Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:153

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật "Nghiên cứu sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen" trình bày các nội dung chính sau: Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các mẫu sen trồng tại Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen giống sen địa phương.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẶNG THANH LONG NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA CÁC VÙNG GENE CHỈ THỊ Ở CÁC MẪU SEN TRỒNG TẠI HUẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ HẠT SEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG - 2023
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẶNG THANH LONG NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA CÁC VÙNG GENE CHỈ THỊ Ở CÁC MẪU SEN TRỒNG TẠI HUẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ HẠT SEN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 94 20 201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. HOÀNG THỊ KIM HỒNG 2. TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM ĐÀ NẴNG - 2023
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Đà Nẵng, ngày 15 tháng 06 năm 2023 Tác giả luận án Đặng Thanh Long
ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cô PGS.TS. Hoàng Thị Kim Hồng, TS. Lê Lý Thùy Trâm đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến Sở khoa học và Công nghệ tỉnh Thừa Thiên Huế và Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VINBIGDATA) đã hỗ trợ kinh phí cho tôi để thực hiện đề tài luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Ban Quản lý đào tạo, Khoa hóa, Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Đà Nẵng, ngày 15 tháng 06 năm 2023 Nghiên cứu sinh Đặng Thanh Long
iii MỤC LỤC Số trang LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... vi DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. xi DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ ......................................................................xii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 3 2.1. Mục tiêu chung .............................................................................................. 3 2.2. Mục tiêu cụ thể .............................................................................................. 3 3. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................. 4 4. Những đóng góp mới của đề tài .............................................................................. 4 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................ 5 5.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 5 5.2. Ý nghĩa thực tiển ........................................................................................... 5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 6 1.1. Giới thiệu về cây sen ............................................................................................ 6 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại .............................................................................. 6 1.1.2. Đặc điểm chung của cây sen ...................................................................... 6 1.1.3. Đặc điểm hệ gene cây sen .......................................................................... 8 1.2. Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA ở thực vật trên thế giới và Việt Nam................ 14 1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới ........................................................................... 14 1.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam............................................................................ 23 1.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây sen trên thế giới và Việt Nam ..................... 25 1.3.1. Nghiên cứu trên thế giới ........................................................................... 25 1.3.2. Nghiên cứu ở Việt Nam............................................................................ 32
iv 1.4. Nghiên cứu hợp chất và hoạt tính sinh học từ cây sen ....................................... 34 1.4.1. Nghiên cứu phân lập và xác định các hợp chất từ cây sen ....................... 34 1.4.2. Nghiên cứu hoạt tính của dịch chiết và cao chiết từ cây sen .................... 38 1.4.3. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của hợp chất tinh khiết từ cây sen ........... 43 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................50 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 50 2.1.1. Nguyên liệu cây sen .................................................................................. 50 2.1.2. Nguồn vật liệu sử dụng trong các thí nghiệm sinh học phân tử ............... 54 2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 55 2.2.1. Phương pháp thu mẫu ............................................................................... 55 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử ................................................................. 56 2.2.3. Phương pháp phân lập hợp chất và thử nghiệm hoạt tính sinh học.......... 60 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 67 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 68 3.1. Kết quả khuếch đại PCR và phân tích trình tự nucleotide một số vùng gene chỉ thị............ .................................................................................................................. 68 3.2. Kết quả phân tích đặc tính di truyền một số mẫu sen trồng tại Huế dựa trên 10 vùng gene chỉ thị ....................................................................................................... 70 3.2.1. Kết quả phân tích đặc tính phân tử 10 vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế .................................................................................... 70 3.2.2. Kết quả phân tích đặc tính di truyền 10 vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế .................................................................................... 71 3.3. Kết quả phân tích đặc tính di truyền giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng dựa trên tổ hợp 9 vùng gene chỉ thị lục lạp ............................................................... 86 3.4. Phân tích quá trình tiến hóa của một số mẫu sen trồng tại Huế dựa trên 10 vùng gene chỉ thị ................................................................................................................. 88 3.4.1. Chỉ thị vùng gene nhân ............................................................................. 88 3.4.2. Chỉ thị vùng gene lục lạp .......................................................................... 90 3.5. Kết quả khảo sát dung môi chiết cao tổng số từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm......... 95
v 3.6. Kết quả định tính và định lượng alkaloid và flavonoid trong một số cao chiết thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm......................................................................... 96 3.7. Kết quả phân lập hợp chất tinh khiết ở phân đoạn n-B thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ......................................................................................................... 98 3.8. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học ............................................................ 103 3.8.1. Hoạt tính kháng oxy hóa......................................................................... 103 3.8.2. Hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư................................ 106 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 114 4.1. Kết luận ............................................................................................................ 114 4.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 115 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 117 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 139
vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACN : Acetonitril AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài nhân bản chọn lọc) AS-PCR : Allele specific polymerase chain reaction (Nhân bản allen đặc biệt) ASO : Allele specific oligo (Các oligo allen đặc biệt) AP-PCR : Arbitrarily primed PCR (Tạo ra do phản ứng PCR với các mồi tùy tiện) ACN : Acetonitril BLAST : Basic Local Alignment Search Tool (Công cụ tìm kiếm đối chiếu cơ bản) CBOL : Consortium for the Barcode of Life (Hiệp hội Mã vạch sự sống) CCC : Counter-current chromatography (Sắc ký ngược dòng hay đối lưu) COI : Cytochrome c oxidase subunit I DNA : Deoxyribonucleic acid DPPH : 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl EtOAc : Ethyl acetat EtOH : Ethanol ESI-MS : Electron Spray Ionisation - Mass Spectrometry (Khối phổ - ion hóa phun mù electron) GC : Gas Chromatography (Sắc ký khí) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HPLC-MS : High Performance Liquid Chromatography– Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng - khối phổ) HSV-1 : Virus herpes simplex virus-1 IC50 : Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ gây ức chế 50% hoạt tính sinh học hoặc hóa sinh)
vii LPS : Lipopolysaccharides ITS : Internal transcribed spacers mRNA : Messenger RNA (RNA thông tin) mg : miligam mL : Mililit n-Bu : n-Buthanol NCBI : GenBank database (Ngân hàng gene Mỹ) NGS-Next : Next-generation sequencing (Giải trình tự thế hệ thứ hai) OD : Optical Density (Mật độ quang học) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RFLP : Restriction fragment length polymorphism (Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế) RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên) rRNA : Ribosome rRNA RE : Restriction enzyme (Enzyme cắt hạn chế) SSR : Simple Sequence Repeats (Các chuỗi lặp lại đơn giản) SCAR : Sequence Characterised Amplification Regions (Vùng nhân bản chuỗi được mô tả) SCoT Start Codon Targeted (Vị trí codon mã hoá) SSCP : Single stranded conformation polymorphism (Đa hình cấu tạo sợi đơn) STS : Sequence tagged site (Vị trí chuỗi đánh dấu) STMS : Sequence tagged microsatellite site (Vị trí trình tự tiểu vệ tinh được đánh dấu) TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng) tRNA : Transfer RNAs (RNA vận chuyển) UHPLC : Ultra-High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng)
viii UV-VIS : Ultraviolet - Visible (Tử ngoại - khả kiến) UV : Ultraviolet (Tử ngoại) VNTR : Variable number tandem repeat (Số lượng thay đổi các chuỗi lặp lại liền kề) µg : microgram μL : microlit
ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. So sánh các bộ gene giữa các giống sen được lắp ráp dựa trên các công nghệ giải trình tự khác nhau. .......................................................................................... 9 Bảng 1.2. Danh sách các gene trong bộ gene lục lạp của loài N. nucifera ................. 13 Bảng 2.1. Danh sách và vị trí thu mẫu sen tại Huế...................................................51 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide các cặp mồi đặc hiệu cho một số vùng gene chỉ thị ...54 Bảng 2.3. Ảnh hưởng của dung môi đến chiết tách cao tổng số từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm....................................................................................................................60 Bảng 2.4. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cổ điển phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n-Bu hạt Sen Trắng Trẹt Lõm .................................................................63 Bảng 2.5. Chương trình gradien dung môi sử dụng trong phân tích khối phổ MS/MS ...................................................................................................................... 65 Bảng 3.1. Kết quả phân tích đặc tính phân tử và đặc tính di truyền 10 vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế ...........................................................71 Bảng 3.2. Kết quả vị trí thay đổi các biến thể nucleotide trong trình tự vùng gene chỉ thị matK giữa một số mẫu sen trồng tại Huế .......................................................73 Bảng 3.3. Kết quả phân tích đặc điểm di truyền 10 vùng gene và tổ hợp các vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế ............................................75 Bảng 3.4. Kết quả phân tích sự phân bố các mẫu sen về các kiểu đơn bội ..............78 Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra tính trung lập giữa một số mẫu sen trồng tại Huế dựa trên các vùng gene và tổ hợp vùng gene chỉ thị ........................................................85 Bảng 3.6. Kết quả phân tích đặc tính di truyền giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng ...........................................................................................................................86 Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra tính trung lập giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng 87 Bảng 3.8. Kết quả giá trị Fst giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng .....................88 Bảng 3.9. Kết quả chiết cao tổng số, định tính alkaloid và flavonoid từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm .........................................................................................................96 Bảng 3.10. Kết quả định lượng alkaloid và flavonoid trong cao tổng số và các cao phân đoạn tinh sạch thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm........................................97 Bảng 3.11. Kết quả tính chất của các hợp chất phân lập từ phân đoạn n-Bu của hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ..................................................................................................99
x Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ khối lượng của các hợp chất tinh khiết ..............99 Bảng 3.13. Kết quả hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết tổng ethanol 70% thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm.......................................................................104 Bảng 3.14. Kết quả hoạt tính bắt gốc tự do DPPH các hợp chất tinh khiết ...........105 Bảng 3.15. Kết quả giá trị IC50 của các hợp chất tinh khiết ...................................105 Bảng 3.16. Kết quả gây độc tế bào của cao chiết tổng ethanol 70% thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ................................................................................................107 Bảng 3.17. Kết quả giá trị IC50 của cao chiết tổng ethanol 70% thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm .......................................................................................................108 Bảng 3.18. Kết quả gây độc tế bào của các hợp chất tinh khiết .............................110 Bảng 3.19. Kết quả giá trị IC50 của các hợp chất tinh khiết ...................................111
xi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bản đồ hệ gene lục lạp của loài N. nucifera từ PacBio RS II. ................. 12 Hình 2.1. Bản đồ vị trí thu mẫu sen tại Huế .............................................................50 Hình 2.2. Hình thái hoa giống Sen Trắng Trẹt Lõm .....................................................53 Hình 2.3. Nguồn nguyên liệu hạt Sen Trắng Trẹt Lõm............................................56 Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm PCR. .......................................................................68 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR.. ......................................................................69 Hình 3.3. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene chỉ thị ITS4-5 giữa một số mẫu sen ..................................................................................................72 Hình 3.4. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene chỉ thị matK giữa một số mẫu sen trồng tại Huế............................................................................74 Hình 3.5. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide các vùng gene chỉ thị giữa một số mẫu sen trồng tại Huế............................................................................77 Hình 3.6. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene chỉ thị trnH- psbA giữa một số mẫu sen trồng tại Huế...................................................................82 Hình 3.7. Cây quan hệ phát sinh dựa trên vùng gene chỉ thị ITS4-5 giữa một số mẫu sen trồng tại Huế .......................................................................................................89 Hình 3.8. Cây quan hệ phát sinh dựa trên tổ hợp 5 vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide giữa một số mẫu sen trồng tại Huế ..........................................................91 Hình 3.9. Cây quan hệ phát sinh dựa trên tổ hợp 9 vùng gene chỉ thị lục lạp giữa một số mẫu sen trồng tại Huế ....................................................................................92 Hình 3.10. Hình thái Sen Trắng Trẹt Lõm được trồng tại hồ Tịnh Tâm ..................95 Hình 3.11. Kết quả định tính alkaloid và flavonoid.. ...............................................97 Hình 3.12. Sắc ký đồ bản mỏng (TLC) của các hợp chất tinh khiết.. ......................98 Hình 3.13. Công thức hóa học của hợp chất nuciferine .........................................100 Hình 3.14. Công thức hóa học của hợp chất armepavine .......................................101 Hình 3.15. Công thức hóa học của hợp chất anonaine ...........................................102 Hình 3.16. Các dòng tế bào ung thư khi thử nghiệm gây độc với chất thử với cao chiết tổng ethanol 70% ............................................................................................109 Hình 3.17. Các dòng tế bào ung thư khi thử nghiệm gây độc với chất thử là hoạt chất tinh khiết ..........................................................................................................113
xii DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ Sơ đồ 1.1. Sơ đồ các bước chính thực hiện các nội dung đề tài luận án ................. 49 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thí nghiệm chiết tách, tinh sạch hợp chất ...................................... 62
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nguồn tài nguyên di truyền thực vật đóng một vai trò quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp theo hướng đa dạng hóa, hiện đại hóa…Trong công tác khai thác và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá đặc điểm kiểu gene là công đoạn vô cùng quan trọng không chỉ phục vụ cho việc xác định, phân biệt các giống/loài khác nhau mà còn giúp tìm hiểu mối quan hệ di truyền của chúng. Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền về kiểu gene, nhằm khắc phục nhược điểm của phương pháp đánh giá sự đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình [14], [15]. Hiện nay, phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử trong việc định danh và nghiên cứu di truyền ngày càng được sử dụng phổ biến. Trong đó, sử dụng vùng gene chỉ thị DNA barcode là một công cụ mới, đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới, dựa trên sự tiến hóa và sự khác biệt trình tự của các nucleotide cho phép phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống/loài khác nhau. Kết quả nghiên cứu từ các công cụ này đã góp phần vào công tác đánh giá nguồn gene, tuyển chọn giống tiêu biểu để nghiên cứu khai thác giá trị kinh tế và sử dụng bền vững các nguồn gene có giá trị, các giống cây trồng quý, đặc hữu của Việt Nam [52], [158]. Nelumbo nucifera Gaertn. (N. nucifera) là loài sen thuộc nhóm thực vật thủy sinh lâu năm sống trong các ao hồ, đầm lầy, được trồng ở nhiều nơi trên thế giới [93]. Loài sen này rất được chú trọng phát triển ở nước ta trong những năm gần đây. Ở Việt Nam loài sen N. nucifera được phân bố rộng rãi khắp mọi nơi và được trồng trên các hệ thống ao hồ và trên đất ruộng. Các tỉnh trồng nhiều sen phổ biến ở nước ta là Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Thanh Hóa, Thừa Thiên Huế, Nghệ An và khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long như Đồng tháp, An Giang, Sóc Trăng, Long An...[9]. Ở Thừa Thiên Huế, hiện nay có nhiều giống sen màu sắc hoa khác nhau đang được trồng tại nhiều nơi ở các khu vực ngoại thành và nội thành. Trong các giống sen trồng ở Huế thì Sen Trắng Trẹt Lõm là giống sen Huế bản địa xưa, được biết đến như một giống sen cung đình rất nổi tiếng, đã được trồng từ xa xưa trên các
2 hồ sen của khu vực nội thành, hồ lăng tẩm và các hồ sen thuộc vùng di tích của Cố đô Huế. Đây là giống sen đặc trưng ở Huế cho hạt nhiều nhưng nhỏ, thơm ngon, dẻo ăn bùi không bở, chất lượng và giá thành cao hơn nhiều so với các giống sen khác đang được trồng ở Huế. Giống sen này có hương thơm dịu dàng, hoa trắng thanh khiết, củ và hạt sen có hương vị và chất lượng đặt biệt, mang thương hiệu “sen Huế”, rất được du khách ưa chuộng [19]. Trong những năm gần đây, phong trào trồng sen ở Huế đã được đầu tư và phát triển mạnh. Trước đây sen chỉ được trồng trên hồ nhưng hiện nay sen còn được trồng trên đất ruộng. Một số địa phương đã chuyển đổi diện tích trồng lúa kém hiệu quả sang trồng sen lấy hạt. Do vậy, ngoài việc trồng các giống sen trắng có nguồn gốc lâu năm ở Huế, người dân cũng đã du nhập một số giống sen hồng từ các địa phương khác nhau về trồng ở Huế, đặc biệt là giống Sen Hồng Cao Sản – một giống sen chuyên cho hạt, mang nhiều đặc tính vượt trội về điều kiện sống và cho năng suất cao hơn các giống sen địa phương [12], [18]. Việc trồng và phát triển nhiều loại sen nội nhập ở Huế đã dẫn tới hiện trạng gây lẫn giống, thoái hóa giống và có nguy cơ làm giảm đi số lượng các giống sen bản địa, quý hiếm ở Huế. Do vậy cần thiết phải nghiên cứu ứng dụng các vùng gene chỉ thị để khảo sát sự khác biệt về kiểu gene, xác định nguồn gốc và mối quan hệ di truyền ở cấp độ phân tử của các giống sen trồng tại Huế, làm cơ sở khoa học cho việc tuyển chọn giống đặc trưng có sự khác biệt nổi trội về mặt di truyền để khai thác và phát triển tiềm năng kinh tế của các giống sen này tại Thừa Thiên Huế. Cây sen đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống như trang trí nghệ thuật, hoa cảnh, văn hóa tâm linh, ẩm thực và y học… Nhiều nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy các bộ phận khác nhau của cây sen có thể được sử dụng làm món ăn và vị thuốc có giá trị trong y học cổ truyền do có chứa nhiều hợp chất có bản chất là alkaloid và flavonoid với nhiều hoạt tính dược lý như chống viêm [61], bệnh tim mạch, cải thiện trí nhớ [182], chống oxy hóa [104], và hoạt tính ức chế khối u [109], và tác dụng trong việc cải thiện sức khỏe của con người [110]. Tuy nhiên việc nghiên cứu về tách chiết, phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học, đánh giá tiềm năng ứng dụng các hoạt chất này chưa được triển khai nhiều ở
3 các bộ phận của cây sen, đặc biệt ở hạt sen của các giống sen địa phương trồng tại Huế. Vì thế, việc nghiên cứu sự sai khác di truyền giữa các mẫu sen trồng tại Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị, tuyển chọn giống có sự khác biệt di truyền về kiểu gene đặc trưng để đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất tách chiết từ hạt sen của giống sen được tuyển chọn là việc làm rất cần thiết, phục vụ cho việc tuyển chọn giống để khai thác tiềm năng của cây sen và bảo tồn các giống sen địa phương quý. Xuất phát từ cở sở khoa học nêu trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen”. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu về cấp độ phân tử của một số vùng gene chỉ thị, xác định giống đặc trưng, thiết lập mối quan hệ di truyền ở các mẫu sen khác nhau trồng tại Huế, đồng thời cung cấp dữ liệu khoa học liên quan đến hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen của giống sen địa phương được tuyển chọn. 2. Mục tiêu của đề tài 2.1. Mục tiêu chung Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các mẫu sen trồng tại Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen giống sen địa phương. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Cung cấp dữ liệu khoa học về sự khác biệt trình tự các nucleotide của các vùng gene chỉ thị thu được từ các mẫu sen trồng ở các địa điểm khác nhau tại Huế, ký gửi dữ liệu và được cấp mã số trên GenBank. - Đánh giá việc ứng dụng một số vùng gene chỉ thị của hệ gene nhân và hệ gene lục lạp trong nghiên cứu phát hiện sự khác biệt trình tự các nucleotide của các vùng gene thu được từ các mẫu sen trồng ở các địa điểm khác nhau tại Huế. Khảo sát qui luật khác biệt, thiết lập mối quan hệ phát sinh dựa trên các vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide giữa một số mẫu sen trồng ở Huế, làm cơ sở khoa học cho việc tuyển chọn giống khác biệt đặc trưng để nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học.
4 - Nghiên cứu phân lập các hợp chất tinh khiết và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất tách chiết từ hạt sen của giống sen khác biệt đặc trưng được tuyển chọn, tạo tiền đề cho việc khai thác và sử dụng bền vững giống sen này tại Huế. 3. Phạm vi nghiên cứu Về thời gian: Các nghiên cứu được thực hiện từ 2017-2022, tại Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng và Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế. Về không gian: Đề tài được thực hiện với nguồn nguyên liệu thu thập tại những địa điểm trồng sen khác nhau tại Huế. Về lĩnh vực nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, bước đầu ứng dụng phương pháp giải trình tự gene đối với một số vùng gene chỉ thị trên cây sen trồng tại Huế đồng thời sử dụng phương pháp chiết tách hợp chất cổ điển dựa trên các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau nhằm phân lập một số hợp chất có trong hạt sen trắng địa phương và thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng. 4. Những đóng góp mới của đề tài - Đề tài đã đóng góp một số kết quả mới sau đây: 1. Xây dựng được bộ dữ liệu về sự khác biệt trình tự các nucleotide của 1 vùng gene chỉ thị từ hệ gene nhân và 9 vùng gene chỉ thị từ hệ gene lục lạp của 33 mẫu sen trồng tại các địa điểm khác nhau ở Huế. Từ đó đã ký gửi và được cấp mã số truy cập của 330 trình tự nucleotide của 10 vùng gene chỉ thị thu được từ 33 mẫu sen ở Huế trên GenBank. 2. Bước đầu phát hiện được qui luật khác biệt trình tự các nucleotide của một số vùng gene chỉ thị của 33 mẫu sen trồng tại các địa điểm khác nhau ở Huế, xây dựng được cây quan hệ phát sinh giữa 33 mẫu sen trồng ở Huế dựa trên các vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide, và tuyển chọn được giống Sen Trắng Trẹt Lõm có sự khác biệt đặc trưng về trình tự các nucleotide để nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong hạt sen. 3. Bước đầu phân lập được ba hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n-Butanol của hạt Sen Trắng Trẹt Lõm có bản chất alkaloid: nuciferine (NH2:C19H21NO2), armepavine (NH8:C19H23O3N), và anonaine (NH11:C17H15NO2).
5 4. Bước đầu ghi nhận ba hợp chất này có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhưng không thể hiện hoạt tính gây độc lên ba dòng tế bào ung thư MKN7, SK-Mel-2 và KB ở các nồng độ được nghiên cứu. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp dẫn liệu khoa học mới có giá trị về sự khác biệt ở mức độ di truyền phân tử của các mẫu sen trồng tại Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị, hợp chất có hoạt tính sinh học trong hạt sen quý của địa phương. Luận án là tài liệu tham khảo hữu ích cho công tác nghiên cứu, đào tạo, bảo tồn, phát triển và khai thác tiềm năng nguồn gene cây sen ở Huế nói riêng và ở Việt Nam nói chung. 5.2. Ý nghĩa thực tiển Kết quả nghiên cứu của đề tài bước đầu đã tìm ra được 7 trong tổng số 10 vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide giữa các mẫu sen như là một công cụ để phân biệt, nhận diện một số mẫu sen thuộc hai nhóm sen chính hiện trồng tại Huế. Đề tài đã phân lập và xác định được 3 hợp chất có hoạt tính sinh học trong hạt Sen Trắng Trẹt Lõm là giống sen địa phương - Làm cơ sở cho việc khai thác và phát triển và bảo tồn giống sen này ở Huế. Đề tài bước đầu giới thiệu được sự kết hợp nghiên cứu giữa sinh học phân tử với công nghệ chiết tách, phân lập hợp chất thiên nhiên ứng dụng trên cây sen - Đây là một hướng nghiên cứu mới có tính ứng dụng trong việc khai thác tiềm năng của cây sen và bảo tồn các giống sen quý địa phương ở Huế nói chung và các loài thực vật khác nói riêng.
6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây sen 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây sen là loài thực vật thủy sinh lâu năm có nguồn gốc từ châu Á, xuất phát từ Ấn Độ [156], sau đó lan qua Trung Quốc, Nhật Bản, vùng Đông Bắc Châu Úc và nhiều nước khác. Ngày nay, cây sen được trồng phổ biến tại Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc, đồng thời các sản phẩm từ cây sen cũng được tiêu thụ mạnh khắp châu Á [13]. Loài sen N. nucifera, thuộc chi Nelumbo Adans, họ sen-Nelumbonaceae, bộ sen-Nelumbonales, phân lớp Mộc Lan Magnoliales, lớp hai lá mầm-Dicotyledonae, ngành thực vật hạt kín-Angiospermea. Trong bộ sen chỉ có duy nhất một họ sen và chỉ có một chi Nelumbo với hai loài rất gần nhau là N. nucifera và Nelumbo lutea Willd. (N. lutea) [139], [72]. Ngoài ra, còn có một số giống sen cảnh được hình thành do sự lai tạo giữa loài N. lutea với N. nucifera [166]. Đặc điểm hình thái của hai loài sen này khác biệt nhau về kích cỡ cây, hình dạng lá, hình dạng và màu sắc cánh hoa [173]. Ở Việt Nam, cây sen chủ yếu là loài N. nucifera, phân bố rộng rãi khắp mọi nơi trong các ao, hồ, đầm lầy hay ruộng sâu. Trước đây cây sen chủ yếu mọc hoang dại theo trạng thái tự nhiên và đã có từ lâu, nhưng hiện nay ở một số nơi sen là cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao [9]. 1.1.2. Đặc điểm chung của cây sen Cây sen thường được trồng trong ao, ruộng lúa, thùng chứa, hồ nước cạn, trong chậu cảnh, hồ cảnh, hoặc trên cánh đồng tùy thuộc vào các mục đích khác nhau để làm đẹp cảnh quan, giúp bảo vệ môi trường, phục vụ giáo dục và khách du lịch [9]. Thời gian tối ưu để trồng sen là từ cuối tháng 3 và đầu tháng 5 tùy thuộc vào khí hậu địa phương [148]. Một chu kỳ sống của cây sen thường chưa tới 12 tháng, thông thường cây sen cần phải mất từ 4 - 6 tháng để hình thành lá, nụ, hoa, hạt, củ, trưởng thành trước khi bước sang giai đoạn ngừng sinh trưởng của cây. Cây sen phổ biến được trồng và canh tác bằng các phương pháp nhân giống thông thường như trồng từ củ sen, ngó sen hay hạt sen, nuôi cấy mô tế bào [148]. Cây sen là loài thực vật hai lá mầm, cây thủy sinh đa niên. Rễ sen thuộc dạng rễ chùm. Khi còn non rễ có màu trắng kem, mang ít lông hút. Khi già rễ chuyển sang