Luận án Tiến sỹ Sinh học: Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp. ở Tây Nguyên

Chia sẻ: Lê Thị Hồng Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:198

Thêm vào BST

Báo xấu

55
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xác định được các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây hại trên các cây trồng chính ở khu vực Tây Nguyên. Đánh giá mức độ đa dạng hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên. Đánh giá khả năng sử dụng một số vi sinh vật trong việc hạn chế sự phát triển của tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sỹ Sinh học: Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp. ở Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ MAI LINH NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC HÀ NỘI – 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ MAI LINH NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Tuyến trùng học Mã số: Thí điểm Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Trịnh Quang Pháp 2. PGS. TS. Phan Kế Long Hà Nội – 2019
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan : Luận án „NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN‟‟là công trình do bản thân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trịnh Quang Pháp và PGS.TS. Phan Kế Long. Các trích dẫn trong luận án theo các nguồn công bố đầy đủ. Số liệu, kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa công bố hoặc công bố trong các bài báo khoa học mà tôi là tác giả hoặc đồng tác giả. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Lê Thị Mai Linh
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Trịnh Quang Pháp và PGS.TS. Phan Kế Long đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn TS. Vũ Thị Thanh Tâm, ThS. Nguyễn Thị Duyên, ThS. Nguyễn Hữu Tiền, TS. Nguyễn Thị Ánh Dương đã hỗ trợ tôi trong quá trình hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, phòng Tuyến trùng học, Học viện Khoa học và Công nghệ cùng các đồng nghiệp, Thầy Cô trong Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOTED) trong đề tài mã số:106–NN.03–2013.56; Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR) trong đề tài mã số: IEBR.ĐT/04/17-18, IEBR.ĐT/04/G2-18 đã hỗ trợ kinh phí để tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu. Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Lê Thị Mai Linh
iii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. ix MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................5 1.1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới...5 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu......................................................................................................... 5 1.1.2. Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne ............... 7 1.1.3. Khả năng gây hại trên một số cây trồng ...................................................................... 9 1.1.4. Nghiên cứu phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne ...... 11 1.1.4.1. Phương pháp phân tích hình thái .............................................................................. 11 1.1.4.2. Phương pháp phân tích phân tử ................................................................................ 13 1.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam ...................................................................................................................................16 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chung tại Việt Nam ............................................................... 16 1.2.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ Meloidogyne tại Tây Nguyên .............. 18 1.2.2.1. Tổng quan Tây Nguyên .............................................................................................. 19 1.2.2.2. Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên.......................................... 21 1.3. Biện pháp phòng trừ sinh học tuyến trùng sần rễ Meloidogyne.................................... 22 CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................27 2.1. Nội dung, đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu .................27 2.1.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 27 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 27 2.1.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 27 2.1.4. Thời gian, địa điểm nghiên cứu .................................................................................. 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................28 2.2.1. Khảo sát thực địa và phương pháp thu mẫu ............................................................. 28 2.2.2. Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất .................................................................. 29 2.2.3 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ rễ ..................................................................... 30 2.2.4. Nhân nuôi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp....................................................... 30 2.2.5. Phương pháp xử lý làm trong và làm tiêu bản tuyến trùng .................................... 31 2.2.6. Nghiên cứu hình thái ................................................................................................... 33
iv 2.2.7. Nghiên cứu đa dạng di truyền.................................................................................... 35 2.2.7.1. Tách chiết DNA .......................................................................................................... 35 2.2.7.2. Phản ứng PCR ............................................................................................................ 36 2.2.7.3. Điện di sản phẩm ........................................................................................................ 37 2.2.7.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và đọc trình tự DNA........................................................ 38 2.2.7.5. Phân tích trình tự DNA .............................................................................................. 38 2.2.7.6. Thiết lập cây phát sinh chủng loại............................................................................. 38 2.2.8. Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng ........................................... 38 2.2.8.1. Nấm Paecylomyces javanicus.................................................................................... 38 2.2.8.2. Vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124.................................................................. 39 2.2.8.3. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HydroxyphenylaceticAcid (4-HPAA) đến tuyến trùng M. incognita.............................................................................................................................. 39 2.2.8.4. Phân tích số liệu.......................................................................................................... 40 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...............................41 3.1. Tần suất xuất hiện, đặc điểm phân bố, khả năng gây hại của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne .............................................................................41 3.1.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên một số cây trồng ở Tây Nguyên ......................................................................................................... 41 3.1.2. Phân bố, mật độ của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu và cây chủ ................................................................................................ 43 3.2. Đặc điểm hình thái các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên ...................................................................................................................................49 3.2.1. Loài Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949 ................. 49 3.2.1.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 49 3.2.1.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 50 3.2.2. Loài Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949..................................... 61 3.2.2.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 61 3.2.2.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 68 3.2.3. Loài Meloidogyne arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949...................................... 69 3.2.3.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 70 3.2.3.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 70 3.2.4. Loài Meloidogyne enterolobii Yang, Eisenback., 1983 ........................................... 80 3.2.4.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 80 3.2.4.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 87 3.2.5. Loài Meloidogyne graminicola Golden & Birchfield 1965 ..................................... 90 3.2.5.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng...................................................................... 90 3.2.5.2. Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại ................................................................. 91
v 3.2.6. Loài Meloidogyne daklakensis Trinh, Le, Nguyen, Nguyen, Liebanas & Nguyen, 2018........................................................................................................................................... 97 3.2.7. Loài Meloidogyne sp................................................................................................... 106 3.3. Đa dạng hình thái, hình thái lƣợng các loài Meloidogyne ..........................113 3.3.1. Phân tích đa dạng hình thái lượng giữa các loài Meloidogyne............................ 113 3.3.2. So sánh hình thái giữa các loài Meloidogyne spp. ................................................. 118 3.4 . Phân tích đa dạng di truyền các loài Meloidogyne spp. .............................127 3.4.1. Phản ứng Multiplex-PCR.......................................................................................... 127 3.4.2. Phân tích đa dạng di truyền ...................................................................................... 128 3.4.2.1 Vùng gen ITS.............................................................................................................. 129 3.4.2.2 Vùng gen D2D3 ......................................................................................................... 133 3.4.2.3. Vùng gen COI ........................................................................................................... 137 3.4.2.4. Vùng gen COII-16S .................................................................................................. 141 3.4.2.5. Vùng gen NAD5 ........................................................................................................ 146 3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của một số vi sinh vật đối kháng ...............................150 3.5.1. Nấm Paecylomyces javanicus .................................................................................. 150 3.5.1.1. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ nở của trứng của tuyến trùng M. incognita.................................................................................................................. 150 3.5.1.2. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ chết của ấu trùng M. incognita.................................................................................................................................. 151 3.5.2. Vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 .............................................................. 154 3.5.2.1. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến sự nở trứng của tuyến trùng M. incognita........................................................................................................ 154 3.5.2.2. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến ấu trùng M. incognita.................................................................................................................................. 155 3.5.3. Ảnh hưởng của 4-HPAA tới tuyến trùng Meloidogyne incognita ..................... 158 CHƢƠNG 4............................................................................................................161 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................161 4.1. KẾT LUẬN .....................................................................................................161 4.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................................162 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...........................................163 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................164
vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Diễn giải 16S-rRNA 16S Ribosomal Axit Ribonucleic ADF Actin depolymerizing factor ANOVA One-way analysis of variance (Phân tích phương sai một yếu tố) CDA Canonical discriminant analysis (Phân tích chỉ số khác biệt) COI Cytochrome c oxidase subunit 1 COII Cytochrome c oxidase subunit 2 ĐC Đối chứng DMSO Dimethyl sulphoxide DNA Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic) EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (Axit ethylenediamine tetraacetic ) ETS E26 transformation-specific GA Gallic acid (Axit galic) HPAA Hydroxyphenylacetic acid (Axit hydroxyphenylacetic) IGS Intergenic spacer ITS Internal transcribed spacer MIG Meloidogyne incognita group NAD5 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 5 NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase) RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA (Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên) SCAR Sequence Characterized Amplified Region (Nhân bản chuỗi DNA được mô tả) SEM Scanning Electron Microscope (Hiển vi điện tử quét) STT Số thứ tự TAE Tris-acetate-EDTA TAF Triethanolamine formalin VSV Vi sinh vật WLB Worm lysis buffer
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu ....................................................... 37 Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng Meloidogyne spp. trên một số cây trồng ở Tây nguyên .................................................................................................................. 43 Bảng 3.2. Phân bố của các loài Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu, cây chủ ...... 45 Bảng 3.3. Danh sách mẫu và mật độ các loài tuyến trùng Meloidogyne ghi nhận được ... 47 Bảng 3.4. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 53 Bảng 3.5. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 54 Bảng 3.6. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 57 Bảng 3.7. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên cứu trước .......................................................................................................................................... 62 Bảng 3.8. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 63 Bảng 3.9. Số đo con đực quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên cứu trước. ......................................................................................................................................... 65 Bảng 3.10. Số đo con cái các quần thể tuyến trùng loài Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên cứu trước ......................................................................................................... 73 Bảng 3.11. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên cứu trước ................................................................................................................................... 74 Bảng 3.12. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên cứu trước ................................................................................................................................... 76 Bảng 3.13. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 81 Bảng 3.14. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước đó ................................................................................................................. 82 Bảng 3.15. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước đó ................................................................................................................. 84 Bảng 3.16. Số đo con cái các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 92 Bảng 3.17. Số đo con đực các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 93 Bảng 3.18. Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước ...................................................................................................................... 94 Bảng 3.19. Số đo các quần thể Meloidogyne daklakensis n. sp.......................................... 102 Bảng 3.20. Số đo các quần thể tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp ................................... 110 Bảng 3.21. Bảng chỉ số CDA giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne.................... 114
viii Bảng 3.22. Đặc điểm so sánh hình thái lượng của các loài tuyến trùng Meloidogyne...... 119 Bảng 3.23. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen ITS........................................... 130 Bảng 3.24. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự vùng gen D2D3 giữa các loài Meloidogyne spp. ................................................................................................................... 134 Bảng 3.25. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen COI giữa các loài Meloidogyne spp. .......................................................................................................................................... 138 Bảng 3.26. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen COII-16S giữa các loài Meloidogyne spp. ................................................................................................................... 142 Bảng 3.27. Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen NAD5 giữa các loài Meloidogyne spp. ................................................................................................................... 146 Bảng 3.28. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ (%) trứng nở của tuyến trùng M. incognita .................................................................................................................. 151 Bảng 3.29. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P. javanicus đến tỷ lệ chết (%) của ấu trùng Meloidogyne incognita .......................................................................................................... 152 Bảng 3.30. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến tỷ lệ nở trứng của tuyến trùng M .incognita................................................................................................. 155 Bảng 3.31. Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L. antibioticus HS124 đến tỷ lệ chết của ấu trùng tuổi 2 loài M. incognita ........................................................................................... 156 Bảng 3.32. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ nở trứng của M. incognita ........ 158 Bảng 3.33. Ảnh hưởng của hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ chết của ấu trùng tuổi 2 tuyến trùng Meloidogyne incognita ................................................................................................ 159
ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh tuyến trùng sần rễ lần đầu tiên được công bố.......................................... 6 Hình 1.2. Hình ảnh chi tiết tuyến trùng sần rễ Meloidogyne exigua trên cà phê ................... 6 Hình 1.3. Chu kỳ vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., .................................. 7 Hình 1.4. Các đặc điểm chung để xác định các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ........ 12 Hình 1.5. Hồ tiêu bị bệnh chết nhanh, chết chậm. ................................................................. 18 Hình 1.6. Vị trí 5 tỉnh Tây Nguyên trên bản đồ Việt Nam.................................................... 20 Hình 2.1. Sơ đồ khu vực nghiên cứu (Google map).............................................................. 28 Hình 2.2. Mẫu đất và rễ sau khi thu mẫu................................................................................ 29 Hình 2.3. Nhân nuôi thuần tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp.,........................................ 30 Hình 2.4. Phương pháp cắt tấm cutin vùng chậu con cái tuyến trùng Meloidogyne spp., .. 30 Hình 2.5. Hình thái giải phẫu của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., sử dụng cho nghiên cứu hình thái ............................................................................................................................. 30 Hình 2.6. Cấu trúc tấm cutin vùng chậu ................................................................................. 35 Hình 2.7. Cấu trúc vùng gen trong hệ gen nhân được sử dụng trong nghiên cứu ............... 36 Hình 2.8. Cấu trúc hệ gen ty thể sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 37 Hình 3.1. Đặc điểm rễ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne trên một số cây trồng .............. 42 Hình 3.2. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne incognita ................................. 59 Hình 3.3. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne incognita........... 60 Hình 3.4. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne javanica .................................. 66 Hình 3.5. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne javanica ............. 67 Hình 3.6. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne arenaria .................................. 78 Hình 3.7. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne arenaria ............. 79 Hình 3.8. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne enterolobii............................... 86 Hình 3.9. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne enterolobii ......... 87 Hình 3.10. Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne graminicola .......................... 96 Hình 3.11. Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne graminicola ..... 97 Hình 3.12. Ảnh vẽ loài Meloidogyne daklakensis ................................................................. 97 Hình 3.13. Ảnh chụp kính hiển vi loài Meloidogyne daklakensis ...................................... 100 Hình 3.14. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (SEM) loài Meloidogyne daklakensis ............ 101 Hình 3.15. Ảnh vẽ loài Meloidogyne sp ............................................................................... 107 Hình 3.16. Ảnh chụp kính hiển vi loài Meloidogyne sp...................................................... 108 Hình 3.17. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (SEM) Meloidogyne sp ................................... 109 Hình 3.18. Hình phân tích CDA ấu trùng các quần thể Meloidogyne spp......................... 116 Hình 3.19. Hình phân tích CDA con đực các quần thể Meloidogyne spp ......................... 116 Hình 3.20. Hình phân tích CDA con cái các quần thể Meloidogyne spp........................... 117
x Hình 3.21. Đặc điểm so sánh tấm cutin vùng chậu con cái các loài Meloidogyne spp ..... 122 Hình 3.22. Đặc điểm so sánh vùng đầu con đực giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., .................................................................................................................. 124 Hình 3.23. Đặc điểm so sánh phần đuôi ấu trùng tuổi 2 giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., .................................................................................................................. 125 Hình 3.24. Hình điện di sản phẩm Multiplex-PCR các mẫu nghiên cứu........................... 140 Hình 3.25. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen ITS 140 Hình 3.26. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen D2D3 ................................................................................................................................................. 140 Hình 3.27. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen COI 140 Hình 3.28. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen COII- 16S .......................................................................................................................................... 140 Hình 3.29. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen NAD5 ................................................................................................................................................. 140 Hình 3.30. Nấm Paecylomyces javanicus ký sinh trên trứng loài M. incognita................ 153 Hình 3.31. Nấm Paecylomyces javanicus ký sinh trên ấu trùng M.incognita ................... 153 Hình 3.32. Trứng và ấu trùng M. incognita chết do vi khuẩn L. antibioticus HS124 ....... 156 Hình 3.33. Hợp chất 4-HPAA gây chết trứng và ấu trùng Meloidogyne incognita .......... 160
1 MỞ ĐẦU Tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne là nhóm tuyến trùng nội ký sinh cố định gây sần rễ [1]. Sau khi xâm nhập vào rễ, ấu trùng tuổi 2 sẽ di chuyển và cư trú tại mô phân sinh, tấn công vào đỉnh sinh trưởng của chóp rễ, làm phân hóa tế bào đỉnh sinh trưởng, đồng thời tiết ra enzyme làm thay đổi mô rễ và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng. Rễ cây bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ bị tổn thương, trên bề mặt có dạng sần sùi hoặc tạo thành các u cục, cây bị còi cọc, vàng lá và gây chết. Các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên nhiều loại cây chủ khác nhau và phân bố rộng trên toàn cầu, làm suy giảm năng suất và sản lượng của các loại cây trồng, đặc biệt là các vùng Nam, Trung Mỹ, Châu Phi và Châu Á trong đó có Việt Nam [1], [2], [3], [4]. Vì vậy, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne trở thành mối quan tâm trong sản xuất nông nghiệp. Tính đến năm 2006, có 111 loài Meloidogyne được mô tả, trong số đó có 18 loài ký sinh trên cây cà phê, chứng tỏ rằng các loài Meloidogyne có tính đa dạng cao [5]. Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ ghi nhận được 5 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne, trong đó Tây Nguyên được biết đến có mặt cả 5 loài này [6]. Các nghiên cứu sau này cho thấy hiện nay tại khu vực Tây Nguyên, sự hiện diện và gây hại của nhóm tuyến trùng này rất lớn đặc biệt trên cà phê và hồ tiêu. Sự gây hại của các loài Meloidogyne spp. làm hàng trăm hecta cà phê, hồ tiêu đã phải loại bỏ để thay thế trồng những cây trồng khác [6], [7], [8], [9]. Biến đổi hình thái của mỗi loài tuyến trùng sần rễ chịu sự ảnh hưởng của cây chủ cũng như phân bố của các quần thể ở sinh thái khác nhau. Những tiêu chuẩn chủ yếu trong phân loại bằng hình thái của tuyến trùng sần rễ thường sử dụng tấm cắt cutin vùng chậu (hậu môn-sinh dục) của con cái, ngoài ra các đặc điểm hình thái vùng đầu con đực, vùng đuôi của ấu trùng; các đặc điểm hình thái lượng của con cái, con đực, ấu trùng cũng được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng hình thái giữa các loài [10], [11], [12], [2]. Tuy nhiên, sự chồng lấn các đặc điểm hình thái của các quần thể trong cùng một loài, giữa các loài gần gũi, hay trên các cây chủ khác nhau hoặc giữa các vùng địa lý khác nhau thường có sự dao động lớn nên gặp nhiều khó khăn trong chẩn loại bằng các đặc điểm hình thái [13], [14]. Vì vậy, để hỗ trợ cho phương pháp phân loại dựa trên hình thái, kỹ thuật phân tử đã được sử dụng hiệu
2 quả trong phân loại các loài Meloidogyne spp.. Nghiên cứu về di truyền trong phân tích trình tự các vùng gen trong hệ gen nhân (18S, ITS, và 28S) [15], [16], [17], [18], [19], [20] và các vùng gen trong hệ gen ty thể COI và COII và đoạn không mã hóa giữa 2 vùng gen COII-16S-rRNA [21], [22], [23], [24] đã hỗ trợ rất nhiều cho các nghiên cứu phân loại và phát sinh chủng loại của các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne được nhanh chóng và chính xác, góp phần phục vụ cho biện pháp đánh giá tác hại và phòng trừ tuyến trùng sần rễ. Với tác hại và phân bố rộng của tuyến trùng sần rễ trên cây trồng, việc ngăn chặn và phòng trừ nhóm tuyến trùng này luôn được quan tâm và định hướng tới nền nông nghiệp an toàn. Biện pháp phòng trừ tuyến trùng hiện nay chủ yếu sử dụng thuốc hóa học với hàm lượng cao đã gây nên hiện tượng kháng thuốc cũng như ảnh hưởng đến môi trường đất, làm suy giảm sự đa dạng của các sinh vật có ích, suy thoái đất, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của con người và vật nuôi [25]. Do đó, các biện pháp phòng trừ sinh học hiện được chú trọng hơn khi sử dụng các vi sinh vật để chống lại các loài tuyến trùng ký sinh thực vật, được xem là một trong những biện pháp rất tiềm năng [26], [27]. Nhiều loại vi sinh vật có khả năng làm tăng sinh trưởng của cây, tạo ra các chất kháng sinh và độc tố làm ngăn cản sự sinh sản, nở trứng và khả năng sống sót của ấu trùng tuổi 2 tuyến trùng sần rễ do vậy có thể được đưa vào ứng dụng trong phòng trừ tuyến trùng [28], [29]. Xuất phát từ thực tiễn về đa dạng cây trồng và địa hình ở Tây Nguyên, cũng như đa dạng của loài tuyến trùng sần rễ và khả năng gây hại, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp. ở Tây Nguyên’’ Mục tiêu nghiên cứu  Xác định được các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây hại trên các cây trồng chính ở khu vực Tây Nguyên.  Đánh giá mức độ đa dạng hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên.  Đánh giá khả năng sử dụng một số vi sinh vật trong việc hạn chế sự phát triển của tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm.
3 Phạm vi nghiên cứu  Đặc điểm hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ghi nhận trên một số cây trồng ở khu vực Tây Nguyên.  Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng lên khả năng nở trứng và sống sót của ấu trùng Meloidogyne incognita. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học  Bổ sung mới thành phần loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên, trong đó ghi nhận thêm nhiều cây ký chủ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne cũng như sự phân bố của chúng. Mô tả và ghi nhận loài mới loài Meloidogyne daklakensis ký sinh trên cà phê tại tỉnh Đắk Lắk.  Các chỉ tiêu hình thái của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở các cây chủ và địa điểm khác nhau được đánh giá, so sánh đưa ra sự biến đổi hình thái trong loài và các loài khác nhau đã xác định được những chỉ tiêu quan trọng ít thay đổi trong phân loại loài như các đặc điểm hình thái, hình thái lượng của vân cutin vùng chậu con cái, vùng đầu con đực và phần đuôi ấu trùng.  Đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể trong một loài và giữa các loài Meloidogyne ở Tây Nguyên được phân tích đưa ra các đoạn gen bảo thủ và tiến hóa cũng như phát sinh loài. Từ đó góp phần đưa ra chọn lựa tốt nhất trong phân loại từng nhóm loài Meloidogyne bằng sinh học phân tử. Bên cạnh đó, lần đầu tiên đóng góp cơ sở dữ liệu các vùng gen nhân (ITS, D2D3) và gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) của các loài Meloidogyne có mặt ở Việt Nam trên Genbank.  Luận án khẳng định vai trò ký sinh và gây chết của vi sinh vật có lợi trong điều kiện phòng thí nghiệm của nấm Paecilomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 trong phòng trừ loài Meloidogyne incognita phổ biến trên nhiều cây trồng. Ý nghĩa thực tiễn
4  Xác định thành phần loài, mật độ tuyến trùng sần rễ hại cây trồng là tiêu chuẩn trong phòng trừ hiệu quả. Cung cấp số liệu về khả năng ký sinh, ký chủ, gây hại và phân bố của các loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ góp phần ngăn chặn chúng phát tán trong điều kiện tự nhiên bảo vệ cây trồng tránh bị lây nhiễm. Từ đó lựa chọn phương thức canh tác phù hợp đối với từng cây trồng nhất là đối với cà phê và hồ tiêu cũng như những cây trồng xen và luân canh.  Luận án cung cấp cơ sở dữ liệu về hình thái và phân tử của các loài Meloidogyne phục vụ cho tra cứu, tham khảo.  Đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bởi nấm Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124, kháng sinh 4-HPAA làm cơ sở cho việc lựa chọn các tác nhân trong phòng trừ, qua đó góp phần giảm lượng thuốc hóa học trong phòng trừ, giữ được cân bằng sinh thái để phát triển bền vững các cây trồng chủ lực ở Tây Nguyên. Những đóng góp mới của luận án  Luận án lần đầu tiên đưa ra dữ liệu đầy đủ về phân bố, cây chủ và đặc trưng hình thái, phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ trên cà phê, hồ tiêu và các cây trồng xen ở Tây Nguyên. Đã xác định thêm nhiều cây chủ mới nhiễm tuyến trùng Meloidogyne ở Tây Nguyên cũng như cho Việt Nam. Bổ sung 145 trình tự các vùng gen ITS, D2D3, COI, COII-16S, NAD5 của các loài tuyến trùng sần rễ ở Tây Nguyên trên Genbank.  Đã ghi nhận 01 loài tuyến trùng sần rễ mới cho khoa học ký sinh trên cà phê đã được mô tả, công bố và đặt tên Meloidogyne daklakensis n. sp. và 01 loài còn lại đã được gửi công bố.  Lần đâu tiên tại Việt Nam đã đánh giá khả năng ký sinh và gây chết của nấm Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 và chất kháng sinh 4-HPAA đối với tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm.
5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu Berkeley (1855) là nhà khoa học đầu tiên công bố sự xuất hiện của tuyến trùng sần rễ trên rễ cây dưa chuột trồng tại khu vườn Nuneham, Vương Quốc Anh với các mô tả triệu chứng như: các nốt sần có màu kem đục, gần như hình cầu, có vảy mờ, có hiện tượng phình to ở rễ (hình 1.1). Jobert (1878) đã ghi nhận sự hiện diện trong rễ cà phê các cá thể hình giun được nở ra từ trứng có trong rễ cây,và ông đã đưa ra các mô tả cơ bản về tuyến trùng này. Sau đó, nhóm tuyến trùng này lần lượt được đặt tên là Anguillula marioni (Cornu, 1879); Heterodera radicicola (Carl Muller, 1884), Heterodera javanica Treub (Melchior, 1885) [30]. Năm 1887 tên tuyến trùng sần rễ Meloidogyne (Meloidogyne theo tiếng latin có nghĩa là „con cái có hình quả táo‟) đã được đề xuất bởi Göldi khi mô tả chi tiết loài M. exigua trên rễ cà phê ở Braxil [1] (hình 1.2). Đến năm 1949, Chitwood thống nhất tách giống tuyến trùng Meloidogyne Göldi, 1887 dựa trên loài chuẩn M. exigua (Goldi, 1887) tách khỏi tuyến trùng bào nang Heterodera. Vị trí phân loại của giống Meloidogyne hiện tại được theo hệ thống Karsen et al. (2013) [30]. Ngành: Nematoda Potts, 1932 Lớp: Chromadorea Inglis, 1983 Phân lớp: Chromadoria Pearse, 1942 Bộ: Rhabditida Chitwood, 1933 Phân bộ: Tylenchina Thorne, 1949 Họ: Meloidogynidae Skarbilovich, 1959 Phân họ: Meloidogyninae Skarbilovich, 1959 Giống: Meloidogyne Göldi, 1887
6 Hình 1.1. Hình ảnh tuyến trùng sần rễ lần đầu tiên được công bố A: Rễ cây bị sần, B: trứng, tuyến trùng trong mô rễ [30]. Hình 1.2. Hình ảnh chi tiết tuyến trùng M. exigua trên cà phê Göldi (1887) [30].
7 1.1.2. Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai đoạn phát triển bao gồm: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1); ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm-J2); ấu trùng tuổi 3, 4 (J3, J4) và giai đoạn trưởng thành với con cái và con đực (hình 1.3) [31]. Trứng sau khi thụ tinh sẽ hình thành giai đoạn đầu tiên của ấu trùng J1 nằm trong trứng. Khi đạt điều kiện thuận lợi trứng chứa J1 sẽ nở ra thành ấu trùng tuổi 2(J2). Ấu trùng tuổi 2 khi chưa xâm nhập vào rễ cây chúng sử dụng dinh dưỡng được dự trữ trong ruột cho đến khi tìm được ký chủ phù hợp [32], khi đó J2 sẽ bắt đầu giai đoạn xâm nhiễm và xâm nhập vào các mô rễ, J2 thường tấn công vào các mô phần sinh trưởng ở đỉnh rễ; nơi các rễ phụ mọc ra tạo điểm xâm nhập cho các J2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương. Khi J2 tiếp xúc với bề mặt của rễ, chúng dùng kim hút châm chích và xâm nhập vào bên trong rễ ở bất kỳ phía nào của rễ. Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ, tách dọc tế bào và định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ bắt đầu quá trình dinh dưỡng. Trong quá trình dinh dưỡng, J2 cố định phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm thay đổi quá trình sinh lý sinh hóa của tế bào rễ và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng. Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào đa nhân) được tạo thành trong vùng nhu mô hoặc hoặc mô libe. Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao của tế bào thực vật, được tạo ra và duy trì bằng sự ký sinh của tuyến trùng. Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng bị phình to ra và tạo thành các nốt sần rễ (gall hoặc root- knot). Sự hình thành các tế bào khổng lồ này có liên quan đến sự thay đổi điều tiết và biểu hiện của gen chẳng hạn như gen ADF mã hóa cho protein ADF2 trong tế bào thực vật chịu trách nhiệm cho sự phát triển các tế bào bình thường [33]. Các tác động từ Meloidogyne sau khi xâm nhiễm sẽ làm kích hoạt các protein ADF2 này làm cho các tế bào thực vật phát triển mạnh hơn và bất thường hơn. Trung bình, kích thước cuối cùng của các tế bào bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ lớn gấp 400 lần so với các tế bào mạch bình thường trong rễ [34], [35]. Các nốt sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi bị tuyến trùng xâm nhập. J2 sẽ tăng kích thước, lột xác lên giai đoạn J3, J4 và phát triển
8 trong thời gian từ 4-6 ngày và cuối cùng là cơ thể trưởng thành đực và cái. Con đực có kích thước dài, hình giun, tuy nhiên chúng không ăn trực tiếp dinh dưỡng từ cây. Con cái có dạng hình quả lê và hoàn thành chu trình sống bắt đầu đẻ trứng, mỗi túi trứng được chứa từ 300-500 trứng, có loài lên tới 2000 trứng, trứng này được chứa trong một túi gelatin có thể ở trong hoặc phủ ra ngoài rễ, khi gặp điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp trứng sẽ được nở [36], [30]. Hình 1.3. Chu kỳ vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. có 2 hình thức sinh sản khác nhau, trong đó một vài loài sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) như M. carolinensis, M. megatyla và M. pini [12] và phần lớn các loài còn lại là sinh sản lưỡng tính (parthenogensis) không cần con đực như M. chitwoodi, M. exigua và M.