Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp Cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:218

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp Cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn trình bày các nội dung chính sau: Phân lập và nghiên cứu đa dạng nấm ký sinh côn trùng từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn; Tuyển chọn các chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide; Nghiên cứu định loại chủng nấm đã tuyển chọn bằng phương pháp hình thái và sinh học phân tử.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp Cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI ---------- NGUYỄN THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƢỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI ---------- NGUYỄN THỊ THÙY VÂN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA VÀ VƢỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9.42.01.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS DƢƠNG MINH LAM 2. GS. TS NGÔ SỸ HIỀN HÀ NỘI - 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các kết quả công bố trong luận án là trung thực, chính xác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án. Hà Nội, ngày 27 tháng 4 năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thùy Vân
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - Thầy PGS.TS Dƣơng Minh Lam, ngƣời thầy kính mến luôn tận tình hƣớng dẫn, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành tốt các công việc của luận án này. - Thầy GS. TS Ngô Sỹ Hiền, ngƣời thầy luôn theo sát bên tôi, chỉ bảo tận tình và có những góp ý vô cùng quý báu trong quá trình nghiên cứu. - Quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học - Vi sinh, TS Trần Thị Thúy, PGS. TS Đoàn Văn Thƣợc, TS Phan Duệ Thanh, ThS Tống Thị Mơ, CN Phạm Thị Hồng Hoa về những góp ý, hỗ trợ tinh thần trong suốt quá trình tôi thực hiện nghiên cứu. - Quý thầy cô trong PTN Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội; Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp tôi rất nhiều trong việc thực hiện luận án. - GS. TS Trƣơng Xuân Lam đã giúp đỡ tôi trong định loại mẫu côn trùng thu thập ở khu vực nghiên cứu. - Phòng Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh - Đại học Sƣ phạm Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận án. - Ban Giám đốc Học viện Cảnh sát nhân dân, Lãnh đạo Khoa Kỹ thuật hình sự đã luôn động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. - Gia đình nhỏ, đồng nghiệp, bạn bè đã luôn yêu thƣơng, động viên, và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa học. Hà Nội, ngày 27 tháng 4 năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thùy Vân
iii MỤC LỤC Trang phụ bìa LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ ii MỤC LỤC .....................................................................................................................iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... vi DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................vii DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ......................................... 5 1.1. Nấm và nấm ký sinh côn trùng ............................................................................ 5 1.1.1. Giới thiệu về nấm .............................................................................................. 5 1.1.2. Nấm ký sinh côn trùng ...................................................................................... 5 1.2. Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide ..................... 9 1.2.1. Cyclooligomer depsipeptide.............................................................................. 9 1.2.2. Đa dạng nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide .. 18 1.2.3. Con đƣờng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide ở nấm ....................... 24 1.3. Nhu cầu dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy của nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide ............................................................................... 26 1.3.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy ........................................................................ 26 1.3.2. Độ pH .............................................................................................................. 28 1.3.3. Nguồn cacbon.................................................................................................. 29 1.3.4. Nguồn nitơ....................................................................................................... 30 1.4. Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng ....................................................................................................... 31 1.4.1. Tách chiết ........................................................................................................ 32 1.4.2. Tinh sạch ......................................................................................................... 33 1.4.3. Nghiên cứu cấu trúc ........................................................................................ 34
iv 1.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam ............................................... 35 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................... 42 2.1. Nguyên vật liệu và đối tƣợng nghiên cứu .......................................................... 42 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu...................................................................................... 42 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ......................................................................................... 42 2.1.3. Môi trƣờng ...................................................................................................... 43 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 43 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật học ........................................................................... 43 2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ................................................................. 49 2.2.3. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide ................. 52 2.2.4. Các phƣơng pháp phân tích ............................................................................. 55 2.2.5. Phƣơng pháp toán học ..................................................................................... 56 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 57 3.1. Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn........................................................................... 57 3.1.1. Kết quả phân lập và nghiên cứu đặc điểm của nấm ký sinh côn trùng ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn ........................................... 57 3.1.2. Một số nhận xét về đa dạng các chủng nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn........................................................ 85 3.2. Khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của các chủng nấm ký sinh côn trùng đã phân lập ................................................................................................ 87 3.3. Định loại chủng nấm CPA14V bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử....... 91 3.3.1. Đặc điểm hình thái của chủng nấm CPA14V ................................................. 91 3.3.2. Định loại chủng nấm CPA14V bằng phƣơng pháp sinh học phân tử ............. 93 3.4. Nghiên cứu môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V ........................................ 99 3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide .... 99 3.4.2. Ảnh hƣởng của độ pH môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng C. cateniannulata CPA14V ............................. 103
v 3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V ..................... 104 3.4.4. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V .............. 106 3.5. Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ C. cateniannulata CPA14V ........................................................... 108 3.5.1. Tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide từ C. cateniannulata CPA14V ở quy mô phòng thí nghiệm..................................................................... 108 3.5.2. Xác định cấu trúc hóa học của cyclooligomer depsipeptide ......................... 114 3.6. Nghiên cứu khảo sát một số hoạt tính sinh học của các cao chiết tổng, phân đoạn và chất sạch beauvericin của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V ............................... 122 3.6.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro ..................................................... 122 3.6.2. Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa ................................................................. 124 3.6.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ............................................ 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................128 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................130 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................131 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ I
vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid deoxyribonucleotide ARN: Acid ribonucleotide CDW: (Cell dry weight): Sinh khối khô COD: Cyclooligomer depsipeptide CzD: Môi trƣờng Czapek – Dox EDTA: Ethylendiamin Tetra Acetic Acid FDM: Môi trƣờng xác định Fusarium HPLC: (High Performance Liquid Chromatography): Sắc kí lỏng hiệu năng cao áp IC50: (Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% KBTTN: Khu bảo tồn thiên nhiên MIC: (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu MM: Môi trƣờng khoáng tối thiểu NCBI: National Center for Biotechnology Information NMR: (Nuclear Magnetic Resonance): Quang phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NRPSs Nonribosomal peptide synthetases PBG: Môi trƣờng dịch chiết khoai tây TLC: (Thin Layer Chromatography): Sắc kí bản mỏng TSB: Trypcase Soya Broth SBR: Môi trƣờng Sabouraud SDB: Sabouraud Dextrose Broth UV: (Untraviolet and Vissible Spectra): Tia tử ngoại VQG: Vƣờn quốc gia
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số cyclooligomer depsipeptide (COD) phổ biến ở nấm ......... 11 Bảng 1.2. Khả năng ức chế sự sinh trƣởng của tế bào ung thƣ của một số COD . 15 Bảng 1.3. Khả năng kháng khuẩn của beauvericin ......................................... 17 Bảng 1.4. Thành phần một số loài thuộc chi Beauveria, Fusarium và Isaria sinh tổng hợp COD ......................................................................................... 19 Bảng 2.1. Môi trƣờng lên men thu nhận COD ................................................ 43 Bảng 2.2. Các trình tự đƣợc sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài trên ba vùng gen ITS, LSU, Rpb1 ................................................................................ 51 Bảng 2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm khảo sát và thí nghiệm sau khảo sát tách chiết, tinh sạch COD ....................................................................................... 53 Bảng 3.1. Thành phần nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc......................... 84 Bảng 3.2. Khả năng sinh tổng hợp COD của các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc ở khu vực nghiên cứu .............................................................. 88 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của CC1 và tài liệu tham khảo........... 120 Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của cao chiết và beauvericin từ chủng nấm C. cateniannulata CPA14V........................................................ 124 Bảng 3.5. Hoạt tính chống oxi hóa in vitro của cao chiết và beauvericin từ chủng nấm C. cateniannulata CPA14V........................................................ 125 Bảng 3.6. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định in vitro của cao chiết và beauvericin từ chủng nấm C. cateniannulata CPA14V................................ 126
viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc một số loại cyclooligomer depsipeptide ...................................... 9 Hình 1.2. Cấu trúc chung của các liên kết este giữa nhóm carboxyl C-terminus α- hydroxy acid, ß-hydroxy acid và hydroxy- acid chuỗi dài ...................................... 10 Hình 1.3. Cấu trúc Pseudoxylallemycin ................................................................... 12 Hình 1.4. Cấu trúc một số diketomorpholine ........................................................... 13 Hình 1.5. Sinh tổng hợp COD .................................................................................. 25 Hình 1.6. Con đƣờng sinh tổng hợp beauvericin ..................................................... 30 Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn xác định COD tích lũy theo...................................... 56 Hình 3.1. Hình thái mẫu CPA1 ................................................................................. 58 Hình 3.2. Hình thái mẫu CPA3 ................................................................................. 59 Hình 3.3. Hình thái mẫu CPA5 ................................................................................. 60 Hình 3.4. Hình thái mẫu CPA13V ............................................................................ 61 Hình 3.5. Hình thái mẫu CPA14V ............................................................................ 62 Hình 3.6. Hình thái mẫu CPA15 ............................................................................... 63 Hình 3.7. Hình thái mẫu CPA16 ............................................................................... 64 Hình 3.8. Hình thái mẫu CPA31 ............................................................................... 64 Hình 3.9. Hình thái mẫu CPA40 ............................................................................... 65 Hình 3.10. Hình thái mẫu CPA44 ............................................................................. 66 Hình 3.11. Hình thái mẫu XS01 ................................................................................ 67 Hình 3.12. Hình thái mẫu XS07 ................................................................................ 68 Hình 3.13. Hình thái mẫu XS12 ................................................................................ 69 Hình 3.14. Hình thái mẫu XS36 ................................................................................ 70 Hình 3.15. Hình thái mẫu XS37 ................................................................................ 71 Hình 3.16. Hình thái mẫu XS38 ................................................................................ 72 Hình 3.17. Hình thái mẫu XS57 ................................................................................ 73 Hình 3.18. Hình thái mẫu XS65 ................................................................................ 74 Hình 3.19. Hình thái mẫu XS66 ................................................................................ 75 Hình 3.20. Hình thái mẫu XS67 ................................................................................ 76 Hình 3.21. Hình thái mẫu XS69 ................................................................................ 77
ix Hình 3.22. Hình thái mẫu XS71 ................................................................................ 78 Hình 3.23. Hình thái mẫu XS77 ................................................................................ 79 Hình 3.24. Hình thái mẫu XS83 ................................................................................ 80 Hình 3.25. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập tại khu vực nghiên cứu ............................................................................... 82 Hình 3.26. Sắc ký đồ HPLC UV 203 nm của chất chuẩn (A) ................................. 90 Hình 3.27. Đặc điểm hình thái của chủng Cordyceps sp. CPA14V ......................... 92 Hình 3.28. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen ......................... 94 Hình 3.29. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen LSU ................ 97 Hình 3.30. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên 3 vùng gen ITS1-5.8S rDNA-ITS2, LSU và Rpb1 ....................................................................................... 98 Hình 3.31. Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V trong 05 loại môi trƣờng nghiên cứu ...................... 100 Hình 3.32. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V .................................................................................... 103 Hình 3.33. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V .................................................. 105 Hình 3.34. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V.......................................................... 107 Hình 3.35. Quy trình thu nhận COD (CC1) quy mô phòng thí nghiệm ................. 111 Hình 3.36. Ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm lƣợng CC1 ........................... 112 Hình 3.37. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng CC1 ...................................... 113 Hình 3.38. Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hàm lƣợng CC1 ........................ 113 Hình 3.39. Phổ LC/MS Q-TOF của CC1 ................................................................ 114 Hình 3.40. Phổ 1H-NMR của CC1 .......................................................................... 115 Hình 3.41. Phổ 13C-NMR, phổ DEPT, phổ HSQC của CC1 .................................. 117 Hình 3.42. Phổ COSY, phổ NOESY và phổ HMBC của CC1 ............................... 119 Hình 3.43. Cấu trúc hóa học, tƣơng tác 1H-1H COSY và HMBC (HC) chính của CC1.......................................................................................................................... 121
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) là nhóm nấm gây bệnh cho côn trùng [96]. Đây là nhóm nấm có vai trò rất quan trọng đối với hệ sinh thái. Cho đến nay có gần 2000 loài nấm ký sinh côn trùng đƣợc ghi nhận [19, 222]. Nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp nhƣ: Cyclic depsipeptide, peptide, dẫn xuất amino acid, polyketide, peptide hybrid, terpenoid… [48], [196]. Các chất chuyển hóa thứ cấp từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính mạnh đã và đang thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Trong đó đáng chú ý là nhóm hoạt chất cyclooligomer depsipeptide. Cyclooligomer depsipeptide (COD) là một nhóm đặc biệt của nonribosomal peptid gồm 2, 3 hoặc 4 đơn phân. Trong đó mỗi đơn phân đƣợc cấu tạo bởi ít nhất một 2-hydroxycarboxylic acid và một 2-amino acid. COD đƣợc sinh tổng hợp nhờ hệ enzyme non-ribosomal peptide synthetase (NRPSs) [53]. COD là hoạt chất tự nhiên đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn [55], nấm [168], thực vật [207], tảo [46], hải miên [17], và một số loại sinh vật biển khác [92, 141]. Trong các nhóm COD thì COD từ nấm ký sinh côn trùng là một nhóm rất quan trọng, chiếm tỷ lệ lớn nhất [196]. Cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính sinh học rộng, bao gồm khả năng gây độc ở thực vật [116], gây độc tế bào [176], kháng virus [93], diệt côn trùng [211], chống sốt rét [75], chống khối u [106], ức chế hoạt động của một số loại enzyme [128, 156] cũng nhƣ là hạn chế sự hình thành các amyloid ở bệnh Alzheimer [73]. Đặc biệt trong các nghiên cứu gần đây cho thấy COD từ nấm ký sinh côn trùng có nhiều tiềm năng trong phòng chống ung thƣ, ức chế sự sinh trƣởng của một số dòng ung thƣ khác nhau ở ngƣời [72, 107, 197]. Hiện nay, các hoạt chất COD từ nấm
2 ký sinh côn trùng đƣợc coi là nguồn nguyên liệu tự nhiên mới có tiềm năng ứng dụng trong y dƣợc. Trên thế giới việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng cũng nhƣ COD từ nấm ký sinh côn trùng bắt đầu từ khá sớm. Điển hình nhƣ nghiên cứu về tách chiết enniatin A từ nấm Fusarium orthocera var. enniatinum của Gaumann [57], nghiên cứu về sinh tổng hợp cyclodepsipeptide D- D-, L-L-, và D-L- Cyclodi- (β-seryloxy- propionyl) của Hassal và cộng sự [66] hay nghiên cứu về cấu trúc của beauvericin từ nấm của Hamill và cộng sự [64],... Trải qua hơn 70 năm, nấm ký sinh côn trùng và COD từ nấm ký sinh côn trùng vẫn thu hút đƣợc sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng và ứng dụng của chúng đã đƣợc công bố. Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào đa dạng nấm ký sinh côn trùng hoặc sử dụng sinh khối nấm để sản xuất các chế phẩm ứng dụng làm thuốc trừ sâu, tiêu biểu nhƣ nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Thị Lộc [3], Phạm Thị Thùy [10], Phạm Văn Nhạ [6],… Nghiên cứu về COD từ nấm ký sinh côn trùng là vấn đề rất mới mẻ, hiện chƣa có một công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam đề cập tới vấn đề này. Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) là hai khu vực có độ đa dạng sinh học nổi bật ở miền Bắc Việt Nam. Đƣợc thiên nhiên ƣu đãi về điều kiện tự nhiên vì thế hệ động thực vật ở hai khu vực này rất phong phú, không chỉ có giá trị nghiên cứu khoa học, bảo tồn nguồn gen mà còn có ý nghĩa trong phát triển kinh tế, khai thác tài nguyên thiên nhiên (đặc biệt là tài nguyên sinh vật). Với những khu rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới, ở đây có rất nhiều loài động thực vật quý hiếm hiện hữu và đặc trƣng cho vùng núi phía Bắc [2, 8, 223]. Tuy nhiên khu hệ nấm ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn còn chƣa có nhiều nghiên cứu. Những hiểu biết về đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạn chế. Đặc biệt, hầu nhƣ không có nghiên cứu nào về nấm gây bệnh côn trùng ở hai khu vực này.
3 Nhằm bổ sung các hiểu biết về nấm ký sinh côn trùng và COD từ nấm ký sinh côn trùng cũng nhƣ góp phần xây dựng danh mục nguồn gen, bảo tồn đa dạng sinh học các loài nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn”. 2. Mục tiêu đề tài Đánh giá đƣợc thành phần loài và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của một số chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ). 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Nấm đƣợc phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ). - Phạm vi nghiên cứu: Phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp COD. Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy thu nhận COD, tách chiết, tinh sạch và khảo sát hoạt tính sinh học của COD từ chủng nấm đã tuyển chọn. 4. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và nghiên cứu đa dạng nấm ký sinh côn trùng từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn. - Tuyển chọn các chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide. - Nghiên cứu định loại chủng nấm đã tuyển chọn bằng phƣơng pháp hình thái và sinh học phân tử.
4 - Nghiên cứu lựa chọn môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy, sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide cho chủng nấm đã tuyển chọn ở quy mô phòng thí nghiệm. - Nghiên cứu thu hồi, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của cyclooligomer depsipeptide. - Nghiên cứu khảo sát một số hoạt tính sinh học của các phân đoạn trong quá trình tách chiết cyclooligomer depsipeptide. 5. Những đóng góp mới của luận án - Là luận án đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện (từ khâu phân lập, tuyển chọn, định loại, nghiên cứu các đặc điểm lên men thu nhận, tách chiết, tinh sạch, khảo sát hoạt tính sinh học của COD) về 01 chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps có khả năng sinh tổng hợp COD và có tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn. - Đây là luận án đầu tiên công bố về đa dạng nấm ký sinh côn trùng và khả năng sinh tổng hợp COD của chủng nấm phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ). - Lần đầu tiên ghi nhận sự có mặt của loài nấm Cordyceps cateniannulata tại Việt Nam. - Là công bố đầu tiên trên thế giới về Cordyceps cateniannulata có khả năng sinh tổng hợp COD.
5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Nấm và nấm ký sinh côn trùng 1.1.1. Giới thiệu về nấm Nấm là nhóm vi sinh vật nhân thật, đơn bào hoặc đa bào, dị dƣỡng, dinh dƣỡng hấp thu, có cơ thể dạng tản, vách tế bào có chứa chitin và ß- glucan. Nấm thƣờng là vi sinh vật hiếu khí, sinh sản bằng bào tử (hữu tính và vô tính) [43]. Nấm rất đa dạng, ƣớc tính có khoảng 1,5 tới 15 triệu loài, và hiện nay đã có gần 150 nghìn loài đƣợc phát hiện và miêu tả [23, 67]... Mặc dù con ngƣời biết tới nấm, sử dụng nấm làm thực phẩm, rƣợu… nhƣng cho tới năm 1969 nấm mới đƣợc xếp thành một giới riêng trong hệ thống 5 giới [200]. Hiện nay nấm đƣợc chia làm 5 ngành bao gồm nấm thích ty (Chytridiomycota), nấm tiếp hợp (Zygomycota), nấm mạch (Glomeromycota), nấm túi (Ascomycota) và nấm đảm (Basidiomycota) [182]. Trong đó, gần 84 nghìn loài thuộc ngành Nấm túi, 50 nghìn loài ngành Nấm đảm [222]. Là một ngành sinh vật đa dạng, nấm đã và đang có nhiều tác động đến đời sống con ngƣời từ môi trƣờng sinh thái, nông nghiệp, thực phẩm, dƣợc phẩm và y học. Nấm có vai trò quan trọng trong chu trình dinh dƣỡng, trong các mối quan hệ sinh thái, có khả năng phân hủy lignin, có khả năng cộng sinh giúp bảo vệ thực vật, động vật đồng thời một số ít có khả năng gây bệnh cho thực vật, động vật. Kháng sinh đầu tiên đƣợc phát hiện, tinh sạch, sản xuất thành dƣợc phẩm là penicillin do Penicillium sinh ra. Từ đó đến nay, đã có hàng nghìn hoạt chất mới đƣợc phát hiện từ nấm. Nấm là nguồn sinh vật có tiềm năng cung cấp đa dạng các hoạt chất có thể ứng dụng trong đời sống con ngƣời [182]. 1.1.2. Nấm ký sinh côn trùng 1.1.2.1. Sơ lược về nấm ký sinh côn trùng Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) là nhóm nấm gây bệnh cho côn trùng [97]. Với đặc tính gây bệnh đặc thù cho các loài côn trùng khác nhau, nấm ký sinh côn trùng đã
6 và đang đƣợc sử dụng làm nhân tố đấu tranh sinh học hiệu quả chống lại các loài côn trùng gây hại mùa màng, cây rừng. Một số khác đƣợc sử dụng trong các quy trình công nghệ sinh học hoặc trong y học [102]. Theo Evans và cộng sự, nấm ký sinh côn trùng đƣợc chia thành 4 nhóm: Nhóm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể ký chủ; nhóm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể của ký chủ; nhóm mọc trên ký chủ và nhóm cộng sinh trên ký chủ [52]. Bào tử nấm tiếp xúc với bề mặt ký chủ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc mầm, xâm nhiễm vào bên trong cơ thể ký chủ qua lớp vỏ cuticun. Ngoài ta, nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con đƣờng hô hấp, tiêu hóa. Nấm mọc khắp bên trong cơ thể côn trùng và sản xuất các độc tố nhằm gây chết côn trùng và ngăn chặn sự cạnh tranh của vi sinh vật khác. Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng bao gồm ba giai đoạn chính: Giai đoạn xâm nhập (bào tử nấm mọc mầm, giải phóng các enzyme ngoại bào phân hủy lớp vỏ cuticun côn trùng xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng); giai đoạn phát triển trong cơ thể côn trùng (nấm tiếp tục phát triển hình thành các sợi nấm phát tán khắp bên trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết); giai đoạn phát triển sau khi ký chủ chết (nấm sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dƣỡng bên trong cơ thể côn trùng chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử) [174]. Cho đến nay, 65 loài Chytridiomycota, 474 loài Zygomycota, 238 loài Basidiomycota và gần 1000 loài Ascomycota đã đƣợc ghi nhận [19, 222]. Trong các nghiên cứu đã công bố, những loài nấm túi thuộc chi Metarhizium (M. anisopliae, M. robertsii, M. brunneum, M. lepidiotae, M. globosum, M. acridum, M. majus, M. flavoviride, M. rileyi, M. pingshaense, M. lepidiotae và M. guizhouense), chi Beauveria (B. bassiana và B. brongniartii), chi Isaria (I. fumosorosea, I. farinosa và I. tennuipes), chi Ophiocordyceps (O. sinensis, O. unilateralis), chi Cordyceps (C. militaris), chi Torubiella (T. ratticaudata),
7 chi Pochonia (P. chlamydosporia), chi Lecanicillium (L. lecani, L. longisporum), chi Hirsutella (H. thompsonii, H. nodulosa, H. aphidis), và các loài Paecilomyces variotii, Purpureocillium lilacinum đƣợc nghiên cứu và ứng dụng phổ biến nhất [19, 86, 127]. Mặc dù các loài thuộc Entomophthorales (ví dụ nhƣ Furia, Conidiobolus, Entomophaga, hoặc Erynia) có khả năng diệt côn trùng cao nhất nhƣng do đặc điểm sinh học của chúng (khó khăn trong nuôi cấy và phát triển sản phẩm) nên chúng không đƣợc sử dụng làm thành phần của chế phẩm sinh học [109]. Nấm ký sinh côn trùng có vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái. Ví dụ, các loài thuộc chi Metarhizium và Beauveria, thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất, không chỉ kiểm soát các quần thể côn trùng tự nhiên mà còn sống nội cộng sinh với thực vật. Một số loài nấm ký sinh côn trùng sống nội cộng sinh ở rễ, thân và lá thực vật [77]. Ví dụ nhƣ loài M. robertsii và B. bassiana cung cấp nitơ đƣợc đồng hóa cho cây trồng trong quá trình ký sinh của côn trùng, do đó hỗ trợ sự phát triển của cây trồng [143]. Beauveria bassiana đƣợc ghi nhận sống nội cộng sinh trong khoảng 25 loài thực vật, góp phần kiểm soát sâu bệnh và nấm bệnh thực vật [186]. Beauveria bassiana còn sống trên lá và chồi bên cạnh rễ cây làm cho cây có khả năng chống lại côn trùng tốt hơn [140], đồng thời cũng bảo vệ thành công thực vật khỏi mầm bệnh vi sinh vật bằng cách ngăn chặn các tác nhân gây bệnh hoặc tăng phản ứng phòng vệ của thực vật [119]. Tƣơng tự, Lecanicillium cũng ngăn ngừa bệnh nấm bằng cách phát triển trên bề mặt của lá, hạn chế các chất dinh dƣỡng có sẵn và tạo ra các hợp chất kháng khuẩn ngoài việc gây ra các phản ứng của cây trong khi xâm nhập vào rễ cây [119]. Trong số nấm ký sinh côn trùng, I. fumosorosea dƣờng nhƣ tƣơng tác mạnh với thực vật. Điều này có lẽ là do Isaria spp. nhạy cảm với các chất hóa học do thực vật tiết ra và thuộc hệ thống phòng thủ chống lại các mầm bệnh thực vật [220]. Hiện nay nấm ký sinh côn trùng đƣợc sử dụng
8 phổ biến nhất để kiểm soát sinh học đối với côn trùng gây hại trong phòng thí nghiệm, nhà kính hoặc trên đồng ruộng. 1.1.2.2. Các hợp chất trao đổi thứ cấp từ nấm ký sinh côn trùng Nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ có trọng lƣợng phân tử thấp đƣợc gọi là chất chuyển hóa thứ cấp. Các hợp chất này cần thiết cho lây nhiễm mầm bệnh một cách hiệu quả bằng cách làm tổn thƣơng hệ thần kinh hoặc giảm sức đề kháng của côn trùng [48]. Các chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký kết hợp với kỹ thuật khối phổ và sinh học phân tử. Dựa trên cấu trúc hóa học, chúng có thể đƣợc chia thành các nhóm sau: Cyclic depsipeptide, peptide, dẫn xuất amino acid, polyketide, peptide hybrid, và terpenoid [48], [196]. Các chất chuyển hóa từ nấm ký sinh côn trùng rất đa dạng và có phổ hoạt tính mạnh đã và đang thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Đơn cử nhƣ cordycepin, thuộc nhóm octadepsipeptide, là sản phẩm của quá trình chuyển hóa thứ cấp của nấm ký sinh côn trùng Cordyceps militaris và Isaria cicadae. Cordycepin đã đƣợc sử dụng trong y học Trung Quốc trong nhiều năm vì đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, kháng u và bảo vệ thần kinh [196]. Ngoài ra cordycepin đƣợc chứng minh làm giảm các triệu chứng viêm xƣơng khớp, tức là viêm bao hoạt dịch, bệnh lý khớp và giảm đau [20]. Cordycepin còn đƣợc chứng minh khả năng ức chế sự già đi của tế bào ở loài gặm nhấm thông qua con đƣờng NRF2 (yếu tố nhân erythroid 2 liên quan đến yếu tố 2) và AMPK (AMP - hoạt hóa protein kinase) trong quá trình viêm. Ứng dụng này mang lại hy vọng cho tƣơng lai để ngăn chặn quá trình lão hóa tế bào và loét bức xạ [196]. Các chất chuyển hóa thứ cấp của nấm ký sinh côn trùng là một tập hợp các hợp chất có hoạt tính đa dạng. Vì vậy, các nhà khoa học hiện nay đang
9 nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc, đặc tính của các hợp chất này; tìm kiếm các hợp chất mới và tìm hiểu con đƣờng sinh tổng hợp. 1.2. Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide 1.2.1. Cyclooligomer depsipeptide 1.2.1.1. Cấu trúc hóa học Cyclooligomer depsipeptide (COD) là các nonribosomal peptide đặc biệt thuộc các nhóm hợp chất peptolide mạch vòng. Đây là những peptide có phổ hoạt tính sinh học rộng đƣợc sản sinh từ các vi sinh vật thông qua con đƣờng sinh tổng hợp peptide ngoài ribosome bởi các enzyme phức hợp chứa một hay nhiều protein lớn (NRPSs) [47, 158]. Hình 1.1. Cấu trúc một số loại cyclooligomer depsipeptide [204] Những nghiên cứu về các COD này bắt đầu sớm nhất là vào những năm 1940, tiêu biểu nhƣ tách chiết enniatin A từ nấm Fusarium orthocera var. enniatinum [57]. Tuy nhiên, thuật ngữ “cyclooligomer depsipeptide” còn đƣợc gọi là “cyclooligomeric depsipeptide” lần đầu tiên đƣợc giới thiệu trong các tài liệu khoa học vào năm 2008 [205].