Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:156

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản, xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản, thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao bằng công nghệ TTON và NBVT. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Bùi Xuân Nguyên 2. TS. Nguyễn Việt Linh Hà Nội, 2021
i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Xuân Nguyên, Nguyên Trưởng Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học và TS. Nguyễn Việt Linh, Phó Trưởng Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, hỗ trợ kĩ thuật và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn ơn các thầy cô giáo, các cán bộ Học viện Khoa học và Công nghệ đã chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu và hoàn thành các thủ tục liên quan đến luận án. Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc TS. Nguyễn Thị Ước, Phòng công nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học đã chỉ bảo, hướng dẫn kĩ thuật và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu làm việc cho đến nay, sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Thị Ước đã góp một phần rất lớn không chỉ trong kết quả của luận án này mà còn trong suốt thời gian làm việc của tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ-Bác sỹ thú y Kazuhiro Kikuchi, trưởng nhóm nghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh học, tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến sỹ Tamas Somfai, nghiên cứu viên chính Phòng nghiên cứu sinh sản và chăn nuôi, Viện chăn nuôi và khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ Đỗ Thị Kim Lành, Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản đã hướng dẫn kĩ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm, tận tình giúp đỡ tôi để thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học cùng các cán bộ Phòng công nghệ Phôi, Viện công nghệ sinh học đã có những góp ý để tôi hoàn chỉnh luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh đã tận tình hướng dẫn
ii tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh tại học viện. Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ, chồng con đã luôn hỗ trợ và tạo điểu kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm làm việc và hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để hoàn thành tốt luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn./. Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả NCS. Nguyễn Thị Nhung
iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021 Tác giả NCS. Nguyễn Thị Nhung
iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ĐOAN............................................................................... iii MỤC LỤC ....................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ........................................................................ viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................ x MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU.............................................. 4 1.1. Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn....................................................... 4 1.1.1. Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn................... 4 1.1.2. Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo......................................... 9 1.1.3. Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn....................... 12 1.2. Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro................................... 15 1.2.1. Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục............................................. 15 1.2.2. Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi.................................... 19 1.2.3. Tạo phôi lợn bằng kĩ thuật NBVT.................................... 26 1.3. Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro............................................. 32 1.3.1. Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản........................... 32 1.3.2. Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt Nam.................................................................................................... 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP................................................. 35 2.1. Vật liệu, hoá chất nghiên cứu......................................................... 35 2.1.1. Mẫu nghiên cứu................................................................................. 35 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu.......................................................................... 36
v 2.1.3. Hóa chất và thiết bị............................................................................ 36 2.1.4. Thiết bị nghiên cứu............................................................................ 36 2.1.5. Môi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản........................................... 37 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................ 37 2.2.1. Phân loại tháng theo mùa................................................................... 37 2.2.2. Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng........................................... 37 2.2.3. Phương pháp đo kích thước và khối lượng buồng trứng.................. 37 2.2.4. Phương pháp phân chia nhóm nang................................................... 37 2.2.5. Phương pháp thu trứng...................................................................... 38 2.2.6. Phương pháp phân loại chất lượng trứng........................................... 38 2.2.7. Phương pháp đo kích thước trứng lợn............................................... 39 2.2.8. Phương pháp nuôi trứng.................................................................... 39 2.2.9. Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi ...................................... 40 2.2.10. Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh........................................... 40 2.2.11. Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh......... 42 2.2.12. Phương pháp TTON..................................................... 43 2.2.13. Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh.......................................... 44 2.2.14. Phương pháp đông lạnh phôi............................................................. 44 2.2.15. Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn................................... 45 2.2.16. Phương pháp nhân nuôi tế bào........................................................... 45 2.2.17. Phương pháp đông lạnh tế bào........................................................... 46 2.2.18. Phương pháp NBVT (NBVT) ........................................... 46 2.2.19. Phương pháp nuôi phôi...................................................................... 49 2.2.20. Phương pháp nhuộm Hoechst............................................................ 49 2.2.21. Phương pháp nhuộm Orcein.............................................................. 50 2.2.22. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu............................................. 50
vi CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................. 54 3.1. Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng 54 ở lợn Bản theo mùa......................................................................... 3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa........ 54 3.1.2. Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản........................................ 56 3.1.3. Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa và kích thước trứng 59 lợn Bản............................................................................................... 3.2. Kết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản ................... 65 3.2.1. Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản.. 65 3.2.2. Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết quả nuôi thành thục 68 trứng lợn Bản...................................................................................... 3.3. Kết quả tạo phôi lợn Bản bằng TTON................... 72 3.3.1. Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản................................................... 73 3.3.2. Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu..................................................... 78 3.3.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục lên sự thụ tinh và phát 84 triển phôi............................................................................................ 3.3.4. Đông lạnh phôi TTON....................................................................... 89 3.4. Kết quả nghiên cứu tạo phôi lợn Bản NBVT................................ 91 3.4.1. Kết quả nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace............ 91 3.4.2. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Landrace..................................... 94 3.4.3. Tạo nguồn tế bào cho nhân trong NBVT........................................... 96 3.4.4. Kết quả tạo phôi lợn Bản NBVT....................................................... 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................ 107 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN 109 ĐẾN ĐỀ TÀI................................................................................................... TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 110 PHỤ LỤC.......................................................................................................... 1
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa ..............................................54 Bảng 3.2. Số lượng nang trung bình theo kích thước ...............................................57 Bảng 3.3. Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản…………………...…60 Bảng 3.4. Kích thước trứng lợn Bản (µm) ................................................................62 Bảng 3.5. Sự thành thục của trứng lợn Bản ..............................................................66 Bảng 3.6. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản ....................................................67 Bảng 3.7. Chất lượng tinh sau khi thu ......................................................................73 Bảng 3.8. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh ....................................................74 Bảng 3.9. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh ..................77 Bảng 3.10. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng....................................................79 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản.. .80 Bảng 3.12. Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau .................................81 Bảng 3.13. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi .....85 Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh .....................................................................................86 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh .....................................................................................86 Bảng 3.16. Kết quả đông lạnh phôi TTON ...............................................................89 Bảng 3.17. Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace .............................................913 Bảng 3.18. Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi trường nuôi............................................................................................94 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT... 96 Bảng 3.20. Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi trường nuôi ............................................................................................97
viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật có vú............................................................................................... 5 Hình 1.2. Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân...................................................................................... 6 Hình 1.3. Quá trình thành thục của trứng lợn. .............................................. 7 Hình 1.4. Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng............ 10 Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển của phôi lợn........................................... 11 Hình 1.6. Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10......................... 12 Hình 1.7. Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thục của trứng động vật có vú............................................. 19 Hình 1.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic...................................... 24 Hình 1.9 Kĩ thuật NBVT.............................................................. 27 Hình 2.1 Buồng đếm tinh trùng.................................................................... 43 Hình 2.2 Bố trí dầu trong kim...................................................................... 47 Hình 2.3 Đĩa môi trương thao tác loại nhân tế bào trứng............................. 47 Hình 2.4 Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân.................... 47 Hình 2.5 Đĩa môi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng...................... 48 Hình 2.6 Xung điện trứng sau cấy nhân...................................................... 49 Hình 3.1 Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản: ........................ 55 Hình 3.2 Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa......................................................................................... 57 Hình 3.3 Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C.................................. 59 Hình 3.4 Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận noãn............................. 62 Hình 3.5 Mối tương quan giữa số lượng nang > 2 mm và số trứng 64
ix A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa........................................ Hình 3.6 Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống Nuôi IVM...................................................................................... 67 Hình 3.7 Trứng lợn Bản sau nuôi thành thục trong các môi trường............. 72 Hình 3.8 Đông lạnh tinh dịch lợn Bản. ........................................................ 77 Hình 3.9 Các giai đoạn phát triển của phôi sau thụ tinh. ............................. 91 Hình 3.10 Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn Landrace......................................................................................... 94 Hình 3.11 Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi trong TCM-199+10% pFF và trong POM ..................................... 95 Hình 3.12 Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển.................... 96 Hình 3.13 Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace............. 101 Hình 3.14 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT.......................... 102 Hình 3.15 Phôi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong cơ thể lợn cái.................................................................................. 104
x DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT BSA Bovine serum albumin Huyết thanh thai bò COCs Cumulus-Oocytes Complexes Tổ hợp trứng và tế bào cận noãn CO2 Cacbon dioxit CNSHSS Công nghệ sinh học sinh sản DMEM Dubelcco′s modified Eagle medium ADN Deoxyribonucleic acid dbc-AMP Dibutyryl-cAMP DPBS Dulbecco′s phosphate buffered saline EGF Epidermal growth factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì FF Follicular fluid Dịch nang trứng FBS Fetal bovine serum Huyết thanh thai bò FCs Follicular cells Tế bào nang FPN Female Pronuclear Tiền nhân cái FSH Follicle Stimulating Hormone Hocmon kích thích nang trứng GV Germinal vesicle Bóng mầm GVBD Germinal vesicle breakdown Phá vỡ bóng mầm hCG Chorionic gonadotropin human Hocmon nhau thai người ICSI Intracytoplasmic sperm injection Tiêm tinh vào trứng IVC In vitro Culture Nuôi cấy trong ống nghiệm IVM In vitro maturation Nuôi thành thục trong ống nghiệm IVP In vitro Production Sản xuất trong ống nghiệm
xi LH Luteinizing hormone Hocmon thể vàng hóa MPN Male Pronuclear Tiền nhân đực MI Metaphase I Kỳ giữa I MII Metaphase II Kỳ giữa II NCSU-37 North Carolina State University 37 NSCU-23 North Carolina State University Medium-23 NBVT Nhân bản vô tính N2 Liquid nitrogen Ni tơ lỏng O2 Oxygen Ôxy pFF Porcine follicular fluid Dịch nang trứng lợn Pig FM Pig Fertilization Medium Môi trường thụ tinh lợn PZM-3 Porcine zygote medium Môi trường hợp tử ở lợn POM Porcine oocyte maturation Môi trường nuôi thành thục trứng lợn PERVs Porcine Endogenous Retroviruses Virus nội sinh ở lợn TALP- Tyrode's albumin lactate pyruvate- PVA Polyvinylalcohol TCM Tissue Culture Medium Môi trường nuôi cấy mô TT Tinh trùng TCM-199 Tissue culture medium-199 Môi trường nuôi cấy-199 TTON Thụ tinh ống nghiệm TB Trung bình β-ME Mercaptoethanol µm Micromet
xii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa ..............................................54 Bảng 3.2. Số lượng nang trung bình theo kích thước ...............................................57 Bảng 3.3. Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản……………………59 Bảng 3.4. Kích thước trứng lợn Bản (µm) ................................................................62 Bảng 3.5. Sự thành thục của trứng lợn Bản ..............................................................66 Bảng 3.6. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản ....................................................67 Bảng 3.7. Chất lượng tinh sau khi thu ......................................................................73 Bảng 3.8. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh ....................................................74 Bảng 3.9. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh ..................76 Bảng 3.10. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng....................................................78 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản.. .79 Bảng 3.12. Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau .................................81 Bảng 3.13. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi .....84 Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh .....................................................................................83 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh .....................................................................................86 Bảng 3.16. Kết quả đông lạnh phôi TTON ...............................................................89 Bảng 3.17. Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace ...............................................91 Bảng 3.18. Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi trường nuôi............................................................................................94 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT... 96 Bảng 3.20. Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi trường nuôi ............................................................................................97
xiii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật có vú............................................................................................... 5 Hình 1.2. Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân...................................................................................... 6 Hình 1.3. Quá trình thành thục của trứng lợn. .............................................. 7 Hình 1.4. Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng............ 10 Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển của phôi lợn........................................... 11 Hình 1.6. Sự phát triển của phôi lợn từ ngày 1 đến ngày 10......................... 12 Hình 1.7. Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận noãn và sự thành thục của trứng động vật có vú............................................. 19 Hình 1.8 Thụ tinh bình thường so với polyspermic...................................... 24 Hình 1.9 Kĩ thuật NBVT.............................................................. 27 Hình 2.1 Buồng đếm tinh trùng.................................................................... 43 Hình 2.2 Bố trí dầu trong kim...................................................................... 47 Hình 2.3 Đĩa môi trương thao tác loại nhân tế bào trứng............................. 47 Hình 2.4 Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân.................... 47 Hình 2.5 Đĩa môi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng...................... 48 Hình 2.6 Xung điện trứng sau cấy nhân...................................................... 49 Hình 3.1 Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản: ........................ 54 Hình 3.2 Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa......................................................................................... 56 Hình 3.3 Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C.................................. 58 Hình 3.4 Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận noãn............................. 61 Hình 3.5 Mối tương quan giữa số lượng nang > 2 mm và số trứng 63
xiv A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa........................................ Hình 3.6 Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống Nuôi IVM...................................................................................... 66 Hình 3.7 Trứng lợn Bản sau nuôi thành thục trong các môi trường............. 71 Hình 3.8 Đông lạnh tinh dịch lợn Bản. ........................................................ 76 Hình 3.9 Các giai đoạn phát triển của phôi sau thụ tinh. ............................. 90 Hình 3.10 Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn Landrace......................................................................................... 93 Hình 3.11 Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi trong TCM-199+10% pFF và trong POM ..................................... 94 Hình 3.12 Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển.................... 95 Hình 3.13 Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace............. 100 Hình 3.14 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT.......................... 101 Hình 3.15 Phôi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong cơ thể lợn cái.................................................................................. 103
1 MỞ ĐẦU Phát triển công nghệ sinh học sinh sản với sự bùng nổ các thành tựu mới về cấy chuyển phôi, thụ tinh ống nghiệm (TTON), nhân bản vô tính (NBVT), bảo quản lạnh tế bào sinh sản và phôi, sự giao thoa giữa công nghệ sinh sản và các liệu pháp công nghệ di truyền trên tế bào sinh sản đã và đang mở ra những tiềm năng ứng dụng to lớn trong các lĩnh vực cải tiến năng suất vật nuôi, đảm bảo an ninh lương thực, bảo tồn và khai thác đa dạng sinh học (ĐDSH), cân bằng sinh thái và phát triển công nghệ y dược hiện đại. Lợn là một trong các đối tượng quan trọng nhất của công nghệ sinh học. Ngoài mục đích cung cấp thực phẩm cho con người, lợn còn là một trong những nhân tố trong hệ thống bảo tồn đa dạng sinh học và có triển vọng ứng dụng lớn trong y học. Lợn cũng là loài động vật có kích thước các cơ quan nội tạng tương đồng với các cơ quan của người, có hệ gen, quá trình sinh lý học, thể chất và hệ miễn dịch gần giống với người, vì vậy lợn được xem là đối tượng khả thi nhất được lựa chọn cho hướng nghiên cứu cấy ghép tạng khác loài (xenotransplantation). Năm 2009, các nhà khoa học đã tạo ra các tế bào gốc cảm ứng đa năng ở lợn (induced pluripotent stem cell-iPS) với hầu hết các đặc điểm giống với tế bào gốc phôi người và tế bào iPS của người. Năm 2018, các nhà nghiên cứu của đại học Missouri cũng cho biết đã tạo được các cá thể lợn có hệ miễn dịch suy yếu làm mô hình cấy ghép tế bào gốc không bị đào thải. Kết quả này giúp cho các nghiên cứu liệu pháp tế bào gốc tiến về phía trước nhanh hơn. Việt Nam là nơi có nhiều giống lợn bản địa như lợn Ỉ, Bản, Cỏ, Mẹo, Mường Khương … ít bị ảnh hưởng bởi quá trình lai tạo giống do được chăn thả tự nhiên ở các vùng núi cao. Do khả năng tồn tại các cá thể không mang bản sao PERVs (Porcine Endogenous Retroviruses-là virus nội sinh có sẵn trong bộ gen lợn từ thời cổ xưa. Các virus này được tìm thấy trong DNA của lợn, mặc dù ở trạng thái bất hoạt, chúng có thể hoạt động trở lại khi lây nhiễm sang loài khác) lợn Bản đang được đánh giá là đối tượng tiềm năng quan trọng đối với công nghệ cấy ghép mô tạng khác loài (xenotranspantation), là nguồn gen quý cần được bảo tồn và phát triển [1] [2]. Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu và ứng dụng tiến bộ công nghệ sinh học sinh sản vẫn chỉ được tiến hành chủ yếu trên các giống lợn ngoại, các nghiên cứu tương tự vẫn chỉ mới được bắt đầu trên các giống lợn bản địa. Các kết quả nghiên cứu tạo phôi các giống lợn mini bản địa tại Việt Nam đã được
2 một số tác giả công bố cho thấy một thực tế chưa được khắc phục đó là sự phát triển phôi in vitro ở lợn bản địa vẫn còn thấp hơn rất nhiều so với các kết quả thu được trên các giống lợn ngoại. Sự thành thục chưa hoàn toàn của trứng, môi trường nuôi trứng và phôi chưa tối ưu cùng những tác động khác trong quá trình thụ tinh và nhân bản được cho là nguyên nhân cơ bản làm chohiệu suất tạo phôi in vitro ở lợn nói chung, lợn bản địa nói riêng còn thấp. Vì vậy chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro”. Mục tiêu: Nghiên cứu được tiến hành trên mô hình lợn Bản là giống lợn bản địa được đánh giá có ưu việt về số lượng bản sao PERV thấp với các mục tiêu: 1. Xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản. 2. Xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản. 3. Thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao bằng công nghệ TTON và NBVT Dựa trên các nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản theo mùa. 2. Nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản bằng phương pháp chuẩn hóa môi trường nuôi. 3. Nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi lợn Bản TTON thông qua môi trường thụ tinh, điều kiện thụ tinh và nuôi phôi. 4. Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống tạo phôi lợn Bản NBVT. Tính mới của luận án 1. Luận án đã cung cấp các thông tin mới về ảnh hưởng của mùa vụ, môi trường nuôi thành thục trứng, môi trường và chế độ thụ tinh, nuôi phôi và bảo quản lạnh phôi TTON tạo phôi NBVT bằng cấy nhân khác giống làm cơ sở thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao, có thể phát triển nhằm mục đích bảo tồn đa dạng sinh học. 2. Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sử dụng hệ thống Piezo để tạo phôi
3 NBVT trên đối tượng lợn. Hiện nay các giống lợn địa phương đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng, số lượng lợn bản địa thuần đã bị giảm đi nghiêm trọng và có nguy cơ mất giống do sự lai tạp giao thoa với các giống lợn khác và nguy cơ gia tăng nhanh tỷ lệ đồng huyết do tự phối giống trong cùng bầy đàn. Hơn nữa phương thức chăn nuôi lạc hậu, không kiểm soát được những đe dọa về dịch bệnh, đã góp phần làm giảm số lượng cá thể các giống lợn này. Việc xây dựng thành công hệ thống nuôi trứng và tạo phôi trên giống lợn bản địa tại Việt Nam sẽ góp phần hỗ trợ nhiệm vụ bảo tồn đa dạng sinh học, nâng cao hiệu quả chăn nuôi và khai thác giá trị nguồn gen các giống lợn này phục vụ các nghiên cứu y- sinh học.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn 1.1.1. Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bào trứng (giao tử cái-noãn bào). Không giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu. Buồng trứng ở các loài gia súc là một tổ chức kép, mỗi cá thể cái có hai buồng trứng gắn với hai đầu sừng tử cung (buồng trứng phải và buồng trứng trái). Buồng trứng của phần lớn động vật có vú gồm có hai miền, miền tủy bên trong và miền vỏ bên ngoài. Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các lớp mô có chức năng tạo tế bào trứng, tổng hợp các hormone progesterone và estrogen. Phía ngoài cùng của miền vỏ là một lớp tế bào lập phương tạo thành lớp biểu mô bao phủ toàn bộ bề mặt buồng trứng. Ngay bên dưới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô kiên kết. Phía dưới lớp này là nhu mô chứa các nang trứng và các tế bào chức năng khác [3]. Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nang nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục (hình 1.1). Nang trứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì quá trình phát triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phôi của chúng [3]. Trong quá trình phát triển nang (folliculogenesis), nang không có xoang di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, tạo thành nang có xoang, phát triển tiếp thành nang trứng thành thục và di chuyển lại bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sự rụng trứng. Tế bào cận noãn của trứng trong các nang thứ cấp tiết ra dịch, phát triển và tách rời, từ đó hình thành nang có xoang. Tế bào trứng tiếp tục phát triển cho đến khi thành thục và được giải phóng khỏi buồng trứng (sự rụng trứng). Các hoạt động tổng hợp các thành phần của tế bào chất, sắp xếp và giảm số lượng nhiễm sắc thể liên kết chặt chẽ với nhau trong quá trình này để đảm bảo sự tích hợp đồng thời sự thành thục nhân và thành thục tế bào chất [4].