit hydroxamic (67a-g) ......... 74 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 81 4.1. Tổng hợp các dẫn xuất triazole artemisinin 61a-l, 62a-l sử dụng phản ứng Click ......................................................................................................................... 81 4.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất triazole artemisinin ......... 86 4.3. Tổng hợp các hợp chất dime artemisinin 66a-g ................................................ 88 4.4. Hoạt tính gây độc tế bào của các dimer artemisinin 66a-g và 65a-g ................ 96 4.5. Tổng hợp các dẫn xuất mới artemisinin chứa nhóm hydroxamic 76a-g ........... 98 4.6. Hoạt tính ức chế HDAC và độc tế bào của các 67a-g ..................................... 103 KẾT LUẬN ........................................................................................................... 107 iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon 13 Nuclear C-NMR Magnetic Resonance spectroscopy) 1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance H-NMR spectroscopy) CH2Cl2 diclomethane CS Khả năng sống sót của tế bào tính theo % d doublet dd double doublet DMAP Dimethyl aminoprydin DMSO-d6 Dimethylsulfoxid deutri hóa EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol HAT Histon acetyltransferase HDAC Histon deacetylase HRMS Phổ khối phân giải cao IC50 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển IDC Carbonyl diimidazol J hằng số tương tác spin-spin m multiplet MeOH methanol MS Phổ khối lượng q quartet RT Nhiệt độ phòng s singlet SAHA Suberoylanilid hydroxamic acid t triplet TLC Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography) TSA Trichostatin A v
UV Ultraviolet δ độ dịch chuyển hóa học δ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học (tính theo phần triệu) EDC ethylene dichloride DHA dihydroartemisinin TMSOTf Trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate TPAP Tetrapropylammonium perruthenate DCM Dichloromethan TEA Triethanolamine µM Micromolar vi
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Hiệu suất các chất triazole 61a – i và 62a – i .............................................. 84 Bảng 2. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro các dẫn xuất triazole ............................... 87 Bảng 3. Cấu trúc và hiệu suất các hợp chất 66a-g.................................................... 96 Bảng 4. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dimer artemisinin 66a-g và 65a-g với một số dòng tế bào ung thư ................................................................................ 96 Bảng 5. Hoạt tính ức chế HDAC và gây độc tế bào của chất 67a-g ...................... 103 Bảng 6: Ái lực liên kết của 67a và 67g với HDAC2 .............................................. 105 vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1: Cây thanh hao hoa vàng ................................................................................ 2 Hình 2. Sinh tổng hợp artemisinin trong cây. ............................................................ 7 Hình 3. Cơ chế tác dụng của ART............................................................................ 14 Hình 4: Một số dẫn xuất ete và este của artemisinin. ............................................... 15 Hình 5. Benzyldeoxoartemisinin (19) ...................................................................... 18 Hình 6: Dẫn xuất 37a, 37b ........................................................................................ 22 Hình 7: Dẫn xuất 38a và 38b .................................................................................... 22 Hình 8: Chất lai hóa artemisinin với 4-amino-7-chloroquinoline 41 và 42 ............. 23 Hình 9. Một số dimer và trime non acetal ................................................................ 25 Hình 10: Cấu trúc tinh thể của HDAC8 kết hợp với suberoylanilide. ..................... 28 Hình 11: Một số chất ức chế HDAC làm thuốc ung thư .......................................... 30 Hình 12: Cấu trúc chung của các chất ức chế HDACi ............................................. 31 Hình 13: Cấu trúc các chất ức chế HDAC ............................................................... 32 Hình 14. Phổ 1H NMR của chất 61a......................................................................... 83 Hình 15. Phổ giãn 1H NMR của chất 61a ................................................................. 84 Hình 16. Phổ giãn 1H NMR của chất 61a ................................................................ 84 Hình 17. Phổ 13C NMR của chất 61a ....................................................................... 85 Hình 18. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất triazole ................................... 88 Hình 19. Artemisinin, dihydroartemisinin (DHA), và các dẫn xuất dimer, trimer artemisinin [118, 119]. ............................................................................................. 89 Hình 20. Phổ 1H NMR của chất 65a......................................................................... 90 Hình 21. Phổ giãn 1H NMR của chất 65a ................................................................. 91 Hình 22. Phổ giãn 1H NMR của axit 65a ................................................................. 92 Hình 23. Phổ 13C NMR của chất 65a ....................................................................... 93 Hình 24. Phổ 1H NMR của chất 66g ........................................................................ 94 Hình 25. Phổ giãn 1H NMR của chất 66g ................................................................ 94 Hình 26. Phổ 13C NMR của chất 66g ....................................................................... 95 Hình 27. Phổ ESI-HRMS của chất 66g .................................................................... 95 Hình 28. Một số chất ức chế HDAC ........................................................................ 99 viii
Hình 29. Thiết kế các dân xuất artemisinin chứa nhóm hydroxamic axit ................ 99 Hình 30. Phổ 1H NMR của 67c .............................................................................. 101 Hình 31. Phổ giãn 1H NMR của 67c ...................................................................... 101 Hình 32. Phổ giãn 1H NMR của 67c ...................................................................... 102 Hình 33. Phổ 13C NMR của chất 67c ..................................................................... 102 Hình 34. Phổ ESI-HRMS của chất 67c .................................................................. 103 Hình 35. Hình ảnh liên kết của SAHA và liên kết mô phỏng của các hợp chất 67a và 67g với HDAC2. SAHA được thể hiện có màu cam. ............................................ 106 ix
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Tổng hợp (+)-artemisinin. ............................................................................ 6 Sơ đồ 2. Tổng hợp các dẫn xuất 14a-g ..................................................................... 16 Sơ đồ 3. Tổng hợp các dẫn xuất C10-oxa dime artemisinin .................................... 17 Sơ đồ 4: Tổng hợp deoxoartemisinin (18) ................................................................ 17 Sơ đồ 5: Tổng hợp dẫn xuất furan deoxoartemisinin (21) ....................................... 18 Sơ đồ 6: Tổng hợp chất 26 ....................................................................................... 19 Sơ đồ 7: Tổng hợp các dẫn xuất Pyrrole Mannich 29, 30 ........................................ 20 Sơ đồ 8: Tổng hợp 32 ............................................................................................... 20 Sơ đồ 9: Tổng hợp 34 từ 32 ...................................................................................... 21 Sơ đồ 10: Tổng hợp 36 a-c ....................................................................................... 21 Sơ đồ 11: Tổng hợp chất lai artemisinin và primaquine hybrid 40 .......................... 23 Sơ đồ 12: i) TMSCl, NaBr, toluene 0 °C, ii và iii) amine, Et3N, CH2Cl2, 0-20 °C, iii) CH2Cl2, N-methylmorpholine-N-oxide, MS, tetrapropylammonium perruthenate. . 24 Sơ đồ 13. Tổng hợp các dime phosphate 44a, 44b ................................................... 25 Sơ đồ 14: Tổng hợp các dẫn xuất của 11-azaartemisin (53a-c). .............................. 26 Sơ đồ 15: Tổng hợp các chất trung gian 58a-i, 59a-i; .............................................. 40 Sơ đồ 16: Tổng hợp các triazole sử dụng phản ứng Click ....................................... 41 Sơ đồ 17. Tổng hợp chất 63..................................................................................... 60 Sơ đồ 18: Tổng hợp các chất trung gian 65a-g......................................................... 62 Sơ đồ 19. Tổng hợp các dimer artemisinin 66a-g .................................................... 69 Sơ đồ 20. Tổng hợp các dẫn xuất artemisinin chứa nhóm hydroxamic axit ............ 75 x
MỞ ĐẦU Ung thư là căn bệnh có tỷ lệ tử vong lớn chỉ sau bệnh về tim mạch. Mặc dù có rất nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị, ung thư vẫn là căn bệnh gây nên 8 triệu ca tử vong mỗi năm, con số này tương đương với khoảng 15% số ca tử vong trên toàn thế giới. Tuy có nhiều phát triển trong các biện pháp trong điều trị ung thư như hóa trị, phẫu thuật và xạ trị. Các phương pháp này vẫn tồn tại những hạn chế. Theo dự báo của WHO, có khoảng 22 triệu người có thể phát triển ung thư hàng năm trong vòng hai thập kỷ tới và con số tử vong có thể lên 13 triệu ca mỗi năm. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các thuốc trị hiệu quả, an toàn và chọn lọc luôn là đòi hỏi cấp bách. Artemisinin là một sesquiterpen lactone chiết xuất từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L. Artemisinin và một số dẫn xuất của nó như artemether, arteether và artesunat đã được sử dụng trên lâm sàng điều trị sốt rét. Bên cạnh tác dụng chống sốt rét, nhiều hoạt tính mới của artemisinin và dẫn xuất của nó đã được phát hiện, đặc biệt là tác dụng kháng ung thư dựa trên nguyên lý tương tự tác dụng chống sốt rét thông qua gốc tự do tạo ra từ tương tác của cầu peroxit của artemisinin và sắt trong nhân hem.Trong đó HDAC điều chỉnh sự biểu hiện và hoạt động của rất nhiều loại protein có liên quan đến cả giai đoạn đầu và giai đoạn phát triển ung thư.Sự biểu hiện bất thường của các HDAC được báo cáo có liên quan đến một số căn bệnh ung thư ở người. Nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có tác dụng kháng u, đề tài luận văn đặt vấn đề ““Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất mới của Artemisinin”’’ nhằm giải quyết mục tiêu sau đây. 1. Nghiên cứu tổng hợp các dãy hợp chất mới chứa khung artemisinin 2. Đánh giá hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được. 1
CHƯƠNG 1 TỒNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây thanh hao hoa vàng và artemisinin 1.1.1. Vài nét về cây thanh hao hoa vàng Cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.), Họ cúc (Asteraceae) là loài thảo dược, sống hàng năm, mọc hoang thành từng đám ở vùng đồi ven suối, ven sông, ở những nước ôn đới và nhiệt đới như Trung Quốc, Mông Cổ, Iran, Châu Âu, Bắc và Nam Mỹ, một số nước Đông Nam Á. Cây thanh hao hoa vàng là cây thân thảo, sống trong vòng 1 năm, cao từ 1-3m; lá mọc so le, phiến lá nhẵn, dọc gân chính và thân non có lông thưa, ngắn; cụm hoa là những đầu nhỏ, tụ lại ở ngọn thân và cành; quả hình trứng, lá và hoa có mùi thơm đặc trưng, vị hơi đắng [1]. Hình 1: Cây thanh hao hoa vàng Cây thanh hao hoa vàng được người Trung Quốc phát hiện một cách tình cờ từ rất lâu. Trong cuộc khai quật khảo cổ ở miền Nam Trung Quốc, khi đào một ngôi mộ cổ, đã phát hiện bản ghi đã mờ có tên “Ngũ thập nhị bệnh phương” về một công thức trà thảo dược từ năm 168 trước Công Nguyên. Kể từ đó, người Trung Quốc đã dùng dịch chiết từ lá cây này để chữa bệnh sốt nóng. Tuy nhiên, mãi đến năm 1972, Tu Youyou, nhà khoa học Trung Quốc mới chiết được một loại tinh thể không màu 2
được xem là hoạt chất chính có tác dụng trị bệnh sốt rét từ lá khô của cây thanh hao hoa vàng bằng dung môi n-hexan và gọi là qinghaosu (QHS) tên sau này là artemisinin. Sau đó, Qinghaosu đã được phân lập từ các chồi của Artemisia annua L. ở dạng tinh khiết và cấu trúc của nó được xác định vào năm 1979 [2, 3]. Vì vậy bà đã được trao giải thưởng Nobel năm 2015 về sinh lý học và y học. Năm 1992, ở Việt Nam nhiều cơ sở cũng chiết được artemisinin từ loài cây này. Hiện nay, cây Thanh hao hoa vàng được trồng ở nhiều tỉnh phía Bắc và một số tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Lâm Đồng, Long An... để nhằm đáp ứng cho nhu cầu chiết xuất artemisinin. 1.1.2. Vài nét về artemisinin 1.1.1.1. Cấu trúc và tính chất vật lý của artemisinin Artemisinin (1) có tên IUPAC: (3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-Octahydro-3,6,9 trimethyl-3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10(3H)-one. Khối lượng phân tử: 282,33g/mol. ART là một lactone sesquiterpene chứa vòng lactone và cầu endoperoxide. Trong phân tử ART có năm nguyên tử oxi, trong đó hai oxi tạo thành cầu peroxide; hai oxi khác tham gia vào cấu trúc vòng lactone. ART có 7 trung tâm bất đối. Artemisinin ở trạng thái tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, vị hơi đắng, tan được trong CHCl3, EtOH, ete dầu hỏa và axeton; tan ít trong n-hexane, benzene, toluene và hầu như không tan trong nước. ART bị thủy phân và phân hủy trong các dung môi phân cực ở nhiệt độ cao; dễ phân hủy trong môi trường axit, bazơ [2, 3]. 1.1.1.2. Dược động học Artemisinin có thể dùng uống hoặc đặt hậu môn. Sau khi uống, artemisinin hấp thu nhanh, nồng độ đỉnh đạt được trong huyết tương trong vòng 1 giờ. Sự hấp 3
thu qua trực tràng của hỗn dịch trong nước kém và thay đổi so với dùng uống hoặc tiêm bắp dung dịch dầu. Sau khi đặt hậu môn, liều 10 mg/kg ở người, nồng độ trong máu của artemisinin là 8,6 nanogam/ml sau 30 phút và đạt tới nồng độ tối đa trong máu khoảng 110 nanogam/ml 6 giờ sau khi dùng thuốc. Sau khi tiêm bắp, artemisinin hấp thu chậm hơn chút ít so với khi uống hoặc tiêm tĩnh mạch, thời gian bán thải là 3,85 – 5,38 giờ. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được khoảng 2 giờ sau khi dùng. Sau khi tiêm tĩnh mạch artemisinin cho chuột, một lượng đáng kể chất này được phát hiện trong não, chứng tỏ thuốc đi qua được hàng rào máu não. Ðiều này có thể có liên quan đến tác dụng của artemisinin đối với sốt rét thể não. Artemisinin liên kết mạnh với protein huyết tương và với hồng cầu (hemoglobin). Sự liên kết với protein huyết tương ở người là 64%. Thuốc phân bố rất rộng vào cơ thể với thể tích phân bố ở chuột cống trắng là 1,1 lít/kg. Thực nghiệm cho thấy gan là nơi chuyển hóa chính của artemisinin. Artemisinin bị thủy phân nhanh trong cơ thể thành chất chuyển hóa còn hoạt tính là dihydroartemisinin. Bốn chất chuyển hóa chính khi uống artemisinin là deoxyartemisinin, deoxydihydroartemisinin, dihydroxydihydroartemisinin và một chất được gọi là crystal-7 có thể phân lập được ở nước tiểu. Các chất này đều không có nhóm peroxid và đều không còn hoạt tính trên ký sinh trùng sốt rét. 80% liều dùng được thải qua phân và nước tiểu trong vòng 24 giờ. Sau khi tiêm tĩnh mạch cho chuột cống trắng và thỏ, thời gian bán thải trong huyết tương của artemisinin khoảng 30 phút, còn của dihydroartemisinin là 5-21 giờ. Chỉ một lượng rất nhỏ artemisinin được thải nguyên dạng qua nước tiểu [4]. 1.1.1.3. Phương pháp sản xuất artemisinin Cho đến nay có nhiều phương pháp đã được phát triển và ứng vào việc chiết xuất artemisinin từ nguyên liệu lá thanh hao hoa vàng. Có thể tóm tắt một số phương pháp như sau. 1.1.1.4. Chiết bằng n-hexan Phương pháp chiết xuất artemisinin bằng dung môi n-hexan là phương pháp truyền thống được áp dụng tại Việt Nam cũng như các nước trên thế giới ngay từ khi phát hiện ra khả năng chữa bệnh của artemisinin. Ở phương pháp này, lá thanh hao hoa vàng được phơi khô, xay thô và cho vào nồi chiết. Dung môi chiết n-hexan 4
với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5, chiết ở nhiệt độ 30 -50°C, thời gian chiết trong 3 giờ, thời gian chiết khoảng 3 giờ, dịch chiết lần 3 được sử dụng làm dung môi chiết lần 1 của mẻ khác. Các dịch chiết được gộp lại, cô thu hồi dung môi rồi rút ra để kết tinh ít nhất trong 24 giờ, artemisinin sẽ kết tinh lẫn với sáp. Loại phần dung dịch bằng cách gạn, loại sáp bằng nhiệt độ và xăng công nghiệp nóng thu được artemisinin thô. Artemisinin thô đã loại hết sáp được hòa tan trong etanol sôi, thêm than hoạt tính và đun sôi trong 20 phút với sinh hàn hồi lưu. Lọc nóng loại than hoạt tính và để kết tinh ở nhiệt độ thường tối thiểu trong 24 giờ. Vẩy ly tâm rửa tinh thể bằng cồn và sấy ở 80°C. 1.1.1.5. Phương pháp chiết siêu âm Năm 2017, Zhang và cộng sự đã dùng phương pháp chiết xuất bằng siêu âm sử dụng dụng môi propylene glycol methyl ether (PGME). Đây là dung môi không gây ô nhiễm môi trường, được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp dược phẩm và mỹ phẩm. 1g bột khô cho bình 40ml chứa 20ml dung môi PGME và được tác động siêu âm dưới một công suất nhất định trong một thời gian nhất định. Cặn không hòa tan tách ra khỏi dung dịch bằng cách lọc bằng giấy lọc. Nồng độ artemisinin trong dịch lọc được xác định định lượng bằng HPLC. PGME trong dung dịch được loại bỏ trong chân không ở 60°C để thu được hỗn hợp giống như gel có chứa artemisinin, sáp,... Sau đó metanol được thêm vào để hòa tan hỗn hợp gel đem kết tinh rồi lọc thu được artemisinin thô. Phương pháp chiết xuất siêu âm mang lại hiệu suất cao trong thời gian ngắn với chi phí năng lượng thấp, điều này khiến nó trở thành một kỹ thuật đầy hứa hẹn có thể được sử dụng trong công nghiệp [5]. 1.1.1.6. Phương pháp chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn Carbon dioxide là dung môi rẻ tiền, thân thiện với môi trường. Độ hòa tan của CO2 siêu tới hạn cao hơn một đến hai bậc so với các dung môi khác, cho phép chuyển khối nhanh chóng, dẫn đến tốc độ chiết xuất lớn hơn. Vì vậy, từ những năm 1997, Marcel Kohler và cộng sự đã thử nghiệm sử dụng CO2 siêu tới hạn để chiết artemisinin và axit artemisinic từ sáu mẫu thanh hao hoa vàng và so sánh với phương pháp thông thường. Kết quả cho thấy chiết bằng CO2 siêu tới hạn cho hiệu suất cao hơn cả các phương pháp khác [6]. Ở Việt Nam, khoảng gần mười năm sau, Phạm Thị Hiền và cộng sự cũng đã nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết CO2 siêu 5
tới hạn để chiết xuất artemisinin. Kết quả cho thấy rằng, nếu phương pháp chiết Soxhlet khoảng hơn 20 giờ thì chỉ cần thời gian 2 giờ, áp suất 200bar, nhiệt độ 50˚C, sử dụng đồng dung môi n-hexan thu được hiệu suất chiết artemisinin đạt trên 80%. Mặc dù vậy phương pháp trên lại tồn tại một số nhược điểm như dòng CO2 siêu tới hạn không có tính chọn lọc nên artemisinin sẽ bị lẫn nhiều tạp. Thêm vào đó, quy trình vận hành khó khăn, về mặt kinh tế tốn kém nhiều chi phí là một trong nhưng trở ngại của phương pháp này [7]. 1.1.1.7. Phương pháp tổng hợp toàn phần Kể từ khi artemisinin được phát hiện, rất nhiều công trình tổng hợp toàn phần artemisinin đã được báo cáo. Dưới đây là công trình có tính minh họa cho tổng hợp toàn phần artemisinin (Sơ đồ 1). Sơ đồ 1: Tổng hợp (+)-artemisinin. a) MVK (5 mol %), ethyl 3,4-dihydroxy-benzoate (20 mol %), 0–4 oC, 48 giờ, 70%; b) KOH (0.1N aq, 1.0 equiv), n-Bu4NOH (40% aq), Et2O: THF: 2O (3:1:3), hồi lưu, 8 giờ, 84%; c) CH3MgI, Et2O, 2 giờ, nhiệt độ phòng, 92%; d) SnCl4, benzene: Et2O (4:1), 0 oC, 65%; e) 9-BBN, 3 N NaOH, H2O2, 85%. (f) Oxy hóa Swern, 94%. (g) NaClO2, NaH2PO4, 0oC, 80%. (h) CH3I, K2CO3, acetone, nhiệt độ 6
phòng 89%; (i) (i) O2, 30oC, 6 giờ, CH3CN, (ii) O2, Cu(OTf)2, CH3CN, 2 oC, (iii) TsOH, CH2Cl2, 4 giờ, nhiệt độ phòng, 25%. Quá trình tổng bắt đầu từ (R)-(+)-citronellal phản ứng với methyl vinyl keton (MVK) có mặt xúc tác proline và ethyl-3,4- dihydroxybenzoate làm đồng xúc tác thu được hợp chất 2. Thực hiện phản ứng Aldol nội phân tử của 2 trong môi trường KOH trong điều kiện hồi lưu cho 3. Sau đó 3 được cho tác dụng với methyl magnesium iodide thu được đồng phân 4 và 4a. Hỗn hợp đồng phân thu được đem phản ứng với SnCl4 trong benzene-diethyl ether (4:1) cho 5. Tiếp theo, hydro hóa olefin 5 sử dụng 9-BBN tạo thành 6. Hợp chất này thực hiện phản ứng oxi hóa Swern cho aldehyde 7 và sau đó thành axit 8 bằng cách sử dụng NaClO2 và NaH2PO4. Este hóa chất 8 với methyl iodua với sự có mặt của K2CO3 sau đó là phản ứng đóng vòng cho (+)-artemisinin (1) [8]. 1.2. Sinh tổng hợp artemisinin Hình 2. Sinh tổng hợp artemisinin trong cây. Quá trình sinh sinh tổng hợp artemisinin trong cây Artemisia annua L được tạo ra bởi quá trình quang hợp trong lục lạp thực vật được chuyển hóa acetyl-CoA 7
trong dịch bào. Trước hết nhờ quá trình quang hóa, CO2 chuyển thành đường. Dưới tác dụng của coenzym acetyl-CoA và enzym farnesyl diphosphate (FPP). Chất trung gian quan trọng được hình thành: artemisininic acid và dihydro artemisininic. Cuối cùng dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, xúc tác cho sự chuyển hóa dihydro artemisininic thành artemisinin (Hình 2) [9]. 1.3. Ung thư và hoạt tính kháng ung thư của artemisinin 1.3.1. Khái niệm ung thư Ung thư được đặc trưng bởi sự phát triển không kiểm soát của các tế bào và thường có thể di căn từ nguồn gốc đến các vị trí xa của cơ thể [10]. Sau các bệnh về hệ tim mạch, ung thư vẫn là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây tử vong ở. Ví dụ theo số liệu thống kê Ireland hàng năm trung bình có gần chín ngàn ca tử vong từ năm 2011 đến năm 2012 [11]. Hơn nữa, cứ 1 trong 3 nam giới và 1 trong 4 phụ nữ ở Ireland sẽ phát triển một số hình thức ung thư xâm lấn trong cuộc đời của họ với ung thư phổi, vú và tuyến tiền liệt nhiều nhất các loại ung thư phổ biến được báo cáo [11]. Do dân số già ngày càng tăng, người ta dự đoán rằng tổng số ca ung thư xâm lấn mới sẽ tăng 84% đối với nữ và 107% đối với nam trong giai đoạn 2010- 2040 [12]. Ung thư ở châu Âu cũng đang gia tăng với hơn một phần tư triệu số ca tử vong do ung thư được ghi nhận vào năm 2013 [13]. Hơn nữa, ung thư là nguyên nhân chính của tử vong trên toàn thế giới với khoảng 8,2 triệu ca tử vong do ung thư được báo cáo trong 2012, ảnh hưởng đến dân số ở tất cả các quốc gia và tất cả các khu vực [14]. Phẫu thuật, xạ trị và hóa trị thường được sử dụng kết hợp để điều trị khối u ác tính để cải thiện kết quả của bệnh nhân [15-19]. Loại bỏ khối u trong phẫu thuật vẫn là một trong những phương pháp điều trị ung thư hiệu quả nhất hiện nay [20]. Tuy nhiên, phẫu thuật bị hạn chế do không thể tiếp cận một số loại khối u như khối u não và những khối u đã di căn đến các cơ quan quan trọng. Sự bóc tách khối u có thể được thực hiện, trong đó một số, nhưng không phải tất cả khối u được loại bỏ để ngăn ngừa thiệt hại đến các cơ quan quan trọng. Bệnh bạch cầu hiện diện trong dòng máu và không hình thành khối u. Do đó, loại ung thư này không thể được loại bỏ bằng phẫu thuật [21]. Hơn nữa, thường rất khó để loại bỏ tất cả các tế bào khối u dẫn đến ung thư tái phát [20]. Ung thư di căn, nguyên nhân gây ra hầu hết các ca tử 8