Luận văn: TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM

Chia sẻ: Carol123 Carol123 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

111
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Lúa gạo là nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu trên thế giới, đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lƣợng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein, các chất khoáng và chất xơ cho con ngƣời. Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lƣợng đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62]. Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ở ĐBSCL. Khi đánh giá về những thành tựu đạt đƣợc trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt Nam, các nhà kinh tế...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn: TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------- Nguyễn Ngọc Sơn TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -----  ----- NGUYỄN NGỌC SƠN TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học (IBT) Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả Nguyễn Ngọc Sơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Trung Nam (Viện Công nghệ Sinh học) đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, KS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Như Cường (Viện Bảo vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học của virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, các biện pháp quản lý tổng hợp cây trồng (ICM) trong sản xuất lúa” đã cung cấp mẫu bệnh và cộng tác trong quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, các thày cô giáo, và cán bộ trong Khoa đã truyền đạt kiến thức cũng như tạo điều kiện cho tôi được thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ 2 MỤC LỤC.............................................................................................................. 3 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. 5 DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... 7 MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 9 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 11 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .. 11 1.1.1. Thế giới ............................................................................................... 11 1.1.2. Việt Nam ............................................................................................. 12 1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL ...................................... 13 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA ..... 14 1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) ............................................................... 14 1.3.2. Các loại virut khác ............................................................................. 16 1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV) ....................................................... 16 1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) ..................................................... 17 1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) ................................................ 18 1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL .............................................................................. 19 1.4.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................ 19 1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại ............................................ 19 1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL ................................................................. 20 1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT .......................................................................... 21 1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử ................................. 21 1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR .............................................................................. 22 1.6.3. Kỹ thuật PCR ..................................................................................... 23 1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli ................................................ 24 1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen ...................................................................... 24 1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) ...................... 25 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26 2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 26 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM .......................................................... 27 2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4 2.2.2. Thiết bị ................................................................................................ 27 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 27 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27 2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm ........................................................................... 27 2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu ......................................................................... 28 2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa ............................................ 28 2.3.4. Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 29 2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) ................. 29 2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt................................................................................. 30 2.3.7. Colony-PCR........................................................................................ 31 2.3.8. Tách chiết plasmit .............................................................................. 32 2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn............................................................. 32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 34 3.1. THIẾT KẾ MỒI.......................................................................................... 34 3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ................... 34 3.2.1. RT-PCR .............................................................................................. 34 3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ............. 37 3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR .................................. 37 3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen ............................... 39 3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ..................................................................................... 40 3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK . 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 46 CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ ................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
5 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên cDNA mã ngƣợc từ RNA thông tin) Cộng sự CS Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng CLRRI bằng sông Cửu Long), http://www.clrri.org Coat protein/Nucleocapsid Protein (Protein vỏ) CP/NCP Đ/c Đối chứng ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long DEPC Diethyl pyroCarbonate DNA Deoxyribonucleic acid Description of Plant Viruses (Miêu tả các virus thực vật), DPV http://www.dpvweb.net EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên ELISA kết với enzym) g gram International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế về ICTV phân loại virus). ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Ngân hàng dữ liệu về virus của ICTV), http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk Isopropylthio-β-D-galactoside IPTG International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế), IRRI http://www.irri.org Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6 Kb Kilobase LB Luria và Bertani Nồng độ mol/lit M ml mililitre mm milimeter National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia NCBI về thông tin Công nghệ Sinh học), http://www.ncbi.nlm.nih.gov ng Nanogram nm Nanometer Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PCR PEG Polyethylene glycon RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân bản RNA và tạo ra RdRp phân tử RNA) RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lá lúa) RRSV RSV Rice stripe virus Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên RT- PCR mã ngƣợc) Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng) RTBV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu) RTSV RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa) Tris - Acetate – EDTA TAE Taq Thermus aquaticus v/p vòng/phút viral complementary RNA (đoạn RNA bổ sung của virus) vcRNA Vàng lùn, lùn xoắn lá VL&LXL viral RNA (đoạn RNA của virus) vRNA 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase X-gal Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
7 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV… 34 Bảng 3.2. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự đã thu đƣợc............... 41 Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP - RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank)...................................... .................................... 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi........................................ 13 Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử......................................... ... 15 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV......................................................... 16 Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................ ................. 17 Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................ 18 Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của rầy nâu..................................................... 19 Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ.... 26 Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT ................................................................................. 30 Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu của tỉnh Bình Thuận bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV....................... 35 Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Hình 3.3. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8 Hình 3.4. Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp của các dòng CP của RGSV tỉnh Bình Thuận trên môi trƣờng LB đặc........... ...................................... 37 Hình 3.5. Điện di sản phẩm colony-PCR các dòng RGSV bằng cặp mồi pUC 18.. 38 Hình 3.6. Điện di sản phẩm colony-PCR từ các dòng của phân đoạn 1 và 4 RGSV bằng cặp mồi pUC 18........................................ ....................................... 38 Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng BamHI....................................................................................... ........................... 39 Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang phân đoạn 1 và 4 của RGSV tại Bình Thuận bằng BamHI..................................................................................... 40 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên việc so sánh trình tự 02 gen CP- RGSV Nam Trung Bộ (NT, BT) với các trình tự tƣơng ứng của ĐBSCL và thế giới đã đƣợc đăng ký vào GenBank........................................... ................ 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
9 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Lúa gạo là nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu trên thế gi ới, đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lƣợng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein, các chất khoáng và chất xơ cho con ngƣời. Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lƣợng đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62]. Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ở ĐBSCL. Khi đánh giá về những thành tựu đạt đƣợc trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt Nam, các nhà kinh tế thế giới đều thống nhất nhận định: Thành công lớn nhất là nông nghiệp và cây lúa vẫn luôn là cây lƣơng thực quan trọng bậc nhất của Việt Nam. Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong thời gian gần đây. Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lá lúa (Rice Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical Virus- RTSV) và virut tungro hình nhộng ( Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43], [48], [59]. Trong một số trƣờng hợp, cây lúa bị nhiễm cùng một lúc 2 đến 4 loại virut này. Trong đó, RGSV thƣờng chiếm tỷ lệ cao nhất. Từ năm 2006 đến nay dịch bệnh lại phát triển rộng ở các tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm rất lớn. Do ảnh hƣởng của dịch bệnh này trên cây lúa, năm 2009 Việt Nam có nguy cơ tiếp tục bị giảm sản lƣợng gạo xuống 1 triệu tấn so với năm 2008 [12]. Rất nhiều thành tựu đã đạt đƣợc trong nghiên cứu các biện pháp phòng chống rầy nâu- môi giới chủ yếu truyền bệnh VL&LXL nhƣ: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học của rầy nâu, các biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học, sinh vật học, kỹ thuật canh tác, giống kháng... Tuy nhiên, hiệu quả của các phƣơng pháp này vẫn chƣa cao. Do dịch bệnh VL&LXL đang gây hại nặn g nề về sản lƣợng lúa gạo cho các tỉnh ĐBSCL [7] và có nguy cơ lây lan ra các khu vực lân cận, nên nhiệm vụ cấp bách là phải kiểm tra sự có mặt của các chủng virus gây bệnh tại khu vực Nam Trung Bộ, nơi có diện tích trồng lúa khá lớn và tiếp giáp với ĐBSCL. Đồng thời, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10 đánh giá độ tƣơng đồng di truyền của các chủng virut gây bệnh, góp phần vào việc đề ra những biện pháp đối phó kịp thời với dịch bệnh tại khu vực miền Trung. Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam”. 2. Mục tiêu Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV). 3. Nội dung nghiên cứu 1> Tách dòng, xác định trình tự một số đoạn trong genome của chủng RGSV. 2> So sánh các trình tự nucleotit của gen CP- RGSV thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank để đánh giá độ tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các chủng virut. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
11 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1. Thế giới Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) đã nổi lên nhƣ một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở Châu Á. Nhiều trận dịch rầy đã xảy ra trên quy mô rộng lớn chƣa từng thấy ở nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan... gây tổn thất nặng nề về kinh tế [17]. Rầy nâu phá hại làm giảm một phần năng suất, hoặc khi cháy rầy làm mất trắng. Ngoài tác hại trực tiếp, rầy nâu còn là môi giới truyền bệnh virut nguy hiểm cho cây lúa nhƣ bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn cây lúa ở Trung Quốc và bệnh vàng lá lúa ở vùng núi phía Bắc Việt Nam. Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979) thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lụi ở Châu Á trong năm 1966 – 1975 lên tới hơn 300 triệu USD [22]. Năm 1966, RGSV lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Nam và Đông Nam châu Á [43]. Năm 1977, dạng héo lùn do RWSV xuất hiện ở vụ mùa thứ hai ở Đài Loan, biểu hiện cây lúa bệnh và hình thái, cấu tạo của RWSV tƣơng tự RGSV [20]. Năm 1974 – 1977, khoảng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm rầy và virut, gây thiệt hại 03 triệu tấn thóc [40]. Năm 1992 – 1993 cả vụ mùa giống SP60 ở Thái Lan bị mất do tác hại của rầy nâu [50]. Rầy nâu mang các loại virut gây bệnh trên cây lúa nhƣ RGSV và RRSV, nên có nguy cơ gây “cháy rầy” làm giảm đáng kể năng suất cây trồng. Hai phƣơng pháp truyền thống đƣợc sử dụng để bảo vệ cây lúa là phun thuốc trừ sâu và dùng giống cây kháng rầy. Dùng thuốc trừ sâu hóa học đắt, độc hại và ô nhiễm môi trƣờng, do đó biện pháp trồng cây lúa mang gen kháng rầy thông qua lai giống đƣợc nghiên cứu và áp dụng rộng rãi. Tinjuangjun và CS (2000) đã chuyển gen gna thành công vào hai giống gạo Thái Lan là Khao Dawk Mali 105 (KDML 105) và Supanburi 60 (SP60), 37% số lƣợng rầy giảm đi khi gna biểu hiện bằng promoter RSs1 và 42% khi gna biểu hiện bằng promoter Ubi-1 [50]. Tuy nhiên, việc trồng lúa mang gen kháng rầy đang gặp trở ngại do sự thay đổi đặc điểm thích nghi nhanh chóng của rầy nâu. Tại các Hội nghị quốc tế về rầy nâu họp tại IRRI- Philippin (05/1977), Việt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12 Nam (11/2001), Trung Quốc (11/2002) và Việt Nam (04/2006), rầy nâu đƣợc coi là mối đe dọa thƣờng xuyên đối với sản xuất lúa ở Châu Á [41], [61]. 1.1.2. Việt Nam Bệnh VL&LXL trên lúa đƣợc ghi nhận sớm nhất tại Mỹ Tho và Long An vào năm 1963. Tại miền Bắc, bệnh đƣợc ghi nhận trong những năm 1964, 1966 và 1970 trên giống Mộc Tuyền với diện tích khá lớn (khoảng 50.000 ha) [8]. Bệnh cũng xuất hiện và gây thiệt hại 20.000 ha vụ Hè Thu 1990 tại vùng ven biển miền Trung nhƣ Bình Định, Phú Yên và Khánh Hoà. Năm 1999 có 13.120 ha lúa bị nhiễm ở các tỉnh Bến Tre, TPHCM, Bạc Liêu và Long An, riêng TPHCM có 242 ha bị bệnh và không trổ bông đƣợc [9]. Đầu vụ Hè Thu 2006 dịch bệnh lại phát triển và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ĐBSCL, với mật số rầy nâu rất cao, diện tích bị nhiễm bệnh vàng lụi riêng tại Đồng Tháp với thiệt hại dƣới 30% là 613 ha, và trên 30% là 2636 ha trong đó tiêu huỷ khoảng 500 ha [54]. Cuối năm 2006, dịch bệnh VL&LXL đã đƣợc công bố ở ĐBSCL và miền Đông Nam bộ. Bệnh VL&LXL lây lan trên lúa vụ Thu Đông và vụ Đông Xuân ở các tỉnh vùng ĐBSCL, Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên. Theo báo cáo của các địa phƣơng, đến tháng 10 năm 2006, diện tích lúa vụ Thu Đông 2006 và vụ Đông Xuân 2006- 2007 bị nhiễm rầy nâu của các tỉnh vùng ĐBSCL và Đông Nam bộ là 33.323 ha, và diện tích nhiễm bệnh VL&LXL là 51.768 ha, trong đó có 26.283 ha nhiễm bệnh nặng cần phải tiêu huỷ [1]. Cũng trong năm 2006, Rogelio Cabunagan (IRRI) cùng các chuyên gia Việt Nam đã đi thực tế đồng lúa ở Trà Vinh, Long An, Bình Chánh (TPHCM), Bình Phƣớc, Đồng Nai, Tiền Giang quan sát thấy cây lúa có dấu hiệu bị bệnh VL&LXL và xuất hiện nhiều rầy nâu gây hiện tƣợng “cháy rầy”. Qua xét nghiệm bằng phƣơng pháp ELISA dƣơng tính với kháng thể đặc hiệu của RGSV và RRSV đã khẳng định tỉ lệ nhiễm RGSV, RRSV khá cao, đồng thời có sự xuất hiện của RTSV [ 56]. Năm 2008, dịch rầy nâu và các bệnh virut hại lúa tuy có giảm so với năm trƣớc nhƣng vẫn đang ở mức nghiêm trọng. Lúa Hè Thu ở khu vực ĐBSCL, diện tích bị nhiễm rầy nâu: 76.795 ha, trong đó có 4.298 ha bị nhiễm nặng. Diện tích bị nhiễm bệnh VL&LXL trong vụ Hè Thu là 206 ha, tập trung trên lúa hè thu giai đoạn đòng trổ, trong đó diện tích nhiễm nhẹ là 55 ha (tỉ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình 13 ha (tỉ lệ bệnh trên 10-20%), nhiễm nặng 138 ha (tỉ lệ bệnh trên 20-50%) [11]. Năm 2009, dịch rầy nâu và bệnh VL&LXL vẫn xảy ra trên nhiều vùng với diện tích lớn. Tính đến tháng 08/2009 tại các tỉnh phía Nam diễn tích nhiễm rầy vụ Hè Thu là 87.246 ha tập trung tại các tỉnh Kiên Giang, Long An, Sóc Trăng, Bạc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13 Liêu, Tiền Giang, Trà Vinh, Bình Thuận; Vụ Thu Đông là 18.747 ha tại Vĩnh Long, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bình Phƣớc, Trà Vinh, Hậu Giang, Tây Ninh. Diện tích nhiễm VL&LXL vụ Hè Thu là 68 ha chủ yếu ở hai tỉnh Đồng Nai và Bình Thuận [12]. 1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL Triệu chứng ban đầu chƣa thấy rõ giữa cây bệnh và cây lúa bình thƣờng. Bụi lúa bệnh chỉ hơi ngã màu xanh nhạt, đôi khi có những lá màu vàng đến cam. Thời gian sau cây lúa bệnh có vẻ kém phát triển hơn (lúc này rất dễ nhầm lẫn với hiện tƣợng kém dinh dƣỡng nên nông dân thƣờng bón thêm phân đạm) [8]. Lúa nhiễm bệnh trong giai đoạn còn non thƣờng rất lùn, mọc nhiều chồi và có lá thẳng đứng. Các lá bệnh thƣờng ngắn, hẹp, có màu nhạt, và có nhiều đốm nhỏ màu nâu với hình dạng không cố định [32],[43]. Các lá non mọc sau khi bị nhiễm bệnh thƣờng bị sọc loang lổ, tuy nhiên lá lúa có thể vẫn xanh bình thƣờng nếu đƣợc cung cấp đủ phân đạm [32]. Nhìn toàn cảnh thấy lúa hồi xanh không đều sau khi cấy, lá hẹp và dựng đứng, lá có màu vàng, mềm và hơi rũ hoặc lá có màu xanh đậm có thể có nhiều đốm màu rỉ sắt (Hình 1.1). Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi “Nguồn: http://www.vaas.org.vn/” Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ quá nhiều nhánh, bụi lúa to hơn, vẫn có chiều cao tƣơng đƣơng với các bụi khác, chƣa khác biệt lắm [64]. Càng về sau nhìn toàn cảnh thấy lúa phát triển không đều do bụi lúa bị bệnh không phát triển chiều cao, cuối cùng các bụi lúa bệnh sẽ khô và lụi dần nhƣ cháy rầy từng chòm. Cây lúa bệnh có thể không có bông hoặc có rất ít bông nhƣng hạt bị đen và lép. Triệu chứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
14 tồn tại rất lâu sau khi phát bệnh [26]. Lúa trƣởng thành khi bị nhiễm bệnh có lá bị vàng, bông bị nâu và hạt lép [43]. 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA 1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) Virut vàng lùn lúa đƣợc phát hiện chủ yếu trên lúa Oryza sativa [25], [43] và có tên khoa học là Rice grassy stunt virus (RGSV), thuộc chi Tenuivirus [57]. Virut phân bố tại nhiều nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, và gây thiệt hại kinh tế rất đáng kể. Các chủng RGSV gây vàng lá, mất mầu và chết cây đƣợc phát hiện năm 1977 tại Đài Loan [19], năm 1982- 1983 tại Philippin và Thái Lan [25], và năm 1984 tại Ấn Độ [33]. Ngoài ra, virut còn phân bố tại các nƣớc châu Á khác nhƣ Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Sri Lanka, Trung Quốc, và Việt Nam [8], [9], [19], [51]. RGSV ký sinh chủ yếu trên các loài lúa Oryza spp. và rầy Nilaparvata spp. Vì vậy có thể nói Nilaparvata spp là vectơ duy nhất truyền bệnh này cho lúa [31]. Thất thu năng suất do RGSV thƣờng khó đƣợc tính toán chính xác vì thiệt hại do virut thƣờng không thể đƣợc tách biệt rõ ràng với thiệt hại của rầy nâu và của virut lùn xoắn lá (RRSV- cũng đƣợc truyền bởi rầy nâu) [40]. Trong năm 1974- 1977, có tổng cộng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm bởi rầy nâu và virut vàng lùn lúa . Sự thất thu năng suất do cả hai loài dịch hại này gây nên khoảng 03 triệu tấn lúa [40]. RGSV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh hoặc qua phấn hoa [31]. Virut cũng không đƣợc truyền bằng cách tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh, hoặc qua lây bệnh bằng tay. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy nâu (Nilaparvata lugens) và một số loài rầy khác (N. bakeri, N. muiri) [28], [43]. Virut đƣợc truyền dạng bền vững qua các tuổi của rầy và nhân mật số trong rầy ký chủ, nhƣng không đƣợc truyền qua trứng rầy [36]. Rầy nâu một khi nhiễm bệnh sẽ truyền virut cho đến lúc chết. Kể từ năm 1984, RGSV thƣờng ít xuất hiện và gây thiệt hại tại châu Á. Mặc dù không đƣợc báo cáo nhiều, sự ít xuất hiện của RGSV có lẽ là do sự thay đổi trong khả năng truyền bệnh của quần thể rầy nâu. Tại Philippin, tỉ lệ rầy nâu có thể lấy và truyền RGSV thay đổi từ 3- 5% trƣớc năm 1977 [32] sang 0- 15% trong năm 1984 [26]. Từ đây ta có thể giả thiết là một trong những khả năng của sự bùng phát của dịch RGSV tại miền Nam Việt Nam hiện nay là do sự thay đổi về khả năng truyền bệnh của rầy nâu: tỉ lệ rầy có khả năng lấy và truyền virut có thể đã tăng lên đáng kể trong quần thể rầy nâu tại vùng này trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
15 những năm vừa qua. Thể virut bao gồm nhiều đoạn vRNA, vcRNA, protein vỏ virut, và vài phân tử RdRp [35]. Thể virut khó đƣợc quan sát thấy trong dịch trích thực vật dƣới kính hiển vi điện tử. Thể virut sau khi đƣợc ly trích có dạng sợi dài 2µm và rộng 6- 8 n m khi đƣợc quan sát bằng cách nhuộm trong uranyl acetate [16], [29] (Hình 1.2). Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử Thanh đen dài 100 nm. “Nguồn: DPV”. Lúa bị nhiễm virut có nhiều bó sợi đƣợc quan sát trong nhân và tế bào chất hoặc trong các thể có màng bao bọc hiện diện ở phần tế bào chất của các tế bào diệp lục [20]. Các thể hình ống đi kèm với các hạt có đƣờng kính 25 nm còn đƣợc tìm thấy trong các tế bào mạch rây của lá lúa bệnh [47]. Các hạt 25 nm tƣơng tự cũng xuất hiện dƣới dạng các mảng kết tinh trong các thể béo và khí quản của rầy nâu nhiễm virut [43]. RGSV có 6 đoạn RNA khác nhau, với tổng chiều dài bộ gen của RGSV là khoảng 25 kb (Hình 1.3) [21], [32]. Cả 6 đoạn RNA đều lƣỡng tính (ambisense, mã hoá protein theo cả 2 chiều dƣơng và chiều bổ sung của phân tử RNA) và đều mang đoạn mã kết thúc dài 17 nucleotit tƣơng tự nhau. Các đoạn mã kết thúc này có khả năng tự cuốn lại và tạo nên cấu trúc hình cán chảo. Đoạn mã theo chiều bổ sung của đoạn RNA dài nhất (RNA1) chứa một ORF mã hoá cho một RdRp tƣơng tự nhƣ RdRp của RSV, loài chuẩn của chi Tenuivirus [35], [38] và có cùng 37 ± 9% axit amin giống nhau trong tổng số 2140 axit amin . Tuy nhiên, khác với các Tenuivirus khác, RNA1 của RGSV còn có thêm một ORF ngắn có chiều dƣơng ở gần đầu 5’. Hai protein dự đoán đƣợc mã hoá bởi RNA2 chỉ tƣơng tự chút ít với các protein đƣợc mã hoá bởi RNA2 của các Tenuivirus khác. Các protein dự đoán đƣợc mã hoá bởi RNA3 và RNA4 rất khác biệt so với các protein đƣợc biết. Sự khác biệt giữa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
16 các protein đƣợc mã hoá bởi các chuỗi RNA2, 3, 4 5 và 6 cho thấy RGSV rất khác biệt so với các Tenuivirus khác [51]. Các đoạn RNA1, 2, 5, 6 của RGSV theo thứ tự tƣơng đƣơng với RNA1, 2, 3, 4 của RSV. Protein vỏ của RGSV đƣợc mã hoá bởi đoạn mã theo chiều bổ sung với RNA5 [21]. Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV Các thanh đen hình sợi chỉ tƣợng trƣng cho các RNA với chiều dài đã đƣợc xác định. Các mũi tên đen tƣợng trƣng cho các sản phẩm protein. Chiều mũi tên là chiều của quá trình dịch mã để tạo ra chuỗi polypeptide. “Nguồn: Hồ Xuân Thiện, 2006” 1.3.2. Các loại virut khác 1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV) Bệnh lùn xoắn lá lúa đƣợc miêu tả đầu tiên năm 1977 [48]. Bệnh xuất hiện chủ yếu trên các loài lúa Oryza spp. và đƣợc gây ra bởi virut có tên khoa học là Rice ragged stunt virus (RRSV), thuộc chi Oryzavirus, họ Reoviridae [58]. RRSV xuất hiện tại nhiều nƣớc trồng lúa châu Á nhƣ Ấn Độ, Bangladesh , Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Philippin, Sri Lanka, Thái Lan, Trung Quốc [60], và Việt Nam. RRSV là một virut quan trọng gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Virut không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh [20]. Virut không đƣợc truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh bằng tay, hoặc qua tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh [60]. Rầy nâu Nilaparvata lugens là tác nhân truyền bệnh duy nhất đƣợc biết [18], [48]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
17 Thể virut của RRSV có dạng hình cầu, bao gồm một vỏ, một phần trung tâm, và một phức hợp nucleoprotein. Vỏ virut không có màng bao và mang nhiều thành phần nhỏ tạo thành các gai (Hình 1.4). Vỏ virut có 12 gai dạng “B” dài 8 – 10 nm, rộng 23- 26 nm ở phần chân đế và 14- 17 nm ở phần trên [36]. Thể virut có rất nhiều ở tế bào chất của các tế bào nhu mô của mạch rây và thƣờng liên kết với n hau tạo thành các sợi dài. Virut không đƣợc phát hiện ở các mô khác [48]. Khi bị nhiễm virut, các tế bào nhu mô của mạch rây nhân lên và phình ra, tạo thành các u sần trên lá và bẹ lá [26]. RRSV có 10 đoạn RNA sợi đôi khác nhau [59]. A B Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (A): Thể virut với các protein gai dạng B “nguồn http://www.iah.bbsrc.ac.uk”.; (B): Các thể virut liên kết lại tạo thành sợi dài, xem trong uranyl acetate, thanh đen dài 50 nm. “Nguồn: DPV”. 1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) Virut tungro hình cầu có tên khoa học là Rice tungro spherical virus (RTSV), chi Waikavirus, thuộc họ Sequiviridae [27]. RTSV phân bố trên các loài lúa Oryza spp. ở hầu hết các nƣớc trồng lúa tại vùng Nam và Đông Nam Á. RTSV còn có thể phân bố ở những quốc gia khác nhƣng không đƣợc phát hiện bởi vì virut này thƣờng không gây ra triệu chứng bệnh. Sự phân bố của RTSV có lẽ liên quan lớn đến sự phân bố của côn trùng truyền bệnh [59]. RTSV kết hợp với RTBV gây nên bệnh Tungro [14]. Đây là bệnh hại lúa gây thiệt hại kinh tế rất lớn với thiệt hại ƣớc tính hàng năm tại vùng Đông Nam Á lên đến hơn 1,5 tỉ USD [24]. RTSV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh. Virut không đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành với cây lúa bị bệnh. RTSV có tác dụng nhƣ là một loài giúp đỡ cho RTBV trong việc truyền bằng côn trùng [42]. RTSV đƣợc truyền dƣới dạng bán bền bởi một số loài rầy xanh. Loài rầy truyền bệnh chủ yếu của RTSV tại vùng Đông Nam Á là rầy xanh đuôi đen Nephotettix virescens (tên khác là N. impicticeps) [47], [59]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn