Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:174

Thêm vào BST

Báo xấu

57
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn của Việt Nam có khả năng sinh chất kháng sinh dùng làm nguyên liệu nghiên cứu đồng thời đóng góp vào sự tìm hiểu tính đa dạng sinh học cũng như phát hiện nguồn gen quý hiếm từ xạ khuẩn của Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------- BÙI THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội-2006 1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------- BÙI THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Từ Minh Koóng 2. GS.TS. Phạm Văn Ty Hà Nội-2006 2
Lêi c¶m ¬n T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n §¹i häc Quèc gia Hµ néi, Tr-êng §H Khoa häc Tù nhiªn ®· ñng hé vµ t¹o mäi ®iÒu kiÖn vÒ c¸c thñ tôc, kinh phÝ ®Ó t«i hoµn thµnh nhiÖm vô cña mét nghiªn cøu sinh. T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c nhÊt ®Õn PGS.TS Tõ Minh Koãng, GS.TS. Ph¹m V¨n Ty nh÷ng ng-êi thÇy ®· tËn t×nh h-íng dÉn vµ gióp ®ì t«i ®Ó hoµn thµnh c«ng tr×nh nghiªn cøu nµy. T«i xin c¸m ¬n PGS.TS KiÒu H÷u ¶nh, Chñ nhiÖm Bé m«n Vi sinh vËt häc, ng-êi ®· lu«n ñng hé vµ t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi trong thêi gian t«i lµm viÖc vµ lµm luËn ¸n t¹i Bé m«n Vi sinh vËt häc, Tr-êng §H Khoa häc Tù nhiªn, §H Quèc gia Hµ néi. Hoµn thµnh b¶n luËn ¸n nµy, t«i còng ®· nhËn ®-îc nhiÒu sù gióp ®ì kh¸c: c¸c thÇy c¸c c« Bé m«n Vi sinh, Khoa Sinh häc, Tr-êng §H Khoa hoc Tù nhiªn ®· gióp ®ì vÒ thêi gian, ho¸ chÊt, thiÕt bÞ m¸y mãc cho c¸c thÝ nghiÖm cña luËn ¸n, c¶m ¬n TS. §ç Quyªn, Tr-êng §H D-îc Hµ néi ®· rÊt nhiÖt t×nh gióp t«i trong viÖc x¸c ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc cña chÊt kh¸ng sinh b»ng ph-¬ng ph¸p ph©n tÝch khèi phæ vµ céng h-ëng tõ h¹t nh©n. Nh©n dÞp nµy t«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi tÊt c¶ sù gióp ®ì quÝ b¸u ®ã. LuËn ¸n nµy sÏ kh«ng thÓ hoµn thµnh nÕu t«i kh«ng nhËn ®-îc sù gióp ®ì vµ ñng hé lín lao tõ gia ®×nh, ng-êi th©n vµ nh÷ng ng-êi ®· lu«n ë bªn c¹nh t«i trong c¶ nh÷ng lóc thuËn lîi vµ khã kh¨n nhÊt ®Ó l¾ng nghe, ®éng viªn vµ chia sÎ. Hµ néi, ngµy 21 th¸ng 2 n¨m 2006 Bïi ThÞ ViÖt Hµ 3
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Hà nội, ngày 21 tháng 2 năm 2006 Tác giả Bùi Thị Việt Hà 4
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................................. 14 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................................ 14 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI .................................................... 15 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 16 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH .................................................................................. 16 1.1.1. Chất kháng sinh (Antibiotic) ............................................................................................ 16 1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh .................................................................... 16 1.2. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH ................................................................. 18 1.2. 1.Ức chế tổng hợp thành tế bào .......................................................................................... 19 Liên kết với protein thụ thể......................................................................................................... 20 1.2.2. Ức chế sự tổng hợp protein .............................................................................................. 20 1.2.3. Chất kháng sinh phá huỷ màng sinh chất của tế bào ....................................................... 21 1.2.4 Ức chế các con đường trao đổi chất ................................................................................. 22 1.2.5. Ức chế sự tổng hợp axit nucleic ....................................................................................... 23 1.3. XẠ KHUẨN VÀ SỰ HÌNH THÀNH KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN. ................................. 24 1.3.1. Xạ khuẩn và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ..................................................... 24 1.3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên ................................. 24 1.3.3. Những khái niệm cơ bản về xạ khuẩn ............................................................................... 26 1.3.4. Streptomyces và xạ khuẩn hiếm........................................................................................ 27 1.3.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN ..................................................................................... 32 1.3.6. Phân loại chi Streptomyces .............................................................................................. 36 1.4. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN ................................................... 37 1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ............................................... 37 1.4.2. Công nghệ lên men CKS – Quá trình sau lên men (Downstream Processing) ................. 40 1.4.3. Sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp CKS ............................................................. 40 1.5. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CHẤT KHÁNG SINH ............................................................ 41 1.5.1. Tách chiết CKS từ hệ khuẩn ty ......................................................................................... 42 1.5.2. Tách chiết CKS từ dịch lọc ............................................................................................... 42 1.5.3. Tinh chế CKS .................................................................................................................... 43 1.5.4. Đơn vị chất kháng sinh ..................................................................................................... 43 1.5.5. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân. ....... 43 1.6. CÁC BỆNH THỰC VẬT DO NẤM GÂY RA VÀ CÁC CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP. ............................................................................................................. 44 1.6.1. Sự lan truyền và chu kỳ phát triển của nấm gây bệnh thực vật. ...................................... 45 1.6.2. Các loại nấm gây bệnh thực vật thường gặp ................................................................... 47 1.6.3. Thiệt hại về kinh tế do vi nấm gây ra đối với nông nghiệp .......................................... 51 5
1.6.4. Sơ lược về tình hình nghiên cứu và ứng dụng chất kháng sinh trong phòng chống các bệnh do vi sinh vật gây ra ở thực vật trên thế giới và ở Việt Nam ........................................................ 52 1.6.5. Các chất kháng sinh được sử dụng phòng trừ nấm gây hại thực vật. .............................. 54 1.6.6. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật ........................................................................... 59 1.6.7. Ứng dụng xạ khuẩn và các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật................................................................................................................................... 59 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 62 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT ............................................................................................ 62 2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................................................... 62 2.1.2. Hoá chất ........................................................................................................................... 62 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................................... 63 2.1.4. Các công thức môi trường ................................................................................................ 63 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................. 66 2.2.1. Phương pháp thu mẫu bệnh thực vật, phân lập nấm và định tên ..................................... 66 2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn ..................................................................................... 67 2.2.3. Bảo quản giống ................................................................................................................ 68 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn............................................... 68 2.2.5. Các phương pháp sinh học phân tử .................................................................................. 71 2.2.6. Lên men tạo kháng sinh .................................................................................................... 76 2.2.7. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh ........................................................................... 78 2.2.8. Xác định một số tính chất của chất kháng sinh ............................................................... 79 2.2.9. Sản xuất chế phẩm bào tử xạ khuẩn ................................................................................. 81 2.2.10. Tìm hiểu khả năng ứng dụng .......................................................................................... 82 2.2.11. Thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng [10] ................................................................. 83 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................... 86 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN ........................................................................ 86 3.1.1. Sự phân bố và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn .......................................... 86 3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm có hoạt tính cao .......................... 88 3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN. .............................................................................................................................................. 89 3.2.1. Đặc điểm hình thái ........................................................................................................... 89 3.2.2. Đặc điểm nuôi cấy ............................................................................................................ 90 MÀU KTCC ..................................................................................................................................... 91 3.2.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hoá ............................................................................................. 92 3.2.4. Hoạt tính kháng sinh ........................................................................................................ 94 3.2.5. Giải trình tự ADNr 16S của 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu ............................................. 96 3.2.6. Phân loại ........................................................................................................................ 100 6
3.3. KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CKS CỦA 3 CHỦNG XẠ KHUẨN ĐÃ LỰA CHỌN .................. 105 3.3.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp ........................................................................ 105 3.3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng hình thành CKS của 3 chủng T-41, D-42 và TC-54 ..................................................................................................................................... 107 3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ. ..................................................................... 107 3.3.3. Động học của quá trình lên men của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu .......................... 111 3.3.4. Tối ưu hoá môi trường lên men chủng TC-54 – Phương pháp Box- Willson ................. 113 3.3.5. Lên men xốp chủng T-41 ................................................................................................ 116 3.4. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CKS TC-54 ........................................................................... 117 3.4.1. Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ .......................................................................... 117 3.4.2. Xác định khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh ..................................................... 119 3.4.3. Xác định Rf của chất kháng sinh ................................................................................... 120 CHẤT KHÁNG SINH ...................................................................................................................... 121 HỆ DUNG MÔI ................................................................................................................................ 121 RF....................................................................................................................................................... 121 3.4.4. Tách chiết CKS TC-54 bằng chất hấp phụ ..................................................................... 121 3.4.5. Tách chiết CKS TC-54 bằng nhựa trao đổi ion ............................................................. 122 3.4.6. Nhận dạng CKS TC-54 ................................................................................................... 124 3.4.7. Mối tương quan giữa nồng độ CKS và đường kính vòng vô khuẩn ................................ 125 3.4.8. Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC) ..................................................................................... 125 3.5. TÌM HIỂU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÁC CKS THÔ T-41, D-42 VÀ TC-54 ........... 126 3.5.1 Ảnh hưởng của CKS trong dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn T-41 và TC-54 tới khả năng nảy mầm của hạt ........................................................................................................................................ 126 3.5.2. Ảnh hưởng của CKS T-4l và TC-54 đến khả năng sinh trưởng của cây ...................... 127 3.6. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ....................................................................................................... 129 3.6.1. Quy trình sản xuất chế phẩm T-41 và D-42 ................................................................... 129 3.6.2. Xác định một số tính chất của chế phẩm T-41 và D-42.................................................. 131 3.6.3. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng .......................................................... 132 KẾT LUẬN ....................................................................................................................................... 141 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .............................................................. 142 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN..... 143 7
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ BVTV Bảo vệ thực vật CFU (colony forming unit) Đơn vị hình thành khuẩn lạc CKS Chất kháng sinh CMC (carboxymethyl cellulose) carboxymethyl xenluloza CZ (Czapek–Dox–Agar) Môi trường Czapeck Dox DAP (diamino acid pymelic) Axit diamino pimelic (DHF), dihidrofolic axit đihidrofolic dNTP (deoxyribonucleotide Các loại nucleotit gồm:dATP, dCTP, triphosphate)Deoxyribo dGTP and dTTP dùng trong phản ứng PCR (PABA) para-aminobenzoic acid Axit para-aminobenzoic EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid) Axit etylen diamin tetra axetic FDA (Food and Drug Administration) Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ G (-) (+) Vi khuẩn Gram âm, dương HPLC ( High performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng cao áp IR (Infrared) spectroscopy Phổ hồng ngoại ISP ( International Streptomyces Project) Chương trình xạ khuẩn quốc tế IU/ml Đơn vị quốc tế/ml KTCC Khuẩn ty cơ chất KTKS Khuẩn ty khí sinh LD50 (lethal dose) Liều gây chết 50 % MIC (Minimum inhibition concentration) Nồng độ ức chế tối thiểu MS ( mass spectrophotometry) Khối phổ MW (Molecular Weight) Trọng lượng phân tử NAG (N-acetylglucozamine) N-acetylglucozamin NAM (N-acetylmuramic) N-acetylmuramic 8
NMR ( nuclear magnetic resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PCR (Polymerase chain reaction) Phản ứng chuỗi polime PDA (Potato Dextrose Agar) Môi trường thạch khoai tây PG (peptidoglycan) Thành tế bào vi khuẩn RA (Retinaculiaperti) Cuống sinh bào tử hình móc câu RF (Rectiflexibiles) Cuống sinh bào tử hơi lượn sóng S (Spirales) Cuống sinh bào tử dạng xoắn SDS ( sodium docecyl sulfate) Natri docecyl sulphat TLC (thin layer chromatography) Sắc ký bản mỏng TLm ( Median Tolerance limit) Giới hạn chịu đựng trung bình THF (tetrahydrofolic) axit tetrahydrofolic U (Unit) Đơn vị UDP-GlcNAc (Uridine Diphosphate -N- Uridin Diphotphat-N- acetylglucosamine) acetylglucosamin VSV Vi sinh vật 9
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes 15 Bảng 3.1. Số lượng và sự phân bố xạ khuẩn trong đất ở một số vùng 73 Bảng3.2. Đặc điểm nuôi cây của 3 chủng 78 Bảng 3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng T-41, D-42 và TC-54 79 Bảng 3.4. Khả năng đồng hoá đường của các chủng T-41, D-42 và TC-54 80 Bảng 3.5. Hoạt phổ kháng khuẩn của 3 chủng xạ khuẩn 81 Bảng 3.6. So sánh đặc điểm phân loại của chủng T-41 với loài chuẩn S. 87 antimycoticus và chủng D-42 với loài chuẩn S.viridogenes Bảng 3.7. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn TC-54 với chủng 88 chuẩn S. hygroscopicus ISP – 5578 Bảng 3.8. Hoạt tính kháng F. oxysporum của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 93 trên các môi trường lên men khác nhau Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp 95 CKS của các chủng T-41, D-42 và TC-54 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành chất kháng 96 sinh của 3 chủng xạ khuẩn Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh 97 tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và TC- 54 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và TC-54 98 Bảng 3.13. Tối ưu hoá môi trường theo phương pháp Box- Willson 101 Bảng 3.14. Môi trường tối ưu “lên dốc” của chủng TC-54 102 Bảng 3.15. Các thông số lên men của chủng TC-54 trong nồi lên men 80 lít 103 10
Bảng 1.16. Hoạt tính kháng sinh được chiết bằng các loại dung môi khác 105 nhau Bảng 3.17. Hệ số Rf của CKS T-41, D-42, TC-54 trên các hệ dung môi khác 108 nhau Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm trên cà chua 120 Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm trên bắp cải 121 Bảng 3.20. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh trước khi phun thuốc 122 Bảng 3.21. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh 5 ngày sau phun thuốc 123 Bảng 3.22. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh 10, 15 và 20 ngày sau phun thuốc 124 Bảng 3.23. Tổng hợp số liệu khảo nghiệm sau 20 ngày 125 11
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Mốc thời gian tìm ra các chất kháng sinh khác nhau 5 Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của tetracylin và aminoglycosit 8 Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của macrolit và chloramphenicol 8 Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của amphotericin B 9 Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của sunfonamit trong quá trình sinh tổng hợp 10 axit folic Hình1.6. Đồ thị về tỷ lệ các vi sinh vật sinh chất kháng sinh 12 Hình 1. 7. Mục tiêu tuyển chọn các chất có hoạt tính sinh học 13 Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc Chi Streptomyces theo nhóm màu 74 Hình 3.2. Tỷ lệ phần trăm các chủng có hoạt tính kháng sinh 75 Hình 3.3. Hoạt tính kháng sinh của 47 chủng xạ khuẩn 75 Hình 3. 4. Bề mặt bào tử chủng T-41 76 Hình 3.5. Bề mặt bào tử chủng D-42 76 Hình 3.6. Bề mặt bào tử chủng TC-54 Hình 3.7. Cuống sinh bào tử chủng TC-54 77 Hình 3.8 Hoạt tính kháng F.oxysporum của 3 chủng T-41, D-42, TC-54 77 Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR 82 Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 84 16S, thể hiện mối quan hệ giữa 3 chủng xạ khuẩn T-41, D-42, TC-54 và các 90 đại diện có quan hệ gần gũi thuộc chi Streptomyces 99 Hình 3.11. Động thái lên men CKS của 3 chủng T-41, D-42, TC-54 104 Hình 3.12. Hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 trên môi trường lên men xốp 12
Hình 3.13. Hoạt tính kháng sinh của 3 chủng nghiên cứu chiết ở các pH khác 105 nhau Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng sinh của 3 chủng xạ 106 khuẩn Hình 3.15. Tách chiết CKS bằng than hoạt tính và giải hấp phụ bằng axeton 109 Hình 3.16. Sơ đồ phân lập chất kháng sinh TC-54-1 110 Hình 3. 17. Công thức cấu tạo của validamyxin 111 Hình 3.18. Mối tương quan giữa đường kính vòng vô khuẩn và nồng độ 112 chất kháng sinh Hình 3.19. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng T-41 lên khả năng nảy mầm 113 của hạt Hình 3.20. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng TC-54 lên khả năng nảy 114 mầm của hạt Hình 3.21. Ảnh hưởng của CKS TC-54 lên tỷ lệ nảy mầm của hạt thóc và 115 sinh trưởng của cây mạ Hình 3.22. Ảnh hưởng của CKS TC-54 lên tỷ lệ nảy mầm của hạt thóc và 117 sinh trưởng của cây mạ Hình 3.23. Quy trình sản xuất chế phẩm từ T-41 và D-42 118 Hình 3.24. Quy trình thử nghiệm chế phẩm T-41 và D-42 119 Hình 3.25. Diễn biến tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau 20 ngày thử nghiệm 126 13
MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương…đẫ gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm 83% trong số các bệnh ở cây trồng [173,174, 175]. Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới [49,152, 187,189]. Việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật nhằm tăng sản lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam với các chủng loại thuốc bảo vệ thực vật rất đa dạng. Mỗi năm Việt Nam sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học diệt sâu bệnh. Theo thống kê năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hoá chất với 1231 tên thương phẩm [61]. Song việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thường rất độc và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái. Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực Châu Á Thái Bình Dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (quản lý dịch hại tổng hợp) với 3 chiến lược cơ bản chính [49, 138]: 1. Sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Hướng dẫn áp dụng với các loại vi sinh vật đối kháng, các chất sinh học diệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau của cây trồng. 2. Làm tăng các loại vi sinh vật có ích, đấu tranh chống các vi sinh vật ký sinh cho cây ở trong đất. 3. Thúc đẩy khả năng sinh trưởng của cây trồng, làm tăng sức chống chịu của cây. Việt Nam là nước nông nghiệp, diện tích đất canh tác 10,126 triệu ha với sản phẩm nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển gây tổn thất nặng nề đến năng suất cây trồng. Năm 2003, Việt Nam phải nhập tới 166 triệu USD thuốc bảo vệ thực vật, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0%. [61]. 14
Những năm vừa qua, nông dân Việt Nam cũng đã ứng dụng một số chế phẩm kháng sinh chống nấm gây bệnh cho cây trồng như: validamyxin, jingangmixin, polioxin, blastixidin S, kasugamyxin…nhưng đây đều là các chế phẩm nhập ngoại. Xuất phát từ những yêu cầu đó, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay, cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của nước ta. Chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ” Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam”. Đề tài tập trung nghiên cứu các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh, tiến hành lên men, chiÕt xuÊt, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh có tiềm năng nhất; đưa ra quy trỡnh sản xuất và ứng dụng trong nông nghiệp. Việc tiến hành đề tài này là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh thực vật từ các chất có hoạt tính sinh học, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sạch, an toàn và bền vững ở Việt Nam. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI  Đối tượng nghiên cứu Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Việt Nam Các vi nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam.  Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn của Việt Nam có khả năng sinh chất kháng sinh dùng làm nguyên liệu nghiên cứu đồng thời đóng góp vào sự tìm hiểu tính đa dạng sinh học cũng như phát hiện nguồn gen quý hiếm từ xạ khuẩn của Việt Nam. 2. Phân loại một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm mạnh nhất theo phương pháp sinh học phân tử. 3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh. 4. Xác định cấu trúc hoá học của chất kháng sinh. 5. Thăm dò khả năng ứng dụng. 15
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1.1.1. Chất kháng sinh (Antibiotic) Chất kháng sinh, theo khái niệm cũ là bất kỳ sản phẩm vi sinh nào mà ngay ở nồng độ thấp (g/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác (vi khuẩn, nấm nem, nấm mốc…) một cách chọn lọc [124]. Thuật ngữ antibiotic bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: “anti” là kháng lại, còn “bios” là sự sống. Thuật ngữ này được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phân biệt penixillin với sulfonamit đã được phát hiện từ những năm 1930. Thuật ngữ này đã được thay đổi sau khi penixillin và các chất kháng khuẩn khác đã được cải tiến và tổng hợp mới trong phòng thí nghiệm. Ngày nay, thuật ngữ này được sử dụng rộng rãi hơn để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, hoặc tổng hợp hoàn toàn có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như là một chất hoá trị liệu có khả năng kháng virut, động vật nguyên sinh, tế bào ung thư…Tất cả các CKS đều có tính độc chọn lọc. Mỗi chất kháng sinh thường chỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định. Một số CKS sử dụng ngoài mục địch y học có tầm quan trọng trong sinh thái như agroxin, bacterioxin, yếu tố gây chết (killer factor), microxin… 1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh Alexander Fleming, người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS – nhà sinh vật học người Anh làm việc tại viện St. Mary, London, đã phát hiện ra penixillin vào tháng 10 năm 1928. Trong khi tiến hành thí nghiệm, ông đã quan sát thấy một hiện tượng lạ: trên đĩa thạch đã cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus bị nhiễm một loại nấm mốc xanh và xung quanh vùng nấm mọc thì vi khuẩn không thể phát triển được. Điều đó chứng tỏ rằng loại nấm này đã sinh ra một chất ức chế sự phát triển và tiêu diệt S.aureus. Fleming đã phân lập và định tên loại vi nấm này là Penicillium notatum và đặt tên cho chất kháng khuẩn Êy là penixillin. 16
Một thập kỷ sau, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh vật häc vµ sinh ho¸ häc Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành một “loại thuốc thần kỳ”. Năm 1945, A.Fleming, E.Chain và H.W. Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã sự khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh. Năm 1939, Rene’ Jules Dubos nuôi cấy Bacillus brevis phân lập từ vùng New Jersey và tách được một hỗn hợp gồm hai chất khác nhau là gramixidin và tiroxidin. Sau đó ít lâu Abraham, Waksman, Schatz và Bugie [82, 135, 172] đã phát hiện ra streptomixin, chất này có tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn G(-), đặc biệt là trực khuẩn lao. Tốc độ tìm kiếm chất kháng sinh ngày càng được đẩy mạnh. Những năm 1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS. Hàng loạt chất kháng sinh được phát hiện trong gia đoạn này có ứng dụng trong y học như: actinomixin (Waksman,1940), chloramphenicol (Erhlich,1947), chlotetraxyclin (Dugar, 1948), [172]. Trong suốt những năm 1960 và 1970, ngành công nghiệp về kháng sinh đã bùng nổ khắp thế giới. Vào đầu năm 1970, hơn 270 CKS đã được sản xuất. Vào những năm 1990, nhiều công ty dược phẩm đã đầu tư để nghiên cứu và phát triển, tìm ra các chất kháng sinh mới do tình trạng kháng thuốc lan tràn của các vi sinh vật gây bệnh. [126]. Vào khoảng những năm 1993 đến 2002, số lượng các tác nhân kháng khuẩn đã tăng lên từ 90 đến 120 (Công bố tại Hội nghị Khoa học về tác nhân kháng khuẩn và hoá trị liệu). Tại hội nghị này 21 công ty dược phẩm lớn đã trình bày các phương pháp để khám phá ra các CKS mới [45,129]. Như vậy, sau hơn 70 năm kể từ khi khám phá ra CKS, đến nay, số lượng CKS được phát hiện lên tới trên 17.000 chất [46]. Tuy nhiên chỉ có 1-2 % CKS đủ tiêu chuẩn để sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học. Thị trường CKS trên thế giới, theo thống kê năm 2002 đã đạt doanh số 26 tỷ đôla [174], và sẽ vẫn còn tăng khoảng 0,6% từ năm 2002-2008. Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đang phải đối mặt với “thời kỳ hậu kháng sinh” (post antibiotic era). [89,90]. Chính vì thế nhiệm vụ 17
đặt ra của ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các CKS cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển (R&D) để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn toàn.[113]. Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới. Có thể nói ngành công nghiệp sản xuất CKS vẫn đang là một trong những hướng phát triển mạnh mẽ nhất trong công nghệ sinh học. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành Vi sinh vật học, Hoá sinh học, Di truyền học phân tử và đặc biệt là sự ra đời của công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu lớn lao. Dưới đây là các mốc thời gian phát hiện ra các CKS trong những năm vừa qua. [45,101,108,153] Hình 1.1. Mốc thời gian tìm ra các chất kháng sinh khác nhau 1.2. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật. Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất kháng sinh và cấu trúc hiển vi của tế bào. Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì thường có cơ chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần giống nhau thì có hoạt phổ tương tự như nhau. Đồng thời nó còn phụ thuộc vào nồng độ. Một số chất 18
kháng sinh khi ở nồng độ thấp không những không tác dụng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật mà còn kích thích vi sinh vật phát triển. Ngoài ra, cùng một chất kháng sinh như nhau nhưng trong các điều kiện khác nhau thì cơ chế tác động cũng có thể không hoàn toàn giống nhau. Nhìn chung, cơ chế tác dụng của CKS được thể hiện theo năm phương thức sau . 1.2. 1.Ức chế tổng hợp thành tế bào Thành tế bào của vi khuẩn là cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại áp suất thẩm thấu. Thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào là peptidoglycan (PG). PG là một đại phân tử cấu tạo bởi các chuỗi polisaccarit bao gồm đơn phân là các dẫn xuất của đường glucoza nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cách liên tục (NAG- NAM). Để tạo thành mạng lưới thực sự vững chắc, các chuỗi polisaccarit của PG phải liên kết chéo với nhau thông qua một đoạn peptit ngắn giữa các tetrapeptit của tiểu phần NAM. Để có thể sinh trưởng và phân chia, tế bào phải tổng hợp các đơn vị PG mới và vận chuyển nó tới đúng vị trí sinh trưởng của thành tế bào [135]. Phần lớn các tác nhân kháng khuẩn thông thường đều hoạt động dựa trên sự ức chế quá trình hình thành liên kết chéo giữa các tetrapeptit của tiểu phần NAM. Nổi bật nhất giữa các chất này là các kháng sinh -lactam mà đại diện là penixillin và cephalosporin. Đây là các chất kháng khuẩn có vùng chức năng là các vòng - lactam. Các kháng sinh -lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng cách gắn với transpeptidaza là enzym cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa các chuỗi PG, kìm hãm hoạt tính của enzym này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn [135]. Tuy nhiên, cần chú ý rằng các chất kháng sinh này chỉ hoạt động ở giai đoạn tế bào đang sinh trưởng vì các tế bào già hay ở trạng thái nghỉ không sinh tổng hợp PG. Các penixillin không thấm qua được màng ngoài của vi khuẩn Gram (-) nên hiệu quả chống các vi khuẩn này rất thấp, tuy nhiên các penixillin và cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng ngoài vi khuẩn Gram (-). Tế bào của người không có PG nên các kháng sinh -lactam rất ít độc đối với tế bào người [135, 172]. 19
Các chất kháng sinh khác như vancomyxin do Streptomyces orientalis sinh ra và CKS bán tổng hợp xycloserin ức chế sự hình thành thành tế bào theo một cách khác. Chúng cản trở trực tiếp đến sự hình thành cầu D-alanin-D-alanin liên kết các tiểu phần NAM của các vi khuẩn Gram (+). Tuy nhiên, các vi khuẩn không có cầu D-alanin-D-alanin có khả năng đề kháng tự nhiên đối với những chất kháng sinh này. Một chất kháng sinh ức chế tổng hợp thành tế bào khác là bacitracin ngăn cản sự vận chuyển các đơn vị PG mới từ tế bào chất đến vị trí tổng hợp của thành tế bào. Cũng như các CKS -lactam, vancomyxin, xycloserin và bacitraxin làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào và làm tế bào bị phá vỡ do áp suất thẩm thấu [135]. Liên kết với protein thụ thể Người ta cho rằng, một số protein liên kết với penixillin–(Peniciline Binding Protein (PBP) nằm trên màng tế bào vi khuẩn) là các đích cho các penixillin và các cephalosporin liên kết. Tất cả các vi khuẩn đều có loại protein này, ví dụ Staphylococcus aureus có 4 PBP còn E.coli thì có ít nhất là 7 PBP. Các PBP này hoạt động như các enzym và biểu hiện hoạt tính của cacbocylpeptidaza, transpeptidaza, enđopeptidaza và transglycozylaza. Song vai trò chính xác của các PBP, bất kể thuộc hoạt tính enzym nào, trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào, vẫn chưa được biết rõ, và vì vậy cơ chế phân tử của hoạt động gây chết của các chất kháng sinh nhóm β-lactam vẫn chưa được giải thích. 1.2.2. Ức chế sự tổng hợp protein Các tác nhân kháng khuẩn có đích tấn công là tiểu phần 30S của riboxom gồm các aminoglycozit và các tetraxyclin. Aminoglycozit bao gồm streptomyxin, gentamyxin, neomyxin, kanamyxin, amykaxin, tobramyxin…Chúng gắn vào tiểu phần 30S của riboxom, làm biến dạng tiểu phần này và gây ra sự bắt cặp không chính xác giữa các codon của ARNt và các anticodon của ARNvc tương ứng. Kết quả làm mã di truyền trên phân tử ARNt bị đọc sai. Ví dụ dưới tác động của streptomyxin, codon UUU mã hoá cho phenylalanin bị đọc sai thành codon AUU mã cho isolexin. Tetracyclin phong bế vị trí gắn của phân tử ARNvc với ARNtt ở 20