Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI part 3

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

84
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút. Thấy DNA kết tủa lơ lửng thành dạng sợi mảnh . Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên.Thu lấy kết tủa chính là DNA. Làm khô DNA bằng cách phơi DNA trong 2h ở nhiệt độ phòng và cho vào TE.1X làm hòa tan DNA, trữ mẫu ở -40C hoặc -200C. Điện di và đọc kết quả. 3.4.5 Quy trình Khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beaveria Bassiana vuille 3.4.5.1 Nấm Metarrhizium anisopliae Đoạn DNA...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI part 3

23 Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút. Thấy DNA kết tủa lơ lửng thành dạng sợi mảnh . Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên.Thu lấy kết tủa chính là DNA. Làm khô DNA bằng cách phơi DNA trong 2h ở nhiệt độ phòng và cho vào TE.1X làm hòa tan DNA, trữ mẫu ở -40C hoặc -200C. Điện di và đọc kết quả. 3.4.5 Quy trình Khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beaveria Bassiana vuille 3.4.5.1 Nấm Metarrhizium anisopliae Đoạn DNA đƣợc khuếch đại theo phƣơng pháp PCR với cặp primer có trình tự cụ thể nhƣ sau: - METPR1: 5’CAC TCT TCT CCC AGC CGT TC 3’ - METPR4 : 5’GTA GCT CAA CTT CCG CAC TC 3’ (Nguồn : Leger St., 1992) Bảng 3.1 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Metarrhizium Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl) 2.5µl - PCR buffer 1X 1.5mM 0.75µl - MgCl2 - dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5µl 50ng 1.5µl - METPR1 - METPR4 50ng 1.5µl - Tag DNA polymerase 0.04UI 0.5µl - DNA khuôn 125ng 1µl - Nƣớc cất 2 lần vô trùng vừa đủ 25 l
24 Bảng 3.2 Quy trình nhiệt khuếch đại gen Pr1 trên nấm Metarrhizium Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian 940C - Tách đoạn DNA 5 phút - Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) 940C - Tách đoạn DNA 1 phút 570C - Ủ bắt cặp 1 phút 720C - Kéo dài 2 phút 720C - Kéo dài 6 phút 40C -Ủ 6 phút 3.4.5.2 Nấm Baeuveria Bassiana vuille Đọan DNA đƣợc khuếch đại có trình tự primer cụ thể nhƣ sau : Primer Trình tự (5’-3’) ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG Bảng 3.3 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Beauveria Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl) - PCR buffer 1X 2.5µl 1.5mM 0.75µl - MgCl2 200mM mỗi dNTP 0.5µl - dNTP - ITS 4 50ng 1µl - ITS 5 50ng 1µl 1UI 0.25µl - Tag DNA polymerase - DNA khuôn 100ng 1µl - Nƣớc cất 2 lần vô trùng vừa đủ 25 l
25 Bảng 3.4 Quy trình nhiệt khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 trên nấm Beauveria Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian 940C - Tách đoạn DNA 3 phút - Số chu kỳ lặp lại (30 chu kỳ) 940C - Tách đoạn DNA 1 phút 560C - Ủ bắt cặp 30giây 720C - Kéo dài 4 phút 720C - Kéo dài 7 phút 40C -Ủ 10 phút 3.4.6 Điện di và đọc kết quả trên gel Agarose 3.4.6.1 Điện di trên gel Agarose - Cho 0.125 gram agarose vào 12.5ml dung dịch 0.5X TAE. - Đun sôi hỗn hợp trên khoảng 2 phút trong lò viba. - Để nguội ở nhiệt độ phòng. - Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí trên gel. - Để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, cẩn thận rút lƣợc ra khỏi gel, cho dung dịch 0.5X TAE vào bể điện di sao cho bảo đảm ngập gel. - Trộn 5 l sản phẩm PCR với 2 l loading dye 6X trên mặt giấy paraffin. Cho hỗn hợp vào các giếng của gel: gồm có giếng than chuẩn, giếng đối chứng và các giếng chứa các mẫu cần xác định kiểu gen, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100V và 250mA.. 3.4.6.2 Đọc kết quả điện di - Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút.
26 - Rửa lại bằng nƣớc nhiều lần và đặt vào máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm quantity one 2000). - Ethidium bromide liên kết với DNA sẽ phát sáng dƣới tia UV, kết quả sẽ xuất hiện những băng sáng trên gel. - Xác định kết quả dự kiến: đối với cặp primer METPR1/METPR4 thì trên màn hình xuất hiện băng có kích thƣớc 1,5kb. 3.4.7 Tiến hành giải trình tự gen gây độc Pr1 trên nấm Metarrhizium anisopliae và ITS1 – 5.8s – ITS2 trên nấm Beaveria Bassiana vuille Sau khi chạy PCR chúng tôi tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vừa khuếch đại để xác định chính xác đây là đoạn gen gây độc Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 nhằm xác định trình tự nucleotide của đoạn gen độc này, từ đó so sánh với ngân hàng gen thế giới. Đầu tiên để đạt đƣợc kết quả cao nên phải tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR để việc đọc trình tự đạt kết quả cao. 3.4.7.1 Tinh sạch sản phẩm PCR 1.Lấy GFX cho vào ống thu dịch lọc đã khử trùng sạch (số lƣợng GFX tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch).Cho vào GFX 500µl capture buffer. 2.Cho 100 µl sản phẩm PCR vào GFX. 3.Trộn đều lên xuống bằng pipette khoảng 4-6 lần. 4.Ly tâm với tốc độ khoảng 12000 vòng trong 30 giây ở 40C. 5.Loại bỏ dung dịch trong ống thu dịch lọc, sau đó đặt lại GFX vào ống thu dịch lọc. 6.Thêm 500µl wash buffer vào cột GFX. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng khoảng 30 giây ở 40C. 7.Loại bỏ ống thu dịch lọc và chuyển GFX sang effpendorf mới. 8.Thêm 50µl elution buffer trực tiếp vào giữa cột GFX. 9.Giữ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. 10.Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút ở 40C. Sản phẩm tinh sạch đƣợc bảo quản ở- 40C
27 3.4.7.2 Thành phần của phản ứng đọc trình tự Buffer đƣợc sử dụng ở nồng độ 5X nhƣng nồng độ cuối cùng phải đạt là 1X Bảng 3.5 Thành phần phản ứng đọc trình tự Thành phần Nồng độ Thể tích(µl) 4µl - BDT mix 2,5 X 2µl - Buffer 5X 1µl - Primer 3.2 pmol - DNA khuôn 10-40 ng 1µl - Nƣớc cho đến 10 µl * Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự * Nấm Metarrhizium anisopliae 1. Đặt tube vào máy PCR và chỉnh đến thể tích chính xác. 2. Biến tính hoàn toàn: 960C trong 1 phút. 960C trong 10 giây. 3. Lặp lại 25 chu kỳ: 500C trong 5 giây. 600C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. * Nấm Beaveria Bassiana vuille 1. Đặt tube vào máy và chỉnh đúng các thông số. 2. Biến tính hoàn toàn: 950C trong 5 phút. 950C trong 30 giây. 3 .lặp lại 25 chu kỳ: 500C trong 10 giây. 600C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. 3.4.8 Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự Sản phẩm đọc trình tự đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp EDTA . Cho 5µl EDTA vào mỗi eppendorf. - Thêm vào 60µl ethanol 100% mỗi eppendorf. -
28 Trộn đều lên xuống hỗn hợp vài lần. - Đem ủ mẩu ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút. - Ly tâm tốc độ 12000 vòng trong 30 phút. - Loại bỏ phần dịch bên trên, thêm vào 60µl ethanol 70%. - Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C. - Lọai bỏ dịch, thu DNA, làm khô ở nhiệt độ phòng. - Làm tan DNA bằng cách cho vào 2µl hidiformamide, biến tính 950C - trong 3 phút. 3.4.9 chạy điện di và ghi nhận tính hiệu trên máy sequencer ABI PRISM 3100 sản phẩm sau tinh sạch, tiến hành điện di và đọc kết quả trên máy Sequencer. 3.4.10 Phân tích RFLP *Quy trình chung phản ứng cắt Ủ khoảng 1 g DNA đã đƣợc khuếch đại với 1U enzyme cắt dƣới những - điều kiện nhà sản xuất (Roche) hƣớng dẫn. Thành phần của phản ứng xem bảng 3.6. - Những đoạn DNA đã cắt đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose 2%, sau đó gel đƣợc nhuộm ethidium brommide. Đọc kết quả và chụp hình dƣới tia UV. Bảng 3.6 Thành phần phản ứng enzyme cắt Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Thể tích SuRE/cut Buffer 10X 2,5 l 100 – 150 ng DNA 6 – 10 l Restriction enzyme 10 UI 0,1 l Nƣớc cất vô trùng Vừa đủ thể tích 25 l
29 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.kết quả phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm đã thu thập đƣợc từ các tỉnh thành trong nƣớc *Kết quả phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA chúng tôi đã phục hồi đƣợc một số dòng nấm dùng trong thí nghiệm sau thời gian khỏang 7-10 ngày nuôi cấy, nấm phát triển tốt, quan sát bào tử nấm trên kính hiển vi, xác định chính xác đây là hai nguồn nấm thu thập ban đầu Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana , không bị tạp nhiễm vi khuẩn hay các lọai nấm khác. Bao gồm các dòng sau: BDQ96, BDTN4, SCLLLA1, RNBT1.7, BXĐTG6, DÒNG3-1, RMTĐ3, BHBD6, NNPT7, SR, BRVT6, PULQ2 . * Kết quả nhân sinh khối sợi nấm trên môi trƣờng CZA. Thu đƣợc sinh khối của 12 dòng nấm gồm: 6 dòng nấm Metarrhizium anisopliae và 6 dòng nấm Beauveria bassiana. B B A Hình 4.1 Nấm Metarrhizium anisopliae(A) Nấm Beauveria bassiana (B)
30 4.2 Kết quả ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana Sau thu sinh khối chúng tôi tiến hành ly trích các dòng nấm, đây là một quá trình đơn giản nhƣng có ý nghĩa quyết định đến chất lƣợng sản phẩm DNA thu đƣợc trong những bƣớc tiếp theo, phải thao tác nhẹ nhàng và chính xác theo qui trình chung nhằm tránh sự đứt gãy DNA, nhiễm tạp….Qua điện di cho thấy mẫu ly trích có lƣợng DNA thu đƣợc chƣa nhiều, còn lẫn tạp và gãy DNA do quá trình thao tác chƣa tốt . Sản phẩm DNA ly trích đƣợc điện di trên gel thƣờng có nồng độ gel1 %, hiệu điện thế 50 v, 250 mA, trong khỏang thời gian 50 phút 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DNA tổng số Tạp nhiễm Hình 4.2 Kết quả ly trích DNA tổng số của nấm Metarrhizium và Beauveria Ghi chú:1.RMTĐ3 7.SCLLLA1 2.BHBD6 8.DONG 3-1 3.NNRT7 9.BDQ96 4.SR 10.BDTN4 11.BXĐTG6 5.PULQ2 6.BRVT6 12.RNBT1.7 Qua hình 4.6 ta thấy rằng: lƣợng DNA thu đƣợc trong quá tr ình ly trích chƣa đồng đều, ở các mẫu 1.RMTĐ3, 2.BHBD6, 3.NNPT7, 4.SR, 5.PULQ2, 6.BRVT67.SCLLLA1, 8.DONG 3-1, 9.BDQ96 thu đƣợc lƣợng DNA nhiều , thể hiện qua ảnh kích thƣớt band đậm và rõ so với 3 mẫu còn lại là 10.BDTN4,11.BXĐTG6, 12.RNBT1.7. Phần cuối giếng còn nhiều tạp nên phát sáng nhiều, điều đó gây khó khăn nhiều cho quá trình tinh sạch ở bƣớc tiếp theo
31 4.3. Kết quả tinh sạch DNA tổng số của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana. Tiến hành tinh sạch sản phẩm DNA vừa ly trích bằng RNAse, nhằm lọai bỏ tạp nhiễm và giúp sản phẩm sau khuếch đại đƣợc tốt hơn. Quan sát hình 4.3 ta thấy sau khi tinh sạch tuy lƣợng DNA có giảm so với lúc chƣa tinh sạch nhƣng nhìn chung các mẫu tƣơng đối sạch, ít tạp và hầu nhƣ không còn sản phẩm đứt gãy. Điều này giúp cho quá trình khuếch đại sản phẩm DNA bằng kỹ thuật PCR diễn ra thuận lợi hơn Kiểm tra sản phẩm tinh sạch thƣờng sử dụng gel có nồng độ 1 %, hiệu địên thế ở 50 v, 250 mA, thời gian điện di 50 phút . DNA toång soá 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tạp nhiễm Hình 4.3 Hình ảnh DNA tổng số của nấm Beauveria và Metarrhizium sau khi xử lý RNAse Ghi chú:1.RMTĐ3 7.SCLLLA1 2.BHBD6 8.DONG 3-1 3.NNRT7 9.BDQ96 4.SR 10.BDTN4 11.BXĐTG6 5.PULQ2 6.BRVT6 12.RNBT1.7 Sau tinh sạch ta thấy rằng các mẫu 1.RMTĐ3, 2.BHBD6, 4.SR, 5.PULQ2, 9.BDQ9 lƣợng DNA còn nhiều, khi tiến hành phản ứng PCR với những mẫu này cần phải pha lõang nồng độ DNA trong nƣớc cất 2 lần khỏang từ 7-10 lần. Riêng những mẫu còn lại gồm 3.NNPT7, 6.BRVT6, 7.SCLLLA1, 8.DONG3-1, 10.BDTN4 11.BXĐTG6, 12.RNBT1.7 do nồng độ DNA trong mẫu còn ít hơn nên có thể pha lõang từ 1-3 lần hoặc không pha lõang. Vd:đối với mẫu 6.BRVT6.
32 4.4. Kết quả phản ứng PCR Thực hiện PCR trên 12 dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana, tuy nhiên kết quả khuếch đại sản phẩm DNA chỉ thu đƣợc 6 dòng nấm Beauveria bassiana khi sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5. qua hình 4.4 chúng tôi đã khuếch đại đƣợc vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 gây độc cao, mặc dù đƣợc phân lập từ nhiều ký chủ và địa phƣơng khác nhau nhƣng vẫn cho kích thƣớt các band trên gel nhƣ nhau. Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ kéo dài, sự cân đối giữa các thành phần của phản ứng PCR. Phản ứng PCR xảy ra tốt trong điều kiện DNA ly trích phải đúng, phải đảm bảo DNA có nồng độ và độ tinh sạch nhất định. Đối với nấm Beauveria bassiana nồng độ DNA phù hợp là 100ng Nồng độ DNA cao hay thấp phụ thuộc vào việc p ha loãng DNA trong dung dịch đệm (TE 1X) hay nƣớc vô trùng Riêng 6 dòng nấm Metarrhizium anisopliae khi sử dụng cặp mồi METPR1 và METPR4 không thực hiện đƣợc phản ứng PCR do một số yếu tố chủ quan nhƣ đã nêu trên. PCR là một phản ứng có độ nhạy cao, nếu quá trình thao tác không đảm bảo điệu kiện vô trùng tƣơng đối thì khó tránh tạp nhiễm dẫn đến kết quả sai lệch hoặc có khi không thu đƣợc kết quả mong muốn. Ngoài ra còn có thể do quy trình chƣa phù hợp, nhiệt độ bắt cặp chƣa tƣơng thích, có sự sai khác đáng kể vùng liên kết trên gen, dẫn đến primer không bắt cặp, nên không khuếch đại đƣợc. Một khả năng nữa không thể thiếu là chính những dòng nấm Metarrhizium đó có độc tính yếu hoặc không có sự hiện diện của gen Pr1 do bị mất đi một đoạn chromosome (Wang C., Skrobek A. and Butt T.M., 2003)…Vì thế phản ứng khuếch đại DNA trên các dòng nấm Metarrhizium anisopliae vẫn chƣa có thể thực hiện đƣợc. Ở hình 4.4 ta thấy rằng, 2 mẫu đầu gồm: 1.RMTĐ3 và 2.BHBD6 tạo band phát sáng đậm là do nồng độ DNA có trong 2 mẫu trên cao hơn so với 4 mẫu còn lại, nên khi khuếch đại sẽ tạo sản phẩm có kích thƣớc band dày. Sản phẩm khuếch đại đƣợc điện di trong 60 phút , 250 mA, 50 V, nồng độ gel là 1 %.
33 1 2 3 4 5 6 7 1 kb 580 bp Hình 4.4 sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0.5 pmol/µl Ghi chú :1. RMTĐ3 2.SR 3.BHBD6 4.BRVT6 5.PULQ2 6.NNPT7 7.LADDER 4.5. Kết quả phân tích RFLP trên các dòng nấm Beauveria bassiana vuille Khi thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn cho 6 dòng nấm Beauveria Bassiana. kết quả cho thấy chƣa thấy rõ sự đa dạng về di truyền giữa các dòng nấm, nguyên nhân là do không có khả năng khảo sát trên nhiều enzyme cắt khác nhau, mà chỉ thực hiện đƣợc phản ứng cắt trên 2 enzyme đặc trƣng Hae III và Alu I. Vì thế nên chƣa thấy rõ đƣợc sự đa hình trên các band địên di, chỉ cho 2 band có kích thƣớc nhƣ nhau trên cả 6 dòng phân tích. Tuy nhiên tổng kích thƣớc band trên mỗi mẫu đều tƣơng đƣơng với kích thƣớc của ladder 580 bp Với enzyme HaeIII khi cắt trên 6 dòng nấm Beauveria bassiana gồm 1.RMTĐ3, 2.SR, 3.BHBD6, 4.BRVT6, 5.PULQ2, 6.NNPT7, qua hình 4.5 cho thấy enzyme cắt đƣợc hết sản phẩm PCR trên cả 6 mẫu nấm, tạo thành 2 band có kích thƣớc tƣơng đƣơng trên ladder 1.5 kb là 200 bp và 380 bp. Nồng độ DNA là 100ng (sử dụng 6µl).
34 với enzyme Alu I cũng thực hiện phản ứng cắt trên 6 dòng Beauveria bassiana nhƣ với enzyme Hae III. Qua hình 4.9 cho thấy enzyme Alu I cũngcắt đƣợc hết lƣợng sản phẩm PCR của các mẫu nấm ban đầu, và tạo thành 2 band có kích thƣớc tƣơng ứng trên ladder là 250 bp và 330 bp. Do quá trình bơm mẫu vào giếng và giai đọan trộn mẫu thao tác chuẩn nên kích thƣớc các band chƣa đề. Tuy nhiên với kích thƣớc band tạo ra tƣơng ứng 580 bp trên mỗi enzyme cho thấy mẫu cắt chính là nấm Beauveria bassiana, và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 Chính là vùng mà enzyme Hae III và Alu I đã cắt đƣợc. 123 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ladder 1.5 kb Alu I Hae III Hình 4.5 Sản phẩm cắt trên 2 enzyme Hae III và Alu I Ghi chú: 1.RMTĐ3 2.SR 3.BHBD6 4.BRVT6 5. PULQ2 6. NNPT7 7. LADDER 8. RMTĐ3 9. SR 10. BHBD6 11. BRVT6 12. PULQ2 13. NNPT7 Mẫu enzyme cắt đƣợc điện di ở 50 V, 250 mA, trong thời gian 60 phút.
35 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Đã phục hồi đƣợc 12 nguồn nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana trên các côn trùng khác nhau: bọ xít đen, bọ dừa, sâu cuốn lá lúa, rầy nâu ở các tỉnh Tiền Giang, Tây Ninh, Long An, Bến Tre, Quận 9 – Thành phố Hồ Chí Minh, Quận 2 – thành phố Hồ Chí Minh. - Sử dụng kỹ thuật PCR đã cho phép phát hiện vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 ở nấm Beauveria với cặp mồi ITS4 và ITS5, các thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt cụ thể đã đƣợc hoàn thiện. 5.2. Đề nghị - Tiếp tục thu thập, phục hồi và phân tích sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae với số lƣợng mẫu lớn hơn từ nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc nhằm làm phong phú thêm bộ giống các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ tự nhiên ở Việt Nam. Tạo điều kiện phục vụ dắc lực cho Nông nghiệp nói chung và công tác bảo vệ thực vật nói riêng . - Trong phân tích RFLP, sản phẩm cắt chƣa cho thấy rõ sự đa hình giữa các dòng nấm với nhau. Nếu có điều kiện cần tiếp tục hoàn thiện và đọc trình tự trên nhiều đối tƣợng khác nhau , từ đó so sánh với ngân hàng gen trên thế giới để biết sự khác biệt và có hƣớng nghiên cứu phù hợp .
36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. Trang 195 – 231. 2. Tạ Kim Chỉnh, 1996. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi nấm diệt côn gây hại ở Việt Nam và khả năng ứng dụng. Luận án PTS. Viện Công Nghệ Sinh Học – Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia, Hà Nội. 3. Nguyễn Lân Dũng, 1981. Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 197 – 206. 5. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000. Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Trang 140 – 145. 6. Trần Quang Hùng, 1999. Thuốc bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 150 – 155. 7. Nguyễn Thị Thƣ Hƣơng, 2004. Xác định gen gây độc của nấm Metarrhizium ký sinh trên sâu hại cây trồng bằng kỹ thuật PCR. Luận án thạc sĩ. Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Trang 7 –30. 8. Võ Thị Thƣơng Lan. Sinh học phân tử. Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Trang 159 – 161. 9. Lê Đình Lƣơng, 2001. Nguyên lý kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 10. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật có ích tập II. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. Trang 49 – 90. 11. Tống Kim Thuần, 2001. Vi sinh vật diệt sâu hại đậu tương và triển vọng sử dụng chúng ở Đồng Bằng Sông Hồng. Tạp chí sinh học 9/2001, 23(3): 22 – 28. 12. Phạm Thị Thùy, Ngƣyễn Văn Thiêm, Võ Hiền, 2000. Kết quả khảo nghiệm chế phẩm nấm Metarrhizium anisopliae để phòng trừ bọ hại dừa.
37 13. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. Trang 19 – 44. 14. Nguyễn Văn Tuất, Lê Văn Thuyết, 2000. Sản suất chế biến và sử thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc và sinh học. Viện Bảo Vệ Thực Vật. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 15. Nguyễn Ngọc Tú-Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản Nông nghiệp. TP.Hồ Chí Minh. 158 trang. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 16. Bidochka M.J., McDonald M.A., St Leger R.J., and Roberts D.W., 1994. Differentiation of species and strain of entomopathogenic fungi by Random Amplifiction of Polymorphic DNA (RAPD). Current Genetics 25: 107 – 113. 17. Charnley A.K., Xia Y., Gao M., and Clarkson J.M.,2002. Molecular cloning, characterisation, and expression of a neutral trehalase frpm the insect pathogenic fungus Metarrhizium anisopliae. Journal of invertebrate pathology 80: 127 –137. 18. Charnley A.K., and El – Sayed, 1989. A technique for accelerating and synchronising germination of conidia of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae. Archives of Microbiology 142: 204 – 206. 19. Destéfano R.H.R., Destéfano S.A.L., and Messias C.L., 2004. Detection of Metarrhizium anisopliae var anisopliae within infected sugarcane borer Diatraea saccharalis (Lepidoptera, Pyralidae) using specific primers. Genetics and Molecular Biology, 27, 2: 245 – 252. 20. Fegan M., Manners J.M., Maclean D.J., Irwin J.A., Samuels K.D., and Holdom D.P., 1993. Random amplified polymorphic DNA markers reveal a high degree of genetic diversity in the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisoliae var anisopliae. Gene Microbiol 139 (Pt9): 2075 – 2081. 21. Hegedus D.D., and Khachatourians G.G., 1993. Construction of cloned DNA probes for the specific detection of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana in grasshoppers. Journal of Invertebrate Pathology 62: 233 –240. 22. Joshi L., Leger R.J.St., and Roberts D.W., 1997. Isolation of a cDNA encoding a novel subtilisin – like protease (Pr1B) from the
38 enthomopathogenic fungus, Metarrhizium anisopliae using differential display RT-PCR. Gene 197: 1 – 8. 23. Leal S.C.M., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1994. Characterization of isolates of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae by RAPD – PCR. Mycological Research 98: 1077 – 1081. 24. Leger R.S.T., Roberts D.W., and Staples R.C., 1999. Molecular cloning of a comlimentary DNA sequence encoding a cuticle degrading protease produced by entomopathogenic fungi. Boyce Thompson Institute for Plant Research, Inc, Ithaca, NY. 25. Maria C.V., and Peberdy J.F., 1997. Location of chitinolytic enzymes in protoplasts and whole cells of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae. Mycological Research 101 (11): 1393 – 1396. 26. Nam Jin – Sik, Lee D.H., Lee K.H., Park H.M., and Bae K.S., 1998. Cloning and phylogenetic analysis of chitin synthase genes from the insect pathogenic fungus, Metarrhizium anisopliae var anisopliae. FEMS Microbiology letters 159: 77 – 84. 27. Raymond J., St Leger R.J., Lokesh Joshi, Michael J., and Bidochka, 1995. Protein synthesis in Metarrhizium anisopliae growing on host cuticle. Mycological Research 99: 1034 – 1040. 28. Soraya C.M.L., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1997. Amplification and restriction endonuclease digestion of the Pr1 gene for the detection and characterization of Metarrhizium strains. Mycological research 101 (3): 257 – 265. 29. St Leger R.J., May B., Allee L.L., Frank D.C., Staples R.C., and Roberts D.W., 1992. Genetic differences in allozymes and information of infection structures among isolates of the entomopathogenic fugus Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertabrate Pathology 60: 98 – 101. 30. Wang C., Skoroberk A., and Butt T.M., 2003. Concurrence of losing a chromosome and the ability to produce destruxin in a mutant of Metarrhizium anisopliae. FEMS Microbiology lettres 226: 373 – 378. 31. Bidochka, M .J.&Khachatorians, G. G (1993). Regulation of extracellular N-acetyl-D-glucosidase production in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana vuille . Canadian Journal of Microbiology 39,6-12 32. Riba, G, Bouvier-Fuorcade, I.,and caudal, A. (1986) Isoenzyme polymorphisms in Metarrhizium anisopliae (Deute-romycotina, Hyphomycetes) entomogenous fungi . Mycopa-thologia 96,161-169
39 33. File://D:\Beauveria- thang7\Selection%20of%20Beauveria%20bassiana%20and%20Metarh... 8/17/2004 34. Kosir, J . M., MacPherson, J.M. &Khachatuorians, G. G.(1991). Genomic analysis of c Virulent and a less virulent strain of the enthomopathogenic fungus Beauveria bassiana , using restriction fragment length polymorphism . Canadian Journal of Microbiology 37,534-541 35. Mugnai, L,. Bridge . P.D & Evans, H.C. (1989). A chemotaxonomic evaluation of genus Beauveria . Mycological Research 92,199-209 36. poprawski, T. J., Riba, G., Jones, W. A. & Aioun , A. (1988) . Variation in isoesterase profiles of geographic population of Beauveria bassiana (Dueteromycotina: Hypomycetes ) isolates from Sitona weevils (Coleoptera:curculiondae). Environmental Entomology 17 , 275-279