intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống một số dòng Tếch (Tectona Grandis Linn) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Tri Lễ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:84

26
lượt xem
2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu: Xác định phương thức và các loại môi trường thích hợp cho việc nhân giống Tếch bằng nuôi cấy mô tế bào, xác định khả năng nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào cho một số dòng Tếch. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống một số dòng Tếch (Tectona Grandis Linn) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

  1. Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Bé n«ng nghiÖp vµ PTNT Tr­êng ®¹i häc l©m nghiÖp NguyÔn thÞ thuú D­¬ng Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng tÕch (Tectona grandis Linn) b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc L©m nghiÖp Hà T©y 2007
  2. Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Bé n«ng nghiÖp vµ PTNT Tr­êng ®¹i häc l©m nghiÖp NguyÔn thÞ thuú D­¬ng Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng tÕch (Tectona grandis Linn) b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro Chuyªn ngµnh: L©m häc M· sè: 60.62.60 LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc L©m nghiÖp Ng­êi h­íng dÉn: T.S Hµ huy thÞnh Hà T©y 2007
  3. Lêi nãi ®Çu N©ng cao chÊt l­îng ®µo t¹o b»ng nghiªn cøu khoa häc lµ môc tiªu quan träng trong viÖc ®µo t¹o cao häc cña Tr­êng ®¹i häc L©m nghiÖp. §Ó hoµn thµnh ch­¬ng tr×nh ®µo t¹o Cao häc L©m nghiÖp kho¸ häc 2005- 2007, ®­îc sù ®ång ý cña Khoa sau ®¹i häc - Tr­êng §¹i häc L©m nghiÖp, t«i thùc hiÖn ®Ò tµi tèt nghiÖp: "Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng TÕch (Tectona grandis Linn) b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro”. §­îc sù nhÊt trÝ cña Ban l·nh ®¹o Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng, ®Ò tµi ®­îc thùc hiÖn t¹i phßng nghiªn cøu nu«i cÊy m« - Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng. §Ó ®¹t ®­îc kÕt qu¶ trong häc tËp vµ hoµn thµnh luËn v¨n tèt nghiÖp nµy, t¸c gi¶ ®· nhËn ®­îc sù quan t©m vµ gióp ®ì tËn t×nh vÒ nhiÒu mÆt cña Tr­êng ®¹i häc L©m nghiÖp, ®Æc biÖt lµ Khoa sau ®¹i häc, cïng tÊt c¶ c¸c thÇy c« gi¸o trùc tiÕp gi¶ng d¹y, còng nh­ l·nh ®¹o Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng. Cho phÐp t«i ®­îc bµy tá lßng biÕt ¬n ch©n thµnh ®Õn c¸c thÇy, c« gi¸o, ®Æc biÖt lµ T.S Hµ Huy ThÞnh vµ Th.S §oµn ThÞ Mai, toµn thÓ c¸n bé c«ng nh©n viªn t¹i trung t©m ®· tËn t×nh h­íng dÉn, chØ b¶o gióp ®ì t«i hoµn thµnh b¶n luËn v¨n nµy. Trong b¶n luËn v¨n nµy kh«ng thÓ tr¸nh khái nh÷ng khiÕm khuyÕt, rÊt mong ®­îc sù chØ b¶o bæ sung ý kiÕn cña c¸c nhµ khoa häc, c¸c b¹n ®ång nghiÖp ®Ó c«ng tr×nh nghiªn cøu nµy ®­îc hoµn thiÖn. T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n! Hµ T©y, Ngµy 25/09/2007 T¸c gi¶
  4. 1 §Æt vÊn ®Ò Theo quyÕt ®Þnh cña thñ t­íng chÝnh phñ (Q§ sè 17/2006/N§-TTg), ®Õn n¨m 2020 chóng ta ph¶i t¹o ra c¸c gièng c©y trång, vËt nu«i… cã n¨ng suÊt cao, chÊt l­îng vµ hiÖu qu¶ kinh tÕ cao phôc vô tèt nhu cÇu chuyÓn ®æi c¬ cÊu kinh tÕ trong lÜnh vùc N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn n«ng th«n. Mét trong nh÷ng nhiÖm vô cña ngµnh L©m nghiÖp lµ “ph¸t triÓn vi nh©n gièng vµ ®¸p øng ®ñ nhu cÇu vÒ gièng c©y L©m nghiÖp vµo n¨m 2015” [16]. TÕch lµ loµi sinh tr­ëng nhanh cã biªn ®é sinh th¸i réng h¬n n÷a gç TÕch ®­îc sö dông phæ biÕn trong x©y dùng vµ lµm ®å gç gia dông v× cã kh¶ n¨ng chèng mèi mät, chÞu n­íc l©u ngµy, mÆt gç cã ®é bãng cao. Trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn gç: TÕch lµ loµi c©y cã chÊt l­îng gç mÞn cã thÓ bãc t¸ch thµnh tÊm máng. Do gç TÕch cã tû träng nhÑ, Ýt bÞ hµ b¸m, chÞu va ®Ëp vµ ng©m n­íc mÆn nªn ®­îc dïng trong c«ng nghiÖp ®ãng tµu. MÆt kh¸c, nhu cÇu th­¬ng m¹i cña gç TÕch ngµy cµng t¨ng bëi nã cã thÓ thay thÕ mét sè loµi gç quý kh¸c[42]. C©y TÕch ®­îc trång th¨m dß ë n­íc ta vµo kho¶ng nh÷ng n¨m 30 cña thÕ kû 20. Lóc ®Çu, c©y TÕch ®­îc trång thö ë c«ng viªn hoÆc trªn ®­êng phè t¹i nhiÒu tØnh nh­: Hµ Giang, Tuyªn Quang, S¬n La, Lai Ch©u, Hµ Néi, §¾c L¾c, §ång Nai, T©y Ninh, Sµi Gßn… Còng trong thêi gian nµy chØ riªng ë Léc Ninh, TØnh B×nh Ph­íc ®· g©y trång TÕch thµnh nh÷ng khu rõng nhá. Vµo nh÷ng n¨m 60, víi nguån gièng thu h¸i tõ Léc Ninh ®· trång thµnh c«ng mét khu rõng TÕch 200 ha t¹i §Þnh Qu¸n, tØnh §ång Nai vµ mét khu rõng TÕch 5 ha t¹i Eak – Mat, tØnh §¾c L¾c. Sau n¨m 1975, c©y TÕch ®­îc trång më réng ë nhiÒu l©m tr­êng trong c¸c tØnh miÒn §«ng Nam Bé vµ T©y Nguyªn nh­: §ång Nai, B×nh Ph­íc, T©y Ninh, §¾c L¾c, Gia Lai, Kom Tum…Nh­ng do ch­a cã gièng ®­îc c¶i thiÖn nªn chÊt l­îng rõng kh«ng cao, n¨ng suÊt rõng trång TÕch ë n­íc ta cßn thÊp (9 – 12m3/ n¨m) [17]. HiÖn nay, diÖn tÝch rõng TÕch trång míi cña c¸c n­íc trªn thÕ giíi mçi n¨m t¨ng nhanh, nhiÒu nhÊt lµ ë Indonesia kho¶ng 1.760 ngh×n ha, Ên §é kho¶ng 2.450 ngh×n ha, Myanmar lµ 139 ngh×n ha, Malaysia kho¶ng 4 ngh×n ha, Th¸i Lan lµ
  5. 2 836 ngh×n ha [29]. ë ViÖt Nam, diÖn tÝch trång TÕch chØ ®¹t 1.500 ha, rÊt Ýt so víi c¸c n­íc trong khu vùc do nhiÒu nguyªn nh©n kh¸c nhau mµ thiÕu gièng ®­îc c¶i thiÖn lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n quan träng. ChÝnh v× thÕ c«ng t¸c chän t¹o vµ nh©n gièng mét sè dßng tÕch cã n¨ng suÊt cao lµ vÊn ®Ò cÇn thiÕt. HiÖn nay, c©y gièng s¶n xuÊt tõ h¹t ®­îc sö dông phæ biÕn nh­ng kh«ng ®¸p øng ®­îc nhu cÇu trång rõng do kh«ng cã rõng gièng chuyªn canh, h¹t gièng thu h¸i x« bå nªn phÈm chÊt h¹t kÐm. H¬n n÷a c¸ch nh©n gièng nµy cßn g©y ra hiÖn t­îng ph©n ly tÝnh tr¹ng v× thô phÊn tù do lµm cho c©y trång kh«ng ®ång ®Òu dÉn ®Õn n¨ng suÊt rõng biÕn ®éng. Mét khã kh¨n n÷a lµ n¨ng suÊt h¹t trªn mét c©y còng rÊt thÊp (1 ha rõng 15 tuæi chØ cho kho¶ng 50 kg h¹t). Kh«ng nh÷ng thÕ, h¹t TÕch trong tù nhiªn cã kh¶ n¨ng n¶y mÇm thÊp, trong v­ên ­¬m tû lÖ n¶y mÇm còng kh«ng cao, chØ ®¹t kho¶ng 5-10% [28] [42]. §Ó kh¾c phôc nh÷ng nh­îc ®iÓm trªn th× gi¶i ph¸p nh©n gièng sinh d­ìng ngµy cµng ®­îc quan t©m. Tuy nhiªn ®èi víi loµi TÕch th× ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh b»ng hom còng gÆp nhiÒu khã kh¨n do tû lÖ ra rÔ kh«ng cao chØ ®¹t kho¶ng 24-30% [3]. ChÝnh v× nh÷ng lý do trªn nªn gi¶i ph¸p nh©n gièng sinh d­ìng b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo ®ang ®­îc quan t©m nghiªn cøu. Nh©n gièng b»ng kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo, cßn gäi lµ nh©n gièng in vitro, lµ ph­¬ng ph¸p s¶n xuÊt c©y con tõ chåi v­ît cña c©y mÑ b»ng c¸ch nu«i cÊy chóng trong èng nghiÖm, ë ®iÒu kiÖn v« trïng tuyÖt ®èi víi m«i tr­êng thÝch hîp vµ cã thÓ kiÓm so¸t trong ®iÒu kiÖn hoµn c¶nh ®ång nhÊt. Nu«i cÊy m« tÕ bµo cã thÓ nh©n nhanh víi sè l­îng c©y con lín trong mét kho¶ng thêi gian ng¾n, ®­îc tiÕn hµnh trong ®iÒu kiÖn phßng thÝ nghiÖm nªn hoµn toµn chñ ®éng trong s¶n xuÊt. Ngoµi ra, kü thuËt nµy cßn gióp chóng ta cã thÓ t¹o ra gièng míi, t¹o nguån c©y s¹ch bÖnh, t¹o ra c©y con cã ®é ®ång ®Òu cao vµ duy tr× ®­îc nh÷ng ®Æc tÝnh tèt nhÊt cña c©y mÑ. Tõ nh÷ng lý do trªn ®Ò tµi “Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng TÕch b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro” ®­îc tiÕn hµnh. §©y lµ mét néi dung trong ®Ò tµi cÊp bé “Nghiªn cøu tuyÓn chän vµ nh©n gièng Xoan ta vµ TÕch cã n¨ng suÊt cao”.
  6. 3 Ch­¬ng 1 Tæng quan vÊn ®Ò nghiªn cøu 1.1. Kh¸i niÖm vµ c¬ së khoa häc cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt 1.1.1. Kh¸i niÖm Nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt hay cßn gäi lµ vi nh©n gièng lµ ph­¬ng ph¸p s¶n xuÊt hµng lo¹t c©y con tõ chåi non cña c©y (c¬ quan, m« tÕ bµo) b»ng c¸ch nu«i cÊy chóng trong èng nghiÖm ë c¸c ®iÒu kiÖn v« trïng tuyÖt ®èi víi m«i tr­êng thÝch hîp vµ ®­îc kiÓm so¸t. ThuËt ng÷ “nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt” hay “nu«i cÊy in vitro” lµ ph¹m trï kh¸i niÖm chØ tÊt c¶ c¸c lo¹i nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo ë ®iÒu kiÖn v« trïng, bao gåm:  Nu«i cÊy c©y: nu«i cÊy thùc vËt.  Nu«i cÊy c¸c bé phËn ®· ®­îc t¸ch khái thùc c¬ thÓ thùc vËt: nu«i cÊy c¬ quan  Nu«i cÊy c¸c ph«i thµnh thôc hay ch­a thµnh thôc ®· ®­îc t¸ch khái c¬ thÓ thùc vËt: nu«i cÊy ph«i.  Nu«i cÊy m« b¾t nguån tõ c¬ quan thùc vËt: nu«i cÊy m« hay nu«i cÊy m« sÑo.  Nu«i cÊy tÕ bµo ®¬n lÎ hay c¸c côm tÕ bµo rÊt nhá trong m«i tr­êng láng.  Nu«i cÊy tÕ bµo thùc vËt sau khi ®· t¸ch bá vá tÕ bµo, cßn gäi lµ nu«i cÊy tÕ bµo trÇn (protoplast) [14]. 1.1.2. C¬ së khoa häc cña cña nu«i cÊy m« tÕ bµo * TÝnh toµn n¨ng (totipotence) N¨m 1902 lÇn ®Çu tiªn nhµ thùc vËt häc ng­êi §øc Haberlandt ®· ®­a ra quan niÖm: “Mçi tÕ bµo bÊt kú (®· biÖt ho¸) lÊy tõ mét c¬ thÓ thùc vËt ®Òu cã kh¶ n¨ng tiÒm tµng ®Ó cã thÓ ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh”. Theo
  7. 4 quan niÖm cña sinh häc hiÖn ®¹i th× mçi tÕ bµo riªng rÏ ®· biÖt ho¸ ®Òu chøa toµn bé th«ng tin di truyÒn (ADN) cÇn thiÕt cña c¬ thÓ ®ã, nÕu gÆp ®iÒu kiÖn thÝch hîp th× mçi tÕ bµo ®Òu cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh, ®ã lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo thùc vËt. TÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo chÝnh lµ c¬ së lý luËn cña nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËy. Cho ®Õn nay, con ng­êi ®· hoµn toµn chøng minh ®­îc kh¶ n¨ng t¸i sinh mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ. * Sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo C¬ thÓ thùc vËt tr­ëng thµnh lµ mét chØnh thÓ thèng nhÊt bao gåm nhiÒu c¬ quan chøc n¨ng kh¸c nhau, trong ®ã cã nhiÒu lo¹i tÕ bµo kh¸c nhau thùc hiÖn c¸c chøc n¨ng cô thÓ kh¸c nhau. Tuy nhiªn, tÊt c¶ c¸c lo¹i tÕ bµo ®ã ®Òu b¾t nguån tõ tÕ bµo ph«i sinh. Sù ph©n ho¸ tÕ bµo lµ sù chuyÓn ho¸ c¸c tÕ bµo ph«i sinh thµnh c¸c tÕ bµo cña c¸c m« chuyªn ho¸ ®¶m nhËn c¸c chøc n¨ng kh¸c nhau cña c¬ thÓ. Qu¸ tr×nh ph©n ho¸ cã thÓ biÓu thÞ nh­ sau: Ph©n ho¸ TÕ bµo ph«i sinh TÕ bµo d·n TÕ bµo chuyªn ho¸ Ph¶n ph©n ho¸ S¬ ®å 1.1: Qu¸ tr×nh ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo Qu¸ tr×nh nµy gåm cã c¸c giai ®o¹n - Sù ph©n chia tÕ bµo: Qu¸ tr×nh ph©n chia tÕ bµo x¶y ra trong m« ph©n sinh lµm cho sè l­îng tÕ bµo t¨ng lªn mét c¸ch ®¸ng kÓ.
  8. 5 - Sù d·n tÕ bµo: TÕ bµo d·n ra c¶ vÒ chiÒu ngang vµ chiÒu däc lµm t¨ng kÝch th­íc cña tõng c¬ quan nãi riªng vµ toµn bé c¬ thÓ nãi chung. Sau hai giai ®o¹n nµy cïng víi qu¸ tr×nh biÖt ho¸ tÕ bµo ph©n ho¸ thµnh c¸c m« cã chøc n¨ng riªng biÖt, ®¶m nhËn c¸c vai trß kh¸c nhau trong cïng mét c¬ thÓ sèng. Tuy nhiªn, khi tÕ bµo ph©n ho¸ thµnh c¸c m« chøc n¨ng th× chóng kh«ng hoµn toµn mÊt ®i kh¶ n¨ng ph©n chia cña m×nh. Trong mét ®iÒu kiÖn nhÊt ®Þnh nµo ®ã c¸c tÕ bµo nµy l¹i cã thÓ trë thµnh d¹ng tÕ bµo ph«i sinh vµ tiÕp tôc qu¸ tr×nh ph©n chia cho ra c¸c tÕ bµo míi cã kh¶ n¨ng t¸i sinh thµnh c©y hoµn chØnh. §©y chÝnh lµ qu¸ tr×nh ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo. VÒ b¶n chÊt th× sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ lµ mét qu¸ tr×nh ®iÒu hoµ ho¹t ho¸ gen. T¹i mét thêi ®iÓm nµo ®ã trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn c¸ thÓ, cã mét sè gen bÞ øc chÕ ®­îc ho¹t ho¸ trë l¹i ®Ó t¹o ra tÝnh tr¹ng míi, mét sè gen kh¸c l¹i bÞ ®×nh chØ ho¹t ®éng. §iÒu nµy x¶y ra theo mét ch­¬ng tr×nh ®· ®­îc m· ho¸ trong cÊu tróc ph©n tö ADN ë mçi tÕ bµo. MÆt kh¸c, khi tÕ bµo n»m trong mét khèi m« cña c¬ thÓ, nã th­êng bÞ øc chÕ bëi c¸c tÕ bµo ë xung quanh. Khi tÕ bµo ®­îc t¸ch riªng ra, gÆp ®iÒu kiÖn thuËn lîi th× c¸c gen ®­îc ho¹t ho¸, qu¸ tr×nh nµy sÏ diÔn biÕn theo mét ch­¬ng tr×nh ®· ®Þnh s½n trong bé gen ®ã. 1.2. C¸c giai ®o¹n chÝnh trong qu¸ tr×nh nh©n gièng in vitro 1.2.1. Giai ®o¹n chuÈn bÞ Môc ®Ých cña giai ®o¹n chuÈn bÞ nh»m t¹o ra nguån mÉu s¹ch ®Ó phôc vô cho c¸c b­íc tiÕp theo. Giai ®o¹n nµy coi nh­ mét b­íc thuÇn ho¸ vËt liÖu ®Ó nu«i cÊy. C©y gièng ®­îc ®­a ra khái n¬i ph©n bè tù nhiªn ®Ó chóng thÝch øng víi m«i tr­êng míi, ®ång thêi gi¶m bít kh¶ n¨ng nhiÔm bÖnh cña cña mÉu nu«i cÊy vµ chñ ®éng trong c«ng t¸c nh©n gièng. Trong tr­êng hîp cÇn thiÕt cã thÓ lµm trÎ ho¸ vËt liÖu gièng.
  9. 6 1.2.2. Giai ®o¹n cÊy khëi ®éng Môc ®Ých cña giai ®o¹n nµy lµ t¹o ra c¸c chåi míi tõ c¸c m« nu«i cÊy. Khi ®· cã nguån nguyªn liÖu nu«i cÊy, tiÕn hµnh lÊy mÉu vµ xö lý trong nh÷ng ®iÒu kiÖn v« trïng. Ng­êi ta th­êng dïng mét sè ho¸ chÊt nh­ HgCl2, Ca(Ocl)2, H2O2… ®Ó khö trïng mÉu cÊy. Tuú thuéc vµo tõng lo¹i vËt liÖu mµ chän ho¸ chÊt, nång ®é vµ thêi gian khö trïng thÝch hîp. VÒ nguyªn t¾c, m« nu«i cÊy cã thÓ lµ bÊt kú bé phËn nµo cña c©y (th©n, rÔ, l¸, hoa qu¶) nh­ng theo Bhatt th× m« lÊy tõ c¸c phÇn non cña c©y cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy thµnh c«ng cao h¬n m« lÊy tõ c¸c bé phËn tr­ëng thµnh kh¸c [29]. V× vËy, ng­êi ta th­êng lÊy chåi ®Ønh hay chåi n¸ch ®Ó nu«i cÊy in vitro. Ngoµi ra, khi lùa chän m« nu«i cÊy cÇn chó ý tuæi sinh lý cña m« cµng thÊp th× ®é trÎ ho¸ cµng cao, nu«i cÊy dÔ thµnh c«ng. C¸c m« lÊy ë thêi kú sinh tr­ëng m¹nh cña c©y trong mïa sinh tr­ëng cho kh¶ n¨ng t¸i sinh tèt h¬n (Anolesnon 1980). §èi víi mÉu dÔ bÞ ho¸ n©u khi nu«i cÊy cã thÓ bæ sung than ho¹t tÝnh hoÆc Polyvinylpyrroline (PVP) vµo m«i tr­êng [8]. Giai ®o¹n nµy cÇn ®¶m b¶o c¸c yªu cÇu: tû lÖ m« nhiÔm thÊp, tû lÖ sèng cao, m« tån t¹i vµ sinh tr­ëng tèt. KÕt qu¶ cña giai ®o¹n nµy phô thuéc vµo viÖc chän bé phËn nu«i cÊy, cho nªn khi lÊy mÉu cÇn ®¶m b¶o c¸c nguyªn t¾c nªu trªn. Giai ®o¹n nµy th­êng kÐo dµi 4 – 6 tuÇn. 1.2.3. Giai ®o¹n nh©n nhanh Mét trong nh÷ng ­u ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro so víi c¸c ph­¬ng ph¸p nh©n gièng kh¸c lµ cã hÖ sè nh©n cao. V× vËy, cã thÓ coi ®©y lµ giai ®o¹n then chèt cña toµn bé qu¸ tr×nh nh©n gièng. HÖ sè nh©n ë giai ®o¹n nµy biÕn ®éng tõ 5 ®Õn 50 lÇn tuú thuéc vµo loµi c©y, m«i tr­êng vµ ph­¬ng ph¸p nh©n. §Ó t¹o hÖ sè nh©n cao cÇn lùa chän m«i tr­êng vµ ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh thÝch hîp. Trong giai ®o¹n nµy vai trß cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng (Auxin, Cytokinin) lµ cùc kú quan träng ®Ó s¶n sinh ra l­îng c©y con tèi ®a mµ vÉn ®¶m b¶o søc sèng vµ b¶n chÊt di truyÒn cña c©y. Theo
  10. 7 nguyªn t¾c chung th× trong m«i tr­êng cã nhiÒu Cytokinin sÏ kÝch thÝch t¹o chåi. ChÕ ®é nu«i cÊy th­êng lµ 25 – 27oC vµ 10 – 16 giê chiÕu s¸ng/ngµy, c­êng ®é ¸nh s¸ng 1000 – 3000lux. Yªu cÇu cña giai ®o¹n nµy lµ t¹o ra sè l­îng c©y con tèi ®a trong thêi gian ng¾n nh­ng vÉn ®¶m b¶o søc sèng vµ b¶n chÊt di truyÒn cña c©y. 1.2.4. T¹o c©y hoµn chØnh (cho ra rÔ) §©y lµ giai ®o¹n chuÈn bÞ cho c©y con chuyÓn ra ngoµi hÖ thèng v« trïng khi ®¹t ®­îc kÝch th­íc nhÊt ®Þnh, c¸c chåi ®­îc chuyÓn tõ m«i tr­êng ë giai ®o¹n 3 sang m«i tr­êng t¹o rÔ. Th­êng sau 2 – 3 tuÇn ë c¸c chåi nµy sÏ xuÊt hiÖn rÔ vµ trë thµnh c©y hoµn chØnh. M«i tr­êng t¹o rÔ ®­îc gi¶m l­îng Cytokinin vµ t¨ng l­îng Auxin ®Ó t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho sù ra rÔ cña chåi c©y. Ng­êi ta th­êng dïng c¸c chÊt NAA (Axit α-naphtyl axetic), IBA (Axit β-indol butyric) vµ IAA (Axit β-indol axetic) ë nång ®é 1mg/lÝt ®Õn 5 mg/lÝt ®Ó t¹o rÔ cho hÇu hÕt c¸c loµi c©y trång. Giai ®o¹n nµy th­êng kÐo dµi tõ 2 – 4 tuÇn lÔ, sau ®ã ®­îc chuyÓn sang m«i tr­êng kh«ng cã Auxin ®Ó rÔ ph¸t triÓn. ë giai ®o¹n nµy c©y con rÊt nh¹y c¶m víi Èm ®é vµ bÖnh tËt do ho¹t ®éng cña l¸ vµ rÔ míi ph¸t sinh rÊt yÕu, c©y ch­a chuyÓn sang giai ®o¹n tù d­ìng. 1.2.5. §­a c©y ra m«i tr­êng tù nhiªn §©y lµ giai ®o¹n chuyÓn dÇn c©y con tõ èng nghiÖm ra nhµ kÝnh råi ra ngoµi trêi. C©y m« ®­îc chuyÓn tõ m«i tr­êng dÞ d­ìng sang m«i tr­êng tù d­ìng nªn ph¶i tËp cho c©y quen dÇn víi m«i tr­êng tù nhiªn, tr¸nh sù thay ®æi ®ét ngét lµm c©y cã thÓ sèc hoÆc bÞ chÕt. Khi c©y con ®· cøng c¸p vµ ®¹t nh÷ng tiªu chuÈn nhÊt ®Þnh vÒ chiÒu cao, sè l¸ vµ sè rÔ th× ®­a ra ngoµi gi¸ thÓ. Gi¸ thÓ tiÕp nhËn c©y in vitro ph¶i ®¶m b¶o t¬i, xèp, tho¸ng n­íc vµ s¹ch bÖnh. Ph¶i gi÷ Èm cho c©y khi míi ®­a tõ b×nh nu«i ra, cÇn duy tr× ®é Èm trªn 50% ®Ó c©y con kh«ng mÊt n­íc vµ lµm giµn che ®Ó tr¸nh ¸nh s¸ng qu¸ m¹nh. Sau 2 – 3 tuÇn ®­a ra ngoµi c©y m« sÏ sinh tr­ëng æn ®Þnh, ch¨m sãc c©y m« t­¬ng tù chÕ ®é ch¨m sãc c©y hom hoÆc c©y tõ h¹t.
  11. 8 1.3. C¸c nh©n tè ¶nh h­ëng tíi qu¸ tr×nh nh©n gièng in vitro 1.3.1. M«i tr­êng nu«i cÊy Trong nu«i cÊy in vitro, m«i tr­êng nu«i cÊy vµ ®iÒu kiÖn bªn ngoµi ®­îc xem lµ vÊn ®Ò quyÕt ®Þnh sù thµnh b¹i cña qu¸ tr×nh nu«i cÊy. M«i tr­êng nu«i cÊy ®­îc xem lµ phÇn ®Öm ®Ó cung cÊp c¸c chÊt dinh d­ìng cÇn thiÕt cho sù t¨ng tr­ëng vµ ph©n ho¸ m« trong suèt qóa tr×nh nu«i cÊy in vitro. Cho ®Õn nay, ®· cã nhiÒu m«i tr­êng dinh d­ìng ®­îc t×m ra (MS – 62, WPM, SH…) tuú thuéc vµo ®èi t­îng vµ môc ®Ých nu«i cÊy. VÊn ®Ò lùa chän m«i tr­êng thÝch hîp cho c©y sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn tèi ­u trong tõng giai ®o¹n cña nu«i cÊy in vitro lµ rÊt quan träng. M«i tr­êng nu«i cÊy cña hÇu hÕt c¸c loµi thùc vËt bao gåm c¸c muèi kho¸ng ®a l­îng, vi l­îng, nguån c¸c bon, c¸c axit amin vµ c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng (còng cã thÓ bæ sung thªm mét sè chÊt phô gia kh¸c nh­ than ho¹t tÝnh…) tuú vµo tõng loµi, gièng, nguån gèc mÉu cÊy, thËm chÝ tuú tõng c¬ quan kh¸c nhau trªn cïng c¬ thÓ mµ dinh d­ìng cÇn cho sù sinh tr­ëng tèi ­u cña chóng kh¸c nhau. V× vËy, vÊn ®Ò cÇn lùa chän m«i tr­êng thÝch hîp cho sinh tr­ëng, ph¸t triÓn tèi ­u cho tõng giai ®o¹n cña hÖ m« trong nu«i cÊy in vitro rÊt quan träng, sè l­îng vµ c¸c lo¹i ho¸ chÊt ph¶i cùc kú chÝnh x¸c phï hîp víi tõng ®èi t­îng cô thÓ. Tuy nhiªn, m«i tr­êng nu«i cÊy bao giê còng cã nh÷ng thµnh phÇn sau: + Nguån C¸cbon: Trong nu«i cÊy m«, c¸c tÕ bµo ch­a cã kh¶ n¨ng quang hîp ®Ó tæng hîp nªn chÊt h÷u c¬ nªn ng­êi ta ph¶i ®­a vµo m«i tr­êng mét l­îng hîp chÊt c¸cbon nhÊt ®Þnh ®Ó cung cÊp ®Ó cung cÊp n¨ng l­îng cho tÕ bµo vµ m« (Debengh – 1991). Nguån c¸cbon ë ®©y lµ c¸c lo¹i ®­êng kho¶ng 20 – 30mg/lÝt cã t¸c dông gióp m« tÕ bµo thùc vËt tæng hîp c¸c hîp chÊt h÷u c¬, gióp tÕ bµo t¨ng sinh khèi, ngoµi ra nã cßn ®ãng vai trß lµ chÊt thÈm thÊu chÝnh cña m«i tr­êng. Ng­êi ta th­êng sö dông 2 lo¹i ®­êng ®ã lµ Saccarose vµ Glucose [13].
  12. 9 + Nguån Nit¬: Tû lÖ nguån Nit¬ tuú thuéc vµo loµi c©y vµ tr¹ng th¸i ph¸t triÓn cña m«. Th«ng th­êng, nguån nit¬ ®­îc ®­a vµo m«i tr­êng ë hai d¹ng lµ NH4+ (amoni) vµ NO3- (Nitrat). Trong ®ã, viÖc hÊp thô NO3- cña c¸c tÕ bµo thùc vËt tá ra cã hiÖu qu¶ h¬n so víi NH4+ . Nh­ng ®«i khi NO3- g©y ra hiÖn t­îng “kiÒm ho¸” m«i tr­êng v× vËy gi¶i ph¸p sö dông phèi hîp c¶ 2 nguån nit¬ víi tØ lÖ hîp lý ®­îc sö dông réng r·i nhÊt. + C¸c nguyªn tè ®a l­îng: lµ nh÷ng nguyªn tè kho¸ng nh­: N, P, K, S, Mg, Ca cÇn thiÕt vµ thay ®æi tuú ®èi t­îng nu«i cÊy. Nh×n chung, c¸c nguyªn tè nµy ®­îc sö dông ë nång ®é trªn 30ppm. C¸c nguyªn tè nµy cã chøc n¨ng cung cÊp nguyªn liÖu ®Ó m« hoÆc tÕ bµo thùc vËt x©y dùng thµnh phÇn cÊu tróc hoÆc gióp cho qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt gi÷a tÕ bµo thùc vËt víi m«i tr­êng ®­îc thuËn lîi. Cã nhiÒu m«i tr­êng víi thµnh phÇn, tØ lÖ c¸c chÊt kh¸c nhau, chóng ta cã thÓ lùa chän ®Ó sö dông. Nãi chung, m«i tr­êng giµu Nit¬ thÝch hîp cho viÖc h×nh thµnh chåi, cßn m«i tr­êng giµu Kali sÏ thóc ®Èy qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt m¹nh h¬n. Thµnh phÇn kho¸ng cña mét m«i tr­êng cÊy ®­îc x¸c ®Þnh do sù c©n b»ng nång ®é cña nh÷ng ion kh¸c nhau trong dung dÞch (nång ®é ion thÓ hiÖn b»ng mg/lÝt). ViÖc lùa chän thµnh phÇn vµ hµm l­îng kho¸ng cho mét ®èi t­îng nu«i cÊy lµ rÊt khã ®ßi hái ng­êi lµm c«ng t¸c nu«i cÊy m« ph¶i cã nh÷ng hiÓu biÕt c¬ b¶n vÒ sinh lý thùc vËt ®èi víi dinh d­ìng kho¸ng. + Nhãm c¸c nguyªn tè vi l­îng:Fe, Cu, Zn, Mg, Mo, B, Co, I … lµ c¸c nguyªn tè rÊt quan träng vµ kh«ng thÓ thiÕu cho sù ph¸t triÓn cña m« vµ tÕ bµo do chóng ®ãng vai trß quan träng trong c¸c ho¹t ®éng cña enzym. Chóng ®­îc dïng ë nång ®é thÊp h¬n nhiÒu so víi c¸c nguyªn tè ®a l­îng ®Ó ®¶m b¶o sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn b×nh th­êng cña c©y [25]. + C¸c Vitamin: MÆc dï c©y in vitro cã thÓ tù tæng hîp vitamin, nh­ng kh«ng ®ñ cho nhu cÇu (czocnowoki – 1952). Do ®ã, ®Ó c©y sinh tr­ëng tèi ­u mét sè vitamin nhãm B ®­îc bæ sung vµo m«i tr­êng víi l­îng nhÊt ®Þnh tuú theo tõng hÖ m« vµ giai ®o¹n nu«i cÊy. C¸c vitamin B1 (Thiamin) vµ B6
  13. 10 (pyrodoxal) lµ nh÷ng vitamin c¬ b¶n nhÊt th­êng dïng trong m«i tr­êng nu«i cÊy víi nång ®é thÊp kho¶ng 0.1 – 1mg/lÝt [13]. + Dung dÞch h÷u c¬ cã thµnh phÇn kh«ng x¸c ®Þnh nh­ n­íc dõa, dÞch chiÕt nÊm men… ®­îc bæ sung vµo m«i tr­êng cã t¸c dông kÝch thÝch sinh tr­ëng m« sÑo vµ c¸c c¬ quan. N­íc dõa ®· ®­îc sö dông vµo nu«i cÊy in vitro tõ n¨m 1941 vµ ®­îc øng dông kh¸ réng r·i trong c¸c m«i tr­êng nh©n nhanh in vitro. Trong n­íc dõa th­êng chøa c¸c axit amin, axit h÷u c¬, ®­êng, ARN vµ ADN. §Æc biÖt trong n­íc dõa cßn cã chøa nh÷ng hîp chÊt quan träng cho nu«i cÊy m« ®ã lµ Myo-inositol, c¸c hîp chÊt cã ho¹t tÝnh Auxin, c¸c Gluxit cña Cytokinin [25]. + ChÊt lµm ®«ng cøng m«i tr­êng: Agar (th¹ch) lµ mét lo¹i Polysacharid cña t¶o cã kh¶ n¨ng ngËm n­íc kh¸ cao 6-12g/lÝt. §é tho¸ng khÝ cña m«i tr­êng th¹ch cã ¶nh h­ëng râ rÖt ®Õn sinh tr­ëng m« nu«i cÊy. Nång ®é th¹ch dao ®éng trong kho¶ng 6 – 10mg/lÝt thuú theo môc tiªu nu«i cÊy. 1.3.2. C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng C¸c Phytohormon lµ nh÷ng chÊt cã t¸c dông ®iÒu hoµ sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña thùc vËt. Chóng ®ãng vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña thùc vËt nh­: ph©n chia, biÖt ho¸ tÕ bµo… Ngoµi ra, nã cßn ¶nh h­ëng ®Õn qu¸ tr×nh l·o ho¸ m« vµ nhiÒu qu¸ tr×nh kh¸c. C¸c Phytohormon cã thÓ chia thµnh 5 nhãm: Auxin, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic Axit. Chóng lµ yÕu tè quan träng nhÊt trong m«i tr­êng quyÕt ®Þnh ®Õn sù thµnh c«ng cña kÕt qu¶ nu«i cÊy. + Auxin: Nhãm nµy gåm cã c¸c chÊt chÝnh lµ: IBA (3-Indol butyric axit), IAA (Indol acetic axit), NAA (Napthyl acetic axit), …Trong nu«i cÊy m« thùc vËt Auxin th­êng ®­îc sö dông ®Ó kÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bµo, biÖt ho¸ rÔ, h×nh thµnh m« sÑo, k×m h·m sù ph¸t triÓn chåi vµ t¹o ra c¸c rÔ phô [25]. + Cytokinin: §­îc bæ xung vµo m«i tr­êng chñ yÕu ®Ó kÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bµo vµ quyÕt ®Þnh sù ph©n ho¸ chåi bÊt ®Þnh tõ m« sÑo vµ c¬
  14. 11 quan. C¸c hîp chÊt th­êng sö dông lµ: Kinetin (6-Furfuryl aminopurine – C10H9NO5), BAP (6-Benzyl amino purine) , Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin. Trong c¸c chÊt nµy th× Kinetin vµ BAP ®­îc sö dông phæ biÕn nhÊt v× chóng cã ho¹t tÝnh cao vµ gi¸ thµnh rÎ. Tuú vµo tõng hÖ m« vµ môc ®Ých nu«i cÊy mµ Cytokinin ®­îc sö dông ë c¸c nång ®é kh¸c nhau. ë nång ®é thÊp (10-7-10- 6 M) chóng cã t¸c dông kÝch thÝch sù ph©n bµo, ë nång ®é 10-6-10-5M chóng kÝch thÝch sù ph©n ho¸ chåi. Trong nu«i cÊy m« ®Ó kÝch thÝch sù nh©n nhanh ng­êi ta th­êng xö dông Cytokinin víi nång ®é 10-6-10-4M [2]. + Gibberellin: Nhãm nµy cã kho¶ng 50 lo¹i hormone kh¸c nhau nh­ng quan träng nhÊt lµ GA3 (Gibberellic Axit 3). GA3 cã t¸c dông kÝch thÝch n¶y mÇm cña c¸c lo¹i h¹t kh¸c nhau, kÐo dµi c¸c lãng ®èt th©n cµnh. Bªn c¹nh ®ã GA3 cßn cã t¸c dông ph¸ ngñ c¸c ph«i, øc chÕ t¹o rÔ phô (Picrik-1987) còng nh­ t¹o chåi phô (Street-1973) [43]. Ngoµi ra, nã cßn ¶nh h­ëng ®Õn sù ra hoa cña mét sè thùc vËt vµ cã t¸c dông rót ng¾n thêi gian sinh tr­ëng sinh d­ìng cña c©y. + Abscisic Axit (ABA): lµ chÊt øc chÕ sinh tr­ëng tù nhiªn nh­ng vÉn ®­îc dïng trong nu«i cÊy tÕ bµo in vitro. ABA cã ¶nh h­ëng ©m tÝnh ®Õn m« nu«i cÊy in vitro. Khi ABA t­¬ng t¸c víi BAP cho hÖ sè nh©n chåi cao h¬n khi dïng BAP riªng rÏ [2]. + Ethylen: Cã biÓu hiÖn t¸c ®éng hai chiÒu, nã k×m h·m sù h×nh thµnh chåi ë giai ®o¹n sím nh­ng l¹i kÝch thÝch sù ph¸t triÓn chåi ë giai ®o¹n muén. Trong mét sè tr­êng hîp, Ethylen cã t¸c dông kÝch thÝch h×nh thµnh rÔ nh­ng mét sè tr­êng hîp nã l¹i k×m h·m qu¸ tr×nh nµy [25]. Ngoµi ra, cÇn ph¶i chó ý tíi ®é pH cña m«i tr­êng vÝ nã ¶nh h­ëng kh¸ râ nÐt tíi kh¶ n¨ng hoµ tan c¸c chÊy kho¸ng trong m«i tr­êng, sù æn ®Þnh cña m«i tr­êng, kh¶ n¨ng hÊp thô chÊt dinh d­ìng cña c©y. NÕu pH thÊp (7.0) ®Òu g©y øc chÕ sinh tr­ëng, ph¸t triÓn cña c©y trong nu«i cÊy in vitro. Nªn viÖc x¸c ®Þnh ®­îc ®é pH ban ®Çu cña m«i tr­êng cho qu¸ tr×nh
  15. 12 sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña m« cÊy lµ cÇn thiÕt. §é pH th­êng ®­îc sö dông trong nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt nãi chung tõ 5,6 – 5,8. 1.3.3. M«i tr­êng vËt lý Trong nu«i cÊy in vitro c¸c yÕu tè cña m«i tr­êng vËt lý ®­îc quan t©m ®ã lµ ¸nh s¸ng, nhiÖt ®é vµ ®é Èm. + ¸nh s¸ng: §©y lµ yÕu tè cÇn thiÕt cho sù ph¸t triÓn vµ ph¸t sinh h×nh th¸i cña c¸c m« nu«i cÊy. ¸nh s¸ng cã ¶nh h­ëng tíi mÉu cÊy th«ng qua thêi gian chiÕu s¸ng, c­êng ®é ¸nh s¸ng vµ chÊt l­îng ¸nh s¸ng. Thêi gian chiÕu s¸ng cã vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn cña m« nu«i cÊy. Víi ®a sè c¸c loµi c©y, thêi gian chiÕu s¸ng thÝch hîp lµ 8 – 12 h/ngµy. C­êng ®é ¸nh s¸ng ¶nh h­ëng lªn qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i m« nu«i cÊy. C­êng ®é ¸ng s¸ng cao kÝch thÝch sinh tr­ëng cña m« sÑo trong khi c­êng ®é thÊp g©y nªn sù t¹o chåi (Ammirato, 1986). Nh×n chung, c­êng ®é ¸nh s¸ng thÝch hîp cho m« nu«i cÊy kho¶ng tõ 1000 – 7000 lux (Moresin, 1974). Bªn c¹nh thêi gian chiÕu s¸ng, c­êng ®é ¸nh s¸ng th× chÊt l­îng ¸nh s¸ng còng ¶nh h­ëng kh¸ râ tíi sù ph¸t sinh h×nh th¸i cña m« nu«i cÊy. ¸nh s¸ng ®á lµm t¨ng chiÒu cao cña th©n chåi h¬n so víi ¸nh s¸ng tr¾ng, cßn ¸nh s¸ng xanh th× øc chÕ sù v­¬n cao cña chåi nh­ng l¹i cã ¶nh h­ëng tèt tíi sù sinh tr­ëng cña m« sÑo. ChÝnh v× vËy mµ trong c¸c phßng thÝ nghiÖm th­êng sö dông ¸nh s¸ng cña ®Ìn huúnh quang víi c­êng ®é 2000 – 3000 lux. + NhiÖt ®é: lµ nh©n tè cã ¶nh h­ëng râ rÖt ®Õn sù ph©n chia tÕ bµo vµ c¸c qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña m« nu«i cÊy, ®ång thêi nã cßn ¶nh h­ëng tíi sù ho¹t ®éng cña Auxin, do ®ã lµm ¶nh h­ëng ®Õn kh¶ n¨ng ra rÔ cña c©y m«. Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña Vonanorld (1982) th× nÕu nhiÖt ®é ngµy/®ªm lµ 20OC/15 OC hoÆc 20 OC/18 OC tû lÖ ra rÔ ®¹t ®­îc kho¶ng 33%, thËm chÝ cßn thÊp h¬n. ë nhiÖt ®é trung b×nh th× ho¹t ®éng trao ®æi chÊt tèt h¬n. Cßn ë nhiÖt ®é cao l¹i kÝch thÝch
  16. 13 ra nhiÒu tÕ bµo kh«ng cã tæ chøc. Trong nu«i cÊy m«, nhiÖt ®é th­êng ®­îc duy tr× æn ®Þnh, ban ngµy tõ 25 - 28 OC vµ ban ®ªm tõ 17 - 20 OC. + §é Èm: Trong c¸c b×nh nu«i cÊy th× ®é Èm t­¬ng ®èi th­êng ®¹t kho¶ng 100% nªn ta kh«ng cÇn ph¶i quan t©m nhiÒu ®Õn vÊn ®Ò ®é Èm khi nu«i cÊy. 1.3.4. VËt liÖu nu«i cÊy ViÖc lùa chän vËt liÖu nu«i cÊy quyÕt ®Þnh ®Õn sù thµnh b¹i cña qu¸ tr×nh nh©n gièng in vitro. VÒ nguyªn t¾c th× mäi tÕ bµo cña c¸c m« chuyªn ho¸ ®Òu cã tÝnh toµn n¨ng, nghÜa lµ ®Òu cã thÓ nu«i cÊy thµnh c«ng. Thùc tÕ cho thÊy c¸c lo¹i tÕ bµo vµ c¸c lo¹i m« kh¸c nhau cã møc ®é nu«i cÊy thµnh c«ng kh¸c nhau. Mét nguyªn t¾c c¬ b¶n trong nu«i cÊy m« tÕ bµo lµ c¸c tÕ bµo lµm vËt liÖu nu«i cÊy cµng non th× kh¶ n¨ng nu«i cÊy thµnh c«ng cµng cao. Nh­ vËy, tÕ bµo vµ m« ph«i non lµ triÓn väng nhÊt, råi ®Õn c¸c tÕ bµo cña ®Ønh sinh tr­ëng nh­: m« ph©n sinh ®Çu ngän, ®Çu rÔ, l¸ non, t­îng tÇng…, sau ®ã lµ c¸c tÕ bµo sinh dôc nh­ no·n bµo vµ tÕ bµo h¹t phÊn ë giai ®o¹n non [21] [22]. 1.3.5. §iÒu kiÖn v« trïng §©y lµ ®iÒu kiÖn c¬ b¶n ®Çu tiªn quyÕt ®Þnh sù thµnh b¹i cña qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro. NÕu ®iÒu kiÖn nµy kh«ng ®­îc ®¶m b¶o th× mÉu nu«i cÊy hoÆc m«i tr­êng sÏ bÞ nhiÔm, m« nu«i cÊy sÏ bÞ chÕt, c¸c thÝ nghiÖm ë giai ®o¹n sau sÏ bÞ ngõng l¹i. Do ®ã, trong toµn bé qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro cÇn ®¶m b¶o ®iÒu kiÖn v« trïng tuyÖt ®èi. Muèn ®¶m b¶o ®iÒu kiÖn v« trïng cÇn cã ph­¬ng ph¸p khö trïng mÉu thÝch hîp, ph­¬ng tiÖn khö trïng hiÖn ®¹i, buång vµ bµn nu«i cÊy v« trïng. Chän ®­îc ®óng ph­¬ng ph¸p khö trïng sÏ cho tû lÖ sèng cao, m«i tr­êng dinh d­ìng thÝch hîp sÏ ®¹t tèc ®é sinh tr­ëng nhanh.
  17. 14 Ph­¬ng tiÖn khö trïng: - Nåi hÊp tiÖt trïng: sö dông cho viÖc khö trïng m«i tr­êng nu«i cÊy, dông cô nu«i cÊy b»ng h¬i n­íc cã ¸p suÊt vµ nhiÖt ®é cao (1,2 – 1.5 atm, 120 – 1300C). - Tñ sÊy: ®Ó sÊy kh« c¸c dông cô thuû tinh vµ dông cô cÊy. - Dung dÞch khö trïng: §Ó khö trïng vËt liÖu ®­a vµo nu«i cÊy ng­êi ta th­êng sö dông c¸c dung dÞch nh­ HgCl2 (Clorua thuû ng©n), NaClO (Hypoclorit natri), Ca(Ocl)2 (Hypoclorit canxi), H2O2 (¤xi giµ) [43]… Cån dïng ®Ó khö trïng mÉu s¬ bé vµ ®èt c¸c dông cô khi nu«i cÊy. - PhÔu läc v« trïng: Dïng ®Ó khö trïng c¸c dung dÞch, kh«ng khö trïng ®­îc ë nhiÖt ®« cao nh­ dung dÞch Enzym hoÆc mét sè chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng. HiÖn nay, ng­êi ta th­êng sö dông mét hÖ thèng b¬m khö trïng dung tÝch lín ®Ó thanh trïng c¸c dung dÞch nu«i cÊy khi nu«i cÊy tÕ bµo trÇn hay huyÒn phï tÕ bµo. - Buång cÊy vµ bµn cÊy v« trïng: + Buång v« trïng: N¬i ®Æt bµn cÊy cÇn kÝn giã, cao r¸o, s¹ch sÏ. Buång ph¶i ®­îc tiÖt trïng liªn tôc tr­íc vµ sau khi lµm viÖc b»ng Foocmon kÕt hîp chiÕu ®Ìn tö ngo¹i. + Bµn cÊy v« trïng: Tèt nhÊt lµ sö dông bµn cÊy Laminair flow box. ThiÕt bÞ nµy lµm viÖc theo nguyªn t¾c läc kh«ng khÝ v« trïng qua mµng vµ thæi kh«ng khÝ v« trïng vÒ phÝa ng­êi ngåi thao t¸c. 1.3.6. Buång nu«i cÊy Buång cÊy lµ n¬i dïng ®Ó ®Æt c¸c mÉu nu«i cÊy. Buång cÊy cÇn ph¶i ®¶m b¶o c¸c ®iÒu kiÖn: - NhiÖt ®é 25 – 30OC. - ¸nh s¸ng ®¹t 2000 – 3000 lux. - S¹ch sÏ, tr¸nh tiÕp xóc víi bªn ngoµi.
  18. 15 1.4. øng dông nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt trong c«ng t¸c gièng c©y rõng 1.4.1. Trªn thÕ giíi HiÖn nay, nu«i cÊy in vitro ®· vµ ®ang ®­îc øng dông réng r·i trong s¶n xuÊt th­¬ng m¹i ë nhiÒu n­íc trªn thÕ giíi, hµng tr¨m loµi c©y l¸ réng vµ hµng chôc loµi c©y l¸ kim ®· ®­îc nu«i cÊy m« thµnh c«ng. Cho tíi n¨m 1991, Th¸i Lan ®· nh©n gièng in vitro thµnh c«ng cho 55 loµi trong tæng sè 67 loµi tre tróc thö nghiÖm. C«ng nghÖ nµy cho phÐp nh©n nhanh loµi Dendrocalamus asper víi sè l­îng kho¶ng 1 triÖu c©y mçi n¨m ®¸p øng ®­îc nhu cÇu c©y con phôc vô cho trång rõng [15]. Sè l­îng c¸c loµi B¹ch ®µn ®· ®­îc nh©n gièng b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro ngµy cµng t¨ng, ®Õn n¨m 1987 ®· cã trªn 20 loµi B¹ch ®µn kh¸c nhau ®­îc nu«i cÊy thµnh c«ng. C¸c nhµ khoa häc Ên §é thµnh c«ng trong viÖc t¹o c©y m« tõ c¸c c©y tréi B¹ch ®µn Eucalyptus camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E. torelliana. C©y m« cã nguån gèc tõ c©y ­u viÖt sinh tr­ëng nhanh gÊp 3 lÇn vµ ®ång ®Òu h¬n lµ c©y mäc tõ h¹t cña cïng c©y mÑ. T¹i Autralia, nh©n gièng in vitro ®· ®­îc ¸p dông ®Ó nh©n nhanh cho c¸c c©y ®­îc chän cho tÝnh chÞu mÆn trong ®Êt vµ ®ang ®­îc ®­a vµo s¶n xuÊt trªn quy m« lín cho loµi E. camandulensis. Trung Quèc lµ mét n­íc thµnh c«ng trong viÖc t¹o c©y in vitro cho c¸c loµi c©y th©n gç. §Õn nay ®· cã h¬n 100 loµi c©y th©n gç ®­îc nu«i cÊy nh­ D­¬ng, B¹ch ®µn, TÕch, Bao ®ång… Lµ mét trong nh÷ng n­íc øng dông sím vµ thµnh c«ng nu«i cÊy m« vµo trång rõng trªn diÖn réng. §Õn n¨m 1991 ë vïng Nam Trung Quèc, ng­êi ta ®· t¹o ra trªn 1 triÖu c©y m« cña c¸c c©y vµ c¸c dßng lai ®­îc chän läc. Nh÷ng c©y m« nµy ®­îc dïng nh­ lµ nh÷ng c©y ®Çu dßng ®Ó t¹o c©y hom t¹i c¸c v­ên ­¬m ®Þa ph­¬ng vµ dïng th¼ng vµo trång rõng [14].
  19. 16 NhiÒu loµi c©y l¸ réng Ch©u ¢u ®· ®­îc thö nghiÖm nh©n gièng thµnh c«ng b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« nh­: Acer, Beluta, Fagus, Quercus, Carpinus... C¸c c©y m« ®· ®­îc trång ra thùc ®Þa ®Ó so s¸nh vµ ®· cho thÊy chóng cã kiÓu h×nh t­¬ng ®èi gièng nhau, tû lÖ sèng ë rõng trång sau khi c©y ®­îc huÊn luyÖn lµ kh¸ cao cã thÓ ®¹t 90% ®Õn 100% cho mét sè loµi [14]. HiÖn nay, nu«i cÊy in vitro còng lµ mét biÖn ph¸p nh©n gièng ®­îc ¸p dông nhiÒu ë c¸c loµi c©y l¸ kim nh»m phôc vô cho c¸c ch­¬ng tr×nh trång rõng dßng v« tÝnh. Mét sè loµi Th«ng ®· ®­îc nu«i cÊy thµnh c«ng ®ã lµ Pinus nigra, P. caribaea, P. pinaster… Cã tíi 30 loµi trong sè c¸c loµi c©y l¸ kim ®­îc nghiªn cøu nu«i cÊy m« ®· ®¹t ®­îc nh÷ng thµnh c«ng b­íc ®Çu, trong ®ã ph¶i kÓ ®Õn c¸c loµi B¸ch t¸n (Araucaria) LiÔu sam (Cryptomeria japonica) B¸ch xanh [14]…Trong sè 30 loµi c©y l¸ kim ®· ®­îc nu«i cÊy m«, cã bèn loµi ®­îc ®­a vµo s¶n xuÊt trªn diÖn réng ®ã lµ Cï tïng (Sequoia sempevirens) ë Ph¸p; Th«ng P. radiate ë ViÖn nghiªn cøu L©m nghiÖp New Dil©n; Th«ng P. taeda vµ Pseudotsuga menziesii ë Mü. T¸c gi¶ Darus H. Ahmas thuéc ViÖn nghiªn cøu L©m nghiÖp Malaysia ®· nu«i cÊy in vitro c©y Keo tai t­îng (Accasia mangium) b»ng m«i tr­êng MS cã bæ sung 3% sucrose, 0.6% agar vµ 0.5mg/l BAP cho giai ®o¹n nh©n chåi. Nh÷ng chåi cã chiÒu cao trªn 0.5 cm ®­îc cÊy vµo m«i tr­êng t¹o rÔ vµ chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng tèt nhÊt cho t¹o rÔ lµ IBA 1000ppm víi tû lÖ ra rÔ lµ 40% [30]. Ng­êi ta còng ®· nh©n gièng thµnh c«ng Phi lao b»ng biÖn ph¸p nu«i cÊy m« vµ ®· trång so s¸nh víi c©y h¹t trong nhµ kÝnh. Kü thuËt nµy ®ang ®­îc ¸p dông ®Ó t¹o c©y m« Phi lao sinh tr­ëng nhanh, kh¸ng bÖnh vµ cè ®Þnh ®¹m cao cho trång rõng [14]. C¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m« còng ®· ®­îc ¸p dông cho c©y TÕch (Tectona grandis). Gupta vµ c¸c céng sù (1979) ®· m« t¶ sù h×nh thµnh côm chåi tõ phÇn c¾t cña c©y non vµ tõ mÇm c©y 100 tuæi. Tõ ®ã hä cã thÓ t¹o
  20. 17 ®­îc 500 c©y in vitro tõ mét chåi ë c©y tr­ëng thµnh vµ 3000 c©y tõ mét c©y non trong mét n¨m. Kaosaard (1990) cho biÕt Th¸i Lan còng ph¸t triÓn thµnh c«ng kü thuËt nu«i cÊy m« vµo n¨m 1986 cho c©y TÕch vµ cho phÐp t¹o ra 500.000 chåi tõ mét chåi trong mét n¨m [28]. Perhutani (Indonesia, 1991) ®· thö nghiÖm vµ nu«i cÊy m« thµnh c«ng ®èi víi loµi TÕch vµ mét vµi c©y m« ®· ®­îc ®em trång thö. 1.4.2. ë ViÖt nam Nh÷ng c¬ së hiÖn nay ®ang nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« ë quy m« lín trong L©m nghiÖp n­íc ta lµ Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng, ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy Phï Ninh, C«ng ty gièng L©m nghiÖp trung ­¬ng, Trung t©m khoa häc s¶n xuÊt L©m nghiÖp Qu¶ng Ninh, XÝ nghiÖp gièng Thµnh phè Hå ChÝ Minh, Tr­êng ®¹i häc L©m nghiÖp, …vv. HiÖn nay, mét sè tØnh vµ ®Þa ph­¬ng ®· thµnh lËp phßng nu«i cÊy m« ®Ó phôc vô cho c«ng t¸c gièng c©y trång vµ ®¹t ®­îc nh÷ng thµnh c«ng b­íc ®Çu. Nu«i cÊy m« ë n­íc ta ®· ¸p dông réng r·i trong c«ng t¸c nh©n gièng mét sè gièng B¹ch ®µn nhËp néi, c¸c dßng v« tÝnh B¹ch ®µn lai vµ Keo lai cã n¨ng suÊt cao. Cïng víi nh÷ng kÕt qu¶ vÒ c¶i thiÖn gièng Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng ®· nghiªn cøu thµnh c«ng kü thuËt nu«i cÊy in vitro cho Keo lai, B¹ch ®µn vµ mét sè gièng c©y rõng kh¸c [9]. D­¬ng Méng Hïng (1993) nghiªn cøu b»ng nu«i cÊy m« cho hai loµi B¹ch ®µn E. camaldulensis vµ E. urophylla tõ c©y tréi cña 2 loµi ®· t¹o ®­îc mét sè c©y m« B¹ch ®µn víi hÖ sè nh©n chåi lµ 1-2 lÇn [5]. N¨m 1995, NguyÔn Ngäc T©n vµ céng sù còng cã nghiªn cøu nh©n nhanh Keo lai b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m«. Keo lai nu«i cÊy trong m«i tr­êng MS cã bæ sung BAP 2mg/l cho hÖ sè nh©n chåi cao h¬n ë c¸c nång ®é kh¸c tõ 3-4 lÇn. C©y m« cã thÓ cho ra rÔ trùc tiÕp trªn nÒn c¸t phun s­¬ng trong nhµ kÝnh b»ng c¸ch ng©m hoÆc nhóng nhanh trong c¸c chÊt kÝch thÝch
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2