Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

100
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận văn nhằm chuẩn hóa được quy trình kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis; xác định được tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình

MỞ ĐẦU Hiện nay, một trong các vấn đề nóng bỏng về chăm sóc sức khỏe sinh sản mà các nước trên thế giới đang đối mặt là bệnh lây truyền qua đường tình dục. Viêm đường sinh dục do Chlamydia trachomatis được coi là bệnh lây truyền qua đường tình dục đứng đầu trên thế giới. Nhiễm Chlamydia trachomatis thường gây viêm niệu đạo, viêm cổ tử cung. Tuy nhiên nêu không điêu tri co thê dân đên cac ́ ̀ ̣ ́ ̉ ̃ ́ ́ ́ ưng nh biên ch ́ ư viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngoài tử cung, vô sinh do tổn thương ống dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn cao. Tổ chức Y tế thế giới ước tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm Chlamydia trachomatis được phát hiện mới [34]. Bệnh do Chlamydia trachomatis hay gặp ở những người trẻ tuổi, trong độ tuổi sinh đẻ. Các nghiên cứu mới đây cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh này đang tăng lên. Tại Châu Âu từ năm 19962003, số bệnh nhân nhiễm Chlamydia trachomatis đã tăng gấp đôi, tại Hoa Kỳ con số này cũng tăng 14% trong giai đoạn 20002005 [15, 18]. Ở Việt Nam trong khoảng vài năm gần đây vấn đề nhiễm khuẩn do Chlamydia trachomatis mới được chú ý. Một vài nghiên cứu đưa ra tỷ lệ khoảng 30% các trường hợp đến khám phụ khoa có tiết dịch đường âm đạo bất thường là do Chlamydia trachomatis. Nguy hiểm nhất của nhiễm Chlamydia trachomatis qua đường sinh dục là có tới 75% nữ giới và 50% nam giới mắc bệnh mà không có triệu chứng, người bệnh hoàn toàn không biết mình nhiễm vi khuẩn [2,9]. Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis người ta thường dùng xét nghiệm nuôi cấy tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định nhiễm Chlamydia trachomatis. Tuy nhiên xét nghiệm này có hạn chế là phải bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá trình vận chuyển đến phòng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài. Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) là kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng rộng rãi trong y học để phát hiện sự tồn 1
tại của các vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm. Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) là một NAATs có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, nhiều nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán khác. Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch âm đạo, tử cung của bệnh nhân. Với mong muốn đóng góp vào công tác chăm sóc sức khỏe nói chung và công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cưu ́ ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình” với mục tiêu: Chuẩn hóa được quy trình kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis. ̣ được tỷ lê nhiêm Chlamydia trachomatis Xác đinh ̣ ̃ ở bệnh nhân viêm âm đạo, cô t ̉ ử cung. 2
Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Chlamydia trachomatis thuộc chi Chlamydia, họ Chlamydiaceae, lớp Chlamydiae, ngành Chlamydiae, giới Bacteria [2, 9]. Về hình thái khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, vi khuẩn có hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước khác nhau, là vi khuẩn Gram âm có màng là lipopolisaccharide. Vì thiếu một số enzyme tổng hợp các hợp chất cao năng sử dụng cho tế bào, vi khuẩn này phải ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả năng sống sót bên ngoài tế bào. Hệ gen của Chlamydia trachomatis gồm phân tử DNA dài 1.042.519 nucleotide với 894 trình tự mã hóa cho protein. Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn Chlamydia trachomatis ( Theo Deborah Dean et al., (2009) Predicting Phenotype and Emerging Strains among Chlamydia trachomatis Infections, CDC Home Vol. 15.(9)) Chlamydia trachomatis (C.trachomatis) chứa 7 đến 10 bản sao của plasmid có kích thước 7.5 kb. Trình tự nucleotide của plasmid là trình tự bảo thủ cao (có dưới 1% nucleotide thay thế), chứa 8 khung đọc mở (Open Reading Frame) mã hoá các 3
gen và các kháng nguyên. Mặc dù chức năng của plasmid còn chưa xác định hết nhưng trình tự nucleotide và sự có mặt của plasmid trong tế bào chứng tỏ nó có vai trò quan trọng đối với vi khuẩn C.trachomatis. C.trachomatis được chia thành 15 loại tuýp huyết thanh khác nhau bao gồm: Tuýp huyết thanh (AK), L1, L2, L3, Ba, Da, Ia và L2a. Trong đó tuýp A, B, Ba và C gây bệnh mắt hột. Tuýp D, E, F, G, H, I, J và K gây bệnh viêm đường sinh dục. Tuýp L1, L2 và L3 gây bệnh lympho hạt, một bệnh viêm hạch bạch huyết hoa liễu ở bẹn [2,9]. Chu kỳ phát triển của C.trachomatis trong bào tương tế bào kéo dài 4872 giờ [34]. Vòng đời của C.trachomatis gồm 2 giai đoạn: Thể cơ bản và thể lưới. Thể cơ bản (Elementary Body EB) là những tế bào tròn có đường kính khoảng 0.3 m, nhân đậm. Thể này xâm nhập vào các tế bào theo kiểu thực bào. Thể lưới (Reticulate Body RB): Sau khi xâm nhập vào tế bào C.trachomatis chuyển hóa nhờ tế bào và tạo thành thể lưới (đường kính 1 m), sinh sản theo hình thức phân đôi kiểu trực phân khoảng 23 giờ một lần. Sau đó thể lưới lại chuyển thành thể cơ bản và giải phóng khỏi tế bào thông qua hinh th ̀ ưc ngo ́ ại tiêt bào (exocytosis). Thông th ́ ường mỗi thể lưới giải phóng 1001000 thể cơ bản rồi tiếp tục xâm nhập vào các tế bào mới. 4
Hình 1.2. Chu kỳ vòng đời của vi khuẩn C.trachomatis (theo Yvonne Pannekoek). Đường truyền bệnh: Vi khuẩn C.trachomatis là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, không có khả năng sống sót ngoài tế bào nên đường truyền chủ yếu là đường tình dục hoặc lây từ mẹ sang con khi người mẹ mang thai bị nhiễm C.trachomatis. Khả năng gây bệnh: C.trachomatis có khả năng gây nên 2 bệnh chính ở người: Bệnh mắt hột và bệnh nhiễm trùng sinh dục tiết niệu, trong đó bệnh sinh dục tiết niệu do nhiều tuýp (D, E, F, G, H, I, J và K) gây ra, tăng nhanh số lượng người mắc. Trẻ sơ sinh có thể bị mắc bệnh viêm kết mạc hoặc viêm phổi do C.trachomatis nếu bị lây từ mẹ. Ở phụ nữ Có tới 75% phụ nữ không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng và triệu chứng nếu có cũng không điển hình [3], nên việc chẩn đoán và sàng lọc nhiễm C.trachomatis đơn thuần dựa vào triệu chứng lâm sàng hoàn toàn không khả thi. Cho đến khi có biểu hiện viêm vùng chậu hoặc khi bệnh nhân khám vô sinh phát 5
hiện có tổn thương ống dẫn trứng thì C.trachomatis đã gây biến chứng khó phục hồi. Vì vậy cần thiết phải có những phương pháp chẩn đoán chính xác và phù hợp giúp phát hiện C.trachomatis nhằm ngăn chặn những hậu quả mà nó gây ra. Ở nữ giới, vi khuẩn C.trachomatis có thể gây viêm âm đao, cổ tử cung và niệu đạo. Các biến chứng thường gặp ở bênh nhân nhiêm ̣ ̣ ́ ̃ C.trachomatis man tinh bao gôm: ̀ Tắc vòi trứng ở phụ nữ: Một trong những nguyên nhân gây tắc vòi trứng là do viễm nhiễm ở vòi trứng, buồng trứng, dây chằng quanh tử cung vòi trứng do C.trachomatis. Chửa ngoài tử cung: Nguyên nhân viêm nhiễm vòi trứng do C.trachomatis khiến phôi thai tắc ngay tại điểm hẹp. Phôi thai lớn dần lên, đến một mức nào đó sẽ phá vỡ các mạch máu nơi nó đậu lại trên vòi trứng, gây chảy máu dữ dội trong ổ bụng, có thể làm thai phụ tử vong nhanh chóng. Nhiều thống kê cho thấy có tới 9% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị chửa ngoài tử cung. Viêm vùng chậu: Phần lớn, viêm vùng chậu do vi khuẩn lậu và C.trachomatis gây ra. Viêm vùng chậu là một bệnh thầm lặng, nhiều tác giả thống kê cho thấy có tới 40% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị viêm nhiễm vùng tiểu khung, trong số đó có 20% bị vô sinh làm ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng cuộc sống. C.trachomatis có thể kết hợp cùng với HPV (Human papilloma virus) – một virus gây u nhú có khả năng đưa đến ung thư cổ tử cung. Ở nam giới Ở nam giới triệu chứng lâm sàng của nhiễm C.trachomatis càng mờ nhạt hơn, biểu hiện đầu tiên là viêm niệu đạo có mủ mà giới chuyên khoa gọi là viêm niệu đạo không do lậu, sau đó có thể dẫn đến viêm mào tinh hoàn. Tại túi tinh, vi khuẩn gây độc cho tinh trùng, làm giảm số lượng tinh trùng, đời sống tinh trùng ngắn lại, chất lượng giảm xuống. Đây chính là lý do gây vô sinh nam. 6
Tuy nhiên, vì C.trachomatis lây qua đường tình dục nên nam giới nhiễm bệnh nếu không được phát hiện và điều trị sẽ là nguồn tái nhiễm cho bạn tình. Ngoài ra, một số nghiên cứu còn cho thấy C.trachomatis ở nam giới có khả năng bám vào tinh trùng và theo tinh trùng đi qua cổ tử cung lên ống dẫn trứng, giúp phát tán C.trachomatis trong vòi trứng của phụ nữ. 1.2. Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis [32] 1.2.1. Nuôi cấy Để phát hiện C.trachomatis, người ta có thể dùng biện pháp nuôi cấy để chờ vi khuẩn gia tăng số lượng. C.trachomatis không phát triển ngoài tế bào sống được nên không thể nuôi cấy theo phương pháp thường dùng mà phải tiến hành nuôi cấy trên các tế bào như McCoy hoặc Hela 229, tế bào nhau thai... Đối với bệnh mắt hột, người ta lấy nang bằng cách nạo các nang rồi cấy vào các tế bào nhau thai người để phát hiện các hạt vùi trong nguyên sinh chất của tế bào. Đối với bệnh viêm sinh dục– tiết niệu: lấy mủ chất tiết niệu đạo (nam giới); chất tiết cổ tử cung, âm đạo (nữ giới) nuôi cấy trong môi trường có chứa tế bào McCoy hoặc Hela 229 ở 370C 5% CO2. Quan sát tính chất xâm nhiễm sau 48 giờ nuôi cấy va phat hiên ̀ ́ ̣ C.trachomatis bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: ủ với kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide (LPS) hoặc protein màng (major outer membrane protein MOMP). Xét nghiệm này được đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong nhóm xét nghiệm vì có độ đặc hiệu rất cao (100%), cho phép lưu giữ vi khuẩn làm kháng sinh đồ phát hiện chủng kháng thuốc. Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thời gian dài, phải bảo đảm vi khuẩn còn sống trong quá trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm, đội ngũ cán bộ thành thạo về nuôi cấy tế bào. Bên cạnh đó xét nghiệm này có độ nhạy thấp (7085%), thấp hơn so với khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests– NAATs) [32]. 7
1.2.2. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays– EIAs) Phương pháp này dựa trên phản ứng hóa miễn dịch giúp phát hiện kháng nguyên LPS của C.trachomatis bằng kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng được đánh dấu bằng enzyme, phức hợp kháng nguyên kháng thể sẽ hoạt hóa enzyme chuyển cơ chất không màu thành có màu, phát hiện được bằng phản ứng tạo màu hay đo bằng quang phổ kế. Khi mẫu xét nghiệm được thêm vào màng, kháng nguyên của C.trachomatis sẽ gắn với kháng thể được phủ sẵn trên màng. Sau đó bổ sung kháng thể đặc hiệu với C.trachomatis liên kết với kháng nguyên đã được bắt giữ bởi kháng thể trên màng. Dung dịch enzyme được thêm vào sẽ liên kết với kháng thể đặc hiệu của C.trachomatis. Bước tiếp theo là rửa để loại bỏ các thành phần không gắn với màng. Bổ sung cơ chất đặc hiệu với enzyme vào màng. Nếu có kháng nguyên, cơ chất phản ứng với enzyme tạo sự thay đổi màu sắc phát hiện và đo được bằng máy quang phổ kế. Xét nghiệm này có hiệu quả với quy mô sàng lọc lớn, không đòi hỏi vi khuẩn còn sống, rẻ tiền hơn nuôi cấy và yêu cầu kỹ năng xét nghiệm vừa phải. Tuy vậy nó có nhược điểm là không sử dụng được với nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, cơ quan hô hấp và âm đạo do giảm độ nhạy và độ đặc hiệu với các mẫu này, được sử dụng sàng lọc quần thể có tỷ lệ dương tính thấp (≤ 5%) [32]. Xét nghiệm này có độ nhạy thấp hơn NAATs và độ đặc hiệu thấp hơn nuôi cấy tế bào. 1.2.3. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody DFA) Phương pháp này sử dụng kháng thể đơn dòng hay đa dòng đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang để phát hiện trực tiếp kháng nguyên vỏ LPS hay kháng nguyên mã hóa protein màng MOMP. Mẫu bệnh phẩm được thu thập, mẫu được đánh dấu tên và địa chỉ bệnh nhân. Sau đó, mẫu được phết nhẹ nhàng lên lam kinh và đ ́ ược cố định ngay lập tức bằng methanol. Sau khi được làm khô trong không khí từ 2 đến 3 phút, lam kính được vận 8
chuyển đến phòng thí nghiệm, nhuộm băng kháng th ̀ ể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu với C.trachomatis. Kháng thể liên kết đặc hiệu với C.trachomatis có trong mẫu. Tiếp đó là bước rửa để loại bỏ những kháng thể không liên kết. Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, mẫu dương tính C.trachomatis dạng cơ bản màu xanh táo tương phản với màu đỏ đất của tế bào. Xét nghiệm áp dụng được cho nhiều loại mẫu khác nhau, không yêu cầu vi khuẩn còn sống, đòi hỏi kỹ năng xét nghiệm vừa phải, thích hợp chẩn đoán trên các đối tượng có nguy cơ cao. Sự thành công của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Có kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu với C.trachomatis, đủ kháng thể để kết hợp, kính hiển vi huỳnh quang chất lượng tốt. Kỹ thuật này không thích hợp cho số lượng mẫu lớn và đối tượng có nguy cơ thấp, độ nhạy thấp hơn NAATs và độ đặc hiệu thấp hơn nuôi cấy tế bào [32]. 1.2.4. Kỹ thuật khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests– NAATs). NAATs là kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng rộng rãi trong y học để phát hiện sự tồn tại của các vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm, độ nhạy trên 90%, độ đặc hiệu tương đương với nuôi cấy tế bào. Ky thuât NAATs co ̃ ̣ ́ưu điêm la ̉ ̀ ́ ̉ ́ ụng ở nhưng n co thê ap d ̃ ơi không có khả năng nuôi cấy, xét nghiệm không đòi hỏi vi khuẩn còn sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong 1 ngày). Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) là xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao thích hợp cho sự phát hiện C.trachomatis [21]. Nhiều nghiên cứu đã xem PCR là một tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán khác. Đối với bệnh nhiễm C.trachomatis, xét nghiệm này cho phép xác định sự tồn tại của vi khuẩn trong dịch quêt cô t ́ ̉ ử cung hoăc trong mâu ̣ ̃ nươc tiêu c ́ ̉ ủa bệnh nhân với các cặp mồi trên plasmid, trên gen mã hóa protein màng hoặc trên rRNA. Tuy nhiên, xét nghiệm này có thể giảm độ nhạy do sự có mặt các chất ức chế có trong mẫu hoặc không đủ độ nhạy để phát hiện mẫu chứa quá ít dạng cơ bản của vi khuẩn C. trachomatis. Do vậy có thể tạo ra sản phẩm âm tính giả. Theo Saiki và cộng sự (1985) [23], để phát hiện 25 ng DNA trên gel 9
agarose nhuộm ethidium bromide sau 35 chu kỳ khuếch đại từ 10 phân tử ban đầu ở mẫu cần hiệu quả khuếch đại cao hơn 90%. Nested PCR là kỹ thuật sử dụng hai cặp mồi thay vì một cặp mồi như kỹ thuật PCR cổ điển. Cặp mồi thứ hai được thiết kế nằm trong đoạn gen mà cặp mồi thứ nhất khuếch đại. Quá trình chạy PCR lần đầu không khác gì PCR thông thường. Sản phẩm của phản ứng PCR lần đầu sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần thứ hai cùng với cặp mồi thứ hai. Kết quả sau hai lần PCR thu được sản phẩm đặc hiệu hơn nhiều. Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện vi khuẩn ở mật độ rất thấp mà các phương pháp thông thường khó có thể phát hiện được (15 ký sinh trùng/1 µl máu). Đây được xem là “tiêu chuẩn vàng” mới trong phát hiện vi khuẩn trong các mẫu bệnh phẩm do độ nhạy và độ đặc hiệu cao của nó. Theo Pamela Cribb và cộng sự (2002) [22], xét nghiệm này có thể phát hiện DNA tương ứng với nhỏ hơn 10 dạng cơ bản (EB) của vi khuẩn C.trachomatis trong hỗn hợp phản ứng, cho phép phát hiện kết quả âm tính giả và đáp ứng được với sự thay đổi ở các phòng thí nghiệm khác nhau. Mẫu được xử lý để tách DNA của C.trachomatis. Các thành phần của phản ứng PCR được thiết lập gồm primer, dNTP, Taq polimerase, MgCl 2. Các primer liên kết với DNA đích đặc hiệu của C.trachomatis. Enzym Taq polymerase kéo dài mỗi trình tự DNA sử dụng các nucleotide tự do để tạo trình tự DNA bổ sung. Quá trình khuếch đại này xảy ra khi hỗn hợp phản ứng được ủ trong máy luân nhiệt. Mỗi chu kỳ làm tăng số lượng DNA đích theo hàm mũ. Sau khi khuếch đại, sản phẩm lần 1 được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2. Sau phản ứng PCR lần 2, sản phẩm được điên di trên gel agarose 1%, nhuôm ethidium bromide va phân tich trên hê ̣ ̣ ̀ ́ ̣ ̣ ̉ thông chup anh gel . ́ Xét nghiệm này có thể phát hiện vi khuẩn C.trachomatis trên mẫu nước tiểu (độ nhạy của mẫu này thấp hơn mẫu dịch phết), nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, cơ quan hô hấp và âm đạo. Xét nghiệm này độ nhạy trên 90%, độ đặc hiệu tương đương với nuôi cấy tế bào, co ́ ưu điêm la co thê ap d ̉ ̀ ́ ̉ ́ ụng ở nhưng n ̃ ơi không có khả năng nuôi cấy, 10
không đòi hỏi vi khuẩn còn sống, thời gian xét nghiệm ngắn (trong 1 ngày) [13, 17]. Nhược điểm của xét nghiệm này là yếu tố ngoại nhiễm cao, tuy vậy có thể tránh bằng cách sử dụng đầu côn lọc và dùng enzyme uracil N glycosylase trong phản ứng. 1.3. Các nghiên cứu về Chlamydia trachomatis trên thế giới và trong nước 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới Số người nhiễm trên 100.000 Năm Hình 1.3. Tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở một số nước Châu Âu Theo ECDC năm 2009 [15], tỷ lệ dương tính C.trachomatis ở một số nước Châu Âu thay đổi từ năm 1998 đến năm 2007. Ở Thụy Điển và Phần Lan, nơi những nghiên cứu được tiến hành từ đầu những năm 90, tỷ lệ này giảm ở đầu những năm 90 (tương tự với tỷ lệ các bệnh lây truyền qua đường tình dục khác ở Châu Âu) do sự thay đổi thói quen sinh hoạt tình dục và mối lo từ hiểm họa AIDS. Tỷ lệ này tăng lên từ năm 1995. Tại Anh và Đan Mạch, tỷ lệ này tăng dần theo mỗi năm, nguyên nhân có thể do không được nghiên cứu từ đầu những năm 90, sử dụng các chẩn đoán có độ nhạy cao hơn, đối tượng nghiên cứu nằm trong các nhóm có nguy cơ cao. 11
Theo một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này tại Châu Âu [20] cho thấy: Phần Lan Nghiên cứu 298 phụ nữ tuổi từ 18 đến 40, từ năm 1977 đến năm 1980 tại một trung tâm y tế sinh viên tại Đại học Helsinki. Những phụ nữ trên được chăm sóc y tế về các biện pháp tránh thai, vấn đề nội tiết và vô sinh hoặc đã được kiểm tra dịch phết cổ tử cung định kỳ (đối với bệnh nhân có triệu chứng). Các xét nghiệm được sử dụng là nuôi cấy dịch niệu đạo và dịch phết cổ tử cung. Bỏ qua mô tả về cách lựa chọn, tỷ lệ đáp ứng, lý do đáp ứng và loại trừ. Tỷ lệ dương tính C.trachomatis là 6%. Thụy Điển Nghiên cứu thứ nhất (Persson et al., 1991) liên quan đến 306 phụ nữ tuổi từ 12 đến 25 (trung bình 22 tuổi) tại một phòng khám thai từ năm 1989 và 1990. Nuôi cấy được sử dụng làm phương pháp xét nghiệm, tỷ lệ dương tính C.trachomatis là 6%. Nghiên cứu thứ hai (Svensson et al., 1994) đã so sánh hai nhóm phụ nữ nghiên cứu vào năm 1991 1992. Nhóm A bao gồm 751 học sinh trung học với độ tuổi 16 đến 20 năm (trung bình 18 tuổi). Các tỷ lệ đáp ứng là 77%. Nhóm B bao gồm 619 phụ nữ đến khám tại phòng khám kế hoạch hóa gia đình thanh thiếu niên và độ tuổi phù hợp với nhóm A. Cả hai nhóm đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng xét nghiệm EIA. Tỷ lệ dương tính C.trachomatis là 2% trong nhóm A và 6% trong nhóm B. Vương quốc Anh Nghiên cứu được tiến hành đầu tiên (Smith et al., 1991) liên quan đến 197 phụ nữ tuổi từ 19 đến 58 (trung bình 30 tuổi) tại một phòng khám soi cổ tử cung. Nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt giữa phụ nữ có dịch phết cổ tử cung bình thường và bất thường. Bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung được sử dụng để nuôi cấy. Tỷ lệ dương tính C.trachomatis là 12%. Nghiên cứu thứ hai (Thompson và Wallace, 1994) liên quan đến 287 phụ nữ từ 15 tuổi đến 40. Các mẫu dịch phết cổ 12
tử cung đã được xét nghiệm bằng kỹ thuật DFA. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ nhỏ hơn 30 tuổi là 3.5% (5/145). Tỷ lệ dương tính C.trachomatis chung là 1.7%. Nghiên cứu thứ ba (Hopwood và Mallinson, năm 1999) đánh giá trên các phụ nữ 16 đến 25 tuổi bằng xét nghiệm DFA. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis là 3.9%. Nghiên cứu thứ tư (Kirkwood et al., 1999) nghiên cứu phụ nữ độ tuổi nhỏ hơn 20 tại phòng khám kế hoạch hóa gia đình. Các mẫu được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. Cỡ mẫu là 97 với 65 phụ nữ đến từ thành phố. Tỷ lệ nhiễm vi khu ẩn này ở phụ nữ thành phố là 3% và thị trấn nông thôn 12.5%. Tỷ lệ dương tính C.trachomatis tổng thể là 6.2%. Sự phổ biến của C.trachomatis phụ nữ không có triệu chứng ở Châu Âu dao động từ 1.7 đến 17% tùy thuộc vào bối cảnh và quốc gia. Tỷ lệ dương tính C. trachomatis là 6% ở phụ nữ sử dụng biện pháp tránh thai và 4% với đối tượng phụ nữ xét nghiệm dịch phết cổ tử cung [15]. James B. Mahony và cộng sự (1992) nghiên cứu tỷ lệ dương tính C.trachomatis ở nam giới ở những địa điểm được lựa chọn tại Hoa Kỳ [18]. Sự sàng lọc phụ thuộc một phần vào chi phí sàng lọc C.trachomatis cũng như phương pháp sàng lọc. Sàng lọc ở những địa điểm có tỷ lệ nam giới dương tính cao sẽ nâng cao chất lượng chương trình kiểm soát C.trachomatis. Đánh giá các chương trình sàng lọc vi khuẩn này trong số những người đàn ông không có triệu chứng tại các phòng khám từ năm 1995 đến tháng 6 năm 2007, thông qua PubMed thu được kết quả: Tỷ lệ dương tính trung bình tổng thể là 5.1%. Mức cao nhất được quan sát thấy ở nam giới thử nghiệm tại các cơ sở giam giữ trẻ vị thành niên (7.9%) và người lớn (6.8%), ở người da đen (6.7%), 1519 tuổi (6.1%) và 2024 tuổi (6.5%). Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis trên nam giới cao ở những địa điểm nhất định. C.trachomatis là bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến nhất ở Canada [27]. Có gần 63.000 trường hợp nhiễm C.trachomatis được báo cáo vào năm 2004, con số cao nhất kể từ khi vi khuẩn này được đề cập vào năm 1990. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở Canada đã tăng hơn 70% từ năm 1997. Tuy nhiên, những con số này đánh giá thấp gánh nặng thực sự của bệnh như một số bệnh nhiễm trùng (40% đến 13
70% các bệnh nhiễm trùng) là không có triệu chứng nên không bị phát hiện. Có một sự khác biệt giới tính trong tỷ lệ nhiễm C.trachomatis, phụ nữ chiếm hơn hai phần ba các trường hợp được báo cáo vào năm 2004. Trong khi số lượng các bệnh nhiễm trùng C.trachomatis báo cáo ở phụ nữ cao hơn nam giới, tỷ lệ lây nhiễm đang gia tăng nhanh hơn ở nam giới. Từ năm 1997, tỷ lệ ở nam giới nhiều hơn gấp đôi, từ 59 đến 129.5 trên 100.000 người, trong khi tỷ lệ ở phụ nữ tăng ít hơn một nửa, từ 168 đến 263 trên 100.000. Sự chênh lệch giới tính có thể một phần là do số phụ nữ được sàng lọc vi khuẩn C.trachomatis lớn hơn. Việc cải thiện công nghệ chẩn đoán có thể sử dụng mẫu nước tiểu để xét nghiệm dự đoán sẽ làm tăng số lượng đàn ông kiểm tra. Tỷ lệ thanh thiếu niên nhiễm C.trachomatis cũng không tương xứng, gần 70% của tất cả các trường hợp được báo cáo xảy ra ở tuổi từ 15 đến 24 trong nghiên cứu. Trong năm 2004, tỷ lệ nhiễm trong thanh thiếu niên từ 15 đến 19 tuổi là 847 trên 100.000. Tỷ lệ là 1.087 trên 100.000 trong độ tuổi 2024. Các vùng lãnh thổ phía Bắc nói riêng phải chịu tỷ lệ nhiễm C.trachomatis cao, trung bình năm 2003 là gần 8 lần so với toàn quốc. Nunavut có tỷ lệ nhiễm C.trachomatis cao nhất ở Canada vào năm 2003 (2.520 trên 100.000) trên 13 lần mức trung bình toàn quốc [27]. Năm 2004 ở Trinidad và Tobago bằng phương pháp nested multiplex PCR với các cặp mồi HO1, HO3, Chlam5/Chlam3, KL1/KL2 và Gon 5/Gon 3, các tác giả đã phát hiện đồng thời hai loại vi khuẩn lậu và C.trachomatis trong mẫu nước tiểu của phụ nữ mang thai [19]. Các mẫu nước tiểu được thu thập từ tháng 3 đến tháng 9 năm 2004 từ 273 phụ nữ mang thai khỏe mạnh ở các phòng khám tư nhân và bệnh viện. Tất cả phụ nữ mang thai có mặt trong phòng khám tại thời điểm lấy mẫu đã được mời tham gia. 1520 ml mẫu nước tiểu đầu dòng được thu thập, bảo quản ở 4°C, vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ, và bảo quản ở 20°C cho đến khi DNA được tách chiết (trong vòng hai tháng). DNA từ nước tiểu được chuẩn bị bằng cách sử dụng Chelex 100 (Sigma Chemical Co, St Louis, Hoa Kỳ). Phản ứng PCR thứ nhất và nested multiplex PCR được tối ưu hóa ở các nồng độ MgCl2 1.5; 2 và 3 mM, ở nhiệt độ thay đổi từ 45°C đến 65°C (sử dụng máy Gradient Master Cycler Eppendorf) với mồi phát hiện vi khuẩn lậu hoặc 14
C.trachomatis. Để tránh nhiễm, sử dụng bốn phòng riêng biệt, một để pha mix, một để chuẩn bị mẫu và PCR lần 1, một tạo phản ứng nested PCR và một phòng điện di. Sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromide và quan sát. Phản ứng PCR đầu tiên dùng 0.2 mM mỗi loại dNTP; 3 mM MgCl2; 0.5 pmol/µl mỗi mồi HO1, HO3, Chlam5 (5'CATTATGTCGGAGTCTG AGC 3’), Chlam3 (5'GGATGACTCAAGGAATAGTCG 3’), 1 µl Internal Amplification Control (IAC), 0.4 pmol/µl mồi IAC (5'TGTTTGACAGCTTATCAT), 5 µl DNA mẫu, 0.5 U Taq polymerase, và nước khử ion đến 25 µl với chu trình nhiệt 94°C/15s, 60°C/30s, 72°C/60s, 40 chu kỳ. Phản ứng nested PCR chứa 0.2 mM m ỗi loại dNTP; 2 mM MgCl2; 0.5 pmol/µl mỗi mồi KL1, KL2, Gon5 (5'GTTCT TGACGCTCCATATCG 3’) và Gon3 (5'ACGAGGCATTGAAGCAAAGC 3’); 0.4 pmol/µl IAC; 1 µl sản phẩm PCR lần 1; 0.5 U Taq polymerase, nước khử ion đến 25 µl, chu trình nhiệt 94°C/15s, 58.5°C/30s,72°C/30s, 40 chu kỳ. Kết quả ở PCR lần 1 là 21 mẫu dương tính C.trachomatis và 1 mẫu nhiễm cả C.trachomatis và lậu. Kết quả phản ứng nested multiplex PCR thu được mẫu dương tính C.trachomatis là 57 mẫu (20.9%), trong đó 5 mẫu nhiễm cả hai loại vi khuẩn trên. Kết quả này chứng tỏ multiplex nested PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn hẳn phản ứng PCR đơn. Farhad B. Hashemi, Babak Pourakbari và Javad Zaeimi Yazdi [16] nghiên cứu tổng cộng 123 phụ nữ đã kết hôn (tuổi từ 2055) với triệu chứng viêm cổ tử cung đến khám tại phòng khám sản phụ khoa của bệnh viện Mirza Kouchek Khan ở Tehran, Iran, từ giữa tháng 12/2004 đến tháng 6/2005, chủ yếu do đau vùng chậu và (hoặc) tiết dịch âm đạo. Tất cả những phụ nữ điều trị kháng sinh trong vòng ba tuần trước khi đến khám được loại trừ khỏi nghiên cứu. Người tham gia đồng ý hoàn thành một bảng câu hỏi về nhân khẩu học và lịch sử bệnh lây truyền qua đường tình dục trước khi kiểm tra cổ tử cung. Sau khi loại bỏ chất nhầy c ổ tử cung, mẫu dịch cổ tử cung được thu thập, lưu trữ ở 20°C. DNA chiết xuất bằng DIAtom Prep100 kit (IsoGene Inc, Moscow, Nga) và bảo quản tại 20°C cho đến khi sử dụng. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn 377 bp của cryptic plasmid với chu trình nhiệt: 94°C/3.5 phút; (94°C/30s, 52°C/30s, 72°C/3 phút) x 30 chu kỳ trong 25 μl đệm 15
phản ứng PCR (bao gồm 10 mmol/l Tris, pH 8,3; 50 mmol/l KCl; 2.5 mmol/l MgCl 2 và 0.1% gelatin); 0.2 mmol/l mỗi loại dNTP; 2.5 U Taq DNA polymerase, và 0.5 μmol/µl mỗi loại mồi BP1 (5’AACCGTTTTTAATAGTGGCA3’) và BP2 (5’ TTCTGGCCAAGAATTATCC3’). Tỷ lệ nhiễm trùng sinh dục do C.trachomatis trên phụ nữ đã kết hôn ở Iran là 17% (cao hơn tỷ lệ 7% báo cáo tại nước này vào đầu những năm 1980). Mặc dù các bệnh nhân trong nghiên cứu không phải là đại diện chung dân số (bao gồm cả phụ nữ không có triệu chứng), hiện tại tỷ lệ nhiễm C.trachomatis cao hơn so với tỷ lệ 411% tại Slovenia, Hà Lan, Colombia, Canada, và Hoa Kỳ. Sự khác biệt tỷ lệ trong nghiên cứu này so với gần đây báo cáo từ Tehran có thể liên quan đến sự cải thiện độ nhạy của xét nghiệm cũng như đối tượng bệnh nhân và các mẫu phân tích. Kết quả cần được khẳng định bởi cỡ mẫu lớn hơn. Theo các công trình nghiên cứu của Gaydos CA, Svensson LO [20], tần suất nhiễm C.trachomatis cao gặp ở đối tượng trẻ dưới 25 tuổi, có lẽ do nam nữ thanh niên các nước Châu Âu thường có quan hệ tình dục tự do ngoài hôn nhân, vì vậy họ dễ mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục trong đó có nhiễm C.trachomatis. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này ở người lớn tại Nam Thái Bình Dương là 73%, Papua New Guinea là 20%, Nhật Bản 7%, Senegan 7%. Một nghiên cứu của Achchhe L Patel và cộng sự [11] trường đại học y khoa Indiana, Ấn Độ sử dụng các phương pháp phát hiện vi khuẩn C.trachomatis như Roche Amplicor test, DFA và PCR. Trong suốt quá trình nghiên cứu (2003–2009), tỷ lệ bệnh nhân nhiễm C.trachomatis dao động từ 24.0% đến 30.0%. Các phụ nữ hành nghề mại dâm ở Surat, Ấn Độ, có tỷ lệ dương tính (xét nghiệm bằng PACE2 test) là 8.5%, trong khi ở Ahmedabad, tỷ lệ này tăng gấp đôi. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm C.trachomatis trong quần thể nghiên cứu ở thủ đô của Ấn Độ chỉ chiếm 4.0% mặc dù tỷ lệ mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục là 36.5%. Tỷ lệ này tương tự với các nghiên cứu trên bệnh nhân ở Azerbaijan 3.1% và Bangladesh 3.4%. Tỷ lệ nhiễm cao được đề cập ở Manila 23.3%, Cebu, Philippines 37.0% và 14.0% ở Nicaragoa [11] . 16
Anahita Jenab và cộng sự (năm 2008) [12] nghiên cứu giá trị chẩn đoán PCR và ELISA trên vi khuẩn C.trachomatis ở phụ nữ không có triệu chứng và triệu chứng tại Isfahan, Iran nhằm xác định sự hiện diện của C.trachomatis bằng phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase (PCR) và ELISA. Mẫu được thu thập sau khi có sự đồng ý bằng văn bản từ 80 bệnh nhân khám phụ khoa tại bệnh viện Shahid Beheshti ở Isfahan, Iran. Bệnh phẩm được thu thập từ 80 phụ nữ, 22 người trong số họ không có triệu chứng và 58 người có triệu chứng. 58 phụ nữ có triệu chứng khác nhau, từ 2060 tuổi (có nghĩa là 36.3 ± 8.8 năm) và 22 phụ nữ không có triệu chứng khác nhau, từ 19 đến 56 tuổi (40 ± 10.5 năm). Tất cả các phụ nữ này được kiểm tra lâm sàng kỹ lưỡng. Độ tuổi trung bình của phụ nữ ở cả hai nhóm là 37.5 ± 9.4 năm. Những người đã dùng kháng sinh trong vòng 4 tuần qua được loại trừ khỏi nghiên cứu. Các mẫu đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR được thiết kế để phát hiện C.trachomatis bằng cặp mồi KL1, KL2 trên cryptic plasmid của vi khuẩn này. Huyết thanh IgG và IgA kháng thể kháng C.trachomatis sử dụng phát hiện bằng phương pháp ELISA. Một tăm bông chứa dịch phết cổ tử cung của mỗi bệnh nhân được đặt vào một lọ nhựa 15 ml có chứa 5 ml dung dịch đệm (PBS) vô trùng và lưu trữ ở 70ºC cho đến khi tách chiết DNA. Ngoài ra, 5ml máu ngoại vi được thu thập từ mỗi bệnh nhân để điều tra huyết thanh học. Kit ELISA được sử dụng trong nghiên cứu rất cụ thể để phát hiện C.trachomatis và không có bất kỳ phản ứng chéo nào với các các loài khác của Chlamydia. Do đó, nó chỉ cho phép phát hiện các kháng thể kháng C.trachomatis trong mẫu, tức là IgG, IgA. Phát hiện C.trachomatis bằng phương pháp PCR: Để phát hiện sự hiện diện của C.trachomatis trong mẫu dich phết cổ tử cung, đoạn gen 241 bp trên plasmid vi khuẩn đã được khuếch đại nhờ cặp mồi KL1 (5’TCCGGAGCGAGTACGAAGA3’) và KL2 (5’ AATCAATGCCCGGGATT GGT3’). Phản ứng PCR được thực hiện trên 5 μl chiết xuất DNA mẫu trong một hỗn hợp phản ứng cuối cùng là 25 μl. Hỗn hợp phản ứng cuối cùng có 3 mM MgCl2, 0.28 mM dNTP, 16 pmol của mỗi loại mồi và 1 U Taq polymerase. Chu trình nhiệt đã được thực hiện như sau: (94ºC/1 phút, 55ºC/1 phút, 72ºC/1 phút) × 40 chu kỳ, 72ºC trong 8 phút. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1.5%. Kết quả: tỷ lệ nhiễm C.trachomatis khi xét nghiệm bằng phương pháp PCR là 27.2% ở phụ nữ không có triệu chứng và 18.9% 17
trên đối tượng có triệu chứng. Kiểm tra huyết thanh học được thực hiện trên tất cả các mẫu cho kết quả nhiễm C.trachomatis là 29.4% và 17.6% tương ứng [12]. Theo CDC, số các trường hợp chẩn đoán đã gia tăng đến 19% ở đàn ông và 25% ở phụ nữ giữa năm 2008 và 2009. Theo một điều tra mới đây với quy mô lớn, các bệnh gây nên bởi C.trachomatis có thể có một vai trò quan trọng trong nguy cơ sinh non. Hơn 4000 phụ nữ có thai đã tham dự vào điều tra này bằng bảng câu hỏi và lấy mẫu nước tiểu xét nghiệm C.trachomatis bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR). Kết quả có 4% các phụ nữ dương tính với vi khuẩn này [15]. Mặc dầu có tính đến những yếu tố khác (tuổi dưới 21, nhiều bạn tình), nhưng nguy cơ sinh non, sinh con từ 35 tuần thai nghén ở các trường hợp nhiễm trùng do C.trachomatis cao gấp đôi. Vì vậy, điều tra phát hiện các phụ nữ có nguy cơ và sử dụng thuốc kháng sinh thích hợp trong thời kỳ thai nghén sẽ cho phép làm giảm nguy cơ này. Nhiễm C.trachomatis có xu hướng ngày càng tăng, tỷ lệ phát hiện tại Mỹ năm 1987 là 50.8 ca (trong 100.000 dân); đến năm 2007 là 370.2 ca. Chi phí dành cho điều trị khoảng 3 tỷ USD/năm [18]. Hầu hết các phương pháp khuếch đại phát hiện C.trachomatis trong mẫu dịch niệu đạo, cổ tử cung và nước tiểu đã chứng minh là có độ nhạy cao hơn so với nuôi cấy tế bào hoặc các phương pháp phát hiện kháng nguyên (Black 1997). Các phương pháp hiện đang có sẵn, chẳng hạn như Amplicor CT PCR, Roche phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng cách sử dụng peroxidase (HRP). Các phương pháp thương mại có lợi thế quan trọng, nhưng chi phí cao, không thích hợp với nhiều phòng thí nghiệm. Một số phương pháp khuếch đại phi thương mại cũng được mô tả. Hầu hết bao gồm một phản ứng PCR đơn có sản phẩm được phân tích dựa vào sản phẩm điện di trên gel agarose và nhuộm với ethidium bromide. Tuy nhiên phương pháp này giảm độ nhạy do các chất ức chế có trong các mẫu lâm sàng. Ngay cả trong trường hợp không có chất ức chế, phản ứng PCR có thể không đủ nhạy để phát hiện mẫu có chứa số lượng quá ít thể cơ bản (EB) của C.trachomatis. Theo nghiên cứu của Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini và Esteban Serra [22], phản ứng nested PCR sử dụng hai cặp oligonucleotides (KL5/KL6 và KL1/KL2) làm 18
mồi có trình tự bổ sung với các đoạn nằm trên cryptic plasmid của C.trachomatis và sau hai vòng khuếch đại tạo ra một sản phẩm cuối cùng 241 bp. Ban đầu, phản ứng đầu tiên đã được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 50 µl có chứa 10 mM Tris (pH 9,0), 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl2, 5 nmol mỗi loại dNTP, 20 pmol mỗi mồi KL5 (5 TTGCCTTAACCCCACCATT3) và KL6 (5CGTCCTTCCTAAAAGAGCTA3) và 1.25 U Taq polymerase (Promega). Sau 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, và 1 phút ở 72°C và một bước kéo dài trong 7 phút ở 72°C; 1 µl sản phẩm của phản ứng PCR đầu tiên đã được chuyển sang một ống phản ứng thứ hai với cùng thành phần ngoại trừ mồi là 20 pmol mỗi loại mồi KL1 (5TCCGGAGCGAG TTACTAAGA3) và KL2 (5ATCAATGCCCGGGATTGGT 3) đã được thêm vào hỗn hợp phản ứng, và 35 chu kỳ mới được thực hiện. Các sản phẩm được phân tích bởi điện di trên gel agarose và nhuộm ethidium bromide. Độ nhạy của nested PCR được xác định bằng cách sử dụng số lượng DNA của C.trachomatis giảm dần. Khảo nghiệm đã có thể phát hiện DNA tương ứng với một EB trong phản ứng. Tuy nhiên, độ nhạy theo thử nghiệm lâm sàng có thể thấp hơn do chất ức chế PCR bị loại bỏ không hoàn toàn trong quá trình tách chiết DNA. Các kết quả độ nhạy trong thực nghiệm khác nhau dao động từ 1 đến 10 thể cơ bản (EB) mỗi phản ứng. Để tìm những điều kiện tốt nhất cho các xét nghiệm, thử nghiệm nồng độ khác nhau cho các thành phần của phản ứng, khối lượng và số chu kỳ khuếch đại. Kết quả tối ưu đạt được với phản ứng PCR đầu tiên trong 30 µl thể tích cuối cùng, có chứa 2.5 nmol dNTP mỗi loại, KL5/KL6 6 pmol mỗi mồi và 25 chu kỳ, tiếp theo với 50 µl của hỗn hợp phản ứng thứ hai và 35 chu kỳ. Cuối cùng, để xác định xem phản ứng có là một thử nghiệm chung xác định C.trachomatis hay không, các thí nghiệm tiến hành bằng cách sử dụng các mẫu khác để xét nghiệm. Kiểm tra cho thấy độ nhạy tương tự đối với mẫu nước tiểu, dịch niệu đạo, dịch nhày mũi họng, và bệnh phẩm từ mắt. Kết quả cho thấy nested PCR đối với phát hiện của C.trachomatis trong các mẫu lâm sàng là rất nhạy, có thể phát hiện ít hơn 10 EB mỗi phản ứng trong các mẫu sinh học khác nhau; loại bỏ đến mức thấp nhất việc phát hiện các kết quả âm tính giả bằng cách sử dụng một kiểm soát nội bộ khuếch đại; đủ mạnh để đối phó với các điều kiện thay đổi trong các phòng thí nghiệm khác nhau. 19
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một số nghiên cứu trong cộng đồng cho thấy tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ thay đổi từ 18% đến 32.5%, trong đó một số yếu tố nguy cơ được nhận diện như số bạn tình, độ tuổi bắt đầu quan hệ tình dục, tiền căn bệnh phụ khoa. Năm 1995, khảo sát tỷ lệ hiện mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục được Vụ Sức Khỏe Bà Mẹ Trẻ Em và Kế Hoạch Hóa Gia Đình của Bộ Y Tế thực hiện ở Việt Nam [29]. Đối tượng là các phụ nữ đến khám tại Trung Tâm Sức Khỏe Bà Mẹ Trẻ Em và Kế Hoạch Hóa Gia Đình thành phố Hồ Chí Minh trong 10 tuần gồm 812 phụ nữ ở độ tuổi 15 đến 39. Chẩn đoán bệnh lậu dựa trên nuôi cấy và xác nhận bằng một xét nghiệm kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho N.gonorrhoea. Sự hiện diện của C.trachomatis được xác định bằng kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên (IDEIA) trong bệnh phẩm nội mạc cổ tử cung. TPHA được thực hiện cho tất cả các mẫu máu để tìm bệnh giang mai. Tỷ lệ bệnh lây truyền qua đường tình dục phát hiện được ở giang mai 0.5%, lậu 0.7% và C.trachomatis 2.5%. Một nghiên cứu cắt ngang về nhiễm HIV và các yếu tố nguy cơ ở phụ nữ mại dâm tại phía nam Việt Nam đã được Nguyễn Thị Thanh Thủy, Võ Tuyết Nhung, Nguyễn Văn Thục, Trương Xuân Liên và Hạ Bá Khiêm thực hiện vào 1995 1996 [24]. Tổng cộng 968 phụ nữ mại dâm ở thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ và An Giang được làm xét nghiệm. Các xét nghiệm bệnh lây truyền qua đường tình dục được thực hiện là: nuôi cấy để phân lập N.gonorrhoeae, ELISA (Sanofi, Organon) để phát hiện nhiễm HIV được xác nhận bằng Western Blot, TPHA cho giang mai, DIF cho C.trachomatis và ELISA HBsAg cho HBV. Tỷ lệ hiện mắc của các bệnh lây truyền qua đường tình dục được phát hiện là 40.4% cho giang mai, 3.3% cho lậu, 5.8% cho C.trachomatis, 5.2% cho HIV và 9% cho HBV. Trong thời gian từ tháng 2/1998 đến 3/1999, các tác giả đã khảo sát 415 phụ nữ từ 1549 tuổi có gia đình đang sống tại huyện Hóc Môn thành phố Hồ Chí Minh [3]. Các đối tượng được chọn một cách ngẫu nhiên, nếu có đủ điều kiện nghiên cứu thì lập danh sách theo phương pháp ngẫu nhiên đơn, sau đó gửi thư mời đối 20