Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:172

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò, và thịt gà tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội; xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được; phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THANH VIỆT NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2020
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***………… NGUYỄN THANH VIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã sỗ: 9 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Nghiêm Ngọc Minh 2. PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy Hà Nội – 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan. Các kết quả nghiên cứu này đã được công bố trên các tạp chí quốc tế và tạp chí chuyên ngành trong nước với sự đồng ý của các đồng tác giả. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào của tác giả khác. Tác giả luận án Nguyễn Thanh Việt
Lời cảm ơn Để hoàn thành luận án này, trước tiên tôi xin cảm ơn GS. TS. Nghiêm Ngọc Minh, Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu Hệ gen và PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy, Phó Trưởng phòng Hệ gen học Vi sinh, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Quân y, Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng đã tạo điều kiện cho tôi được học tập tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo viện Nghiên cứu hệ gen đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại viện. Cảm ơn TS. Nguyễn Thị Thanh Ngân, chuyên viên đào tạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi hoàn thành những thủ tục cần thiết trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng Đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học. Tôi xin cảm ơn Khoa xét nghiệm, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác, Học viện Quân y đã giúp tôi thực hiện một số thí nghiệm trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn TS. Moreland Gibbs, Trung tâm hỗ trợ phần mềm Genenious, New Zealand, đã giúp đỡ tôi trong quá trình phân tích số liệu. Cảm ơn các đồng nghiệp đã đóng góp, giúp đỡ tôi hoàn thiện luận án của mình. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc đến gia đình, những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thanh Việt
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tên tiếng việt AM Ampicillin BHI Brain Heart Infusion Broth Canh thang BHI C Chloramphenicol CAZ Ceftazidime CIP Ciprofloxacin DNA Deoxyribonucleic Acid Axit đêôxiribônuclêic RNA Ribonucleic Acid Axit ribônuclêic GN Gentamycin GI Genomic Island KSĐ Kháng sinh đồ LCS Longest Contig Size Độ dài contig dài nhất LPS Lipopolysaccharide MDR Multidrug Resistance Đa kháng kháng sinh MSS Mean Sequence Size Kích thước trung bình của trình tự NC Number of Contigs Số lượng các contig NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới OMP Outer Membrane Protein Protein màng ngoài R Resistant Đề kháng S Sensitive Nhạy cảm STR Streptomycin SCS Shortest Contig Size Độ dài contig ngắn nhất SXT Sulfamethoxazol/Trimetoprim TE Tetracycline
MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục các từ viết tắt Mục lục Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella....................................................... 3 1.1.1. Hình thái .......................................................................................... 3 1.1.2. Tính chất nuôi cấy ........................................................................... 3 1.1.3. Tính chất hóa sinh ........................................................................... 4 1.1.4. Sức đề kháng .................................................................................... 4 1.1.5. Kháng nguyên .................................................................................. 4 1.1.5.1. Kháng nguyên O ......................................................................... 5 1.1.5.2. Kháng nguyên H ......................................................................... 5 1.1.5.3. Kháng nguyên Vi......................................................................... 6 1.1.6. Phân loại .......................................................................................... 6 1.2. Đặc điểm hệ gen của Salmonella .......................................................... 8 1.2.1. Cấu trúc hệ gen ................................................................................ 8 1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella ....................................... 10 1.2.2.1. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside ..................... 11 1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm β-lactam ................................ 12 1.2.2.3. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm phenicol ................................. 13 1.2.2.4. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolone............................... 13 1.2.2.5. Cơ chế kháng kháng sinh tetracycline ...................................... 13 1.2.2.6. Cơ chế kháng sulfonamide và trimethoprim ............................ 14
1.2.3. Liên quan giữa đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở vi khuẩn ........................................................................................................ 15 1.2.4. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc ................................ 15 1.2.4.1. Phân loại các loại kênh bơm thải thuốc ................................... 16 1.2.4.2. Liên quan giữa kênh bơm thải thuốc và kháng kháng sinh ở Salmonella ............................................................................................. 18 1.3. Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong thực phẩm ................................................................................................... 19 1.3.1. Trên thế giới ................................................................................... 19 1.3.2. Tại Việt Nam .................................................................................. 22 1.4. Một số kỹ thuật hay được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen ...................................................................................................................... 23 1.4.1. Reverse transcription PCR (RT-PCR) .......................................... 24 1.4.2. Real-time PCR (qPCR) .................................................................. 24 1.4.3. Microarray...................................................................................... 24 1.4.4. Giải trình tự thế hệ mới ................................................................. 26 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 28 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................ 28 2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................... 28 2.1.2. Môi trường, hóa chất, kháng sinh, các bộ kit .............................. 29 2.1.2.1. Môi trường, hóa chất phân lập Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002 .............................................................................................. 29 2.1.2.2. Môi trường dùng để làm kháng sinh đồ ................................... 33 2.1.2.3. Kháng sinh ................................................................................ 34 2.1.2.4. Các bộ kít .................................................................................. 34 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ........................................................................ 35 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................... 37 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu ................................................................. 37 2.2.2. Định danh Salmonella ................................................................... 37 2.2.2.1. Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc ............................................... 37
2.2.2.2. Tăng sinh chọn lọc .................................................................... 37 2.2.2.3. Quy trình khẳng định ................................................................ 38 2.2.3. Kháng sinh đồ ................................................................................ 41 2.2.4. Giải trình tự thế hệ mới ................................................................. 42 2.2.4.1. Tách chiết, tinh sạch RNA tổng số và thiết lập thư viện cDNA 42 2.2.4.2. Giải trình tự thế hệ mới bằng công nghệ Illumina ................... 42 2.2.5. Nhóm phương pháp tin sinh học .................................................. 43 2.2.5.1. Kiểm tra chất lượng trình tự ..................................................... 43 2.2.5.2. Lọc trình tự chất lượng cao bằng phần mềm Trimmomatic [57] ................................................................................................................ 43 2.2.5.3. Lắp ráp de novo ........................................................................ 43 2.2.5.4. Chú thích hệ gen biểu hiện ....................................................... 44 2.2.5.5. Xác định các gen kháng kháng sinh ......................................... 44 2.2.5.6. Xác định đột biến gen kháng kháng sinh .................................. 44 2.2.6. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger ................................................................. 45 2.2.7. Xử lý thống kê ................................................................................ 45 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 46 3.1. Phân lập và định danh type các chủng Salmonella nghiên cứu ... 46 3.1.1. Kết quả phân lập Salmonella ........................................................ 46 3.1.2. Kết quả định danh type các chủng Salmonella phân lập được 56 3.2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được ............................................................................................................. 59 3.2.1. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được .......................................................................................................... 61 3.2.2. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập.............................................................................................................. 63 3.2.3. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập ................................................................................................................... 65 3.2.4. Kiểu hình kháng kháng sinh ......................................................... 66
3.3. Kết quả phân tích các nhóm gen ở một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh ....................................................................................... 69 3.3.1. Số lượng trình tự đọc (read) .......................................................... 71 3.3.2. Lắp ráp de novo .............................................................................. 72 3.3.3. Chú thích chức năng các gen........................................................ 73 3.3.4. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella nghiên cứu ... 74 3.3.4.1. Nhóm gen kháng kháng sinh ..................................................... 74 3.3.4.2. Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone .................... 87 3.3.4.3. Nhóm gen liên quan đến hệ thống kênh bơm thải thuốc (efflux pump) ..................................................................................................... 90 3.3.4.4. Nhóm gen độc lực ..................................................................... 97 3.3.4.5. Nhóm gen liên quan đến tổng hợp flagellar ............................. 99 3.3.4.6. Nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp Lipopolysaccharide (LPS) và thành tế bào .......................................................................... 101 3.3.4.7. Nhóm gen đáp ứng với các chất gây độc................................ 102 3.3.4.8. Nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage................ 105 3.3.4.9. Nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC ..................... 107 3.4. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger ................................................................. 110 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 114 Kết luận ........................................................................................................ 114 Kiến nghị ...................................................................................................... 114 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .......................................... 115 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ........................................................................................... 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 117 PHỤ LỤC ................................................................................................... 1 Phụ lục 1. Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện cDNA bằng máy Bioanalyzer. ................................................................................................ 1 Phụ lục 2. Gen độc lực biểu hiện ở các mẫu nghiên cứu. .......................... 4
Phụ lục 3. Biểu hiện của các gen liên quan đến flagellar ........................ 14 Phụ lục 4. Các gen tổng hợp LPS và thành tế bào ................................... 16 Phụ lục 5. Các gen liên quan đến các yếu tố di truyền vận động, phage, và prophage. ................................................................................................... 18 Phụ lục 6. Các gen liên quan đến tác động bất lợi của môi trường biểu hiện ở cả 6 mẫu nghiên cứu. ..................................................................... 20
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1. Các gen kháng tetracycline [17] ..................................................... 14 Bảng 1.2. Hệ thống kênh bơm thải thuốc và cơ chất ở Salmonella ................ 17 Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu, số mẫu và ký hiệu mẫu..................................... 28 Bảng 2.2. Thành phần các môi trường và hóa chất sử dụng để định danh Salmonella ....................................................................................................... 29 Bảng 2.3. Thành phần môi trường BHI .......................................................... 33 Bảng 2.4. Thành phần môi trường Muller Hinton .......................................... 34 Bảng 2.5. Kháng sinh sử dụng làm kháng sinh đồ.......................................... 34 Bảng 2.6. Giải thích kết quả các phép thử khẳng định. .................................. 41 Bảng 2.7. Điểm phred và độ chính xác của trình tự [56] ................................ 43 Bảng 3.1. Kết quả tăng sinh sơ bộ không chọn lọc và tăng sinh chọn lọc 90 mẫu nghiên cứu ............................................................................................... 47 Bảng 3.2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của 25 chủng vi khuẩn mọc được trên các môi trường tăng sinh chọn lọc .......................................... 49 Bảng 3.3. Kết quả phân lập các chủng Salmonella ở các mẫu nghiên cứu .... 53 Bảng 3.4. Danh sách các mẫu dương tính với Salmonella ............................. 54 Bảng 3.5. Kết quả định danh type của các chủng Salmonella ở các mẫu nghiên cứu ....................................................................................................... 57 Bảng 3.6. Mức độ đề kháng kháng sinh của Salmonella phân lập được ........ 61 Bảng 3.7. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập .................................................................................................................... 64 Bảng 3.8. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập ... 65 Bảng 3.9. Kiểu hình kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được ................................................................................................................. 66 Bảng 3.10. Danh sách Salmonella đa kháng kháng sinh ................................ 68 Bảng 3.11. Nồng độ RNA tổng số của các mẫu nghiên cứu. ......................... 70 Bảng 3.12. Tóm tắt số lượng trình tự RNA của Salmonella ........................... 71 Bảng 3.13. Kết quả lắp ráp de novo hệ gen biểu hiện của các Salmonella..... 72
Bảng 3.14. Trình tự mã hóa ở 6 mẫu nghiên cứu ........................................... 74 Bảng 3.15. Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu ................................................................... 75 Bảng 3.16. Kết quả chi tiết các gen kháng kháng sinh biểu hiện ở các mẫu nghiên cứu. ...................................................................................................... 79 Bảng 3.17. Kết quả xác định đột biến gen kháng kháng sinh nhóm quinolone ......................................................................................................................... 87 Bảng 3.18. Kết quả xác định biểu hiển các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc ở các mẫu nghiên cứu ............................................................................ 91 Bảng 3.19. Các gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC. .......................... 108
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1. Kháng nguyên của Salmonella [4]. ................................................... 4 Hình 1.2. Phân loại Salmonella [6]. .................................................................. 7 Hình 1.3. Số lượng các gen chung và gen riêng ở một số loài Salmonella [8]. 9 Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen của S. Gallinarum [9]. ............................................. 9 Hình 1.5. Các kênh bơm thải thuốc ở Salmonella [23]................................... 17 Hình 3.1. Vi khuẩn từ mẫu TB-1 trên môi trường MSRV.............................. 47 Hình 3.2. Vi khuẩn từ các mẫu TL-1, 2, và TG-1 trên môi trường thạch XLD ......................................................................................................................... 48 Hình 3.3. Vi khuẩn từ các mẫu TB-1 và TL-1 trong thạch Kligler ................ 50 Hình 3.4. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TB-1 trong môi trường ure .......... 51 Hình 3.5. Vi khuẩn lập được từ mẫu TB-1, TL-1, 2 trong môi trường LDC . 52 Hình 3.6. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TL-2 trong môi trường VP .......... 52 Hình 3.7. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TL-1 trong môi trường Indol....... 53 Hình 3.8. Hình ảnh kháng sinh đồ của một số chủng Salmonella nghiên cứu. ......................................................................................................................... 60 Hình 3.9. Hình ảnh điện di các mẫu RNA tổng số trên gel agarose 0,8%...... 71 Hình 3.10. Heatmap của các gen độc tố biểu hiện ở 6 mẫu nghiên cứu. ........ 97 Hình 3.11. Cấu trúc flagellar của vi khuẩn [129]. ........................................ 100 Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen parC ................................. 111 Hình 3.13. Kết quả phân tích sự sai khác nucleotide ở gen parC................. 112 Hình 3.14. Kết quả thay đổi amino acid ở các mẫu nghiên cứu ................... 112
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Trang Biểu đồ 3.1. Số lượng các serovar phân lập được từ 3 nguồn thịt .................. 58
MỞ ĐẦU Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), gánh nặng gây ra do các bệnh từ thực phẩm là rất lớn. Theo đó, mỗi năm cứ khoảng 10 người thì có 1 người bị bệnh. Bệnh từ thực phẩm có thể tiến triển nghiêm trọng, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ, người già và người bị suy giảm miễn dịch. Trong số các bệnh do thực phẩm gây ra thì tiêu chảy là phổ biến nhất do sử dụng thực phẩm không an toàn, khoảng 550 triệu người bị bệnh này mỗi năm, trong đó có 220 triệu trẻ em dưới 5 tuổi. Salmonella là một trong 4 nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy trên toàn cầu. Salmonella có khoảng hơn 2500 serovar khác nhau và có mặt ở khắp mọi nơi. Tất cả các type huyết thanh của Salmonella đều có khả năng gây bệnh cho người. Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella đang tăng lên nhanh chóng và trở thành mối đe dọa lớn tới sức khỏe loài người. Salmonella kháng kháng sinh gây khó khăn cho việc kiểm soát nhiễm khuẩn, dự phòng và điều trị bệnh. Do vậy, việc phân lập và xác định đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella từ thực phẩm là việc làm cần thiết. Việc nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc dự phòng, kiểm soát bệnh tật cũng như kiểm soát ô nhiễm thực phẩm và quy định sử dụng kháng sinh trong điều trị và chăn nuôi nhằm hạn chế khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Hiện nay ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào dịch tễ học kháng kháng sinh của các chủng Salmonella. Nghiên cứu chuyên sâu ở mức độ phân tử về Salmonella ở Việt Nam còn chưa nhiều. Nghiên cứu các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh giúp hiểu biết sâu về dịch tễ học phân tử các gen kháng kháng sinh. Quan trọng hơn là có thể phát hiện được các đột biến mới ở gen kháng kháng sinh gây ra tính kháng kháng sinh ở Salmonella. Ngoài ra còn có thể tìm ra các nhóm gen mới có khả năng gây nên tính kháng kháng sinh ở loài vi khuẩn này. Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu nào về phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh phân lập được 1
từ thực phẩm bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới. Theo tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc, Việt Nam là quốc gia có lượng tiêu thụ thịt bò, thịt lợn, và thịt gia cầm tăng lên rất nhanh kể từ năm 1993 trở lại đây. Trong đó lượng thịt lợn tiêu thụ trên đầu người tăng 3 lần, lượng thịt bò tăng lên 6 lần và thịt gia cầm tăng gấp 7 lần khi so sánh lượng thịt tiêu thụ giữa năm 2015 và năm 1993. Lượng thịt tiêu thụ này được dự báo là sẽ tăng lên đáng kể trong những năm tiếp theo. Vì vậy, luận án: "Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng" đã được thực hiện với mục tiêu và nội dung sau: Mục tiêu: 1. Phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò, và thịt gà tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội. 2. Xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được. 3. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh. Nội dung nghiên cứu: 1. Nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn từ các mẫu thịt thu thập được ở các chợ trên địa bàn Hà Nội, lựa chọn các mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella. 2. Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ đó lựa chọn ra các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh. 3. Giải trình tự gen thế hệ mới một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh để phân tích các nhóm gen liên quan. Xác nhận một số kết quả bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger. 2
Chương 1. TỔNG QUAN Salmonella được phân lập lần đầu tiên từ ruột lợn rừng năm 1884 bởi Salmon. Vào thời điểm đó, loài vi khuẩn này được đặt tên là Bacillus choleraesuis. Tên này sau đó được thay đổi thành Salmonella Choleraesuis bởi Lignières vào năm 1900 khi ông tìm cách đặt tên cho nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở lợn. Tên này cũng được sử dụng bởi Buchanan năm 1918 khi ông nghiên cứu loài vi khuẩn thuộc giống Salmonella, có tính chất sinh hóa như glucose dương tính, lactose âm tính, sinh acid và CO2. Cũng trong những năm 1900, một vài loài Salmonella quan trọng được phát hiện và nghiên cứu gồm S. Typhosum (sau này được đặt tên là Typhimurium), Paratyphosum A và B (Paratyphi A và B). Ở thời kỳ đó, hai loài S. Gallinarum và S. Typhimurium được nghiên cứu và chỉ ra vai trò gây bệnh của chúng ở người và động vật đã được công nhận rộng rãi. Cho đến năm 1960 tên Salmonella, dùng để chỉ loài vi khuẩn đặc biệt thuộc họ Enterobacteriaceae mới được chấp nhận và sử dụng rộng rãi trên thế giới [1]. 1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu ở người và động vật. Loài vi khuẩn này gây ra nhiều bệnh như thương hàn và viêm dạ dày ruột, đe dọa đến sức khỏe nhân loại [2]. 1.1.1. Hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3 x 0,5-1,0 µm, có nhiều lông quanh thân (trừ S. Gallinarum và S. Pullorum). Hầu hết Salmonella đều di động được. Salmonella không có vỏ, không sinh bào tử [2]. 1.1.2. Tính chất nuôi cấy Salmonella dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí. Phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC. Salmonella có thể sống được ở khoảng pH từ 3,8 đến 9,5 và pH thích hợp là 6,5-7,5 [1]. Trên môi trường thích hợp khuẩn lạc sau 24 giờ có kích thước trung bình 2 - 4 mm. Salmonella có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate). Trên 3
môi trường XLD, khuẩn lạc của Salmonella thường có màu đỏ (ngoại trừ loại không có xylose hoặc không khử carbonyl của lysine), ở giữa có màu đen (ngoại trừ loại không sinh H2S) [2]. 1.1.3. Tính chất hóa sinh Salmonella có lactose âm tính, glucose dương tính và thường sinh hơi, đa số có sucrose âm tính, salicin âm tính, inositol âm tính, citrate dương tính ở môi trường Simmons. Salmonella có catalase dương tính, oxidase âm tính, lysine decarboxylase dương tính. Hầu hết sinh H2S, không sinh urease, lipase, và deoxyribonuclease. Không phải tất cả các Salmonella đều có đầy đủ tính chất trên. Ví dụ, S. Typhi có glucose âm tính, không sinh hơi và citrate Simmons âm tính. Hầu hết các S. Paratyphi A và S. Choleraesuis không sinh H2S. Khoảng 5% các Salmonella có khả năng sinh bacteriocin kháng lại E. coli, Shigella và một số Salmonella khác [2]. 1.1.4. Sức đề kháng Salmonella có sức đề kháng cao ở ngoại cảnh. Chúng có khả năng sống trong môi trường khô. Trong rác thải, chúng có khả năng sống nhiều năm. Một vài loài có khả năng sống nhiều tuần trong môi trường có 20% muối. Salmonella nhạy cảm với nhiệt độ, chúng có thể bị tiêu diệt từ 70oC trở lên [3]. 1.1.5. Kháng nguyên Salmonella có 3 loại kháng nguyên được trình bày trong hình 1.1. Hình 1.1. Kháng nguyên của Salmonella [4]. Chú thích: ba loại kháng nguyên của Salmonella là kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H, và kháng nguyên Vi. Kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O, kháng nguyên này chỉ có ở S. Typhi và S. Paratyphi C. 4
1.1.5.1. Kháng nguyên O Kauffmann và White là những nhà khoa học đã nghiên cứu một cách hệ thống cấu trúc kháng nguyên O của Salmonella. Có khoảng gần 70 yếu tố kháng nguyên O khác nhau. Mỗi type huyết thanh mang một số yếu tố kháng nguyên khác nhau. Kháng nguyên O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài tế bào Salmonella. Kháng nguyên này có khả năng chịu nhiệt và là nội độc tố của vi khuẩn, đóng vai trò gây bệnh. Dựa vào kháng nguyên O, Salmonella được chia thành các nhóm huyết thanh từ A đến Z [2]. Mỗi kháng nguyên O gồm từ 5 đến 6 đơn vị đường, sự biến đổi ở các đơn vị đường, liên kết cộng hóa trị giữa chúng và liên kết giữa các tiểu đơn vị kháng nguyên O tạo ra các kháng nguyên O khác nhau [1]. Kháng nguyên O ở Salmonella có thể được chia thành hai nhóm chính. Nhóm một gồm có các phân tử đường N-acetylglucosamine hoặc N- acetylgalactosamine và nhóm hai gồm có phân tử đường galactose trong cấu trúc. Trong những năm gần đây, người ta đã xác định được 21 cấu trúc hóa học và trình tự của 28 nhóm gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một. Hiện tại, đã xác định được cấu trúc hóa học và trình tự các gen mã hóa cho 46 kháng nguyên O của Salmonella. Cấu trúc hóa học và các gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một có tính đa dạng cao [5]. 1.1.5.2. Kháng nguyên H Hầu hết Salmonella đều có kháng nguyên H trừ S. Gallinarum và S. Pullorum. Kháng nguyên H của Salmonella có thể có tính đặc hiệu đơn hoặc kép. Những Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ mất khả năng di động. Một số Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép, khi nuôi cấy trong môi trường có kháng huyết thanh tương ứng với một kháng nguyên thì Salmonella vẫn di động và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H kia. Ví dụ S. Paratyphi B có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép là đặc hiệu b và đặc hiệu 1, 2. Nếu nuôi trong môi trường có huyết thanh kháng cả hai đặc hiệu kháng nguyên trên thì S. Paratyphi B bị ngưng kết và mất khả năng di động. Tuy nhiên, chúng 5
không bị ngưng kết và vẫn di động được khi nuôi trong môi trường có huyết thanh chỉ kháng một loại đặc hiệu kháng nguyên. Kháng nguyên H dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ, cồn và acid. Kháng nguyên H được ứng dụng để chẩn đoán huyết thanh [2]. 1.1.5.3. Kháng nguyên Vi Kháng nguyên Vi là kháng nguyên bề mặt. Kháng nguyên Vi là polysaccaride của N-acetylglucosamine uronic acid dưới dạng một lớp rất mỏng không quan sát được bằng kính hiển vi quang học. Kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O. Kháng nguyên Vi chịu trách nhiệm sinh độc tố, có vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh thương hàn. Kháng nguyên này chỉ có ở S. Typhi và S. Paratyphi C [2]. 1.1.6. Phân loại Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S. Typhi và các S. Paratyphi A, B, C (typhoid là bệnh thương hàn và para là phó thương hàn). Salmonella còn được đặt tên theo vật chủ như S. Typhimurium gây bệnh ở chuột (murine nghĩa là chuột). Về sau người ta thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài động vật khác nhau. Vì thế, các loài mới phát hiện được đặt tên theo địa phương nơi nó lần đầu tiên được phát hiện. Ví dụ S. Teheran, S. Congo, S. London [2]. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, những nghiên cứu sâu về cấu trúc DNA cho phép xếp tất cả Salmonella vào một loài duy nhất. Tuy nhiên đề xuất này không được chấp nhận vì cách phân loại truyền thống đã được sử dụng quá quen và có ý nghĩa thực tiễn riêng [2]. Ngày nay, Salmonella được phân thành hai loài là S. bongori và S. enterica. Trong đó, S. enterica được chia thành 6 dưới loài là: I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae) và VI (indica). Hiện nay, người ta đã phát hiện được 2.610 serovar khác nhau (hình 1.2). Salmonella được phân thành các serovar bằng cách sử dụng hệ thống phân loại cổ điển của Kauffman. Các serovar được xác định nhờ sự kết hợp của 46 kháng nguyên O 6