Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập tại Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:134

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học "Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập tại Việt Nam" trình bày các nội dung chính sau: Tuyển chọn một số chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ tốt; Nghiên cứu một số các điều kiện lý hóa như pH, nhiệt độ, nồng độ muối ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học của các chủng được lựa chọn; Đánh giá hiệu suất phân hủy một số thành phần hydrocarbon dầu mỏ bởi màng sinh học đơn chủng/ đa chủng gắn trên giá thể.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập tại Việt Nam

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROCARBON DẦU MỎ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP TẠO MÀNG SINH HỌC PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2022
ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***………… NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROCARBON DẦU MỎ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP TẠO MÀNG SINH HỌC PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Lê Thị Nhi Công 2. PGS.TS. Đồng Văn Quyền Hà Nội – 2022
iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Nhi Công - Trưởng phòng Công nghệ sinh học môi trường và PGS.TS. Đồng Văn Quyền, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm qúy báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Liên và toàn thể các anh, chị cán bộ nhân viên phòng CNSH môi trường Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo và đóng góp những lời khuyên bổ ích trong suốt quá trình học tập nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt những năm qua. Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn chuyên viên Bùi Thị Hải Hà phụ trách đào tạo của Viện Công nghệ sinh học và chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm phòng Đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ tôi hoàn thành những thủ tục cần thiết trong suốt quá trình nghiên cứu sinh và bảo vệ luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Nghiên cứu cơ bản cấp Nhà nước (Nafosted) đã cấp kinh phí cho nhóm nghiên cứu. Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2 nơi tôi đang công tác, cùng với sự giúp đỡ nhiệt tình cũng như những đóng góp quý báu của các bạn bè đồng nghiệp. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận án Nguyễn Thị Minh Nguyệt
iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn, các tài liệu trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả luận án Nguyễn Thị Minh Nguyệt
v MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Một số đặc điểm sinh học cơ bản của vi khuẩn tía quang hợp . 3 1.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp ................................... 3 1.2.2. Sinh thái học của vi khuẩn tía quang hợp ....................................... 3 1.2.3. Đa dạng vi khuẩn tía quang hợp ..................................................... 4 1.2.4. Đặc điểm của bộ máy quang hợp .................................................... 9 1.2.5. Dinh dưỡng carbon.......................................................................... 12 1.2. Ứng dụng của vi khuẩn tía quang hợp để phân hủy hydrocarbon dầu mỏ ..................................................................... 13 1.2.1. Tính độc của hydrocarbon dầu mỏ .................................................. 13 1.2.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu mỏ ......................................... 18 1.2.3. Ứng dụng của vi khuẩn tía quang hợp để phân hủy hydrocarbon dầu mỏ ............................................................................................. 22 1.3. Vi sinh vật có khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ và tạo màng sinh học................................................................................. 24 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 30 2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................ 30 2.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................... 30 2.1.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy ........................................................ 31 2.1.3. Các thiết bị máy móc ....................................................................... 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 33 2.2.1. Các phương pháp phân tích vi sinh vật ........................................... 34 2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử................................................. 42 2.2.3. Nhóm phương pháp phân tích hóa học ........................................... 43 2.2.4. Xử lý thống kê .................................................................................. 43 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 44
vi 3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng VKTQH khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ ............... 44 3.1.1. Kết quả phân lập các chủng VKTQH từ các mẫu nước và bùn ô nhiễm dầu ........................................................................................ 44 3.1.2. Tuyển chọn các chủng VKTQH khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ ........................................................ 48 3.2. Các đặc điểm sinh học và định danh ba chủng DQ41, DD4 và FO2 .................................................................................................. 56 3.2.1. Các đặc điểm hình thái ................................................................... 56 3.2.2. Trình tự 16S rRNA và định danh ba chủng DQ41, DD4 và FO2 .. 58 3.2.3. Các đặc điểm sinh học ..................................................................... 59 3.3. Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sự hình thành màng sinh học của 3 chủng VKTQH ................................ 63 3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ................................................................... 63 3.3.2. Ảnh hưởng của pH ........................................................................... 64 3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) ............................................. 65 3.4. Hiệu suất phân hủy một số hydrocarbon dầu mỏ của màng sinh học từ 3 chủng VKTQH ........................................................ 66 3.4.1. Hiệu suất phân hủy một số hydrocarbon thơm bởi màng sinh học đơn chủng không gắn giá thể của các chủng VKTQH được lựa chọn ................................................................................................. 66 3.4.2. Phân hủy hydrocarbon dầu mỏ bởi màng sinh học từ các VKTQH lựa chọn ........................................................................................... 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 97 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ........................................................................................... 98 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 99
vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BA Benzoic acid Axit benzoic Bchl Bacteriochlorophyl BLAST Basic local alignment search Công cụ tìm kiếm các trình tự tool tương đồng BOD Biochemical oxygen demand Nhu cầu oxy sinh hóa BTNMT Bộ tài nguyên môi trường CB Cinder bead Sỏi nhẹ CF Coconut fiber Xơ dừa CFU Colony Forming Unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc COD Chemical oxygen demand Nhu cầu oxy hoá học DAD Diode array detector Detectơ dãy diode DNA Deoxyribonucleic acid Axit đeoxyribônuclêic DSMZ Deutch samplung Trung tâm lưu trữ giống vi sinh microorganism zentrum vật – Đức GCMS Gas chromatography – Mass Sắc kí khối phổ spectrometry HPLC High performance – Liquid Sắc kí lỏng cao áp chromatography MSH Màng sinh học OD Optical density Mật độ quang PAH Polycyclic aromatic Hydrocacbon thơm đa vòng hydrocarbon PCR Polymerase chain reaction Chuỗi phản ứng trùng hợp PUF Polyurethare foam Mút xốp QCVN Quy chuẩn Việt Nam rARN Ribosomal ribonucleic acid Axit ribônuclêic ribôxôm RNA Ribonucleic acid Axit ribônuclêic TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam VK Vi khuẩn VKTQH Vi khuẩn tía quang hợp PNSB Purple non-sulfur Vi khuẩn tía quang hợp không lưu photosynthetic bacteria huỳnh PSB Purple sulfur photosynthetic Vi khuẩn tía quang hợp lưu huỳnh bacteria VSV Vi sinh vật
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các chi vi khuẩn tía quang hợp .................................................. 6 Bảng 1.2. Những ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật ............ 17 Bảng 1.3. Các chi vi khuẩn có khả năng phân huỷ hiếu khí hydrocarbon 24 thơm ............................................................................................ Bảng 1.4. Các chi vi khuẩn có khả năng phân huỷ hiếu khí hydrocarbon 24 no ................................................................................................ Bảng 1.5. Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân huỷ kỵ khí hydrocarbon 25 Bảng 2.1. Các loại giá thể ........................................................................... 31 Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng VKTQH từ mẫu các mẫu nước và bùn ô nhiễm dầu .......................................................................... 45 Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng VKTQH đã phân lập được (theo ∆OD800) ...................................................... 48 Bảng 3.3. Khả năng sinh trưởng và phát triển trên các nguồn cơ chất của VKTQH ...................................................................................... 56 Bảng 3.4. So sánh mức độ sử dụng một số nguồn C của ba chủng DQ41, DD4 và FO2 với đại diện của loài Rhodopseudomonas ............. 62 Bảng 3.5. Khả năng phân hủy một số hydrocarbon thơm của màng sinh học do 3 chủng VKTQH tạo thành sau 14 ngày nuôi cấy. ......... 67 Bảng 3.6. Sự phân hủy thành phần (%) của 20 (g) dầu thô sau 14 ngày nuôi cấy ....................................................................................... 90 Bảng 3.7. Sự phân hủy hydrocacbon no (%) của dầu thô sau 14 ngày nuôi cấy bởi MSH đơn chủng và đa chủng VKTQH không giá thể................................................................................................ 93
ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình ảnh chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang của VKTQH ... 5 Hình 1.2. Sơ đồ vị trí các thành phần của bộ máy quang hợp sơ cấp ở VKTQH .................................................................................... 10 Hình 1.3. Quang hợp ở vi khuẩn tía không lưu huỳnh ............................. 11 Hình 2.1. Hình ảnh các loại giá thể .......................................................... 31 Hình 2.2. Sơ đồ các bước thí nghiệm thực hiện trong luận án ................. 33 Hình 2.3. Sơ đồ xử lý sơ bộ các loại giá thể ............................................. 39 Hình 2.4. Chi tiết mô hình xử lý hydrocarbon dầu mỏ ............................. 40 Hình 2.5. Các giai đoạn trong mô hình xử lý hydrocarbon dầu mỏ ......... 41 Hình 3.1. Mẫu bùn ô nhiễm dầu trước và sau làm giàu ............................... 44 Hình 3.2. Một số khuẩn lạc VKTQH được phân lập từ mẫu làm giàu ..... 45 Hình 3.3. Khả năng tạo MSH dựa trên khả năng bắt giữ tím tinh thể của MSH do các chủng VKTQH tạo thành ..................................... 50 Hình 3.4. Khả năng tạo màng sinh học của các chủng VKTQH phân hủy hydrocarbon dầu mỏ và Acinetobacter calcoaceticus P23 50 Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các nồng độ dầu diesel khác nhau ................................... 51 Hình 3.6. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 10% dầu diesel sau 7 ngày nuôi cấy ............................................................................ 51 Hình 3.7. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ toluene khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy .................................... 52 Hình 3.8. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 250 ppm toluene sau 7 ngày nuôi cấy ......................................................................... 52 Hình 3.9. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các nồng độ phenol khác nhau ........................................ 53 Hình 3.10. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 150 ppm phenol sau 7 ngày ........................................................................................... 53 Hình 3.11. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ naphthalene khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy ............................. 54 Hình 3.12. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở nồng độ 200 ppm
x naphthalene sau 7 ngày nuôi cấy .............................................. 54 Hình 3.13. Khả năng sinh trưởng của các chủng VKTQH ở các nồng độ pyrene khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy ..................................... 55 Hình 3.14. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở nồng độ 200 ppm pyrene sau 7 ngày nuôi cấy ....................................................... 55 Hình 3.15. Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào dưới kính hiển vi điện tử của chủng DD4, DQ41, FO2 ........................................ 57 Hình 3.16. Cây phát sinh chủng loại của 3 chủng DD4, DQ41, FO2 ........ 58 Hình 3.17. Phổ hấp phụ dịch huyền phù tế bào của 3 chủng DD4 (A), DQ41 (B), FO2 (C) ................................................................... 60 Hình 3.18. Khả năng tạo sắc tố quang hợp của VKTQH ở hai điều kiện (A) kỵ khí, sáng và (B) hiếu khí, tối. ........................................ 61 Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành màng sinh học của các chủng VKTQH ..................................................... 64 Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH tới khả năng hình thành màng sinh học của các chủng VKTQH ............................................................ 64 Hình 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng hình thành màng sinh học của các chủng VKTQH .............................................. 66 Hình 3.22. Thí nghiệm đánh giá sự đối kháng lẫn nhau của các chủng VKTQH lựa chọn...................................................................... 70 Hình 3.23. Mật độ tế bào của chủng DD4, DQ41 và FO2 trong màng sinh học VKTQH sau 9 ngày nuôi cấy ..................................... 71 Hình 3.24. Hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) của các giá thể trước và sau khi VKTQH bám dính ........................................................ 72 Hình 3.25. Thời gian phân hủy dầu diesel và mật độ tế bào của chủng VKTQH trong màng sinh học đơn hoặc đa chủng không giá thể.............................................................................................. 74 Hình 3.26. Khả năng phân hủy dầu diesel và mật độ tế bào của chủng VKTQH DD4, DQ41 và FO2 trong MSH đa chủng trên giá thể.............................................................................................. 75 Hình 3.27. Hiệu suất phân hủy thành phần n-alkane (từ C8 đến C16) có trong dầu diesel bởi màng sinh học đa chủng VKTQH trên
xi các giá thể khác nhau ................................................................ 76 Hình 3.28. Hiệu suất phân hủy PAH bởi các loại màng sinh học khác nhau ........................................................................................... 81 Hình 3.29. Sắc ký đồ phân tích thành phần dầu thô còn lại sau 14 ngày trong thí nghiệm phân huỷ dầu bằng MSH đơn chủng VKTQH .................................................................................... 86 Hình 3.30. Sắc ký đồ phân tích thành phần dầu thô còn lại sau 14 ngày trong thí nghiệm phân huỷ dầu bằng MSH đa chủng VKTQH không gắn trên giá thể............................................................... 87 Hình 3.31. Sắc ký đồ phân tích thành phần dầu thô còn lại sau 14 ngày trong thí nghiệm phân huỷ dầu bằng MSH đa chủng VKTQH trên giá thể (sỏi nhẹ, xơ dừa, mút xốp) ..................................... 88 Hình 3.32. Sắc ký đồ phân tích thành phần dầu thô còn lại sau 14 ngày trong thí nghiệm khả năng hấp phụ dầu thô của giá thể (sỏi nhẹ, xơ dừa, mút xốp) ............................................................... 89 Hình 3.33. Hiệu suất phân huỷ hydrocarbon no (%) của dầu thô sau 14 ngày nuôi cấy bởi màng sinh học đơn chủng và đa chủng VKTQH không giá thể.............................................................. 91 Hình 3.34. Hiệu suất phân huỷ hydrocarbon no (%) của dầu thô sau 14 ngày nuôi cấy bởi màng sinh học đa chủng VKTQH trên giá thể.............................................................................................. 92
1 MỞ ĐẦU Dầu mỏ đã được sử dụng từ thời cổ đại và ngày càng trở nên quan trọng trong xã hội, đặc biệt là kinh tế, chính trị và công nghệ. Bên cạnh những lợi ích kinh tế, dầu mỏ và các sản phẩm của dầu cũng là một trong những nguồn ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, được thải ra từ quá trình khai thác, sử dụng và chế biến dầu. Dầu mỏ có chứa nhiều hợp chất độc hại khó phân hủy trong tự nhiên, gây độc và có thể gây những hệ lụy nghiêm trọng cho môi trường sinh thái. Đặc biệt, các hợp chất thơm như: benzene, toluene, naphthalene, pyrene, phenol... có độ hòa tan trong nước khá cao, độc hại đối với nhiều loài sinh vật. Xử lý ô nhiễm dầu mỏ có thể được tiến hành theo phương pháp cơ học (vật lý), hóa học và sinh học. Trong đó, các phương pháp vật lý và hóa học thường được sử dụng để xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ ở nồng độ cao, có chi phí lớn. Biện pháp sinh học sử dụng các vi sinh vật (VSV) phân hủy hydrocarbon dầu mỏ là biện pháp hiệu quả trong xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ ở nồng độ thấp, nằm ngoài khả năng của xử lý cơ học/hoá học. Ứng dụng VSV có khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ đồng thời tạo màng sinh học sẽ tăng hiệu quả xử lý sinh học. Vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) là các vi khuẩn quang hợp kỵ khí, được công bố là có khả năng trao đổi chất linh hoạt, sử dụng nhiều loại cơ chất, trong đó có hydrocarbon. Một số VKTQH có khả năng tạo màng sinh học có thể đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hydrocarbon trong dầu mỏ. VKTQH phân bố rộng rãi trong tự nhiên, do vậy có tiềm năng ứng dụng cao trong xử lý ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ tại chỗ (in situ) và bên ngoài (ex situ). Luận án “Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp tạo màng sinh học phân lập tại Việt Nam” được thực hiện với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau: Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Tuyển chọn được một số chủng VKTQH từ các vùng biển ô nhiễm dầu ở Việt Nam, vừa có khả năng tạo tạo màng sinh học vừa có khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ hiệu suất cao.
2 - Đánh giá hiệu suất phân hủy các hợp chất hydrocarbon dầu mỏ bởi màng sinh học đơn chủng và đa chủng VKTQH trên các loại giá thể, từ đó đưa ra giải pháp xử lý ô nhiễm dầu ở điều kiện mô hình. Nội dung nghiên cứu 1. Tuyển chọn một số chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ tốt; nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh các chủng được lựa chọn. 2. Nghiên cứu một số các điều kiện lý hóa như pH, nhiệt độ, nồng độ muối ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học của các chủng được lựa chọn. 3. Đánh giá hiệu suất phân hủy một số thành phần hydrocarbon dầu mỏ bởi màng sinh học đơn chủng/ đa chủng gắn trên giá thể (xơ dừa, mút xốp, sỏi nhẹ) hoặc không gắn giá thể. Những đóng góp mới của luận án 1) Đã tuyển chọn được 03 chủng VKTQH ở Việt Nam vừa tạo màng sinh học tốt vừa phân hủy thành phần hydrocarbon dầu mỏ hiệu suất cao. 2) Luận án là công trình đầu tiên đánh giá hiệu suất phân hủy dầu thô, dầu diesel bởi màng sinh học đơn chủng và đa chủng VKTQH trên giá thể (sỏi nhẹ, xơ dừa, mút xốp).
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm sinh học cơ bản của vi khuẩn tía quang hợp 1.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp VKTQH thuộc nhóm vi khuẩn (VK) thủy sinh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí bằng cách quang hợp nhưng không thải oxy vì chúng không nhận điện tử từ quá trình quang phân ly nước mà từ một số chất như: hydro, các acid hữu cơ đơn giản, lưu huỳnh, hydro sulfide, đường đơn giản và rượu. VKTQH thường có màu hồng đến đỏ tía, sắc tố quang hợp đều chứa bacteriochlorophyll (Bchl) và carotenoid. Nhóm VK này có các kiểu trao đổi chất linh hoạt tùy thuộc vào điều kiện môi trường sống nên chúng phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên [1, 2, 3, 4]. Theo khoá phân loại của Bergey, VKTQH được chia thành 2 nhóm: - VKTQH lưu huỳnh (PSB): có khả năng tích luỹ giọt lưu huỳnh bên trong tế bào. - VKTQH không lưu huỳnh (PNSB): không có khả năng tích luỹ giọt lưu huỳnh bên trong tế bào [2]. 1.1.2. Sinh thái học vi khuẩn tía quang hợp Khối lượng lớn (hiện tượng “nở hoa”) của PSB thường được phát hiện trong các hệ sinh thái thủy sinh có sulfide. Đa số các loài trong nhóm này có thể sinh trưởng trên môi trường chứa sulfide và có thể oxy hoá sulfide ở các mức độ khác nhau thành các dạng lưu huỳnh không độc hại như: S0, S4O62- hoặc SO42- [5]. Trong đáy ao nuôi trồng thủy sản ven biển thường có hàm lượng sulfate đáng kể, nhóm vi khuẩn khử sulfate hoạt động tích cực tạo thành sulfide ở tầng đáy, sulfide khuếch tán từ tầng đáy lên trên theo cột nước bởi sự chênh lệch gradient nồng độ. Sulfide kích hoạt sự phát triển của PSB ở vùng có ánh sáng xuyên qua và hàm lượng sulfide tối ưu. Ở các độ sâu khác nhau có thể thu nhận được các loài khác nhau. Nếu sinh khối của VKTQH phát triển mạnh mẽ, sẽ xuất hiện sự “nở hoa” của ao, hồ làm cho ao, hồ có màu đỏ tía hoặc đỏ nâu. Khi sự “nở hoa” trong ao, hồ xảy ra, người ta có thể phân biệt được hình thái tế bào đặc trưng của các chi VKTQH dưới kính hiển vi. Trong các ao, hồ có sự “nở hoa” có thể bắt gặp hỗn hợp các loài hoặc có thể chỉ xuất hiện 1 loài VKTQH [6].
4 Hiện tượng “nở hoa” của PNSB thường xảy ra ở các môi trường mà nồng độ sulfide thấp (hoặc không có). Chúng thường được tìm thấy trong các các ao hồ tù đọng, các nguồn nước thải, trong các hệ thống xử lý nước thải… Các hồ xử lý nước thải được xem là nơi có các điều kiện phù hợp cho PNSB sinh trưởng. Các PNSB đã được tìm thấy ở trong các hệ thống xử lý nước thải như: Rodobacter (Rba.) capsulatus, (Rba.) sphaeroides, Rhodopseudomonas (Rps.) faecalis, Rhodopseudomonas (Rps.) palustris, Rhodospirillum (Rsp.) photometricum, Blastochloris viridis, Rubrivivax gelatinosus, Rhodocyclustenuis, Rubrivivax gelatinosus… [5, 7, 8, 9]. Tác giả Okubo và cộng sự (2006) đã phát hiện ra nhóm PNSB trong kênh chứa nước thải chăn nuôi tạo nên một tấm thảm có màu đỏ, trong đó xuất hiện các loài như Rba. sphaeroides, Rba. capsulatus và các loài trong chi Rhodopseudomonas, đặc biệt là Rps. palustris [9]. Ngoài ra có thể gặp đại diện của VKTQH trong một số thủy vực có điều kiện khắc nghiệt như: suối nước nóng, suối lưu huỳnh thủy vực kiềm hóa, thủy vực có tính acid, ở vùng biển có độ mặn cao và thậm chí cả ở hồ có băng bao phủ. Quá trình quang hợp của VKTQH có thể diễn ra ở nhiêt độ cao nhất có thể lên tới 57oC và thấp nhất ở 0oC; dải pH có thể thấp đến 3 và cao đến 11; ở độ mặn có thể lên tới giá trị bão hòa của NaCl (~32%) … [5]. 1.1.3. Đa dạng của vi khuẩn tía quang hợp 1.1.3.1. Đa dạng về hình thái VKTQH là các tế bào Gram âm, đơn bào và có các dạng hình cầu, phẩy, xoắn, gậy, cũng có thể gặp chúng ở trạng thái chuỗi trong những điều kiện môi trường đặc biệt. Kích thước của tế bào thường từ 0,3 - 0,6 m. Đa số các loài đều sinh sản bằng cách nhân đôi, một số loài có tế bào dinh dưỡng dạng phân cực thường sinh sản bằng cách nảy chồi (là đặc trưng của chi Rhodopseudomonas và Rhodomicrobium). Khi sinh trưởng trong điều kiện quang hợp, dịch huyền phù tế bào thường có màu tím tía, đỏ, nâu vàng, nâu hoặc xanh [2]. Sự đa dạng về hình thái tế bào của VKTQH là đặc điểm quan trọng được sử dụng để phân loại chúng.
5 1.1.3.2. Đa dạng về di truyền VKTQH được chia làm 3 họ, bao gồm (i) họ Chromatiaceae: gồm tất cả các vi khuẩn lưu huỳnh màu tía có khả năng hình thành hạt lưu huỳnh bên trong tế bào, (ii) họ Ectothiorhodospiraceae: gồm tất cả các vi khuẩn lưu huỳnh màu tía có khả năng hình thành hạt lưu huỳnh bên ngoài tế bào, (iii) họ Rhodospirilaceae: gồm tất cả các vi khuẩn quang hợp không tích lũy hạt lưu huỳnh [2]. a b Hình 1.1. Hình ảnh chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang của VKTQH (a) Tế bào của VKTQH Thermochromatium tepidum được phân lập từ suối nước nóng New Mexico. Các hạt lưu huỳnh nội bào khúc xạ ánh sáng (mũi tên); (b) Tế bào của PNSB Rhodobaca bogoriensis được phân lập từ Hồ Bogoria (Kenya) [5] Phân tích phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự gene 16S rRNA, VKTQH được xếp vào 3 phân lớp (i) Alphaproteobacteria: gồm VKTQH không lưu huỳnh (ii) Betaproteobacteria: cũng gồm VKTQH không lưu huỳnh và (iii) Gammaproteobacteria: gồm VKTQH lưu huỳnh (Bảng 1.1 và 1.2) [5]. Hiện nay, 20 chi PNSB đã được công bố (Bảng 1.1). Loài Rhodobacter và Rhodopseudomonas là những loài tiên phong cho các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về quang hợp kỵ khí. Ngoài ra, một số loài khác có một hoặc nhiều đặc điểm trao đổi chất đặc biệt cũng được biết đến. Ví dụ, các loài sống trong môi trường cực trị nóng, lạnh, mặn, kiềm và môi trường axit đã được phân lập (Hình 1.1b). Như trong Bảng 1.1, tất cả PNSB là proteobacteria và cây phát sinh chủng loại cho thấy nhiều loài có quan hệ chặt chẽ với các loài không quang dưỡng [10].
6 Khi nghiên cứu về đặc điểm sắc tố và phức hệ quang hợp giữa các loài PNSB khác nhau mà lại có sự giống nhau cho thấy khả năng quang dưỡng ở PNSB là do chuyển gene ngang. Nghiên cứu của Nagashimi và cộng sự, 1997 về phức hệ quang hợp protein đơn đã chứng minh điều này [11]. Hơn 25 chi VKTQH đa dạng về hình thái đã được công bố (Bảng 1.1). VKTQH bao gồm cả các loài có khả năng hình thành hạt lưu huỳnh bên trong tế bào (họ Chromatiaceae) và các loài có khả năng hình thành hạt lưu huỳnh bên ngoài tế bào (họ Ectothiorhodospiraceae). Bảng 1.1. Các chi vi khuẩn tía quang hợp [5] Phân loại Chi Viết tắt Hình thái tên chi1 Alphaproteobacteria Rhodobaca 3 Rca. Hình cầu hoặc que ngắn Rhodobacter Rba. Hình que Rhodovulum Rdv. Hình cầu hoặc que Rhodopseudomonas3 Rps. Hình que có nảy chồi Rhodoblastus3 Rbl. Hình que có nảy chồi Blastochloris Blc. Hình que có nảy chồi Rhodomicrobium Rmi. Hình que có nảy chồi Rhodobium Rbi. Hình que Rhodoplanes Rpl. Hình que Rhodocista3 Rcs. Dạng sợi Rhodospirillum Rsp. Dạng sợi Phaeospirillum Phs. Dạng sợi Rhodopila3 Rpi. Hình cầu Rhodospira Rsa. Dạng sợi Rhodovibrio3 Rhv. Hình dấu phẩy Rhodothallasium Rts. Dạng sợi Roseospira Ros. Dạng sợi Roseospirillum Rss. Dạng sợi Betaproteobacteria Rhodocyclus Rcy. Hình dấu phẩy tròn Rhodoferax3 Rfx. Hình que, dấu phẩy Rubrivivax Rvi. Hình que, phẩy tròn
7 Phân loại Chi Viết tắt Hình thái tên chi1 Gammaproteobacteria Họ Chromatiaceae2 Allochromatium Alc. Hình que Amoebobacter Amb. Hình cầu Chromatium Chr. Hình que Halochromatium3 Hch. Hình que Isochromatium Isc. Hình que Lamprobacter Lpb. Hình que Lamprocystis Lpc. Cụm hình cầu Marichromatium Mch. Hình que Rhabdochromatium Rbc. Hình que Thermochromatium3 Tch. Hình que Thioalkalicoccus3 Tac. Hình cầu Thiobaca Tba. Hình que Thiocapsa Tca. Hình cầu Thiococcus Tco. Hình cầu Thiocystis Tcs. Hình cầu đến que ngắn Thiodictyon Tdc. Tập hợp hình que Thiofl avicoccus Tfc. Hình cầu Thiohalocapsac3 Thc. Hình cầu Thiolamprovum Tlp. Hình cầu Thiopedia Tpd. Hình cầu, dạng đĩa Thiorhodococcus Trc. Hình cầu Thiorhodovibrio Trv. Hình dấu phẩy dạng sợi Thiospirillum Tsp. Dạng sợi Họ Ectothiorhodospira3 Ect. Hình dấu phẩy dạng sợi Ectothiorhodo- Halorhodospira3 Hlr. Hình dấu phẩy dạng sợi spiraceae2 Thiorhodospira3 Trs. Hình dấu phẩy dạng sợi Ectothiorhodosinus Ets. Hình que Ghi chú: 1 - Viết tắt theo Imhoff và Madigan (2004) [12]; 2 - Các loài thuộc họ Chromatiaceae tích luỹ lưu huỳnh từ quá trình oxy hóa sulfide nội bào (Hình 1.1a); các loài thuộc họ Ectothiorhodospiraceae không tích luỹ lưu huỳnh; 3 - Chứa một hoặc nhiều loài phát triển ở nhiệt độ, độ pH, hoặc độ mặn lớn hơn độ mặn của biển.
8 Ngày nay, với sự đa dạng của nhóm VKTQH bên cạnh việc phân tích thông tin di truyền gen 16S rDNA, người ta còn phát hiện ra gen pufM có tính bảo thủ cao để phân loại và đánh giá nhanh sự có mặt của nhóm VKTQH. Gen pufM thuộc operon puf (photosynthetic unit forming) được tìm thấy trong nhóm vi khuẩn quang hợp không thải oxy thuộc phân lớp Alpha-, Beta- và Gammaproteobacteria và họ Cloroflexaceae. Hiện nay, người ta phát hiện ra 5 loại operon puf khác nhau. Trong tất cả VKTQH đều chứa pufBALM mã hóa cho tiểu phần L và M của protein trong tâm phản ứng quang hợp. Ở VKTQH tâm phản ứng gồm ba tiểu phần, L (light), M (medium) và H (heavy). Chúng có chức năng gắn với bacteriochlorophyll và carotenoid cũng như quinone và được tách ra nguyên vẹn như là một phức hợp sắc tố - protein riêng biệt. Gen pufL và pufM có mặt trong tất cả các loại operon puf, chúng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng quang dưỡng. Hiện nay, hai gen pufL và pufM đang được quan tâm khi nghiên cứu nhóm VKTQH ở cấp độ phân tử. Đặc biệt, gen pufM mã hóa cho tiểu phần M của protein liên kết với sắc tố trong tâm phản ứng quang hợp được nhiều nhóm tác giả sử dụng khi nghiên cứu VKTQH. Gen pufM có tính bảo thủ cao, sản phẩm PCR gen pufM có kích thước khoảng 200 bp, dễ dàng phân tích trình tự và so sánh. Ngoài việc dùng gen pufM để phân loại nhóm vi khuẩn này người ta còn sử dụng như một công cụ cho việc phát hiện khả năng sinh sống trong cả điều kiện môi trường thuận lợi và khắc nghiệt [13]. 1.1.3.3. Đa dạng về các phương thức trao đổi chất Hai nhóm PSB và PNSB được minh chứng có sự khác nhau dựa trên cơ sở trao đổi chất và phát sinh loài, nhưng các loài thuộc hai nhóm này thường cùng tồn tại trong môi trường kỵ khí được chiếu sáng trong tự nhiên. PSB có khả năng quang tự dưỡng rất cao và có khả năng quang hóa ở mức hạn chế, nhưng chúng lại ít có khả năng trao đổi chất và tăng trưởng trong bóng tối. Ngược lại, PNSB tồn tại trong dải ánh sáng rộng, vừa có khả năng quang tự dưỡng và vừa có khả năng đa dạng cho sự trao đổi chất và tăng trưởng tối [5]. Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chủ yếu đề cập tới nhóm PNSB. Nhóm PNSB phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Một vài loài PNSB có thể sinh trưởng kỵ khí trong tối bằng phương thức lên men hoặc hô hấp kỵ khí và hầu hết chúng có thể sinh trưởng hô hấp hiếu khí trong tối. Trong các điều kiện này,
9 chất cho điện tử có thể là hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ như H2. Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng chủ yếu của PNSB là quang hợp dị dưỡng, trong đó ánh sáng là nguồn năng lượng và một hợp chất hữu cơ là nguồn carbon [2, 3]. PNSB có tính linh hoạt đặc biệt trong các phương thức dinh dưỡng và sử dụng các nguồn năng lượng. Chúng có thể sử dụng các acid béo, đường, rượu và cả các hợp chất thơm là nguồn carbon. Phần lớn PNSB có thể sinh trưởng quang tự dưỡng với CO2 + H2 hoặc CO2 + H2S ở nồng độ thấp. Rất nhiều hợp chất thơm được sử dụng bởi các VK này bao gồm các chất được tạo thành từ quá trình phân hủy kỵ khí lignin cũng như những sản phẩm tổng hợp độc hại tích tụ trong môi trường. Chúng có khả năng đồng hóa hầu như hoàn toàn nguồn carbon từ một số cơ chất thơm thành sinh khối tế bào của mình [3]. Vì các hợp chất thơm ở trạng thái bị khử hơn các vật liệu của tế bào nên VK phân hủy hợp chất thơm trong điều kiện quang hợp cần sự đồng hóa CO2 ở một mức độ nhất định để làm cân bằng thế oxy hóa khử của chúng. Ví dụ như oxy hóa benzoate ở VKTQH xảy ra theo các phương trình sau: C7H6O2 + 6 H2O → 3 CH3COOH + CO2 + 6 [H] 6[H] + 1,5 CO2→ 1,5 [CH2O] +1.5 H2O Ngoài ra, nhiều quá trình chuyển hóa carbon của PNSB đã được nghiên cứu và công bố. Đồng thời, vai trò cố định nitơ của PNSB cũng đã được biết đến. Rba. capsulatus và Rba. sphaeroides có thể sinh trưởng nhanh chóng với N2 là nguồn N với hoạt tính của enzyme nitrogenase tăng mạnh. Do đó, đây là nhóm VKTQH có nhiều hướng ứng dụng khác nhau, có thể liệt kê đến như là sinh vật mô hình để nghiên cứu các quá trình quang hợp không thải oxy, ứng dụng trong xử lý các nguồn ô nhiễm hữu cơ [10]. 1.1.4. Đặc điểm của bộ máy quang hợp VKTQH chỉ có một hệ thống quang hóa với một trung tâm phản ứng, do đó sự vận chuyển điện tử của chúng rất khác biệt so với mạch truyền điện tử ở thực vật (có ít nhất hai hệ quang hóa với hai trung tâm phản ứng) [14]. Phương trình tổng quát: CO2 + 2H2A + hv [CH2O]n + 2A + H2O