Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tinh sạch các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập ở Việt Nam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm tinh sạch hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani từ chủng B. subtilis AS; đánh giá tính chất lý hóa của hợp chất được tinh sạch. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tinh sạch các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập ở Việt Nam

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÝ THỊ BÍCH HẠNH TINH SẠCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Đỗ Thị Tuyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ii THÁI NGUYÊN - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dƣới đây là do tôi và nhóm cộng sự nghiên cứu tại phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 5 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015. Thái Nguyên, ngày 06 tháng 11 năm 2015 Học viên Lý Thị Bích Hạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Tuyên, Phó trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã định hƣớng nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin cảm ơn các anh chị cán bộ Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình nghiên cứu cũng nhƣ chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh các thầy cô giáo tại trƣờng Đại Học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này. Hà Nội, Tháng 5 năm 2015 Học viên Lý Thị Bích Hạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iv BẢNG CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium presulphate AFC Antifungal compound B. subtilis Bacillus subtilis BCF Biological Control Fungi CFU Connoly-Forming unit DEAE-cellulose Dimethylaminoethyl-cellulose ĐC Đối chứng F. oxysporum Fusarium oxysporum kDa Kilo Dalton LB Luria – Bertani PDA Potato Dextrose agar M Marker MIC Minimal Inhibitory Concentration FTIR Fourirer ransform infrared spectroscopy TLC Thin Layer Chromatography Pr Protein R. solani Rhizoctonia solani SDS Sodium doecyl sulfate TB Trung bình TEMED N, N, N’, N’, - Tetramethyl ethylene diamine TN Thí nghiệm v/v Volume/volume (thể tích/ thể tích) w/v Weight/volume (khối lƣợng/thể tích) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. iii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. iv MỤC LỤC ......................................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1 2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Khái quát về chất đối kháng sinh trƣởng nấm .......................................... 3 1.2. Vai trò của vi khuẩn B. subtilis trong kiểm soát sinh học ......................... 5 1.2.1. Đại cƣơng về vi khuẩn B. subtilis ........................................................... 5 1.2.2. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm .................................. 6 1.3. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm trên thế giới ... 8 1.4. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm tại Việt Nam .....13 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................ 16 2.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................. 16 2.1.1. Chủng giống .......................................................................................... 16 2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 16 2.1.3. Các loại đệm và dung dịch .................................................................... 16 2.1.4. Môi trƣờng ............................................................................................ 17 2.1.5. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 18 2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh và thu nhận dịch ngoại bào .................. 18 2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính ức chế sinh trƣởng nấm..................... 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vi 2.2.3. Thử hoạt tính kháng nấm bằng khoanh giấy lọc ................................... 20 2.2.4. Phƣơng pháp tủa muối amonium sulfate .............................................. 20 2.2.5. Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose ............................... 20 2.2.6. Phƣơng pháp sắc ký lọc gel Biogel P100.............................................. 21 2.2.7. Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 23 2.2.8. Điện di SDS - PAGE ............................................................................. 23 2.2.9. Đánh giá tính chất lý hóa của protein tinh sạch .................................... 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 27 3.1. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS ........ 27 3.1.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm F. oxysporum.... 27 3.1.2. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm R. solani ........... 29 3.2. Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm ............................................... 31 3.2.1. Tủa protein bằng muối amonium sulfate .............................................. 31 3.2.1. Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose ..................... 31 3.2.2. Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm qua sắc ký lọc gel Biogel P100 ..35 3.3. Đánh giá tính chất của protein tinh sạch .................................................. 39 3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ........................................................................ 40 3.3.2. Ảnh hƣởng của proteinase K................................................................. 41 3.3.3. Khả năng ức chế sợi bào tử nấm ........................................................... 43 3.3.4. Hoạt tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein với nấm R.solani và F. oxysporum .............................................................................................. 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 48 1. Kết luận ....................................................................................................... 48 2. Đề nghị ........................................................................................................ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 49 PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS trên môi trƣờng PDA ....... 5 Hình 2.1. Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtilis AS .... 22 Hình 2.2. Đƣờng chuẩn Brardford .................................................................. 23 Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS đối với nấm F. oxysporum sau 5 ngày. ................................................................. 28 Hình 3.2. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS đối với nấm R. solani sau 3 ngày. ................................................................... 30 Hình 3.3. Sắc ký đồ các phân đoạn qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE- cellulose ........................................................................................................... 32 Hình 3.4. Điện di đồ các phân đoạn protein tinh sạch qua cột DEAE – celulose ........................................................................................................... 33 Hình 3.5. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A, D) và R. solani (B, C) ...................................................................................................34_Toc434515732 Hình 3.6. Sắc ký đồ các phân đoạn proteintinh sạch có hoạt tính kháng nấm sau khi qua cột Biogel P100 ............................................................................ 36 Hình 3.7. Điện di đồ các phân đoạn protein có hoạt tính kháng nấm qua cột Biogel P100 ..................................................................................................... 36 Hình 3.8. Các phân đoạn protein tinh sạch có hoạt tính kháng nấm qua cột Biogel P100,. .................................................................................................. 38 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) ......40 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) và nấm R. solani (B) .................................................................................. 42 Hình 3.11. Khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử F. oxysporum của protein tinh sạch từ chủng B. subtilis AS. ................................................................... 44 Hình 3.12. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng B. subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum ........................................ 45 Hình 3.13. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng B. subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm nấm R. solani. ....................................... 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch .......................................... 17 Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật .................................. 17 Bảng 2.3. Danh sách các thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng ............................ 18 Bảng 2.4. Thành phần gel cô và gel tách ........................................................ 24 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh trƣởng của F. oxysporum ................................................................................ 28 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh trƣởng của nấm R. solani ................................................................................ 29 Bảng 3.3. Tóm tắt quá trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtillis AS qua các bƣớc tinh sạch .............................................................................. 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Hàng năm, các bệnh cây trồng đã gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp. Theo tổ chức nông lƣơng liên hợp quốc (FAO, 2004), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm gây ra đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm khoảng 11,6% tổng sản lƣợng nông nghiệp trên thế giới. Trong đó chiếm 83% là bệnh do vi nấm gây ra, chủ yếu là các bệnh nhƣ: đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng… đặc biệt bệnh do nấm Fusarium và Rhizoctonia gây ra chiếm tỉ lệ tƣơng đối lớn. Hiện nay, các biện pháp hóa học vẫn đƣợc sử dụng rất phổ biến và rộng rãi với một lƣợng rất lớn vì nó mang lại hiệu quả phòng trừ cao, rẻ tiền. Tuy nhiên bên cạnh đó, nó cũng gây ra những tác hại rất to lớn đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời, tạo ra sự kháng thuốc với nhiều loại bệnh hại. Vì vậy gây nên nhiều khó khăn trong công tác phòng trừ bệnh. Để khắc phục những nhƣợc điểm do biện pháp hóa học gây ra nhƣ trên, hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, việc sử dụng các chế phẩm sinh học thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh cây trồng do vi sinh vật gây ra đang là xu hƣớng chủ yếu. Chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp, ƣu việt hơn so với việc dùng thuốc hóa học. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho ngƣời sản xuất nhƣ: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu tƣ, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trƣờng sinh thái, không ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời và vật nuôi, góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả. Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu đã công bố đƣợc biết đến với vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau nhƣ các chất kháng sinh,
2 lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin. Một số chủng Bacillus subtilis đã đƣợc ứng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng do nấm gây ra. Việc nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây trồng bằng các chế phẩm sinh học đã đƣợc hình thành và phát triển ở Việt Nam nhƣng vẫn còn nhiều hạn chế. Các chế phẩm dƣới dạng tinh sạch tách chiết từ vi sinh vật mới nghiên cứu chủ yếu ở trong phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất thử nên giá thành còn cao. Các sản phẩm trên thị trƣờng chủ yếu là các sản phẩm có chứa tế bào vi sinh vật đối kháng nên thời gian hữu hiệu ngắn hiệu quả không cao. Mặt khác, các sản phẩm sử dụng tế bào mang nguy cơ gây bệnh rất lớn cho con ngƣời. Vì vậy, để phát triển sản phẩm sinh học đạt độ tinh sạch cao để phòng chống nấm bệnh cây trồng là một vấn đề rất cấp thiết. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng B. subtilis AS có khả năng ức chế mạnh các nấm gây bệnh cây trồng nhƣ F. oxysporum và R. solani. Xuất phát từ những lý do trên và tình hình nghiên cứu ở Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện đề tài luận văn: "Tinh sạch các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập ở Việt Nam" . 2. Mục tiêu của đề tài - Tinh sạch hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani từ chủng B. subtilis AS. - Đánh giá tính chất lý hóa của hợp chất đƣợc tinh sạch. 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng ức chế sinh trƣởng và phát triển của dịch lọc ngoại bào vi khuẩn B. subtilis AS đối với hai chủng nấm F. oxysporum và R. solani. - Tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ dịch lọc ngoại bào vi khuẩn B. subtilis AS. - Đánh giá sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, proteinase K, ức chế sợi tử bào nấm và nồng độ ức chế tối thiểu lên hoạt tính kháng nấm của protein tinh sạch đƣợc.
3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về chất đối kháng sinh trƣởng nấm Chất đối kháng sinh trƣởng nấm (Antifungal – compounds, AFC) là những chất có khả năng ức chế sự sinh trƣởng hoặc tiêu diệt sự phát triển của các loại nấm.Các chất này đã đƣợc ứng dụng để phòng và chữa trị các bệnh do nấm gây ra, đặc biệt là các loại nấm gây bệnh hại trên cây trồng nhƣ lạc, cà chua, đậu tƣơng, cây cà phê và nhiều loại cây khác. Các protein và peptide có hoạt tính kháng nấm đều đƣợc tách chiết phần lớn từ động vật, thực vật, vi khuẩn và nấm. Năm 1993, Lijima và cộng sự đã xác định đƣợc protein chống nấm Candida albicans, Shizosaccharomyces pombe có trong hemolymph của ấu trùng Sarcophaga (2,5 mg protein tinh khiết thu đƣợc từ 10ml hemolymph với nồng độ ức chế sự tăng trƣởng 50% là 30 pg/ml) [25]. Hoạt tính kháng nấm cũng đƣợc phát hiện ở thực vật nhƣ tính kháng nấm của heme preoxidase từ cây mây Acoru peroxidase có vai trò trong việc ức chế các sợi nấm của Phaseolina macrophomina, Fusarium moniliforme và trichosporium vesiculosum [23]. Một chất ức chế protease cysteine đƣợc công bố có khả năng kháng nấm từ hạt kê. Chất này ức chế mạnh hoạt động của nấm T. reesei một loại nấm gỗ, nồng độ tối thiểu để ức chế sự tăng trƣởng của sợi nấm hay bào tử nảy mầm là 1 µg/ml (250mg/đĩa). Ngoài ra chúng còn ức chế một số loại nấm gây hại thực vật khác nhƣ: Claviceps, Helminthosprium, Curvularia, Alternaria và các loài thuộc chi Fusarium [27]. Một protein kháng nấm đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens MET0908 có khả năng kiểm soát sự sinh trƣởng của nấm Colletotrichum lagenarium gây bệnh trên dƣa hấu. Protein này còn có thể hoạt động đƣợc trên vách tế bào C. lagenarium [28]. Đặc biệt hoạt chất kháng nấm còn đƣợc phân lập từ quả thể của nấm hypsizygus marmoreus là Hypsin một protein chịu nhiệt ức chế sự tăng trƣởng
4 của sợi nấm trong các loài nấm khác nhau bao gồm Mycosphaerella arachidicola, Physalospora piricola, F. oxyproum, và Botrytis cinerea với giá trị IC50 tƣơng ứng là 2,7; 2,5; 14,2 và 0,06 µM [33]. Trong các nguồn trên thì các chất AFC tách chiết từ vi khuẩn thuộc các chi Bacillus đƣợc quan tâm nhiều hơn cả bởi tính phổ biến và thuận lợi trong tinh sạch. Các chủng Bacillus có rất nhiều đặc tính tốt nhƣ: dễ nuôi cấy, phổ biến, sinh trƣởng nhanh trong môi trƣờng lỏng, cho nhiều bào tử và đặc biệt chúng có khả năng tổng hợp nhiều chất đối kháng sinh trƣởng nấm. Các protein và peptide có khả năng kháng nấm đƣợc phân loại theo nhiều cách khác nhau, dựa vào cơ chế tác động có thể phân thành 3 loại đó là loại tác động vào vách tế bào nấm: (1) ức chế sự tổng hợp chitin và glucan, loại tác động vào màng tế bào nấm: (2) các chất gắn dính hay ức chế sự tổng hợp ergosterol của nấm và (3) loại tác động vào quá trình tổng hợp protein và acid nucleic của nấm. Dựa vào cấu trúc hoặc chức năng, các protein và peptide có khả năng kháng nấm đƣợc phân loại thành nhiều lớp khác nhau, chẳng hạn nhƣ chitinase và chitinase-like protein [14], [34], ribonuclease [39], chất ức chế protease [27]. Peptide kháng nấm đầu tiên đƣợc tách chiết từ chủng Bacillus là iturin và bacillomycin. Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng và có khả năng kháng nấm và tan huyết [35]. Bacillus cũng chính là đối tƣợng vi khuẩn đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất hiện nay, chủng này sinh tổng hợp rất nhiều các polypeptide có hoạt tính kháng nấm và có tiềm năng trong việc kiểm soát các bệnh hại cây trồng do nấm gây ra cũng nhƣ trong sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm.
5 1.2. Vai trò của vi khuẩn B. subtilis trong kiểm soát sinh học 1.2.1. Đại cương về vi khuẩn B. subtilis Chủng B. subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủng đƣợc sử dụng để phòng bệnh lị cho bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Đến năm 1949, khi Henry và các cộng sự tách đƣợc chủng thuần khiết của B. subtilis thì chúng mới đƣợc dùng để điều trị bệnh về rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn B. subtilis đã trở nên phổ biến và đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học, thực phẩm… và đặc biệt là kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillacea Chi: Bacillus Loài: B.subtilis Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS trên môi trƣờng PDA Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đƣờng ruột, chúng đƣợc phân bố hầu hết trong tự nhiên nhƣ: cỏ khô, bụi đất, nƣớc … phần lớn chúng tồn tại trong đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu CFU/g. B. subtilis là trực khuẩn hình que, hai đầu tròn, Gram dƣơng, kích thƣớc từ 0,5- 0,8 µm x 1,8-3µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động 8-12 lông. Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm ở giữa tế bào. Kích thƣớc từ
6 0,8-18µm. Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ấm, tia tử ngoại, phóng xạ. Điều kiện phát triển nuôi cấy là môi trƣờng hiếu khí , nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu là 37oC. Mặc dù là vi khuẩn hiếu khi nhƣng B. subtilis có khả năng phát triển trong môi trƣờng thiếu oxi. pH thích hợp nhất khi nuôi cấy với pH=7,0- 7,4. Trên môi trƣờng thạch đĩa, khuẩn lạc chủng có dạng hình tròn, rìa răng cƣa không đều, có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đƣờng kính 3-5mm. Sau 1-4 ngày thì bề mặt nhẵn và chuyển sang màu hơi sẫm. Trên môi trƣờng thạch nghiêng chủng dễ mọc tạo thành màu xám rìa gợn sóng. Trên môi trƣờng lỏng chủng phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn lại nhƣ vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên. 1.2.2. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm Chủng Bacillus Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu đã công bố đƣợc biết đến với vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh tồng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau nhƣ các chất kháng sinh, lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin [29], [46], [47], [50]. Một số chủng B. subtilis đã đƣợc ứng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng do nấm gây ra, chúng có phổ biến trong đất, chịu đƣợc nhiệt độ cao, sinh trƣởng nhanh trong môi trƣờng lỏng và có nhiều bào tử. Rất nhiều loài thuộc chi Bacillus đã đƣợc biết đến với khả năng sinh tổng hợp đa dạng về chức năng và cấu trúc các chất chuyển hóa thứ cấp. Việc sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính đối kháng vi sinh vật là một trong những yếu tố quyết định đến khả năng kiểm soát các bệnh hại cây trồng. Những chất chuyển hóa có thể là hợp chất ribosome nhƣ subtilin [63], subtilosin A [12], và sublancin [48]. Các peptide kháng sinh nhỏ không phải từ ribosome nhƣ họ surfactin: surfactin và lichenysin; họ kháng sinh iturin:
7 iturin A, C, D, và E, bacillomycin D, F, L, và mycosubtilin; họ kháng sinh fengycin: fengicin và plipastatin; các aminopolyol nhƣ zwittermycin A [54]. Trong chi Bacillus thì B. subtilis là loài có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại hoạt chất có hoạt tính đối kháng vi sinh vật. Loài này thƣờng tổng hợp các loại peptide kháng sinh nhỏ không phải từ ribosome (
8 Chủng Pseudomonas sp. Đƣợc phân lập từ lá cây ô liu, có khả năng sản xuất endophyte chống lại một số loại nấm gây bệnh. Chúng ức chế 86% sự tăng trƣởng của nấm R. solani sau 5 ngày và giảm mạnh sự lây nhiễm trên khoai tây. Đây có thể là một tác nhân trong việc bảo vệ cây trồng chống lại bệnh nấm [21]. Chủng Burkholderia Chủng Burkholderia cepacia là một vi sinh vật đất phổ biến và rất nhiều chủng đã đƣợc biết đến sinh tổng hợp ra lƣợng lớn các chất đối kháng sinh trƣởng nấm nhƣ cepacin, pyrrolnitrin, xylocandin (còn đƣợc gọi là cepacidine) là các glycopeptide từ Bur. cepacia và có tác dụng cộng hƣởng hơn là amphotericin B và hoạt động kháng nhiều nấm gồm cadida sp., A. Niger, Cryptococcus neoformans, F. oxyporum [36]. Một số hợp chất kháng nấm C. gloeosporioides từ chủng Burkholderia cepacia B23. Hợp chất kháng nấm đƣợc xác định là pyrrolnitrin rất bền nhiệt từ dịch lên men ngoại bào của chủng Bur. cepacia B23 bằng phƣơng pháp TLC. Dịch lên men ngoại bào từ chủng Bur. cepacia B23 ức chế sự phát triển hệ sợi và và nảy mầm của bào tử nấm C. gloeosporioides từ 41% - 100%. Năm 2013, Salgado và cộng sự đã nghiên cứu, chọn lọc từ bộ sƣu tập gồm 15 chủng Bur. tropica từ các vùng khác nhau ở Mexico, xác định chủng Bur. tropica Mto431 có khả năng ức chế sự sinh trƣởng nhiều loại nấm gây bệnh thực vật. Hợp chất bay hơi siderophore đƣợc xác định trong dịch lên men ngoại bào từ nấm, cụ thể trong 4 ngày đối với các loại nấm C. gloeosporioides, S.rolfssi và 7 ngày đối với các nấm F. oxyporum, F. culmorum. 1.3. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm trên thế giới Hàng năm trên thế giới bệnh hại cây trồng đã gây ra những tổn thất lớn cho ngành nông nghiệp. Tính đến năm 2005 khoảng 14% các khoản thiệt hại trên thế giới hoàn toàn là từ các bệnh hại cây trồng gây ra. Trong đó hơn 50%
9 là do nấm gây ra với hàng tỷ euro thiệt hại mỗi năm [9]. Trong đó các loại bệnh hại cây trồng thì bệnh do nấm F. oxysporum và R. solani gây ra, nấm bệnh gây chết héo mạch dẫn và bệnh thối thân, thối rễ, lở cổ rễ ở nhiều loại cây rau quả và cây lƣơng thực lạc, cà chua, khoai tây, đậu tƣơng … [28]. Việc sử dụng ngày càng nhiều các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong nông nghiệp sẽ ảnh hƣởng tiêu cực đến môi trƣờng, dẫn đến mất cân bằng trong quần thể vi sinh vật có ích, tạo môi trƣờng bất lợi đối với các sinh vật có ích phát triển, và tạo điều kiện để nấm bệnh, các loại côn trùng có hại kháng thuốc hơn, đồng thời cũng tiêu diệt các loại thiên địch có ích. Dƣ lƣợng thuốc diệt nấm, thuốc trừ sâu hóa học còn lại trên sản phẩm nông nghiệp và trên đất sẽ làm ô nhiễm nguồn nƣớc ngầm, gây ra các tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe của ngƣời và vật nuôi. Vì vậy một số nƣớc phát triển, thuốc diệt nấm có nguồn gốc hóa học bị hạn chế hoặc cấm sử dụng [22]. Hiện nay trên thế giới, việc sử dụng các chế phẩm sinh học thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh do vi nấm gây ra đang là hƣớng chủ yếu. các chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho ngƣời sản xuất. Vì vậy mà các nhà khoa học quan tâm đặc biệt tới việc nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh, các nghiên cứu đều tập trung mạnh về hóa sinh, di truyền và bản chất của các hợp chất di vi sinh vật tạo ra có khả năng hạn chế sự sinh trƣởng và phát triển của các loài vi sinh vật có hại. Kumar và cộng sự (2009) đã phân lập đƣợc chủng B.subtilis MTCC 8114 trong một số mẫu đất vƣờn, hoạt tính vòng ức chế nấm khi thử nghiệm bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm là 14-16mm và 22-14mm bằng phƣơng pháp khuếch tán vòng trên thạch đối với nấm Microsporum fulvum và
10 Trichophyton. Sau khi tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy đã tìm ra đƣợc nguồn dinh dƣỡng là dịch chiết bột đậu tƣơng, pH 7,0, nhiệt độ 370C và thời gian lên men 48 giờ là điều kiện thích hợp cho sản xuất kháng sinh của chủng vi khuẩn này. Phân tích dữ liệu phổ FITR đã xác định hợp chất thuộc nhóm pedtide kháng nấm, nồng độ ức chế tối thiểu MIC của kháng sinh kháng nấm là 135-145 µg/ml [30]. Bệnh thán thƣ do nấm bệnh colletotrichum gloeosporioides gây ra làm giảm năng suất và chất lƣợng đến nhiều loại cây trồng nhƣ hồ tiêu, quất, xoài và nhiều loài cây trồng khác, gây tổn thƣơng nặng nề đến lợi ích thƣơng mại trên thế giới. Trong quá trình phân lập một số chủng vi khuẩn từ đất, Kim và cộng sự (2010) đã tìm ra đƣợc chủng B.subtilis CMB32 có tiềm năng trong việc kiểm soát chủng nấm bệnh C.gloeosporioides, sử dụng phƣơng pháp khối phổ MALDI-TOF để phân tích, kết quả đã cho thấy chủng B.subtilis CMB32 có khả năng sinh tổng hợp ra 3 loại peptide kháng nấm: inturin , fengycin và surfactin A [29]. Mendizabal và cộng sự (2012) đã tìm ra chủng CPA-8 có khả năng kiểm soát bệnh thối rễ do nấm bệnh monilinia spp gây ra trên cây đào. Thí nghiệm ức chế sự tăng trƣởng bằng cách sử dụng hoạt chất từ dịch nuôi cấy tế bào đƣợc chiết xuất bằng butanol đã cho thấy kết quả ức chế mạnh đối với nấm M.laxa và M.fructicola. Hoạt chất kháng nấm từ chủng B.subtilis CPA-8 đã đƣợc xác định là fengycin, giống liopeptide và có hoạt tính kháng nấm mạnh [43]. Yiu-Kowk và cộng sự (2012) đã phân lập đƣợc chủng B.subtilis D1/2 từ đất canh tác có khả năng ức chế nấm F. graminearum. Hoạt tính kháng nấm của chủng vi khuẩn này do một loại polypeptide ngoại bào và đã xác định là fengycin. Ứng dụng chủng vi khuẩn trên trồng ngô và lúa mì để kiểm soát bệnh thối tai và tàn rụi đầu đã đƣợc đã đƣợc kiểm soát hoàn toàn, trên cây ngô thì bệnh thối tai đã giảm đi một nửa. Mặc dù chƣa kiểm soát đƣợc triệt để trên cây
11 ngô, nhƣng có thể thấy chủng B.subtilis D1/2 có tiểm năng rất lớn trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng và sản xuất chế phẩm kháng nấm [61]. Năm 2012 , Malfnovan và cộng sự khi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ đã phát hiện tới 8 loại hợp chất polypeptide mạch vòng có hoạt tính kháng nấm trong dịch chiết ngoại bào của chủng B. subtilis HC8. Dựa vào thời gian lƣu và khối lƣợng phân tử, đã xác định đƣợc các hợp chất kháng nấm này chủ yếu thuộc 3 họ kháng sinh lớn đó là iturin, fengycin và surfactin. Trong đó thì họ kháng sinh fengycin cho kết qủa tác động mạnh nhất đến việc ức chế sự phát triển của nấm đối kháng. Chủng B. subtilis HC8 đƣợc xác định là chủng đầu tiên có khả năng sinh tổng hợp ngoại bào cả 3 họ kháng sinh lớn, đây là chủng vi khuẩn có tiềm năng rất lớn trong kiểm soát dịch bệnh hại cây trồng. [42]. Tan và cộng sự (2013) đã phân lập đƣợc vi khuẩn B. subtilis B25 từ đất vùng rễ chuối, thí nghiệm cho thấy chủng B25 có khả năng đối kháng mạnh mẽ đối với nấm Fusarium. Ngoài ra chúng còn có khả năng ức chế tốt đối với các nấm corynespora casiicola, Alternaria solani, Botrytis cinerea … Sau khi soi dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy protein kháng nấm của B. subtilis B25 có khả năng ức chế mạnh đối với nấm dẫn đến sợi nấm sƣng lên, biến dạng, bất thƣờng [58]. Năm 2013, khi quan sát hình thái và phân tích dữ liệu phân tử, bao gồm cả trình tự gen 16S rDNA và gyraseA (gyrA) các mẫu vi khuẩn đƣợc lấy từ bùn Gomsohang và Mohang ở đảo Jeju Hàn Quốc, Ji và cộng sự đã phân lập đƣợc chủng Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 có hoạt tính đối kháng đáng kể đối với các loại nấm gây bệnh. Bằng sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao, đã xác định đƣợc hoạt chất kháng nấm là iturin. Các hoạt chất bán tinh khiết hạn chế đáng kể sự phát triển của nấm sợi gây bệnh (Alternaria, Botrytics cinema, Colletotrichum orbiculare, Penicillium digitatum, Pyricularia grisea và Sclerotinia sclerotiorum) ở 200 độ ppm. Dịch thô
12 của hoạt chất này có khả năng chống thối dƣa chuột trong phòng thí nghiệm, và cho thấy khả năng chống lại nấm mốc xám ở cà chua, dƣa chuột và bí đỏ trong điều kiện nhà kính [26]. Năm 2014, Guo và cộng sự khi nghiên cứu vi khuẩn B. subtilis NCD-2 để sản xuất fengycin đã thấy rằng chúng có khả năng đối kháng mạnh mẽ với nấm Phytopathogenic, và có chức năng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học tuyệt đối với các bệnh do nấm ở cây bông. Nghiên cứu của Guo đã chứng minh rằng fengycin là một loại polipeptide có hoạt tính kháng nấm chính đƣợc sản xuất bởi B. subtilis NCD-2. Những hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế và kiểm soát bệnh do nấm R. solani gây ra [24]. Nghiên cứu mới đây nhất của Christopher và cộng sự (2015) đã phân lập đƣợc vi khuẩn B. subtilis OH131.1 là một chất đối kháng của nấm F. graminearum, một mầm bệnh gây nên bệnh bạc lá lúa mì. Bộ gen của vi khuẩn B. subtilis OH131.1 đƣợc giải trình tự có hoạt tính trong việc kiểm soát sinh học [18]. Ngoài ra trên thế giới, đã có nhiều chế phẩm từ các hoạt chất vi sinh vật đƣợc thƣơng mại hóa. Điển hình là Ballad – một chế phẩm từ chủngB. pumilus (Stain QST 2808) của hãng AgraQuest, là sản phẩm năm 2005, có thể sử dụng cho khoai tây, đậu tƣơng, ngũ cốc… Chủng B. pumilus sinh tổng hợp một chất đƣờng amoni chống nấm mà ngăn sự hình thành các tế bào mới và làm rối loạn trao đổi chất tế bào, dẫn đến phá hủy tế bào và diệt thể gây bệnh cây trồng. Ballad cũng tạo ra các rào cản vi khuẩn trên bề mặt lá, ngăn cản thể gây bệnh nhƣ nấm gây rỉ sắt và mốc sƣơng từ khi hình thành trên thực vật. Thuốc này có phổ sử dụng rộng. Đƣợc ghi vào danh sách chất kiểm soát gỉ sắt (rỉ sắt trên cây đậu tƣơng, Châu Á), mốc sƣơng, mốc lông tơ và bệnh bạc lá.