Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) ở miền Trung – Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:139

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật "Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) ở miền Trung – Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm" trình bày các nội dung chính sau: Tìm kiếm, phát hiện và xác định những hợp chất có hoạt tính sinh học đáng qu trong rễ cây mật nhân ở miền Trung – Tây Nguyên. Từ đó, ứng dụng bổ sung vào quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) ở miền Trung – Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA VÕ KHÁNH HÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT VÕ KHÁNH HÀ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) Ở MIẾN TRUNG – TÂY NGUYÊN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG, NĂM 2021
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÀ VÕ KHÁNH HÀ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) Ở MIẾN TRUNG – TÂY NGUYÊN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 9.54.01.01 ĐÀ NẴNG, NĂM 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định. Người cam đoan Võ Khánh Hà
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN TRANG TÓM TẮT MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2 3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu .......................................................................... 2 4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 2 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 4 6. Bố cục của luận án .............................................................................................. 5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 6 1.1. Tổng quan về cây mật nhân ...................................................................................... 6 1.1.1. Đặc điểm sinh thái, phân bố ......................................................................... 6 1.1.2. Thành phần hóa học của cây mật nhân ......................................................... 7 1.1.3. Tác dụng dược lý của cây mật nhân và ứng dụng trong dân gian ................ 9 1.2. Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu ........................................................... 12 1.2.1. Tổng quan về phương pháp chiết ............................................................... 12 1.2.2. Tổng quan về phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học ........... 15 1.2.3. Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học............................. 16 1.2.4. Tổng quan về quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe .................... 23 1.3. Tổng quan về tình hình nghiên cứu mật nhân trong và ngoài nước ....................... 27 1.3.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học............................................................. 27 1.3.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học ............................................................... 31 1.3.3. Nghiên cứu về phương pháp chiết .............................................................. 32 1.3.4. Nghiên cứu về ứng dụng mật nhân trong thực phẩm ................................. 33 1.4. Đánh giá tình hình nghiên cứu cây mật nhân ......................................................... 36
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 39 2.1. Nguyên liệu............................................................................................................. 39 2.1.1. Thu hái và định danh mẫu rễ cây mật nhân ................................................. 39 2.1.2. Xử lý nguyên liệu ........................................................................................ 39 2.2. Hóa chất, vật tư, thiết bị, dụng cụ........................................................................... 39 2.2.1. Hóa chất, vật tư ............................................................................................ 40 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................... 40 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát .................................................................................... 41 2.4. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm ................................................................... 42 2.4.1. Khảo sát, lựa chọn nguyên liệu ................................................................... 42 2.4.2. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ rễ cây mật nhân .................................................................................................................. 43 2.4.3. Phương pháp xây dựng quy trình chiết rễ mật nhân ................................... 48 2.4.4. Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân ....................... 54 2.4.5. Nghiên cứu ứng dụng bổ sung mật nhân trong sản xuất một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe ............................................................................................................. 55 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 60 3.1. Định danh mẫu thực vật và lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu ............................... 60 3.1.1. Kết quả định danh mẫu thực vật ................................................................. 60 3.1.2. Đánh giá, lựa chọn vùng nguyên liệu nghiên cứu ...................................... 60 3.2. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học ...................................................... 65 3.2.1. Kết quả phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất nhóm alkaloid .............. 65 3.2.2. Kết quả phân lập, định danh các hợp chất không thuộc nhóm alkaloid ..... 71 3.3. Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân ............................................................. 77 3.3.1. Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong dung môi ethanol 80 % ............................................................................ 77 3.3.2. Xây dựng quy trình chiết rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu trong nước ......................................................................................................... 79 3.4. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân .............................. 85 3.4.1. Kết quả thử khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 80 % từ rễ cây mật nhân .......................................................................... 85
3.4.2. Kết quả thử khả năng kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm .......................................................................................................... 88 3.4.3. Kết quả thử khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO ............................. 90 3.4.4. Khả năng ức chế enzyme -glucosidase .................................................... 91 3.4.5. Kết quả thử khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết nước .... 91 3.4.6. Kết quả thử khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết nước ......................... 93 3.4.7. Kết quả thử độc tính bất thường của dịch chiết nước rễ cây mật nhân ...... 94 3.4.8. Kết quả thử khả năng không gây độc đối với tế bào thận gốc phôi ở người HEK-293 ........................................................................................................................ 94 3.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe ...... 96 3.5.1. Sản phẩm cao chiết mật nhân ..................................................................... 96 3.5.2. Sản phẩm trà thảo mộc mật nhân .............................................................. 100 3.5.3. Nghiên cứu sản xuất sản phẩm nước rau má mật nhân ............................ 105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 112 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT EU Liên minh châu Âu The European Union QCVN Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia DĐVN Dược điển Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn kỹ thuật Việt Nam MKN7 Ung thư dạ dày ở người Human Gastric Carcinoma SW626 Ung thư buồng trứng ở người Human Ovarian Adenocarcinoma HL Ung thư bạch cầu cấp tính Human Acute Leukemia leukemic ở người SK-Mel-2 Ung thư da người Human Malignant Melanoma NIH/3T3 Nguyên bào sợi của gốc phôi chuột Mouse Embryo Fibroblast Lu Ung thư phổi ở người Human Lung Carcinoma MCF-7 Ung thư vú ở người Human Breast Carcinoma IC50 Nồng độ ức chế tối đa 50 % Half Maximal Inhibitory Concentration IL Interleukine MBC Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Minimum Bactericidal Concentration MIC Nồng độ ức chế tối thiểu Minimal Inhibited Concentration NCI Viện Ung thư quốc gia Hoa Kỳ National Cancer Institute OD Mật độ quang học Optical Denisity LPS Lipopolysaccharide TNF Yếu tố hoại tử khối u alpha Tumor Necrosis Factor RNI Nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị Recommended Nutrition Intakes CODEX Cơ sở dữ liệu về an toàn thực phẩm Codex Alimentarius DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl NMR Cộng hưởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic Resonance MS Phổ khối Mass spectrometry HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High-performance liquid chromatography IR Phổ hồng ngoại Infrared spectroscopy CC Sắc ký cột Column chromatography
TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography NOESY Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy DEPT Phổ DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer COSY Phổ tương quan proton – Proton Correlation spectroscopy HSQC Phổ tương tác dị nhân đơn liên kết Heteronuclear single quantum coherence spectroscopy HMBC Phổ tương tác dị nhân đa liên kết Heteronuclear Multiple Bond Correlation QPA Phân tích chương trình chất lượng Quality Program Analysis ESI Ion hóa đầu phun điện tử Electrospray Ionization GMP Thực hành sản xuất tốt Good Manufacturing Practice HMP Pectin methoxyl hóa cao High Methoxyl Pectin DE Chỉ số este hóa Degree of Ester DA Chỉ số amin hóa Degree of Amine MI Chỉ số methoxyl Methoxyl Index ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm SKC Sắc ký cột
DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang Bảng 1.1. Danh mục các hợp chất được phân lập từ cây mật nhân 30 Bảng 1.2. Một số sản phẩm mật nhân được bán trên thị trường ở một số 34 nước trên thế giới Bảng 1.3. Một số sản phẩm và liều lượng mật nhân sử dụng tại EU 34 Bảng 2.1. Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 51 Bảng 2.2. Ma trận và kết quả thí nghiệm 51 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố nhiệt độ 52 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 52 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát yếu tố thời gian chiết 53 Bảng 2.6. Ma trận và kết quả thí nghiệm 54 Bảng 3.1. Phân tích một số thành phần hóa học trong rễ mật nhân tại Gia 61 Lai và Quảng Nam Bảng 3.2. Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết ethanol 80 % rễ 61 cây mật nhân tại huyện Ia Grai, tỉnh Gia Lai Bảng 3.3. Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết ethanol 80 % rễ 62 cây mật nhân tại huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam Bảng 3.4. Giá trị IC50 của dịch chiết rễ mật nhân và vitamin C 64 Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 1 65 Bảng 3.6. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 2 67 1 13 Bảng 3.7. Số liệu phổ H- và C-NMR của chất 3 68 Bảng 3.8. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 4 70 Bảng 3.9. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 5 71 Bảng 3.10. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 6 và chất 7 74 Bảng 3.11. Bảng tổng hợp kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các 76 chất từ rễ cây mật nhân Bảng 3.12. Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết ethanol 80 % rễ 86 cây mật nhân Bảng 3.13. Khả năng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết nước rễ cây mật 87 nhân Bảng 3.14. Khả năng ức chế sản sinh NO của dịch chiết nước ở các nồng độ 90 khác nhau Bảng 3.15. Khả năng ức chế enzyme -glucosidase của dịch chiết nước 91
Bảng 3.16. Giá trị IC50 kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết nước 92 Bảng 3.17 Kết quả đo ABS đối với dịch chiết rễ cây mật nhân và acid 93 ascorbic Bảng 3.18. Bảng giá trị IC50 của dịch chiết rễ cây mật nhân và acid ascorbic 93 Bảng 3.19. Kết quả thử độc tính bất thường của dịch chiết nước rễ mật nhân 94 Bảng 3.20. Khả năng gây độc tế bào HEK-293 của dịch chiết rễ cây mật 94 nhân Bảng 3.21. Kết quả các chỉ tiêu chất lượng cao chiết mật nhân 97 Bảng 3.22. Kết quả định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết mật 98 nhân Bảng 3.23. Kết quả kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm cao mật nhân 99 Bảng 3.24. Bảng kết quả đánh giá cảm quan 103 Bảng 3.25. Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu trà thảo mộc mật nhân 104 Bảng 3.26. Chiều cao cột lắng qua mỗi ngày theo từng nồng độ pectin 105 Bảng 3.27. Điểm đánh giá cảm quan thị hiếu người tiêu dùng 109 Bảng 3.28. Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu nước rau má mật nhân 110
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình Trang Hình 1.1. Hình ảnh cây mật nhân tại vùng núi Gia Lai 6 Hình 2.1. Một số hình ảnh của rễ mật nhân 39 Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu 41 Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các chất nhóm alkaloid 44 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất không thuộc nhóm alkaloid 47 Hình 2.5. Hệ thống chưng ninh hồi lưu 48 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình chiết 49 Hình 3.1. Sự thay đổi màu DPPH theo nồng độ 62 Hình 3.2. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin C, dịch chiết rễ mật 63 nhân Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam Hình 3.3. Đường xu hướng của khả năng bắt gốc tự do DPPH của vitamin 63 C, dịch chiết rễ mật nhân Gia Lai và dịch chiết rễ mật nhân Quảng Nam. Hình 3.4. Sự ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ chiết và thời gian chiết đến 79 hiệu suất chiết rễ cây mật nhân trong dung môi ethanol 80 % Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng EL4 80 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng EL4 81 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng EL4 82 Hình 3.8. Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong ethanol 84 Hình 3.9. Sơ đồ quy trình chiết mật nhân trong nước 85 Hình 3.10. Khả năng ức chế sản sinh TNF-anpha của dịch chiết nước tại các 88 nồng độ khác nhau Hình 3.11. Khả năng ức chế sản sinh IL-6 của dịch chiết nước tại các nồng 89 độ khác nhau Hình 3.12. Khả năng ức chế sản sinh IL-8 ở dịch chiết nước tại các nồng độ 89 khác nhau Hình 3.13. Sơ đồ quy trình sản xuất cao mật nhân 96 Hình 3.14. Sơ đồ quy trình sản xuất trà thảo mộc mật nhân 102 Hình 3.15. Biểu đồ mạng nhện thể hiện mức độ ưa thích đối với sản phẩm 103 trà thảo mộc mật nhân
Hình 3.16. Sự biến đổi chiều cao cột lắng theo thời gian 106 Hình 3.17. Quy trình công nghệ sản xuất nước rau má mật nhân 108 Hình 3.18. Biểu đồ mạng nhện thể hiện mức độ ưa thích đối với sản phẩm 109 nước rau má mật nhân
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Mật nhân là một loại thực vật có hoa thuộc họ Simaroubaceae họ Thanh Thất có nguồn gốc từ Đông Nam Á Mật nhân được sử dụng phổ biến, có tên khoa học là eurycoma longifolia jack hay còn gọi là cây bách bệnh, mật nhơn hay hậu phác nam. Nhiều công trình khoa học nghiên cứu về cây mật nhân trên thế giới đã được công bố và được ứng dụng rộng rãi với kết quả phân lập được nhiều hợp chất hữu cơ có giá trị, các chiết xuất từ mật nhân được sử dụng để bổ sung vào sản xuất các sản phẩm dược phẩm, thực phẩm có lợi cho sức khỏe. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh, rễ cây mật nhân là thành phần có giá trị nhất và được sử dụng để điều trị đau nhức, ăn uống không tiêu, no hơi, đầy bụng, sốt dai d ng, sốt r t, suy dương, kiết l , sưng tuyến và có thể d ng làm thuốc bổ tăng cường sức khỏe Các chiết xuất từ mật nhân đã được con người sử dụng để chống sốt r t, thuốc tăng trưởng hormone sinh dục và thuốc hạ nhiệt Ngoài ra, chiết xuất từ rễ cây mật nhân còn được d ng để khôi phục năng lượng và sinh khí, tăng cường lưu thông máu và có vai trò tốt đối với phụ nữ sau khi sinh con. Bên cạnh đó, chiết xuất này còn chứa các hợp chất có hoạt tính chống khối u và chống k sinh tr ng, chống lo t Trong đó, được biết đến nhiều nhất là tác dụng làm tăng cường lượng hormone nội sinh testosterol ở nam giới. Ở nước ta, hiện nay, mật nhân không những được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền mà còn có một số công trình nghiên cứu khoa học được công bố, khá nhiều hợp chất có giá trị được tìm thấy và đã ứng dụng mật nhân vào sản xuất một số sản phẩm. Tại khu vực miền Trung - Tây Nguyên, đặc biệt là vùng núi các tỉnh như Gia Lai, Quảng Nam, Huế, cây mật nhân phát triển rất nhiều, người dân khai thác và sử dụng chúng như một loại thuốc bổ rất phổ biến, đặc biệt là rễ. Tuy nhiên, các nghiên cứu được công bố trên đối tượng tại những địa phương này không mang tính hệ thống, chưa có công trình nghiên cứu nào công bố chi tiết và đầy đủ về phân lập, ứng dụng những hoạt tính sinh học quý có trong rễ mật nhân để làm cơ sở ứng dụng trong công nghệ sản xuất sản phẩm thực phẩm. Ngoài ra, ứng dụng mật nhân chủ yếu trong lĩnh vực dược phẩm, trong khi đó, ứng dụng bổ sung mật nhân vào sản xuất thực phẩm chưa nhiều và đa dạng, đặc biệt, chưa có nhiều sản phẩm nghiên cứu làm giảm vị đắng khó chịu khi bổ sung mật nhân
2 để tạo thành sản phẩm có giá trị dược lý và có giá trị cảm quan. Với những tác dụng to lớn như trên của mật nhân, một loại dược liệu qu và tình hình thực trạng nghiên cứu về mật nhân tại miền Trung - Tây Nguyên hiện nay, đồng thời nhằm đa dạng hóa sản phẩm thực phẩm, nâng cao giá trị kinh tế và khuyến khích công tác bảo tồn nguồn nguyên liệu thiên nhiên này của địa phương, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Xây dựng quy trình công nghệ chiết tách, xác định thành phần hóa học của rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia Jack) ở khu vực miền Trung - Tây Nguyên và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tìm kiếm, phát hiện và xác định những hợp chất có hoạt tính sinh học đáng qu trong rễ cây mật nhân ở miền Trung – Tây Nguyên. Từ đó, ứng dụng bổ sung vào quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe. 3. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Rễ cây mật nhân được thu nhận tại vùng nguyên liệu được lựa chọn ở khu vực vùng núi tỉnh Gia Lai và Quảng Nam. Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát, đánh giá lựa chọn nguyên liệu để phục vụ toàn bộ quá trình nghiên cứu, sử dụng các phương pháp phân lập, định danh xác định thành phần các hợp chất chính Thăm dò một số hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây mật nhân. Ứng dụng sản xuất một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe với quy mô phòng thí nghiệm. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo, các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về đặc điểm, cấu trúc, thành phần, các phương pháp thu nhận cao chiết, khảo sát hoạt tính sinh học và ứng dụng của rễ cây mật nhân trong nước và trên thế giới. 4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 4.2.1. Phương pháp phân lập, định danh và xác định cấu trúc hóa học 4.2.1.1. Phương pháp phân lập Chiết các hợp chất thuộc nhóm alkaloid bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu với dung môi là nước để chiết các hợp chất chủ yếu tan nhiều trong dung môi phân cực. Chiết các hợp chất khác bằng phương pháp chiết Soxhlet với dung môi hữu cơ
3 ít phân cực để chiết các hợp chất chủ yếu tan nhiều trong dung môi ít phân cực hoặc không phân cực. Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký, tinh chế bằng phương pháp kết tinh phân đoạn, trong đó, cao chiết trong các dung môi khác nhau được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp. Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp. 4.2.1.2. Phương pháp định danh, xác định cấu trúc hóa học của các chất Các phương pháp định danh, xác định cấu trúc hóa học phổ biến: Kết hợp giữa các phương pháp vật lý (tonc, []D) và các phương pháp phổ hiện đại: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ khối ion hóa bằng bụi electron (ESI- MS), phổ khối có độ phân giải cao (HR-ESI-MS , phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY). 4.2.1.3. Phương pháp tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1, 2 mức với k yếu tố ảnh hưởng - Xây dựng quy trình tối ưu để chiết những hợp chất có lợi bổ sung vào quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe - Khảo sát các điều kiện thu nhận cao chiết bằng phương pháp chưng ninh hồi lưu. - Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng phương pháp chưng ninh hồi lưu Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1, 2 mức với k yếu tố ảnh hưởng (TYT 2k). - Các yếu tố khảo sát gồm: Thời gian chiết, nhiệt độ chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 4.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của các dịch chiết - Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư - Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO - Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase - Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền
4 viêm và cytokine gây viêm - Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định - Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa - Phương pháp thử độc tính - Phương pháp thử khả năng không gây độc đối với tế bào người 4.2.3. Phương pháp sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Nghiên cứu quy trình sản xuất của một số sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình công nghệ tạo ra sản phẩm đáp ứng quy định hiện hành của Nhà nước đối với thực phẩm bảo vệ sức khỏe. 4.2.4. Phương pháp đánh giá mức độ an toàn thực phẩm Xác định hàm lượng kim loại nặng, vi sinh vật gây bệnh trong nguyên liệu và sản phẩm bằng các thiết bị và phương pháp phân tích hiện đại. 4.2.5. Phương pháp phân tích và đánh giá cảm quan sản phẩm thực phẩm Sản phẩm thực phẩm mới, đặc biệt là trong sản phẩm có vị đắng của mật nhân đòi hỏi phải được người tiêu dùng chấp nhận, do đó, yêu cầu sản phẩm phải được đánh giá cảm quan là cần thiết và quan trọng. Sử dụng phương pháp cho điểm thị hiếu để đánh giá mức độ chấp nhận của người tiêu d ng đối với sản phẩm. 4.2.6. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng các phần mềm xử lý số liệu: TableCurve 2Dv4, Matlab R2016a, Anova, Excel. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài * Ý nghĩa khoa học - Cung cấp các thông tin khoa học về thành phần và hoạt tính sinh học của rễ cây mật nhân được thu hái tại Gia Lai Góp phần làm phong phú nguồn dữ liệu về hợp chất thiên nhiên của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. - Cung cấp các thông tin khoa học của những sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe được ứng dụng từ rễ mật nhân * Ý nghĩa thực tiễn - Đặt cơ sở cho việc xây dựng quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bổ sung cao chiết mật nhân có hiệu quả cao, thúc đẩy sự phát triển đa dạng của ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm có lợi cho sức khỏe người tiêu d ng.
5 - Góp phần nâng cao giá trị kinh tế của rễ cây mật nhân tại v ng núi các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên - Làm cơ sở để phát triển ngành công nghiệp khai thác và ứng dụng các loại thảo dược qu tại địa phương. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 123 trang (không kể phần phụ lục), kết cấu bao gồm: Mở đầu có 5 trang trình bày tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, nghĩa khoa học, nghĩa thực tiễn của luận án. Nội dung chính gồm 3 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu gồm 32 trang; Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu, gồm có 18 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu gồm có 52 trang; Phần kết luận và kiến nghị gồm 3 trang; Các công trình nghiên cứu đã công bố 1 trang. Ngoài ra phần các công trình công bố và tài liệu tham khảo gồm 12 trang. Trong luận án tổng cộng có 37 bảng, 28 hình vẽ và đồ thị. Có 114 tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh và trang web.
6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây mật nhân 1.1.1. Đặc điểm sinh thái, phân bố Mật nhân, còn gọi là bá bệnh, hậu phác, tho nan Lào , antongsar Campuchia , danh pháp khoa học: Eurycoma longifolia Jack, là loại cây có hoa thuộc họ Thanh Thất Simaroubaceae, loài bản địa ở Malaysia, Indonesia, Việt Nam, mật nhân phân bố ít hơn ở Thái Lan, Lào và Ấn Độ. Ở Indonesia, cây mật nhân tự nhiên mọc duy nhất ở Sumatra và Kalimanta [1] [2]. Cây mật nhân (hình 1.1) là loại cây nhỏ có cành, bụi thân mảnh, sinh trưởng ở tầng rừng thấp, trên đất sỏi, ưa chua và dẫn lưu nước tốt Cây có kích thước trung bình, có thể cao đến 10 m, thường không phân nhánh Lá kép lông chim chẵn có thể dài đến 1m, cuống lá màu nâu đỏ Mỗi lá k p gồm 30 – 40 lá ch t, hình mũi mác hoặc hình trứng ngược Mỗi lá ch t dài khoảng (5 – 20) cm, rộng (1,5 – 6) cm, mặt trên của lá màu xanh, mặt dưới màu trắng Hoa mọc thành cụm hình ch y ở nách lá, màu đỏ nâu, có nhiều lông tơ mịn Hoa lưỡng tính, cánh hoa nhỏ, rất mềm Quả hạch cứng, hình trứng, nâu vàng khi còn non và trở thành nâu đỏ khi chín Vỏ và rễ của mật nhân thường có màu trắng hoặc vàng ngà [1] [2]. Hình 1.1. Hình ảnh cây mật nhân tại vùng núi Gia Lai
7 Mật nhân thường mọc ở v ng đồi núi có sườn dốc cao, v ng đất cát có tính acid, nghèo chất dinh dưỡng mọc dưới tán cây, thích hợp ở những nơi có nhiệt độ trung bình 25 0C và độ ẩm khoảng 80 – 90 % mọc trong các khu rừng ven bờ biển hoặc rừng nguyên sinh, rừng tái sinh và các khu rừng hỗn tạp, rừng thưa, cây ưa acid và đất cát ở độ cao khoảng 700 m so với mực nước biển [1] [2]. Mật nhân được xem là loại thảo dược quý, các bộ phận của cây mật nhân gồm lá, quả, thân, đặc biệt là rễ có tác dụng điều trị nhiều bệnh Hiện nay, mật nhân được d ng rộng rãi ở rất nhiều nơi trên thế giới, trong đó, có ở cả ở châu Âu, Hoa Kỳ, dưới dạng thực phẩm bổ sung và nước uống [1]. Cây mật nhân mọc nhiều nơi ở nước ta, nhưng phổ biến nhất là ở miền Trung và một số v ng Tây Nguyên như: Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Gia Lai, trong đó, ở v ng núi tỉnh Gia Lai như huyện Kbang, huyện Ia-Grai, cây mật nhân mọc tự nhiên rất nhiều và được khai thác với số lượng lớn [1] [2]. 1.1.2. Thành phần hóa học chính của cây mật nhân Thành phần hóa học của mật nhân rất đa dạng, mỗi bộ phận của cây thì có các thành phần khác nhau, bao gồm những hợp chất thuộc nhóm triterpen với ba khung sườn quassinoid, squallan và tirucallan. Ngoài ra, còn có alkaloid (các dẫn chất có khung cơ bản canthin-6-one và β-carbolin), steroid, coumarin, acetic acid, benzoic acid, menthol… Trong đó, quassinoid và alkaloid đóng vai trò quan trọng và là hoạt chất chủ yếu của các cây họ Thanh Thất (Simarubaceae) nói chung và cây mật nhân nói riêng [3]. Quassinoid là thành phần chất đắng đặc trưng của những thực vật thuộc họ Thanh Thất Các hợp chất quassinoid đều là dẫn xuất của các hợp chất triterpenoid và hầu như đa phần đều có dẫn xuất từ tetracyclic triterpend Đa số các quassinoid đều có dược tính; xu hướng phổ biến của các quassinoid là được sử dụng trong điều trị viêm khớp, chống sốt, điều trị bệnh viêm đường ruột, [4]. Nhiều hợp chất quassinoid được tìm thấy ở phần thân và rễ Trong đó, eurycomanone và eurycomanol là hai quassinoid điển hình trong rễ mật nhân Các hợp chất này làm tăng nội tiết tố testosterone và lượng tinh dịch ở chuột đực [5] Ba dạng quassinoid Eurycolactone D, E và F cũng được phân lập từ phần rễ theo báo cáo vào năm 2002 của Ang và cộng sự [6] Vào năm 2009, nhóm nghiên cứu Miyake và cộng sự đã phân lập được 34 loại
8 quassinoid từ phần thân đồng thời đã khám phá ra 10 hợp chất mới và chứng minh hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này [7]. Quassinoid có thể được phân loại thành năm loại chính dựa theo bộ khung carbon cấu tạo nên hợp chất đó, bao gồm nhóm quassinoid có 18 nguyên tử carbon C18 , 19 nguyên tử carbon C19 , loại có 20 nguyên tử carbon C20 , loại có 22 nguyên tử cacbon C22 và loại có 25 nguyên tử carbon C25 trong công thức phân tử Cấu trúc của quassinoid phụ thuộc nhiều vào bộ khung carbon chính [4]. Alkaloid là một chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược tính mạnh, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc thử của alkaloid Alkaloid là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ đa số có nhân vòng Các alkaloid trong cây mật nhân là các dẫn xuất có khung cơ bản canthin-6-one và β-carboline Một số alkaloid được tìm thấy trong rễ mật nhân như n -pentyl β-carboline-1-propionate, 5- hydroxymethyl-9-methoxycanthin-6-one và 1-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one, các hợp chất này có hoạt tính gây độc tế bào và chống sốt r t Bên cạnh đó, nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào sợi nhân HT-1080 của các hợp chất trong mật nhân, nhóm tác giả Miyake và cộng sự vào năm 2010 đã nghiên cứu và công bố hợp chất 9,10- dimethoxy-canthin-6-one hiển thị hoạt động gây độc tế bào này mạnh nhất với nồng độ tác dụng IC50 = 5,0 μM [5]. Alkaloid thường là các hợp chất có trọng lượng phân tử cao; ở thế rắn khi ở nhiệt độ thường, một vài alkaloid ở dạng lỏng Một số alkaloid không đo được độ chảy do nó bị phá huỷ ở nhiệt độ thấp hơn độ chảy Đa số các alkaloid thường không màu hoặc màu trắng, một số có màu vàng Ngoài ra, có một số alkaloid ở dạng bazơ không màu nhưng muối của nó với acid lại có màu Các alkaloid thường có vị đắng Do cấu trúc của phân tử alkaloid phức tạp có chứa cacbon bất đối nên có tác dụng với ánh sáng phân cực Alkaloid tự nhiên thường có tác dụng quay mặt ph ng ánh sáng phân cực sang trái [8]. Alkaloid thường chứa trong các bộ phận của cây như hoa, lá, rễ, hạt, vỏ Có trường hợp, trong c ng một cây, bộ phận này rất giàu alkaloid nhưng bộ phận khác lại không có Lượng alkaloid và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây có thể thay đổi tuỳ theo m a thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Trong c ng một