Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

Chia sẻ: Quỳnh Quỳnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:24

Thêm vào BST

Báo xấu

190
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng nhằm nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong tế bào cây nghệ đen nuôi cấy huyền phù.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

48 1 was suitable for cell growth of Zedoary in flask 250 mL. The cell MỞ ĐẦU biomass was maximum with 10.44 g fresh weight (0.66 g dry weight) 1. Tính cấp thiết của đề tài after 14 culture days with inoculum size of 3 g. Thực vật là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm 3. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; agitation speed 150 rpm/min, hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương aeration rate 2,5 L/min was suitable to growth of Zedoary cells in 10 L liệu... Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, bioreactor. The cell biomass was maximum with 603 g fresh weight chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật (53.25 g dry weight) after 14 culture days with inoculum size of 200 g. với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động 4. The concentration of essential oil in cells reached maximum at vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật 2.57% dry weight after 14 culture days, 1.6 times higher than that in đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có rhizome. The concentration of curcumin in cells reached maximum at khoảng hơn 80.000 hợp chất đã đuợc công bố. Việc khai thác nguồn 1.16% after 14 culture days, 2.7 times higher than that in rhizome. dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng There was a biotransformation of curcuminoid in cell culture. The mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều concentration of polysaccharide in cell was maximum at 6.55% dry hơn. Vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc weight after 10 culture days, 1.4 time lower than that in rhizome. đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến động của điều kiện môi There was accumulation of sesquiterpenes in cell culture. The trường và địa lý, cũng như sự khai thác bừa bãi của con người. Điều compositions of sesquiterpene distributed in suspension cells was less này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến tiềm năng của kỹ thuật than that in rhizome. There were 3-4 peaks of sesquiterpene distributed nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế để cung cấp nguyên liệu similar to rhizome. There was a biotransformation of sesquiterpene in ổn định cho ngành công nghiệp sản xuất dược phẩm. cell culture. Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những 5. Essential oil could inhibit growth of B. cereus ATCC 11778 (31 năm 1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một mm), S. aureus ATCC 6538 (22.33 mm) and E. coli ATCC 25922 phương thức hiệu quả trong sản xuất các hoạt chất sinh học hoặc các (18.33 mm). Overall, the antibacterial ability of essential oil derived chất chuyển hóa của chúng. Đến nay, người ta đã thành công trong sản from culture cell was high. xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này RECOMMENDATION như anthraquinone, vincristine, berberin, diosgenin, taxol, 1. More studies to enhance the accumulation ability of ginsenoside…. Nghệ đen là loài thảo dược quý, không độc, có chứa bioactive compounds in Zedoary cells. các chất như curcumin, terpenoid và tinh dầu. Curcumin của nghệ đen 2. More studies in composition as well as bioactivities of có khả năng ức chế khối u; chống lại một số dạng ung thư ở chuột như curcumin, sesquiterpenes, polysaccharides produced from ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng; Zedoary cells. curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp;
2 47 curcuminoid và sesquiterpen là những chất có khả năng ức chế sự hình (22.33 mm) and finally E. coli (18.33 mm). Meanwhile, essential oil thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng derived from rhizome can inhibit the growth of B. Cereus; E. coli; S. chống viêm nhiễm; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả aureus (16 mm; 17.67 mm and 14 mm) respectively. năng bảo vệ tế bào. Tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và Table 3.18. The antibacterial ability of essential oil in Zedoary cells kháng đột biến rất cao. Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức D-d (mm) chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180), ngăn ngừa Bacteria Essential oil of Rhizome essential Control đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào. Trong tự cells oil B. cereus ATCC 11778 0 22.33b 16.00a nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian 0 18.33b 17.67a dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc E. coli ATCC 25922 biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân S. aureus ATCC 6538 0 31.00a 14.00a công và vật tư sản xuất. Mặt khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá. Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Figure 3.14. Antibacterial ability of essential oil. A: E. coli ATCC 25922. B: Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: control. TN: essential thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định oil of rhizome. TB: essential oil of cells khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong tế bào cây nghệ đen nuôi cấy huyền phù. CONCLUSION AND RECOMMENDATION 3. Nội dung nghiên cứu CONCLUSION - Tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro; 1. The basic MS medium supplemented with 3% sucrose, 0.8% - Nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen; agar; 0.5 mg/L BA and 0.5 mg/L 2,4-D was suitable to callus - Khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tinh sinh học của tế bào; induction from leaf-base of in vitro Zedoary. The yellow compact and - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu của tế bào. friable callus were most suitable for cell suspension culture. 4. Những đóng góp mới của luận án 2. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented - Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; shaking speed of 120 rpm/min
46 3 nghệ đen in vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác và trong hệ lên men 10 lít. - Đã khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcummin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy. Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen. - Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về nuôi cấy tế bào cây nghệ đen và khả năng tích lũy một số hoạt chất sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án sẽ là cơ sở khoa học để phát triển nuôi cấy tế Figure 3.13. Distribution of sesquiterpene. A: Accumulation of sesquiterpene in rhizome; bào cây nghệ đen nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn B: kinetics of sesquiterpene accumulation in suspension cells from day 2 to 18 nguyên liệu ổn định để chiết tách thu hồi các hợp chất thứ cấp dùng 3.5. Antibacterial activity of essential oil in Zedoary cells làm dược liệu, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Results performed in table 3.18 indicated that, essential oil 6. Cấu trúc của luận án extracted from both cells and rhizome can depress growth E. coli, S. Luận án gồm 105 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành aureus and B. cereus. Overall, essential oil collected from suspension các phần: Phần Mở đầu có 4 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 32 cells could be antibacterial (Figure 3.14). The essential oil from trang; Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu, 7 culture cells depressed most to S. aureus (31 mm), then to B. cereus
4 45 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận, 36 trang; Phần Kết For examples, peak 1 (retention time 4.7 min) had absorption of 6.05 luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án: mAU in rhizome but got just 2.55 mAU in suspension cells, 1 trang, Tài liệu tham khảo: 23 trang với 193 tài liệu tham khảo bằng meanwhile, peak 4 (retention time 7.5 min) in suspension cells had tiếng Việt và tiếng Anh; Luân án có 18 bảng số liệu và 16 hình. absorption of 7.33 mAU and 2.23 mAU in rhizome. Some peaks appeared in rhizome (5-8) were absent or trace (< 1 mAU) in Chương 1 suspension cells. However, in suspension cells, some new peaks TỔNG QUAN TÀI LIỆU appeared (not numbered) that had retention time about 6.8; 7.8; 8.2 Luận án đã tham khảo 17 tài liệu tiếng Việt và 189 tài liệu tiếng and 9.2 min and the absorption of 1.38-4.10; 5.62-7.54; 1.70-8.41 and Anh với các nội dung liên quan gồm: (1) Nuôi cấy tế bào thực vật; (2) 1.06-8.38 mAU respectively. These resultd indicated that many Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật nuôi cấy in biotransformation of sesquiterpene were occuring in process of cell vitro; (3) Giới thiệu về cây nghệ đen. culture, producing different sesquiterpene types compared with the Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực rhizome control. vật hoàn chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh Table 3.17. Comparision of eluted peak heights (mAU) for rhizome control and lý thực vật người Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra suspension cells of Zedoary at different culture times Culture Compound number/retention time (min) phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Những thử nghiệm đầu tiên time trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược phẩm đã được tiến hành (day) 1/4.7 2/5.1 3/6.0 4/7.5 5/12.7 6/13.8 7/19.2 8/20.5 9/26.7 2 2.11 - 2.49 5.99 - trace trace trace - trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer. Đến nay, một thế kỷ 4 1.93 - 2.23 5.76 - trace trace trace - sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ cấp đã được 6 1.15 trace 2.81 3.17 - trace - - - sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật. 8 1.06 - 1.54 3.57 - - - - - Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các 10 1.22 - 1.02 4.05 - trace trace - - 12 1.04 trace 2.14 3.29 - trace - trace - tế bào không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được 14 2.55 1.59 - 7.33 - trace - trace - bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh 16 1.58 - 3.82 4.04 - trace - - - dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar. Nuôi cấy huyền phù tế bào 18 2.36 1.15 1.15 5.11 - trace - trace - thường được khởi đầu bằng cách chuyển các khối callus vào nuôi cấy Rhizome 6.05 2.59 2.15 2.23 6.23 1.46 3.59 1.29 1.19 trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa. Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật cần thiết phải
44 5 quan tâm đến các yếu tố sau: Môi trường nuôi cấy như các chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbon và các điều kiện nuôi cấy như: cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu, sự khuấy trộn, sục khí…Trình tự của một quá trình nâng cấp điển hình bắt đầu từ nuôi cấy tế bào trong các chai, lọ đến bình tam giác nuôi cấy lắc có dung tích 1 L, sau đó đến hệ lên men bằng thuỷ tinh từ 1-10 L, và sau đó nâng cấp đến hệ lên men bằng thép không rỉ từ 30-150 L rồi đến 1000 L. Hệ lên men là một hệ thống nuôi cấy tự động mà chức năng chính của nó là cải thiện kiểm soát môi trường để đạt được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của tế bào và/hoặc hình thành sản phẩm. Trong vài thập kỷ qua, những bằng chứng từ thực nghiệm và trong thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản sau: Bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; kháng nấm và vi khuẩn; kháng virus... Các hợp chất hóa học này còn được dùng nhiều trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi, thuốc trừ sâu. Các hợp chất thứ cấp của thực vật có thể phân thành ba nhóm chính đó là terpene, phenol và các hợp chất chứa nitrogen. Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy đã được tiến hành bởi các nhà khoa học thực vật và vi sinh vật ở nhiều quốc gia. Hầu hết các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong công nghệ sinh học đều nhằm vào mục đích sản xuất các hợp chất thứ cấp. Những thành tựu đạt được trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất dùng để chữa bệnh đã tạo ra khả năng có thể sản Figure 3.12. HPLC results of curcumin in Zedoary suspension cells from days 2 to18 xuất trên qui mô lớn các chất thuộc nhóm alkaloid, terpenoid, steroid, 3.4.4. Sesquiterpenes saponin, phenol, flavonoid và các amino acid. Study showed that the appearance of separated peaks in rhizome Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật phát triển vào was more than that in suspension cells (Figure 3.13). Overall, peaks những năm 1970 và đến nay đã đạt được một số thành công. Một trong had retention time related to sesquiterpene compounds (numbered 1-9) những kết quả nuôi cấy tế bào thành công nhất đó là nuôi cấy tế bào in the rhizome and in suspension cells had different absorption cây sâm Ngọc Linh. Ngoài ra còn có một số nghiên cứu nuôi cấy tế spectrums (mAU), particularly peaks numbered 1 and 4 (Table 3.17). bào các loài cây thuốc khác như cây thông đỏ, cà gai leo, rau má, dừa
6 43 cạn… Nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu speak at 1.16% before gradually decreasing from day 16 to day 18 bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene; alongs to cell growth (Figure 3.9). Overall, concentration of curcumin curcuminoid. Ngoài ra, nghệ đen còn chứa các chất như tinh bột, chất in culture cell with diferent culture time was higher than that in dẻo và một số chất có vị đắng khác. Cây nghệ đen đã được con người rhizome (0.43%). dùng trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nhiều nghiên Bảng 3.16. Concentration of curcumin in Zedoary cells cultured in 10L bioreactor cứu cho thấy, các hợp chất như tinh dầu, curcumin, sesquiterpene.. của Culture time Retention time Peak square Curcumin (day) (min) (mAU) concentration (%) nghệ đen có các hoạt tính sinh học quý như: kháng ung thư, bảo vệ 2 2.09 1909 0.44g gan, kháng loét, kháng viêm, kháng khuẩn và kháng nấm. 4 1.98 2226 0.52e Có một số công trình nghiên cứu về nhân giống in vitro ở cây 6 2.05 2285 0.53e 8 2.00 2442 0.56e nghệ đen chẳng hạn như tái sinh chồi từ callus nghệ đen; nhân giống in 10 1.97 4244 0.98b vitro cây nghệ đen từ chồi. Ngoài các nghiên cứu nhân giống in vitro 12 1.99 4448 1.03b 14 2.07 5034 1.16a cây nghệ đen, một số kết quả bước đầu trong nuôi cấy callus và huyền 16 1.99 3631 0.84c phù tế bào cây nghệ đen cũng đã được công bố. Cho đến nay, công 18 2.07 2573 0.60d trình nghiên cứu nuôi cấy tế bào với khả năng tích lũy sinh khối cao Rhizome 2.06 1868 0.43g cũng như khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính học của tế bào nghê đen nuôi cấy in vitro trong hệ lên men là rất hạn chế. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tương nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cây nghệ đen. Nguyên liệu nghiên cứu là các tế bào callus được tạo từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nuôi cấy callus Figure 3.10. HPLC result of standard curcumin Figure 3.11. HPLC result of rhizome Bẹ lá của cây nghệ đen in vitro được nuôi trên môi trường MS có 2% sucrose và 0,8% agar, bổ sung 0,5-4,0 mg/L 2,4-D và 0,5-4,0 mg/L BA để tạo callus. 2.2.2. Nuôi cấy tế bào huyền phù 2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào trong bình tam giác Khoảng 2 g callus 2 tuần tuổi được chuyển vào bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường MS lỏng có 2% sucrose, bổ sung 0,5 mg/L
42 7 3.4.2. Total water soluble polysaccharide 2,4-D và 0,5 mg/L BA, nuôi ở tốc độ lắc 100 vòng/phút để thiết lập nuôi Table 3.15 showed the concentration of total water soluble cấy huyền phù tế bào. Môi trường MS lỏng bổ sung nguồn carbon khác polysaccharide (% dry quantity) from Zedoary cells at variety time. Overall, nhau (sucrose, glucose và fructose) và các chất ĐHST BA và 2,4-D ở concentration of polysaccharide increased from 2 to 10 and reached a peak at dạng riêng rẽ hoặc tổ hợp, nuôi ở tốc độ lắc 120 vòng/phút để đánh giá 6.55%, 1.4 time lower than that in Zedoary (9.46%) (p
8 41 glucose (4-20 mg/ml) theo Chaplin và cs 1994 và tính toán theo hệ số Table 3.13. Effects of aeration rate on cell growth chuyển đổi sang polysaccharide là 3,168 theo Li và cs 2007. Aeration rate Fresh weight (g) Dry weight (g) (L/min) 2.2.7. Xác định sesquiterpene 1.5 489.67c 36.9b Tách chiết sesquiterpene theo phương pháp của Jang và cs 2004. 2.0 561.00b 50.84a Phân tích HPLC để xác định sesquiterpene được thực hiện trên máy 2.5 603.00a 53.25a Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình 3.0 583.33b 50.33a ChromQuest (ver. 4.2.34). 3.5 441.00d 33.17b 2.2.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được xác định theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch của Lehrer và cs (1991) . 2.2.9. Xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được tính trung bình mẫu ± sai số chuẩn và phân tích Ducan’s test (p
40 9 Table 3.11. Effects of inoculum size on cell growth Bảng 3.1. Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro Inoculum size (g) Fresh weight (g) Dry weight (g) 2,4-D BA % mẫu vật Sinh trưởng c d Hình thái callus 100 241.67 22.28 (mg/L) (mg/L) tạo callus của callus 150 358.33bc 32.68c 0,0 0,0 - - - a a c 200 514.67 47.97 0,5 0,5 15,74 ++ Trắng, mọng nước b b a 250 441.00 38.89 1,0 1,0 46,01 ++++ Trắng, xốp b 3.3.2.2. Agitation speed 2,0 2,0 40,10 ++++ Trắng, xốp d This research showed that, the increase of agitation speed 100-150 3,0 3,0 10,20 +++ Trắng, mọng nước cd rpm/min resulted in the increase of cell biomass as well as can got 4,0 4,0 8,20 + Trắng, mọng nước peak 561 g fresh weight (50,84 g dry weight). However, at the higher ++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: agitation speed (>150 rpm/min) cell growth decreased with 437 g fresh sinh trưởng kém; - : không xuất hiện callus. weight (37,42 g dry weight) at 200 rpm/min (table 3.12). Table 3.12. Effects of agitation speed on cell growth Agitation speed Fresh weight (g) Dry weight (g) (rpm/min) 100 435.67c 38.19c A B 120 514.67bc 47.97b Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. (A) callus trắng và xốp, 150 561.00a 50.84a (B) callus trắng và mọng nước b a 180 547.33 50.03 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất KTST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus c c 200 437.00 37.42 2,4-D Sinh trưởng BA (mg/L) Hình thái callus 3.3.2.3. Effects of aeration rate (mg/L) của callus Increasing aeration rate from 1.5 to 2.5 L/min resulted in a 0,25 0,25 + Trắng và mọng nước increase of cell growth and reached a peak at 603 g fresh weight 0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc (53.25 g dry weight). However, increasing aeration rate from 3 to 3.5 1,00 1,00 ++ Trắng và xốp L/min, cell growth were decreased. With aeration rate of 3.5 L/min, 2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước fresh weight of cell was 441 g fresh weight (33,17 g dry weight) 4,00 4,00 - Hóa nâu và chết (Figure 3.9 và Table 3.13). ++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng kém; - : không sinh trưởng.
10 39 3.3. Cell suspension culture of Zedoary in bioreactor 3.3.1. Assessment of cell growth Study showed that cell mass got maximum on the 14th with 241.67 g fresh weight (22.28 g dry weight), then decreased. The fresh cell biomass was 132.67 g fresh weight (10.08 g dry weight) after 18 days of culture. Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn và rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy Callus sơ cấp có màu trắng, xốp và sinh trưởng mạnh được cấy chuyển lên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA từ 0,25-4 mg/L. Kết quả cho thấy, các callus sinh trưởng trên môi trường có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L BA dần dần hóa nâu và chết sau khi cấy chuyển. Các callus trên môi trường có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BA phát triển thành dạng callus thứ cấp tốt nhất trên môi trường có chứa 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA (Bảng 3.2). Các môi trường còn lại không có tác dụng Figure 3.7. Growth of Zedoary cells in 10 litter bioreactor kích thích sinh trưởng callus (callus sinh trưởng kém hoặc hóa nâu và chết) sau 4 tuần cấy chuyển. Các calus thứ cấp có màu vàng sáng, rắn và dễ vỡ vụn (Hình 3.2) thu được trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA tạo nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào huyền phù. 3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác Figure 3.8. Fresh weight biomass (A) and dry weight biomass (B) 3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu Với cỡ mẫu 2 g, sinh khối đạt cao nhất sau 16 ngày là 4,12 g tươi Based on observating the growth curve of Zedoary cell, we study effects (0,37 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,06. Với 3 g tế bào nuôi cấy thì of some culture conditions on cell biomass accumulation after 14 days. sinh trưởng của tế bào đạt cực đại chỉ sau 14 ngày là 5,61 g tươi (0,41 3.3.2. Effects of culture conditions g khô) và chỉ số sinh trưởng là 1,87. Khi tăng cỡ mẫu lên 4-5 g, sinh 3.3.2.1. Inoculum size khối đạt cực đại sau 12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và Results showed that the inoculum size effected on cell growth. 7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng chỉ số sinh trưởng thấp chỉ đạt 1,54 và Biomass increased when supplementing 100-200 g of cell and got pick 1,44. Mặc dù cỡ mẫu 2 g sau 14 ngày cũng có chỉ số sinh trưởng có at 514.64 g fresh weight (47,97 g dry weight). However, when cao (2,0), nhưng chất lượng tế bào kém hơn (tế bào có màu vàng nhạt, increasing the inoculum size up to 250 g, cell growth was depressed dịch huyền phù ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g (tế bào có màu (441 g fresh weight and 38.89 g dry weight) (Table 3.11).
38 11 from 20-60 g/L, the cell biomass also increases and reaches a vàng đậm và tươi, dịch huyền phù đồng nhất). Vì thế, theo nhận định maximum of 8.40 g fresh weight (0.62 g dry weight). However, when của chúng tôi cỡ mẫu 3 g là thích hợp hơn cả. the fructose up to 70 g/L, the cell growth slowed (7.65 g fresh weight Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên tích lũy sinh khối của tế bào nghệ đen 2 g 3g 4g 5g and 0.57 g dry weight). TN FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI 2 2,22c 0,18d 1,11 3,14d 0,28c 1,05 4,07c 0,32b 1,02 5,20d 0,39c 1,04 Table 3.10. Effects of fructose on cell growth 4 2,52c 0,24c 1,26 3,52c 0,32c 1,17 4,34c 0,35b 1,09 5,32d 0,42c 1,06 Fructose (g/L) FW DW GI 6 3,00b 0,24c 1,50 4,00c 0,35b 1,33 4,94c 0,37b 1,24 5,61c 0,44c 1,12 20 6.72b 0.35c 2.24 8 3,30b 0,30b 1,65 4,53b 0,38b 1,51 5,65b 0,40b 1,41 6,09c 0,47b 1,22 10 3,50b 0,33b 1,75 4,92b 0,40a 1,64 6,04a 0,42b 1,51 7,02b 0,48b 1,40 30 7.34b 0.55b 2.45 12 3,70a 0,35b 1,85 5,15b 0,40a 1,72 6,15a 0,44a 1,54 7,22a 0,51a 1,44 40 7.70ab 0.57b 2.57 14 4,00a 0,35b 2,00 5,61a 0,41a 1,87 6,12a 0,46a 1,53 5,68c 0,41c 1,14 50 7.72ab 0.59b 2.57 16 4,12a 0,37a 2,06 5,21b 0,37b 1,74 5,20b 0,35b 1,30 5,00d 0,32cd 1,00 18 4,01a 0.23c 2,01 4,67b 0,29c 1,56 4,56c 0,27c 1,14 4,12e 0,22d 0,82 60 8.40a 0.62a 2.80 70 7.65b 0.57b 2.55 TN: thời gian nuôi cấy (ngày); FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: Cell culture of Zedoary on MS medium supplemented with 3% chỉ số sinh trưởng sucrose, 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D, shaking speed 120 3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc rpm/min. The maximum biomass was gotten after 14 days with 10.44 Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. Nhìn chung, tốc độ g fresh weight (Figure 3.4 and 3.5). lắc cũng đã ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào. Ở tốc độ lắc 80-120 12 0.8 10 vòng/phút, sinh khối tế bào đã tăng dần lên và đạt cực đại là 5,91 g tươi 0.6 (0,44 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,97 và dịch huyền phù tế bào có màu Fresh cell weight (g) 8 Dry cell weight (g) 6 0.4 4 vàng sáng, đồng nhất. Khi tăng tốc độ lắc lên cao hơn 150-180 vòng/phút, 0.2 2 Fresh cell weight Dry cell weight tế bào sinh trưởng chậm lại, đặc biệt bị ức chế mạnh ở 180 vòng/phút, sinh khối cao nhất chỉ là 4,75 g tươi (0,35 g khô), dịch huyền phù tế bào 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Culture time (days) chuyển sang màu nâu nâu sau 14 ngày nuôi cấy. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh sinh trưởng tế bào Tốc độ lắc (vòng/phút) FW DW GI Figure 3.4. Growth of Zedoary cells in flask of 250 ml 80 5,00ab 0,34c 1,67 100 5,61b 0,41b 1,87 a 120 5,91 0,44a 1,97 150 5,60b 0,42b 1,87 180 4,75ab 0,35c 1,58 3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST 3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ BA 0,25 và 0,5 mg/L có hiệu quả tương đương (p
12 37 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh sinh trưởng tế bào culture were showed in figure 3.8. BA (mg/L) FW DW GI Table 3.8. Effects of sucrose on cell growth 0,25 6,17a 0,45a 2,06 0,5 6,25a 0,46a 2,08 Sucrose (g/L) FW DW GI 1,0 5,76 b 0,42ab 1,92 20 7.22c 0.55b 2.41 1,5 5,92b 0,37b 1,97 30 10.44a 0.66a 3.48 2,0 5,41 bc 0,35b 1,80 40 8.85b 0.64a 2.95 bc 2,5 4,55 0,32b 1,52 50 8.80b 0.65a 2.93 3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D 60 8.75b 0.70a 2.92 Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ 70 6.75c 0.60b 2.25 sung 2,4-D từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở Results showed that, cell growth were slowly at low concentration bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ 2,4-D 1,5 mg/L có of 20 g/L sucrose (7,22 g of fresh weight and 0.55 g dry weight). The ảnh hưởng lớn nhất, khối lượng tươi của tế bào đạt 6,75 g (0,52 g khô) medium contained 30 g/L sucrose, cell growth increase dramatically và chỉ số sinh trưởng là 2,25, cao hơn các môi trường còn lại. (10.44 g fresh weight and 0.66 g dry weight) with growth index of Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh sinh trưởng tế bào 3.48, the suspension solution was bright yellow and rather 2,4 D (mg/L) FW DW GI homogenous. At the sucrose concentration of 40-70 g/L, cell growth 0,25 5,10c 0,42b 1,70 0,5 5,77b 0,43b 1,92 decreased, especially at 70 g/L (6.75 g fresh weight and 0.6 g dry b 1,0 6,02 0,45b 2,01 weight). 1,5 6,75a 0,52a 2,25 2,0 6,04 b 0,46b 2,01 3.2.4.2. Effects of glucose c 2,5 5,35 0,36c 1,78 Results indicated that cell biomass was rather low when culturing 3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA cells on medium contain 20-30 g/L glucose. At the glucose of 40-60 Tế bào nghệ đen được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA và g/L cell biomass got maximum (7.32 g fresh weight and 0.59 g dry 2,4-D nồng độ từ 0,25-2,5 mg/L. Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy được weight), with growth index of 2.44. At the glucose of 70 g/L, the cell trình bày ở bảng 3.7. growth was depressed. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh sinh trưởng tế bào 2,4 D (mg/L) BA (mg/L) FW DW GI Table 3.9. Effects of glucose on cell growth 0,5 0,25 5,82b 0,43b 1,94 Glucose (g/L) FW DW GI 0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97 20 3.15cd 0.22c 1.05 0,5 1,0 5,32c 0,40c 1,77 30 6.05c 0.42bc 2.02 0,5 1,5 5,00c 0,39c 1,67 40 7.12a 0.53b 2.37 0,5 2,0 4,45cd 0,38c 1,48 50 7.20a 0.55b 2.40 0,5 2,5 4,00d 0,35c 1,33 60 7.32a 0.59a 2.44 0,25 0,5 5,12c 0,39c 1,71 70 6.65b 0.53b 2.22 0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97 1,0 0,5 6,20b 0,46b 2,07 3.2.4.3. Effects of fructose 1,5 0,5 7,22a 0,55a 2,41 2,0 0,5 6,03b 0,43b 2,01 The study results showed that fructose has significant influence 2,5 0,5 6,01b 0,42b 2,00 than glucose. When fructose concentrations in the medium increasing
36 13 mg/L was most effect, fresh weight of cell got 6.75 g (0.52 g dry Nhìn chung, môi trường có bổ sung đồng thời 2,4-D và BA cho kết weight) and growth index was 2.25, higher than other medium. quả tốt hơn các môi trường bổ sung riêng rẽ hai chất này. Khối lượng tế Table 3.6. Effects of 2,4-D on cell growth bào và chỉ số sinh trưởng đạt cao nhất trong môi trường có 2,4-D 1,5 2.4 D (mg/L) FW DW GI mg/L và BA 0,5 mg/L, tương ứng là 7,22 g tươi (0,55 g khô) và 2,41. 0.25 5.10c 0.42b 1.70 0.5 5.77b 0.43b 1.92 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon 1.0 6.02b 0.45b 2.01 3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose 1.5 6.75a 0.52a 2.25 2.0 6.04b 0.46b 2.01 Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau 2.5 5.35c 0.36c 1.78 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.8. 3.2.3.3. Effects of 2,4-D and BA Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng tế bào The cells of Zedoary were cultured on the medium supplemented Sucrose (g/L) FW DW GI with BA and 2,4-D (0.25-2.5 mg/L). Results after 14 days of culture 20 7,22c 0,55b 2,41 30 10,44a 0,66a 3,48 were showed in table 3.7. b 40 8,85 0,64a 2,95 Table 3.7. Effects of 2,4-D and BA on cell growth 50 8,80 b 0,65a 2,93 b 2.4 D BA FW DW 60 8,75 0,70a 2,92 c (mg/L) (mg/L) b GI 70 6,75 0,60b 2,25 0.5 0.25 5.82 0.43b 1.94 0.5 0.5 5.91b 0.44b 1.97 Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nồng độ sucrose thấp (20 g/L) tế 0.5 1.0 5.32c 0.40c 1.77 bào sinh trưởng chậm, chỉ đạt 7,22 g khối lượng tươi (0,55 g khô). 0.5 1.5 5.00c 0.39c 1.67 0.5 2.0 4.45cd 0.38c 1.48 Sinh trưởng của tế bào đã tăng mạnh đạt 10,44 g khối lượng tươi (0,66 0.5 2.5 4.00d 0.35c 1.33 g khô) với chỉ số sinh trưởng là 3,48 trong môi trường có 30 g/L 0.25 0.5 5.12c 0.39c 1.71 0.5 0.5 5.91b 0.44b 1.97 sucrose, dịch huyền phù có màu vàng tươi và khá đồng nhất. Ở nồng 1.0 0.5 6.20b 0.46b 2.07 độ sucrose từ 40-70 g/L, sinh trưởng của tế bào giảm, đặc biệt là ở 70 1.5 0.5 7.22a 0.55a 2.41 2.0 0.5 6.03b 0.43b 2.01 g/L (chỉ đạt 6,75 g tươi/0,60 g khô). 2.5 0.5 6.01b 0.42b 2.00 3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose Overall, the medium that supplemented both 2,4-D and BA showed Kết quả cho thấy, tế bào có sinh khối tương đối thấp khi được better result, compared to the medium supplemented only one of them. nuôi trong môi trường có 20-30 g/L glucose. Ở nồng độ glucose từ 40- The cell weight and growth index got maximum on the environment 60 g/L sinh khối tăng lên và đạt cực đại là 7,32 g tươi (0,59 g khô), chỉ containing 2,4-D 1.5 mg/L and BA 0.5 mg/L, with 7.22 g fresh weight số sinh trưởng là 2,44. Glucose ở nồng dộ 70 g/L đã ức chế sinh (0.55 g dry weight) and 2.41 respectively. trưởng của tế bào. 3.2.4. Effects of carbon sources 3.2.4.1. Effects of sucrose Effects of sucrose on the growth of Zedoary cells after 14 days of
14 35 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng tế bào 3.2.2. Effects of shaking speed Glucose (g/L) FW DW GI The results were showed in table 3.4. Overall, the shaking speed 20 3,15cd 0,22c 1,05 30 6,05c 0,42bc 2,02 also affected on biomass. At the speed of 80-120 rpm/min, biomass 40 7,12a 0,53b 2,37 increases and got the maximum of 5.91 g fresh weight (0.44 g dry 50 7,20a 0,55b 2,40 weight), growth index was 1.97 and the solution of cell suspension 60 7,32a 0,59a 2,44 70 6,65b 0,53b 2,22 was bright yellow, homogenous. When the speed increased to 150-180 3.2.4.3. Ảnh hưởng của fructose rpm/min, cell growth was slower, depressed especially at 180 Kết quả nghiên cứu cho thấy, fructose có ảnh hưởng đáng kể hơn rpm/min, the best biomass was 4.75 g fresh weight (0.35 g dry weight), glucose. Khi tăng nồng độ fructose trong môi trường từ 20-60 g/L, solution of cell suspension become brown after 14 days of culture. sinh khối tế bào tăng theo và đạt cực đại là 8,40 g tươi (0,62 g khô). Table 3.4. Effects of shaking speed on cell growth Shaking speed GI Tuy nhiên, khi bổ sung fructose lên đến 70 g/L thì sinh trưởng của tế FW DW (rpm/min) bào chậm lại và chỉ còn 7,65 g tươi (0,57 g khô). 80 5.00ab 0.34c 1.67 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng tế bào 100 5.61b 0.41b 1.87 Fructose (g/L) FW DW GI 120 5.91a 0.44a 1.97 20 6,72b 0,35c 2,24 b 1.87 150 5.60 0.42b 30 7.34b 0,55b 2,45 40 7,70ab 0,57b 2,57 180 4.75 ab 0.35 c 1.58 ab 50 7,72 0,59b 2,57 60 8,40a 0,62a 2,80 3.2.3. Effects of hormones 70 7,65 b 0,57b 2,55 3.2.3.1. Effects of BA Chúng tôi cũng đã thành công khi nuôi cấy tế bào nghệ đen trong The results indicated that, concentration BA 0.25 and 0.5 mg/L môi trường MS có 3% sucrose, 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, tốc showed similar effects (p
34 15 calluses that were light yellow, compact and friable (Figure 3.2) were collected from MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA and then become materials of suspension cell culture. 3.2. Suspension cell culture in flasks 3.2.1. Effects of inoculum size With inoculum size of 2 g, cell biomass was maximum after 16 Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác đặt trên máy lắc days with 4.12 g fresh weight (0.37 g dry weight) and the growth 3.3. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men index was 2.06. With inoculum size of 3 g, cell biomass was 3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào maximum after 14 days with 5.61 g fresh weight (0.41 g dry weight) Kết quả nghiên cứu cho thấy, sinh khối tế bào đạt cực đại ở ngày and the growth index was 1.87. When increasing the inoculum size up thứ 14 với 241,67 g tươi (22,28 g khô), sau đó bắt đầu giảm dần. Sinh to 4-5 g, cell biomass get maximum after 12 days, with 6.12 g fresh khối tươi tế bào chỉ còn lại 132,67 g (10,08 g khô) sau 18 ngày nuôi. 300 25 (0.46 g dry weight) and 7.22 g fresh weight (0.51 g dry weight) 250 respectively but the growth index were low, at 1.54 and 1.44. 20 Khối lượng tươi tế bào (g) Khối lượng khô tế bào (g) 200 Although inoculum size of 2 g after 14 days got a rather high growth 15 150 index (2.0), the cell quality was worse (cells were light yellow, 10 100 suspension was less homogenous), compared to inoculum size of 3 g 50 5 Khối lượng tươi tế bào (cells were bold and bright yellow, homogenous suspension). Thus, 0 Khối lượng khô tế bào 0 the inoculum size of 3g was the best. 0 2 4 6 8 10 12 Thời gian nuôi cấy (ngày) 14 16 18 Table 3.3. Effect of inoculum size on biomass accumulation of Zedoary cells Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 lít 2 g 3g 4g 5g TN FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI 2 2.22c 0.18d 1.11 3.14d 0.28c 1.05 4.07c 0.32b 1.02 5.20d 0.39c 1.04 4 2.52c 0.24c 1.26 3.52c 0.32c 1.17 4.34c 0.35b 1.09 5.32d 0.42c 1.06 b c c b c b c c 6 3.00 0.24 1.50 4.00 0.35 1.33 4.94 0.37 1.24 5.61 0.44 1.12 b b b b b b c b 8 3.30 0.30 1.65 4.53 0.38 1.51 5.65 0.40 1.41 6.09 0.47 1.22 Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệ đen b b b a a b b b 10 3.50 0.33 1.75 4.92 0.40 1.64 6.04 0.42 1.51 7.02 0.48 1.40 Dựa trên kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ 12 3.70a 0.35b 1.85 5.15b 0.40a 1.72 6.15a 0.44a 1.54 7.22a 0.51a 1.44 đen, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi 14 4.00a 0.35b 2.00 5.61a 0.41a 1.87 6.12a 0.46a 1.53 5.68c 0.41c 1.14 a a b b b b d cd cấy đến sự tích lũy sinh khối tế bào sau 14 ngày. 16 4.12 0.37 2.06 5.21 0.37 1.74 5.20 0.35 1.30 5.00 0.32 1.00 3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 18 4.01a 0.23c 2.01 4.67b 0.29c 1.56 4.56c 0.27c 1.14 4.12e 0.22d 0.82 3.3.2.1. Cỡ mẫu TN: culture time (day); FW: fresh weight (g); DW: dry weight (g), GI: Growth index Kết quả của chúng tôi cho thấy, lượng mẫu đã ảnh hưởng thật sự
16 33 lên sự sinh trưởng của tế bào. Sinh khối tăng lên khi đưa vào môi trường từ 100-200 g tế bào và đạt cực đại là 514,64 g tươi (47,97 g khô). Tuy nhiên, khi tăng lượng mẫu lên 250 g thì sinh trưởng của tế bào bị ức chế do tăng mật độ, vì thế chỉ đạt 441 g tươi (38,89 g khô) (Bảng 3.11). Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào A B Cỡ mẫu (g) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 100 241,67c 22,28d Figure 3.1. Callus induction culture of Zedoary. (A) White and soft callus, (B) White 150 358,33bc 32,68c 200 514,67a 47,97a and viscous callus 250 441,00b 38,89b Table 3.2. Effect of hormone on growth and morphogenesis of callus 3.3.2.2. Tốc độ khuấy 2,4-D BA Callus growth Callus morphogenesis Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khi tăng tốc độ khuấy từ 100- (mg/L) (mg/L) 0.25 0.25 + White and viscous 150 vòng/phút thì sinh khối tế bào cũng tăng theo và cực đại đạt là 561 0.50 0.50 ++++ Light yellow, compact and friable g tươi (50,84 g khô). Tuy nhiên, khi khuấy trộn trên 150 vòng/phút thì 1.00 1.00 +++ White and soft 2.00 2.00 ++ White and viscous sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm và chỉ đạt được 437 g tươi (37,42 g 4.00 4.00 - Brown and dead khô) ở 200 vòng/phút (Bảng 3.12). ++++: high growth of callus; +++: medium growth of callus; ++: low growth of callus; +: weak growth; - : no growth. Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào Tốc độ khuấy (vòng/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 100 435,67c 38,19c 120 514,67bc 47,97b 150 561,00a 50,84a 180 547,33b 50,03a 200 437,00c 37,42c 3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí Ở tốc độ 1,5-2,5 L/phút, sinh trưởng của tế bào tăng dần và đạt cực đại với 603 g tươi (53,25 g khô). Nếu tốc độ sục khí tiếp tục tăng Figure 3.2. The yellow, compact and friable callus after 14 days of culture lên từ 3-3,5 L/phút thì sinh trưởng của tế bào sẽ giảm. Ở tốc độ sục khí Primary callus that were white, soft and high growth were 3,5 L/phút, khối lượng tươi của tế bào chỉ đạt 441 g (33,17 g khô) subcultured to MS medium supplemented with 2,4-D and BA (0.25 – (Hình 3.9 và Bảng 3.13). 4.0 mg/L). The results showed that callus growed on the medium Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào contained 2.0 mg/L 2,4-D and 2.0 mg/L BA become brown and dead Tốc độ sục khí (l/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) after subculture. Callus growing on the medium supplemented with 1.0 c 1,5 489,67 36,9b mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L BA become the best secondary callus on the b 2,0 561,00 50,84a medium containing 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA (Table 3.2). The 2,5 603,00a 53,25a 3,0 583,33 b 50,33a other medium did not stimulate callus growth (callus was weak growth 3,5 441,00 d 33,17b or becoming brown and dead) after 4 weeks of subculture. Secondary
32 17 method of agar plate diffusion as Lehrer et al. (1991) . 700 60 2.2.9. Statistics 600 50 Every experiment was repeated 3 times. The collected data were Khối lượng tươi tế bào (g) Khối lượng khô tế bào (g) 500 40 calculated average ± standard error and analysed Ducan’s test (p
18 31 3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số stored liquid of MS environment including 3% sucrose, added 1.5 mg/L Bảng 3.15 trình bày hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước 2,4-D and 0.5 mg/L BA, sample amount of 100-250 g, agitation speed tổng số (% khối lượng khô) trong tế bào nghệ đen tại các thời điểm of 100-200 rpm/min, aeration rate of 1.5-3.5 L/min. The cell mass was nuôi cấy khác nhau. Nhìn chung, hàm lượng polysaccharide tăng từ 2- collected every two days during 18 days to study their growth ability. 10 và đạt cực đại là 6,55% thấp hơn khoảng 1,4 lần so với củ nghệ đen 2.2.3. Determination of the cell growth (9,46%) (p
30 19 anticancer, protecting brave, antiulcerated, anti-inflammatory, cực đại là 1,16%, sau đó giảm từ ngày 16-18 cùng với sinh trưởng của antibacterian and antifungus. tế bào (Hình 3.9). Nhìn chung, hàm lượng curcumin trong tế bào ở các There have been some studies in in vitro multiplication of the thời gian nuôi cấy khác nhau đều cao hơn trong củ nghệ đen tự nhiên curcuma such as regenerating buds from callus of Zedoary. Overmore, (0,43%), lúc cao nhất gấp khoảng 2,7 lần. some initial results in culturing callus and cell suspension of the Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên curcuma have been published already. Up to now, there have been no men 10 lít any studies of cell culture of the Zedoary in fermentation system as Thời gian nuôi Thời gian Diện tích peak Hàm lượng cấy (ngày) lưu (phút) (mAU)2 curcumin (%) well as no any assessment in their ability in accumulating bioactive 2 2,09 1909 0,44g compounds. 4 1,98 2226 0,52e 6 2,05 2285 0,53e 8 2,00 2442 0,56e Chapter 2 10 1,97 4244 0,98b RESEARCH OBJECTIVE AND METHODS 12 1,99 4448 1,03b 14 2,07 5034 1,16a 2.1. Research objective 16 1,99 3631 0,84c The objective was C. zedoaria Roscoe. The materials were callus 18 2,07 2573 0,60d from leaf-base of in vitro Zedoary. MTN 2,06 1868 0,43g 2.2. Methods 2.2.1. Callus culture Leaf-base of in vitro Curcuma zedoaria Roscoe were cultured on the MS medium supplemented with sucrose 2% and agar 0.8%; 0.5-4.0 mg/L 2,4-D; and 0.5-4.0 mg/L BA. 2.2.2. Cell suspension culture 2.2.2.1. Culturing cells in flask 2 g callus of two weeks age were transfered into flasks of 250ml Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin Hình 3.11. Phổ HPLC của dịch chiết củ containing 50 mL of MS liquid medium supplemented with 2% sucrose, chuẩn (0,5 mg/ml) nghệ đen tự nhiên 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA, cultured on the shaking machine with speed of 500 rpm/min. The liquid MS medium added variety of carbon resources and hormones like BA and 2,4-D cultured on the shaking machine with speed of 500 rpm/min to evaluate the ability of cells growth. 2.2.2.2. Cell suspension culture in bioreactor 100 g of cell mass was transfered to fermentation system of 10 L
20 29 bottles, jars to flasks of 1 litter in shaking culture, after that, glass fermentation system of 1-10 litter, and then unrested steel bioreactor of 30-150 L and final up to 1000 L. Bioreactor is a automatic culture system with main aim of improving the ability of controlling optimal condition for cell growth or for producing products. Some collected evidences from reality over recent decades indicated that secondary substance possed basic functions such as protecting from herbivores, antibacterial, antivirus. Such substances were also applied in pharmacy, agriculture chemicals, staining chemical, perfurme – created substances, insecticide. Secondary substances come from plant can be devided into 3 groups: terpene, phenol and nitrogen compounds. Studies in the ability of biosynthetic of cultured cells were conducted by botanist and microbiologist in many nations. Most of applications of plant cell culture in biotechnology are focused on producing secondary substance. Some archievements in the field of plant cell culture to produce substances applied in treatment indicated the future of producing with a large – scale substances of class of alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid and amino acids. Hình 3.12. Phổ HPLC của dịch chiết tế In Vietnam. The technology of plant cell has been culture bào nghệ đen sau 2-18 ngày nuôi cấy developed from 1970s and already got some suscesses up to now. One of most successful archivements is culturing ginseng Ngoc Linh. Besides, there were some other cell culture of others medicinal plants like Taxus Wallichiana zucc, Solanum hainanense, Centella asiatica, 3.4.4. Xác định sesquiterpene vinca rosea... Zedoary possess essential oil including sesquiterpene Kết quả cho thấy, sự hiện diện của các peak phân tách trong củ and monosesquiterpene; curcuminoid. Moreover, the plant also stores nghệ tự nhiên nhiều hơn trong tế bào huyền phù (Hình 3.13). Nhìn starch, plastic and some other bitterness compounds. Zedoary has been chung, các peak có thời gian lưu liên quan với các hợp chất utilized in some remedies of oriental medicine for treatment. Many sesquiterpene (được đánh số từ 1-9) trong củ nghệ và tế bào huyền phù studies indicated that compounds like essential oil, curcumin, có chiều cao phổ hấp thụ (mAU) khác nhau, đặc biệt là peak số 1 và 4 sesquiterpene… of Zedoary possess precious bioactivities such as