Luận văn:Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng ngô thuần Vi ệt Nam tại Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội

Chia sẻ: Nguyentien Thanh | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:56

Thêm vào BST

Báo xấu

160
lượt xem 31
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong công tác chọn tạo giống ngô lai, các kỹ thuật như tạo dòng.thuần bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn, sử dụng chỉ thị phân tử đánh.giá tính đa dạng di truyền của tập đoàn nguyên li ệu đã đ ược s ử d ụng và là.trợ giúp đắc lực cho phương pháp truyền thống, góp phần đẩy nhanh việc.xây dựng các tổ hợp lai ưu tú đáp nhu cầu ngày càng tăng về số lượng

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn:Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng ngô thuần Vi ệt Nam tại Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội

PHẦN MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngô (Zea mays.L) là cây lương thực quan trọng đối với con người có tiềm năng năng suất cao được trồng phổ biến ở nhiều nước. Trên th ế giới, ngô xếp thứ ba về diện tích và thứ nhất về năng suất, sản lượng các cây lấy hạt và sử dụng dưới nhiều hình thức khác nhau. Hiện nay, 49% s ản lượng ngô được sử dụng làm thức ăn gia cầm,12% làm thức ăn động vật, 25% làm lương thực thực phẩm cho con người, 13% trong tinh bột và các ngành khác, 1% là làm hạt giống. Ước tính đến năm 2020 sản lượng ngô trên thế giới sẽ tăng từ 820,7 triệu tấn lên 837 triệu tấn so với năm 2010. Trong nền nông nghiệp Việt Nam, ngô là cây màu quan trọng nhất, đứng vị trí thứ hai sau lúa, được trồng nhiều ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ và hình thức canh tác. Kể từ thập niên 90 đ ến nay, cuộc cách mạng ngô lai đã làm thay đổi căn bản nghề trồng ngô ở nước ta, đưa nước Việt Nam đứng trong hàng ngũ các nước trồng ngô tiên tiến trong khu vực Châu Á (Trần Hồng Uy,1997)[1] Những năm gần đây, sản xuất ngô của nước ta đã có sự phát tri ển mạnh mẽ về diện tích, năng suất và sản lượng. Tỷ lệ tăng trưởng bình quân trong 20 năm qua về diện tích là 7,5%, năng suất là 6,7% và sản lượng là 24,5% (TS.Bùi Mạnh Cường, 2007)[2]. Đặc biệt việc khai thác tiềm năng năng suất thông qua ưu thế lai và đưa nhanh các giống ngô lai vào s ản xuất trên quy mô rộng lớn là một trong những đóng góp quan trọng làm tăng sản lượng lương thực cả nước. Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công ngh ệ sinh h ọc (CNSH) đã tạo ra những thay đổi kì diệu trong nhiều lĩnh vực. Trong nông nghiệp CNSH được coi là phương tiện giải quyết các vấn đ ề khó khăn mà 1
công tác chọn tạo giống truyền thống khó có th ể thực hiện đ ược ho ặc n ếu có thực hiện được thì mất nhiều thời gian. Trong công tác chọn tạo giống ngô lai, các kỹ thuật như tạo dòng thuần bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn, sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá tính đa dạng di truyền của tập đoàn nguyên li ệu đã đ ược s ử d ụng và là trợ giúp đắc lực cho phương pháp truyền thống, góp phần đẩy nhanh việc xây dựng các tổ hợp lai ưu tú đáp nhu cầu ngày càng tăng về số lượng cũng như chủng loại giống ngô lai vào sản xuất, giảm thiểu một số công đoạn trong công tác chọn tạo. Vì vậy, chúng tôi tiến hành th ực hiện đ ề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng ngô thu ần Vi ệt Nam tại Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội” 2. Mục tiêu của đề tài - Tách chiết DNA của tổ hợp lai ưu tú 20 dòng ngô thuần Việt Nam trong phòng thí nghiệm. - Kiểm tra độ thuần của các dòng ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử - Dựa trên chỉ thị phân tử SSR xác định mức độ đa hình và xây dựng s ơ đồ phả hệ của các dòng - Dự đoán các tổ hợp lai ưu tú của 20 dòng ngô thuần Việt Nam 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn • Ý nghĩa khoa học Đề tài nghiên cứu được thực hiện chi tiết, các vấn đề liên quan đến việc đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô, phân tích đa d ạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR với mong muốn cung cấp thêm s ố li ệu, thông tin và khả năng ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác ch ọn t ạo giống lai trong điều kiện cụ thể ở Việt Nam. 2
• Ý nghĩa thực tiễn Rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc lai tạo trên đồng ruộng, kết hợp các phương pháp đánh giá đồng ruộng sẽ nhanh chóng xác định, chọn lọc tổ hợp lai cho năng suất cao. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: 20 dòng ngô thuần Việt Nam - Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá độ thuần di truyền, khoảng cách di truyền giữa các dòng, phân nhóm và dự đoán ưu thế lai nhờ sử dụng chỉ thị SSR - Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Công nghệ Sinh h ọc - Vi ện nghiên cứu Ngô - Đan Phượng - Hà Nội. - Thời gian từ 23/02/2011 đến 22/05/2011 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC Cây ngô (Zea mays.L) thuộc chi Zea, phân họ ngô (Maydeae), họ phụ hòa thảo (Panicoideae), họ hòa thảo (Grmaineae), bộ hòa th ảo (Grmainale), lớp một lá mầm (Cosmobionia) và có bộ nhiễm sắc thể 2n=20. Cây ngô là cây hàng năm với hệ thống rễ chùm phát triển, là loài cây giao ph ấn có hoa đơn tính cùng gốc. 1.1. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế Trong lịch tiến hóa của khoảng một nghìn loài cây trồng phổ biến nhất trên trái đất hiện nay, chưa có loài cây trồng nào phát tri ển nhanh chóng và có nhiều công dụng cho con người như cây ngô (Cao Điểm Đắc, 1988)[3]. Trước hết ngô là cây ngũ cốc nuôi sống gần 1/3 dân s ố toàn c ầu. Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực. Ngô là lương thực chính của người dân khu vực Đông Nam Phi, Tây Phi, Nam Á,… Ngô là thành phần quan trọng bậc nhất trong thức ăn chăn nuôi. Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn chăn nuôi tổng hợp là từ ngô, 71% sản lượng ngô thế giới làm thức ăn chăn nuôi (Ngô Hữu Tình,2003)[8]. Ngô còn là một loại hàng hóa xuất khẩu của ngành nông nghiệp, trên thế giới hàm lượng ngô xuất nhập khẩu khoảng 70 triệu tấn. Bên cạnh đó ngô còn đem lại nhiều lợi nhuận cho người dân. Theo thống kê của ISAAA, ở Philippine, có ít nhất 200 ngàn người nông dân hưởng lợi từ cây ngô CNSH trong năm 2008. Nghiên cứu về tác động của giống ngô này đến kinh tế - xã hội cho thấy trong niên vụ 2003-2004, ngô CNSH làm thu nhập cho người dân thêm 7482 peso/ha (khoảng 135USD) trong mùa khô, còn trong mùa mưa thì thu nhập tăng thêm là 7080 peso/ha (khoảng 125USD). Sử dụng số liệu năm 2008, các nhà khoa học đã tính được rằng ngô Bt có thể cho thu nhập cao hơn từ 5-14% trong mùa mưa và từ 20-48% trong mùa khô (Clive James, 2008). 4
1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô trong và ngoài nước 1.2.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô trên thế giới Nhờ có vai trò quan trọng trong nền kinh tế mà cây ngô ngày càng được quan tâm và phát triển. Ngô là một trong ba cây lương th ực lấy h ạt quan trọng nhất trong nền nông toàn cầu và được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới đem lại năng suất và sản lượng cao nhất trong các loại ngũ cốc. Thực vậy, năm 2009 theo số liệu của tổ chức Nông nghi ệp và lương thực LHQ (FAO) về sản xuất ngô: Diện tích toàn th ế giới là 159,53 triệu ha, Năng suất trung bình là 5,18 tấn/ha, Tổng sản lượng 817,1 triệu tấn. Năm 2009, phần lớn sản lượng ngô thế giới tập trung ở các nước Mỹ, Trung Quốc, Braxin, Mehicô, Pháp và Ấn Độ, chiếm trên 75% (FAOSTAT, 2009). Bảng 1.1: Tình hình sản xuất ngô ở một số nước dẫn đầu trên thế giới năm từ 2004 - 2010 Chỉ tiêu Nước 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Thế giới 145,3 145,5 149,6 160,5 158,2 156,3 160,6 Diện tích Mỹ 29,8 30,4 28,6 35,0 31,8 32,2 32,9 (triệu ha) Trung Quốc 25,4 26,4 28,5 29,5 29,9 31,2 31,5 Braxin 11,6 12,9 14 14,7 14,1 12,9 12,8 Thế giới 4,9 4,8 4,8 4,9 50 5,2 5,1 Năng Mỹ 10,1 9,3 9,4 9,5 9,7 10,3 9,7 Trung Quốc 5,1 5,3 5,3 5,2 5,6 5,1 5,3 suất Braxin 3,0 3,2 3,6 4,0 3,6 4,3 4,0 (tấn/ha) S ản Thế giới 715,5 699,4 713,5 793,6 797,8 812,4 820,7 lượng Mỹ 299,9 282,3 267,5 331,2 307,1 333,0 318,5 Trung Quốc 130,3 139,4 151,6 152,3 165,9 158,0 168,0 (triệu Braxin 35,0 41,7 51,0 58,6 51,0 56,1 51,0 tấn) (Nguồn USDA (2010) [23]) Mỹ luôn là nước chiếm vị trí hàng đầu thế giới về diện tích và sản lượng ngô, đồng thời cũng là nước có năng suất cao nhất. Hiện nay 100% diện tích 5
trồng ngô của Mỹ là ngô lai, năng suất ngô tăng từ 1,5 tấn/ha năm 1930 lên đến 10,34 tấn /ha vào năm 2009, với tổng sản lượng 332,01 triệu tấn (FAO 2009). Và Mỹ đang phấn đấu đến năm 2030, năng suất ngô sẽ tăng gấp đôi hiện nay, lên >18 tấn/ha. Năm 2009 diện tích trồng ngô ở các nước Đông Nam Á là 8,212 triệu ha, năng suất bình quân đạt 31,3 tạ / ha với tổng sản lượng 25,67 triệu tấn (USDA, 2010) [23]. Kể từ khi ngô được phát hiện ở châu Mỹ và du nhập vào các khu vực khác trên thế giới, trong một khoảng thời gian dài năng suất chỉ đạt khoảng 0,1-0,2 tấn/ha. Nhưng đến nay nhờ những ứng dụng rộng rãi nhiều tiến bộ khoa học về kĩ thuật di truyền chọn giống, các biện pháp kỹ thuật canh tác tiên tiến, cơ giới hoá… đặc biệt là khai thác và sử dụng ưu thế lai ở ngô trong quá trình chọn giống. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô ở Việt Nam Trong nền nông nghiệp Việt Nam, cây ngô là cây màu quan tr ọng, cây lương thực thứ hai sau lúa nước. Ngô đ ược đ ưa vào Vi ệt Nam cách đây khoảng 300 năm, mặc dù cây lương th ực đ ứng th ứ hai nh ưng do truy ền thống trồng lúa nước nên ngô vẫn ch ưa đ ược chú tr ọng, không phát huy được tiềm năng của nó (Ngô Hữu Tình, 2009)[9]. Ngày nay, s ản xu ất ngô đã được phổ biến rộng khắp cả nước từ vùng núi cao đ ến đ ồng b ằng, trung du. Năm 2009, diện tích ngô c ả n ước là 1086.8 nghìn ha, năng su ất đạt 40,8 tạ/ha và sản lượng ngô là 4431,8 nghìn t ấn. Nh ưng 9 tháng đ ầu năm 2009, Việt Nam đã ph ải nh ập h ơn 0,8 tri ệu t ấn ngô, do nhu c ầu dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi tăng m ạnh. Hiện nay thị phần giống ngô lai của Việt Nam chiếm khoảng trên 60%, chủ yếu là giống lai đơn được áp dụng vào s ản xu ất ở t ất c ả các vùng sinh thái trong cả nước.Trong những năm gần đây Viện Nghiên cứu 6
Ngô đã liên kết với các Viện thành viên trong VAAS và các công ty trong nước và đã nâng cao hiệu quả trong nghiên cứu và chuyển giao nhanh các kết quả nghiên cứu phục vụ sản xuất, như các giống ngô LVN4, LVN9, LVN14. LVN99… Bảng1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 2005 – 2009 Năm Diện tích Năng suất Sản lượng (1000 ha) Tạ/ ha (1000 tấn) 2005 1052,6 36,0 3787,1 2006 1033,1 37,3 3854,6 2007 1096,1 39,3 4303,2 2008 1140,2 40,1 4573,1 2009 1086,8 40,8 4431,8 Nguồn: tổng cục thống kê 2009 [12] Tiến độ gieo trồng năm 2010 nhanh hơn so với năm 2009, tính đến trung tuần tháng 2/2010 các địa phương trên cả nước gieo trồng đ ược 2632,7 nghìn ha ngô bằng 106,1% cùng kì năm trước. Đến trung tu ần tháng 9/2010 cả nước đã gieo trông được 953,8 nghin ha ngô tăng 1,4% so với ̀ ̀ cung kì năm 2009. Và đên ngay 15/3/2011 cả nước ta đă gieo trông được ̀ ́ ̀ ̀ 353,7 nghin ha băng 95,8% cung kì năm trước (Tổng cục th ống kê 2010, ̀ ̀ ̀ 2011)[13]. Chiến lược nghiên cứu và phát triển cây ngô của Việt Nam đến năm 2020 xác định: -Đẩy mạnh nghiên cứu về cây ngô góp phần đưa diện tích ngô c ủa c ả nước đến năm 2015, phấn đấu đạt 1,3 triệu ha ngô; năng suất đạt trên 50 tạ/ha; sản lượng đạt 6,5 triệu tấn, đến năm 2020 đạt 1.500.000 ha với năng suất bình quân 60 tạ/ha và sản lượng 9,0 triệu tấn, nhầm đảm b ảo cung cấp nguyên liệu cho chế biến thức ăn chăn nuôi và các nhu cầu khác trong nước, từng bước tham gia xuất khẩu. 7
Bảng 1.3. Dự kiến diện tích, năng suất và sản lượng ngô cả nước đến năm 2020 Năm Diện tích Năng suất Sản lượng ( ha ) ( tạ / ha) Triệu tấn 2005 1043 300 36,0 3,7 2010 1200 000 42,0 5,4 2015 1300 000 50,0 6,5 2020 1500 000 60,0 7,8 Nguồn: Chiến lược pháp triển cây ngô đến năm 2020[14] -Cải thiện thu nhập và đời sống cho người sản xuất ngô, nâng cao hiệu quả sử dụng đất, lao động và vốn đầu tư. -Đẩy mạnh nghiên cứu chọn tạo giống ngô lai đảm bảo đủ sức cạnh tranh trên thị trường trong nước và xuất khẩu. -Đảm bảo cung cấp giống ngô lai Việt Nam chiếm 51-55% thị ph ần ngô lai của cả nước nhằm chủ động hạt giống với giá bán phù h ợp với khả năng đầu tư của nông dân. -Nghiên cứu các giải pháp về khoa học kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất ngô, tăng thu nhập cho người trồng ngô, bảo vệ môi trường sinh thái, góp phần xây dựng nền nông nghiệp bền vững. 1.3. Cơ sở khoa học 1.3.1. Ưu thế lai (ƯTL) - lịch sử nghiên cứu, ứng dụng trong ch ọn t ạo giống ngô ƯTL là hiện tượng di truyền, trong đó con lai biểu hiện sức sống, các đặc tính hình thái, sinh lý, khả năng thích nghi, khả năng chống chịu và năng suất hơn hẳn bố mẹ (Nguyễn Lộc, 1997) [5]. Người đầu tiên quan sát th ấy hiện tượng ƯTL ở ngô là Charles Darwin, ông nhận thấy những cây giao phối phát triển cao hơn những cây tự phối 20% trong tác phẩm “ Tác đ ộng của giao phối và tự phối trong thế giới thực vật” xuất bản năm 1876. 8
Năm 1878 nhà nghiên cứu người Mỹ tên Beal đã áp dụng th ực t ế ƯTL trong việc tạo giống ngô lai giữa giống. Ông thu được những cặp lai hơn hẳn các giống bố mẹ về năng suất từ 10-15%. Năm 1904 Shull lần đầu tiên tiến hành tự thụ cưỡng bức ở ngô đ ể thu được các dòng chuẩn và đã tạo ra những giống lai từ các dòng chuẩn này. Năm 1913 chính Shull đã đưa vào tài liệu khoa học thuật ngữ “Hetetosis” để chỉ ƯTL (Hetetosis là từ rút gọn của Stimulus of heetrozygosis). Từ năm 1918 Jones đề xuất sử dụng lai kéo trong sản xuất để giảm giá thành h ạt giống thì việc áp dụng ƯTL vào trồng trọt, chăn nuôi được phát triển nhanh chóng. ƯTL của những cơ chế dị hợp tử biểu hiện ở tổ hợp lai trên các tính trạng đã được các nhà di truyền chọn giống chia làm 5 dạng biểu hiện chính: - Ưu thế lai về hình thái. - Ưu thế lai về năng suất. - Ưu thế lai về tính thích ứng. - Ưu thế lai về tính chín sớm. - Ưu thế lai về sinh lý, sinh hóa. Đối với cây ngô, ƯTL về năng suất có vai trò quan trọng nh ất, th ể hiện qua sự tăng của các yếu tố cấu thành năng suất như chi ều dài b ắp, s ố hàng hạt, số hạt/hàng, tỉ lệ hạt/cây…Theo Richey (1927) ƯTL về năng suất ở ngô với các giống lai đơn có thể đạt từ 193% đến 263% so v ới trung bình của bố mẹ (Trích dẫn theo Mai Xuân Triệu, 1998). Trong những năm gần đây, phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các dòng thuần dựa vào chỉ thị phân tử để phân nhóm cách biệt di truyền đã giảm bớt được kh ối lượng công việc lai tạo trên đồng ruộng, rút ngắn thời gian đánh giá. 9
Phương pháp này không phụ thuộc vào môi trường và mùa vụ, do đó tiết kiệm được rất nhiều thời gian và công sức cho các nhà tạo giống. 10
1.3.2. Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo ph ương pháp truy ền thống 1.3.2.1. Đa dạng di truyền của cây ngô: Sự đa dạng di truyền của cây ngô được thể hiện ở tất cả các tính trạng của cây, bông cờ và bắp. Các nghiên cứu cho thấy: Ngô có mức độ sai khác về di truyền rất lớn trong cùng một quần th ể hoặc các qu ần th ể chéo nhau. Các nghiên cứu ở mức độ phân tử cũng cho thấy mức độ đa dạng c ủa ngô cao hơn 3-10 lần so với những loài thân thảo khác (Buckler và cs, 2001) [17]. Các nhà chọn giống đã dựa vào sự đa dạng tự nhiên để lựa chọn các giống /loài tốt, từ đó cải tiến nhằm nâng cao chỉ tiêu về số lượng và chất lượng và chất lượng của giống, ở ngô, năng suất hiện tại cao gấp 55 lần so với năng suất của các giống ngô tổ tiên (Buckler và cs,2001)[17]. 1.3.2.2. Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo phương pháp truyền thống Các nghiên cứu về hiện tượng ƯTL cho thấy sự khác biệt di truy ền của bố và mẹ có ảnh hưởng rất lớn tới sự biểu hiện ƯTL của các tổ hợp lai đơn, Shull G,H (1948) đã kết luận: ƯTL sinh lý của một cơ th ể được biểu hiện qua sự phát triển nhanh, qua chiều cao và ƯTL có m ối t ương quan thuận với độ không giống nhau trong giao tử mà từ đó con lai đ ược hình thành. Sự khác nhau giữa giao tử càng nhiều thì sự biểu hiện ƯTL ở con lai càng lớn (trích theo Ngô Hữu Tình và cs, 1997) [7]. Cây ngô là loài cây giao phấn điển hình, quần th ể rất đa dạng và d ị hợp tử về kiểu gen, vì thế những thông tin về đa dạng di truy ền của các nguồn gen là rất cần thiết và vô cùng hữu ích trong công tác đánh giá dòng, phân nhóm ƯTL và dự đoán tổ hợp lai ưu tú có khả năng cho năng suất cao. Đa dạng di truyền có tầm quan trọng hết sức to lớn trong ch ọn t ạo giống ngô, đặc biệt là cho chương trình tạo giống ngô lai. Chính vì vậy, cây 11
ngô đã được mô tả, thu thập và bảo tồn rất tốt ở các trung tâm đa dạng di truyền. Ngày nay, có khoảng 15 000 mẫu giống ngô được thu th ập từ các nước khác nhau trên thế giới (Ngô Hữư Tình và cs, 1997) [7]. Ở Vi ệt Nam, nguồn gen ngô được bảo tồn tại Viện nghiên cứu Ngô với khoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự do; 3 000 dòng tự phối và được trồng ở khắp các vùng miền trong cả nước. 1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và ưu thế lai Nguyên tắc cơ bản trong công tác tạo giống cây trồng là vi ệc xác đ ịnh và khai thác các kiểu ƯTL giữa các nguồn vật liệu nghiên c ứu (Hallauer và Miranda, 1988) [18]. Đối với ngô, thông tin về đa dạng di truy ền giữa các dòng sẽ giúp cho các nhà chọn tạo giống quyết định được k ế ho ạch lai tạo, cải tạo dòng và phân nhóm ƯTL. Công tác này mang tính quy ết đ ịnh chủ yếu để dẫn đến sự thành công trong bất cứ chương trình chọn tạo giống ngô lai nào. Chính vì thế mà các nhà ch ọn tạo gi ống ngô mong mu ốn mô tả được sự đa dạng di truyền của các nguồn vật liệu trong và giữa các nhóm ƯTL và mối quan hệ di truyền giữa chúng (Messmer và cs, 1992) [20]. Đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu có thể được đánh giá thông qua việc xác định khoảng cách di truyền giữa chúng và dựa trên cơ sở dữ liệu phả hệ, chỉ thị hình thái như kiểu nội nhũ, chỉ thị phân tử như: chỉ thị isozyme và gần đây là chỉ thị DNA. Các chỉ thị phân tử DNA có thể được chia làm hai nhóm chính sau: ch ỉ thị phân tử dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP dựa vào các băng DNA trên gel điện di có thể phát hiện các thể đồng h ợp tử hoặc d ị h ợp t ử (Becker và cs, 1995) [16] và chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như: RAPD, AFLP, SSR, STS…Trong nh ững năm g ần 12
đây, nhiều chỉ thị thuộc nhóm này đã thành công trong nghiên cứu đa dạng di truyền. * Chỉ thị RFLP (Restiction Fragment Lengh Polymorphism) Chỉ thị RFLP (đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn ) được sử dụng rộng rãi trong đánh giá tính đa dạng di truyền, nghiên cứu quá trình tiến hóa và phân loại các loài của nhiều nhóm th ực vật và trong l ập b ản đ ồ di truyền. Chỉ thị RFLP được sử dụng như là mẫu chuẩn để xác đ ịnh s ự có mặt hay thiếu vắng các đoạn nhiễm sắc thể nhất định. Khả năng theo dõi quá trình di truyền các đoạn nhiễm sắc thể cho phép sử dụng kĩ thuật RFLP trong chọn tạo giống cây trồng (Lê Trần Bình và cs, 1997). Khả năng phân biệt của chỉ thị RFLP đã được nghiên cứu rộng rãi ở ngô, như xác lập mối quan hệ với năng suất và UTL, đánh giá đa dạng di truyền. Chỉ thị này không những phát hiện được những cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử mà còn phân biệt được cá thể đồng hợp tử trội và đồng hợp tử lặn. Vì thế mà phương pháp này còn được gọi là chỉ thị đồng trội. Tuy nhiên, phương pháp này có quy trình thực hiện phức tạp, tốn kém, yêu cầu số lượng DNA lớn, chất lượng DNA cao, sử dụng chất phóng xạ gây nguy hiểm cho người. Do đó xu hướng sử dụng các chỉ thị phân t ử đ ơn gi ản h ơn trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR. * Chỉ thi RAPD (Random Amplified Polymorphic DAN) Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn DNA được nhân ngẫu nhiên. Kỹ thuật này đã được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như lập bản đồ di truyền liên kết, đánh dấu gen, xác đ ịnh giống cây trồng… Ở Việt Nam chỉ thị RAPD cũng đã được Ts.Bùi Mạnh Cường và cs (2000,2003) nghiên cứu và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống ngô lai. Kỹ thuật RAPD có ưu điểm là quy trình phân tích đơn giản, nhanh, rẻ tiền và cho phép tiến hành với số lượng mẫu lớn, an toàn với người th ực 13
hiện, tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là mức độ phát hiện sự đa hình thấp. * Chỉ thị AFLP (Amplified Length Polymorphism) Phương pháp này dựa trên nguyên tắc PCR, DNA nhân được cắt b ằng enzym giới hạn thành nhiều đoạn có kích th ước khác nhau, sau đó đ ược gắn với các đoạn nucleotide ngắn (adapter) vào hai đầu nhờ enzym ligase. Mồi của phản ứng được thiết kế trên trình tự của các đoạn adapter có g ắn thêm các đoạn từ một vài nucleotide. Kỹ thuật AFLP cho phép phát hi ện được đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân chọn lọc. Trên cây ngô chỉ thị AFLP được các nhà khoa học ứng dụng trong đánh giá mối quan hệ giữa đa hình phân tử với sự biểu hiện ở giống ngô lai (Ajmone-Marsan và cs,1998). * Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) SSR hay còn gọi là vi vệ tinh là sự lặp lại trình t ự đo ạn nucleotide đ ơn giản cực ngắn (chỉ từ 1-6 cặp base). Các SSR xuất hi ện ph ổ bi ến trong b ộ gen của sing vật nhân thực (Eukaryote). Tuy nhiên tùy từng loài mà s ố lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đợn vị lặp lại có thể biến động t ừ hai đ ến hàng trăm ngàn lần và nhiều hơn. Phương thức lặp lại cũng rất ph ức t ạp và đa d ạng, chủ yếu có ba dạng sau: (1) lặp lại hoàn toàn; (2) lặp lại không hoàn toàn; (3) lặp lại phức tạp. Kỹ thuật SSR cho phép chúng ta phát hiện được tính đa hình v ề đ ộ dài các trật tự nucleotide lặp lại đơn giản. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của PCR và phương pháp điện di trên gel polyacrylamide. Do sự khác nhau về số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại và số lần lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR khuếch đại sẽ được phân tách trong quá trình điện di. 14
Trên đối tượng là cây ngô, các nhà khoa học cũng đã sử dụng chỉ th ị SSR trong nhiều nghiên cứu khác nhau, Senior và Heun (1993) đã công bố, do sự biến đổi cao trong số đơn vị lặp lại nên chỉ thị SSR cung cấp m ức đ ộ đa hình cao ở ngô. Kết quả dự đoán của chỉ thị SSR nhanh, đáng tin c ậy và có khả năng lặp lại, chuẩn xác và có hiệu quả hơn phân tích RFLP. Phân tích SSR sử dụng gel agarose chất lượng cao rất hữu ích trong đánh giá đa dạng di truyền của các dòng tự phối ở ngô. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây việc nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử trên cây trồng được nhiều nhà khoa học đề cập, quan tâm nghiên cứu và đã thu được những kết quả khả quan như công trình nghiên c ứu c ủa tác giả Nguyễn Thị Liên và cs (2003) “Ứng dụng ch ỉ thị SSR trong ch ọn dòng lúa chịu hạn”. Một số tác giả đã có những công trình nghiên cứu đa dạng di truyền các nguồn vật liệu ngô bằng chỉ th ị SSR ph ục v ụ nghiên cứu về khả năng kết hợp và xác định cặp lai: Nguyễn Thị Phương Đoài (2004)[6] đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 30 dòng ngô có ngu ồn g ốc khác nhau. Kết quả xác định được khoảng cách di truy ền của các dòng ngô nghiên cứu biến động từ 0,47-0,86 và được phân thành 3 nhóm ưu thế lai. Phan Xuân Hào và cs (2004)[11] đã sử dụng 41 mồi SSR để phân tích đa dạng di truyền của 88 dòng ngô ( 51 dòng có nguồn gốc Vi ệt Nam, 1 dòng từ Mỹ và 36 dòng từ CIMMYT). Trong đó có 16 dòng QPM ( Quality Protein Maize), 6 dòng tham khảo từ AMBIONET. Kết quả xác định được sơ đồ phả hệ giữa các dòng nghên cứu, phân chia bộ dòng thành 2 nhóm lớn. Nghiên cứu cũng kết luận những dòng rút ra từ cùng m ột ngu ồn thì đứng gần nhau trong sơ đồ phả hệ, các dòng QPM đứng gần nhau trong nhóm thứ cấp. 15
Hiện nay sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai ở ngô đặc biệt là chỉ thị SSR đang được Viện Nghiên cứu Ngô tiếp tục nghiên cứu và phát triển. Với những ưu điểm vượt trội và lớn mạnh của ngành CNSH, việc áp dụng phương pháp này là c ần thi ết đ ể hỗ trợ phương pháp truyền thống trong công tác tạo giống ngô lai, góp phần nhanh chóng xác định được các tổ hợp ngô lai có ưu thế lai cao phục vụ sản xuất. 1.3.4. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truy ền và d ự đoán ưu th ế lai cây ngô ở Việt Nam Những năm trước đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu đa dạng di truyền của các dòng ngô thuần và dự đoán ƯTL chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái như chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, … Mai Xuân Triệu (1998) [4] đã sử dụng phương pháp phân tích nhóm của Mahalanobis để phân loại dòng thuần theo sự cách biệt về di truyền (phân loại dưới loài) của 24 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau của Viện nghiên cứu Ngô, Kết quả 24 dòng đã được phân thành 4 nhóm. Bùi Mạnh Cường và cs (2000) [1] đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD với 35 cặp mồi để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu th ế lai của 7 dòng ngô đường tại Viện nghiên cứu Ngô. Kết quả đã chia được 7 dòng ngô nghiên cứu thành 2 nhóm cách biệt di truyền. Ngô Thị Minh Tâm, Bùi Mạnh Cường (2007) [10] đã sử dụng 36 mồi SSR để phân tích đa hình của 8 dòng ngô có ngu ồn gốc khác nhau trong t ập đoàn nguyên liệu của Viện nghiên cứu Ngô. Kết quả khảo sát đánh giá các tổ hợp lai trên đồng ruộng và chỉ ra mối tương quan thuận gi ữa kho ảng cách di truyền với năng suất của con lai F1 ở 8 dòng ngô nghiên cứu… 16
Gần đây, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa d ạng di truyền và dự đoán ưu thế lai ở các đối tượng cây trồng nói chung và ở cây ngô nói riêng đang ngày càng phát triển. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu Gồm 20 dòng ngô thuần của Bộ môn Công nghệ sinh học - Vi ện nghiên cứu Ngô – Đan Phượng – Hà Nội Bảng 2.1: Danh sách các dòng ngô nghiên cứu TT Tên Nguồn gốc TT Tên Nguồn gốc 1 C1 Cargi U777 11 C200 CP888 2 C24 Syngenta 70224 12 C208 C919 x AC24 3 C40 Dekalbgold 13 C329 C919 x AC24 4 C43 Dekalbgold 14 C369 C919 x AC24 5 C45 NK67 15 C222 C919 6 C84 NK67 16 C236 LVN10 7 C115 MB69 17 C245 LVN61 8 C128 LVN99 18 C275 HQ2000 9 C133 CP999 19 C477 NK4300/06A 10 C143 CP999 20 C738 Pacific747 • Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: - Thiết bị thí nghiệm: 17
Máy PCR 9700, máy quang phổ kế Ultrospec, máy chạy điện di gel agarose và polyacrylamide, máy khuấy từ gia nhiệt, máy li tâm, máy đo pH, máy soi chụp gel, tủ lạnh sâu (-80 độ C), tủ lạnh, tủ đông, lò vi sóng, …và các trang thiết bị khác sử dụng trong nghiên cứu. Dụng cụ thí nghiệm: pipet, ống eppendof, đầu côn các loại, lược gel, ống bơm gel, …. - Hóa chất tách chiết DNA: Bao gồm các loại hóa chất như EDTA,CTAB, chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, Amino acetic. Đệm tách chiết DNA của mẫu lá: CTAB 2%( Tris-HCl 10mM, pH 8,0, EDTA 10mM, NaCl 100mM, beta-Mercatoethanol 0,5%,), TE( 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0 ) - Hóa chất chạy phản ứng PCR: + Đệm PCR 1X( 10mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 5mM KCl) hoặc đệm PCR 1X của Quiagen. + MgCl2 của Fementas, Invitrogen. + dNTPs của Fementas, Invitrogen. + Mồi: hệ thống mồi SSR dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi AMBIONET (bảng 2.2). + Marker 1kb + 2Tap polymerase của Fementas + H2O cất vô trùng - Hóa chất chạy điện di và nhuộm gel: TEB 1X, TEB 5X, TEMED, APS 10%, Acrylamide 4,5%, formandehyde 36%, Bind silane, Sigma code, Na2S2O3.5H2O … - Chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đề tài: là h ệ th ống gồm 20 mồi SSR 18
Bảng 2.2: Danh sách 20 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu TT Tên mồi Kiểu lặp lại Vị trí gắn mồi trên NST 1 Phi308707 AGG 1,10 2 Phi448880 AAG 9,05 3 Phi109188 AAAG 5,0 4 Phi84 GAA 10,04 5 Phi109275 AGCT 1,00 6 Phi227562 ACC 1,12 7 Phi83 AGCT 2,04 8 Phi32 AAAG 9,04 9 Phi102228 AAGC 3,04-3,05 10 Phi374118 ACC 3,02 *** 11 Phi029 AG/AGCG 3,04 12 Phi72 AAG 4,00 13 Phi108411 AGCT 9,06 14 Phi109642 ACGG 2,0 15 nc133 GTGTC 2,05 16 Phi06 ACG 4,11 17 Phi1304 (TCGA)4 8,02 18 Umc1143 AAAAT 6,0 19 Phi87 ACC 5,06 20 Phi423796 AGATG 6,01 2.1.2. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA của tổ hợp lai ưu tú 20 dòng ngô thuần Việt Nam trong phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Ngô. - Kiểm tra đánh giá độ thuần của các dòng ngô nghiên cứu ở m ức độ phân tử. - Dùng chỉ thị phân tử SSR đánh giá khoảng cách di truyền, và xây dựng sơ đồ phả hệ của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên c ứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội. 19
- Xác định mức độ đa hình, phân nhóm ưu thế lai và dự đoán các tổ hợp lai ưu tú của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền trong phòng thí nghiệm Tách DNA tổng số Mỗi dòng lấy 10 cây đại diện, lấy lá non lúc cây được 3 – 4 lá. Quy trình tách triết theo phương pháp Saghai Maroof và cs (1984) [15]. Các bước tiến hành: - Nghiền lá tươi thành thể nhuyễn, bổ sung 2-3ml đệm chiết CTAB, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml, đảo đều mẫu nhẹ nhàng. - Ủ mẫu ở 65°C trong thời gian 45-60 phút, sau đó để nguội ở nhệt độ phòng, đem ly tâm 13,000 vòng/phút trong 1 phút. - Chiết DNA 2 lần với Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều, ly tâm ở 13,000 vòng/phút mỗi lần trong 5 phút. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống eppendorf sang một ống mới. - Kết tủa DNA với 600µl Isopropanol và 100µl Ammonium acetate, đảo đều ở -20°C trong 30 phút, ly tâm thu tủa ở 13,000 vòng/phút trong th ời gian 10 phút. - Rửa tủa DNA trong 1ml dung dịch rửa, ly tâm trong 5 phút. - Làm khô DNA sau đó hòa tan DNA trong 100µl dung dịch TE và b ảo quản ở 20°C. • Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số Độ tinh sạch và nồng độ của DNA tổng số được đo bằng máy đo quang phổ ( Ultrospec UV/Visible-65 spectrophotomrter) Nồng độ DNA được tính theo công thức: Nồng độ DNA (µg/µl) =( OD260 x 50 x 50 µg/ml)/1000 20