Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:77

Thêm vào BST

Báo xấu

201
lượt xem 40
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh từ nước, bùn ở các vùng biển Bắc, Trung, Nam; nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn lựa chọn; phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn theo phương pháp giải trình tự gene 16S-rRNA; nghiên cứu một số điều kiện thu nhận chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong phòng thí nghiệm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phương Nhuệ ii
LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Để hoàn thành được luận văn này tôi nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Phương Nhuệ Phó Trưởng phòng Công nghệ lên men – Viện Công nghệ sinh học, người đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Lê Gia Hy, TS. Phí Quyết Tiến Trưởng phòng Công nghệ lên men – Viện Công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, thực hành thí nghiệm trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Đồng thời tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn tới NCS Phạm Thanh Huyền và các cán bộ nghiên cứu phòng Công nghệ lên men – Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn phòng TNTĐCNG, Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài này. Em xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh học, các cán bộ trường ĐH Khoa học Tự nhiên ĐH Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ, trang bị kiến thức và tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập. iii
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người thân đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 04 năm 2013 Tác giả Hồ Văn Hoàn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, xuất phát từ yêu cầu phát sinh trong thực tiễn để hình thành hướng nghiên cứu. Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng nguyên tắc và kết quả được trình bày trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai công bố trước đây. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài này đã được cảm ơn và ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 04 năm 2013 Tác giả iv
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CKS Chất kháng sinh CW Cell wall DAP Diaminopienat DNA Deoxyribose nucleic axit ĐHSP Đại học sư phạm KHKT Khoa học kĩ thuật KTCC Khuẩn ti cơ chất KTKS Khuẩn ti khí sinh NXB Nhà xuất bản PG Peptidoglycan RNA Ribonucleoic axit TNTĐCNG Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gene VKK Vòng kháng khuẩn v
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển Bảng 2.1. Các thiết bị chính sử dụng trong đề tài Bảng 3.1. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.2. Mầu sắc của các chủng xạ khuẩn trên các môi trường ISP khác nhau Bảng 3.3. Khả năng sử dụng nguồn nitơ của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.4. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.5. Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở nồng độ NaCl khác nhau Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau Bảng 3.7. Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở điều kiện pH khác nhau Bảng 3.8. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA113 với chủng xạ khuẩn S. scabies ISP 5058 Bảng 3.9. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA115 với chủng chuẩn S. tendae ISP 5101 Bảng Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16SrRNA của chủng NA113 3.10. với gene tương ứng của các chủng vi khuẩn được đăng ký trên GenBank Bảng Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16SrRNA của chủng NA115 3.11. với gene tương ứng của các chủng vi khuẩn được đăng ký trên GenBank Bảng Khả năng sinh chất kháng sinh trên các môi trường lên men khác 3.12. nhau của các chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 vi
Bảng Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn 3.13. của chủng NA113 và NA115 Bảng Ảnh hưởng của pH ban đầu và độ thoáng khí đến hoạt tính kháng 3.14. sinh Bảng Phổ hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 3.15. DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc của Abyssomicin C và Trioxacacin Hình 1.2. Cấu trúc của Diazepinomicin Hình 1.3. Cấu trúc của deoxynyboquinone (1) và pseudonocardian AC (24) Hình 3.1. Tỉ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc của chủng NA113 trên môi trường ISP2, ISP3 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của chủng NA115 trên môi trường ISP2, ISP3 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA113 Hình 3.6. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA115 Hình 3.7. Khả năng sinh trưởng của chủng NA113 trên môi trường có pH khác nhau Hình 3.8. Khả năng sinh trưởng của chủng NA115 trên môi trường có pH khác nhau Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn trên gel agarose 1% Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% Hình 3.11. Cây phân loại của chủng NA113 và một số chủng xạ khuẩn Hình 3.12. Cây phân loại của chủng NA115 và một số chủng xạ khuẩn vii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. iii LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN .................................................. v DANH MỤC BẢNG BIỂU .............................................................................. vi DANH MỤC HÌNH VẼ .................................................................................. vii MỤC LỤC ..................................................................................................... viii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3 1.1. Tổng quan về xạ khuẩn ........................................................................ 3 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ............................................ 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ................................................. 4 1.1.3. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn .................................................. 7 1.2. Phân loại xạ khuẩn ............................................................................... 8 1.2.1. Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy ............. 8 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) .................................. 8 1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................. 9 1.2.4. Phân loại số (Numerical Taxonomy) ........................................... 10 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16S rDNA ....................................................................................................... 10 1.3. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển ............................................... 11 1.3.1. Nhóm chất kháng sinh polyketide ................................................ 11 1.3.2. Nhóm kháng sinh Nonribosomal peptide ..................................... 13 1.3.3. Nhóm kháng sinh phức hợp PolyketideNonribosomal peptide 13 ... 1.3.4. Nhóm kháng sinh isoprenoid ......................................................... 13 1.3.5. Các chất kháng sinh khác ............................................................. 14 1.4. Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ........................................ 16 1.4.1. Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ........................ 16 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn ....................................................................................................... 17 viii
1.5. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ...................... 19 1.5.1. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước ........................................................................................................ 19 1.5.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới .......................................................................................................... 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 22 2.1. Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu ...................................... 22 2.1.1. Vật liệu ......................................................................................... 22 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ...................................................................... 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 24 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu .................................................................. 24 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu ......................................................................................................... 24 2.2.3. Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh ........................... 26 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn 26 ....... 2.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử .......... 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 31 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh 31 .. 3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn ..................................... 35 3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy ....................................................................... 35 3.2.2. Đặc điểm hình thái ....................................................................... 37 3.3. Đặc điểm sinh lí sinh hóa .................................................................. 38 3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn nitơ ..................................................... 38 3.3.2. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon ............................................... 39 3.3.3. Khả năng chịu muối NaCl ............................................................ 40 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng .................. 41 3.3.5. Ảnh hưởng của độ pH .................................................................. 42 3.4. Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 ..................... 43 3.4.1. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lísinh hóa ............... 43 3.4.2. Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử ............................................................................................................. 46 3.5.1. Lựa chọn môi trường lên men .......................................................... 51 3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nguồn nitơ .............................. 52 3.5.3. Ảnh hưởng của pH môi trường và độ thoáng khí ....................... 54 3.6. Phổ hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu ............ 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 56 KẾT LUẬN ................................................................................................. 56 ĐỀ NGHỊ ..................................................................................................... 57 ix
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 57 PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN .................................... 61 PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI ........... 63 PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH ..................................................... 65 PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA 16SrRNA ................................. 65 x
MỞ ĐẦU Vùng biển Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km2 và 3.260 km bờ biển (không tính các đảo), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nước ta tính đa dạng về cảnh quan tự nhiên và nguồn lợi thuỷ sinh vật. Với mong muốn khám phá, khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú của biển, nhiều nghiên cứu khoa học gần đây, nhất là công nghệ sản xuất sinh học đã chuyển dần từ khai thác sang tìm hiểu, ứng dụng và đưa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ những vùng nước ngập mặn, biển xa bờ, thậm chí cả đáy biển sâu để sinh trưởng bền vững dựa trên cơ sở của các công nghệ mới. Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Xạ khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều do có khả năng sản xuất các sản phẩm trao đổi chất quan trọng. Trong số hơn 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì có trên 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn chủ yếu là từ các chi Streptomyces và Micromonospora. Giai đoạn những năm 1980 trở về trước các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá các chủng xạ khuẩn trên mặt đất. Từ vài thập kỷ trở lại đây các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý như: khả năng sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung thư… có ý nghĩa ứng dụng trong y học [1]. Cùng với sự sinh trưởng của công nghệ sinh học hiện đại, các nghiên cứu về ứng dụng xạ khuẩn biển đã thu được rất nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất sinh khối, dược phẩm… được sử dụng trong các ngành công nghiệp, y dược học, nông nghiệp… Trong lĩnh vực y dược, sản xuất chất kháng sinh có ý nghĩa lớn trong đời sống, góp phần đẩy lùi bệnh tật và nâng cao sức khỏe cộng đồng. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh đã dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc làm ảnh hưởng đến kết quả điều trị bệnh. Việc tìm ra các chất kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩn cao từ các nguồn khác nhau, đặc biệt từ biển, trở thành 1
nhu cầu cấp thiết hiện nay. Bên cạnh đó, nghiên cứu phân loại các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh cũng rất quan trọng, các nghiên cứu cơ bản này giúp định hướng sản xuất các sản phẩm hữu ích từ các chủng xạ khuẩn biển, góp phần đánh giá sự đa dạng của các vi sinh vật biển. Xuất phát từ những định hướng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam”. Mục tiêu: Tuyển chọn và phân loại các chủng xạ khuẩn biển có khả năng tổng hợp kháng sinh cao định hướng ứng dụng trong y dược. Nội dung nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh từ nước, bùn ở các vùng biển Bắc, Trung, Nam. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn lựa chọn. Phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn theo phương pháp giải trình tự gene 16SrRNA Nghiên cứu một số điều kiện thu nhận chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong phòng thí nghiệm. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về xạ khuẩn 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trưởng được. Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giàu dinh dưỡng và lớp đất bề mặt thường có số lượng lớn xạ khuẩn. Trong 1 gam đất canh tác có thể phân lập được 5 triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hóa chỉ có 10 – 100 nghìn mầm. Số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [7]. Xạ khuẩn cũng thường sống hoại sinh trên xác các sinh vật (cây chết, rơm rạ) nhưng cũng có thể kí sinh trên thân, củ hoặc rễ cây. Xạ khuẩn biển thường được phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật khác như san hô, rong biển. Trước đó, người ta tin rằng xạ khuẩn biển có nguồn gốc từ trên cạn. Tuy nhiên, sau đó có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nhiều nhóm xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển. Xạ khuẩn biển thường có khả năng chịu mặn cao, đặc biệt có những chủng Streptomyces ssp. có thể sinh trưởng được ở nồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc chi Streptomyces và Nocardia sinh trưởng tốt khi ở nồng độ 3
NaCl 10%, Micromonospora sp. và Salinospora sp. cũng có khả năng chịu mặn cao [24, 25]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn Ở trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Do đó mới có tên gọi là xạ khuẩn (Actinomycetes, tiếng Hy Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”). Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo [4]. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng. Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể đơn bào, không có nhân thực và kích thước giống vi khuẩn. Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn sinh trưởng thành 2 hướng tạo thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Khuẩn ti cơ chất sinh trưởng cắm sâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn. Khuẩn ti cơ chất sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh. Người ta gọi khuẩn ti khí sinh là khuẩn ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp là loại khuẩn ti sinh trưởng từ các loại bào tử nảy mầm [4]. Nhiều loại chỉ có khuẩn ti cơ chất mà không có khuẩn ti khí sinh, nhưng cũng có loại như chi Sporichthya lại chỉ có khuẩn ti khí sinh. Khi đó khuẩn ti khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản. Khuẩn ti của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc, đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1 m đến 2 – 3 m. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ti không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Sau một thời gian sinh trưởng, ở đầu các khuẩn 4
ti khí sinh thường hình thành các sợi bào tử. Khuẩn ti không mang bào tử gọi chung là khuẩn ti dinh dưỡng. Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lưới dày khoảng 10 – 20 nm, có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ti và bảo vệ tế bào. Căn cứ vào kết cấu hóa học người ta chia thành tế bào thành 4 nhóm: Nhóm CW I: có chứa L, LDAP và glycin. Thuộc nhóm này có Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides. Nhóm CW II: có chứa mezoDAP và glycin. Thuộc nhóm này có Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella. Nhóm CW III: có chứa mezoDAP. Gồm các chi Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, Nocardiopsis, Microbispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora, Streptosporangium, Actinosynnema. Nhóm CW IV: có chứa mezoDAP, arabionose và galactose. Gồm các chi Nocaridia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora [4]. Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu gồm 3 lớp: lớp ngoài dầy 60 – 120 Å, khi già có thể dầy tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50 Å và lớp trong dầy 50 Å. Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptid gồm các gốc N acetylglucozamin liên kết với Nacetymuramic bởi liên kết 1,4glicozit. Khi xử lí bằng lysozym, các liên kết này bị phát vỡ, thành tế bào bị phá hủy và màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần. Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử lí bằng hỗn hợp ether và chloroform và các dung môi hòa tan lipit. Điều đó chứng tỏ lớp ngoài thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose hay chitin [7]. Đối với xạ khuẩn phân lập từ các vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dầy và độ bền cơ học cao, có thể chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường (nồng độ muối từ 3 4%, pH từ 6,8 – 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20 – 5
35oC). Thành tế bào của xạ khuẩn chịu kiềm ngoài peptidoglycan còn có chứa nhiều axit polyme như axit galacturonic, axit glutamic, axit aspartic và axit phosphoric. Với điện tích âm của các thành phần axit không thuộc peptidoglycan, bề mặt thành tế bào có thể hấp thụ các ion Na+, H+ trong khi đẩy các ion OH. Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớp peptidoglycan là giống nhau ở xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhưng lại khác nhau về thành phần hợp chất cấu thành, xạ khuẩn ưa kiềm chứa nhiều hesoamin và axit amin [20]. Màng sinh chất của xạ khuẩn dầy khoảng 7,5 – 10 nm gồm thành phần chủ yếu là phospholipit và protein, chúng có cấu trúc và chức năng tương tự như màng sinh chất của vi khuẩn. Trên màng có nhiều enzym có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các chất qua màng [4]. Thể trung gian hay mesosome nằm ở phía trong của màng sinh chất và có hình phiến, hình bọng hay hình ống. Tác dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào và từ đó làm tăng cường hoạt tính của enzyme, tăng chuyển điện tử…[4]. Các thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm các hạt polyphosphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III) và polysaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) [4]. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khác với những vi sinh vật nhân sơ khác là tỉ lệ G – C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 – 45%. Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về di truyền và thường xảy ra sự đột biến trong phân tử DNA. Điều này tạo ra tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng. Hơn nữa, sự tự nhân lên của các đoạn DNA còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền ở xạ khuẩn [7]. 6
1.1.3. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn là dựa vào hình thái và kích thước của cuống sinh bào tử. Sợi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác nhau tùy theo loài: thẳnglượn sóng (Retiflexibilis), xoắn (Spirales) hoặc có móc, vòng (Retinaculiaperti)… có loại mọc vòng đơn cấp, có loại mọc vòng hai cấp. Một số xạ khuẩn có sinh nang bào tử, bên trong có chứa các bào tử nang. Bề mặt của bào tử có thể nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì (warty), nếp nhăn (rugose)… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn [4, 5, 13]. Bào tử xạ khuẩn được hình thành theo 3 phương thức sau đây: Phương thức sinh trưởng toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ti hình thành ra thành bào tử. Phương thức sinh trưởng trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ti. Trường hợp này gặp ở Planomonospora. Phương thức sinh trưởng bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ti không tham gia vào quá trình hình thành bào tử. Trường hợp này gặp ở Thermoactinomycetes [4]. Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích hình thành khuẩn ti khí sinh. Nhiều tài liệu đã đề cập đến mối quan hệ giữa sự hình thành bào tử và môi trường nghèo dinh dưỡng trong nuôi cấy xạ khuẩn. Một số tác giả còn cho rằng việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vào môi trường cũng kích thích sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn. Tuy nhiên, việc bổ sung các nguyên tố vào môi trường phải được nghiên cứu kĩ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng thì quá trình hình thành bào tử thường sẽ bị kìm hãm. Độ ẩm và nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử [7]. 7
1.2. Phân loại xạ khuẩn 1.2.1. Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Trong phân loại người ta thường chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính dựa trên các dấu hiệu hình thái: Các nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt. Đặc trưng của nhóm này là sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành KTKS và KTCC. Nhóm xạ khuẩn có bào tử nang. Đặc trưng của nhóm này là khuẩn ti phân chia theo hướng vuông góc với nhau, tạo ra cấu trúc tương tự nang bào tử. Nhóm xạ khuẩn dạng Nocardia: sinh sản bằng cách phân đốt khuẩn ti. Nhóm xạ khuẩn dạng tương tự Corynebacter và dạng cầu: tế bào có hình chữ V, T hoặc dạng cầu, thông thường không có khuẩn ti. Trước kia, nhiều loại xạ khuẩn được phân chia tùy theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như màu của KTCC, KTKS, sắc tố tan; sự có mặt của KTCC, hình dạng và kết cấu mặt bào tử; đặc điểm cuống sinh bào tử và sự phân đốt của khuẩn ti. Tuy nhiên, ngày nay chỉ tiêu này chỉ là bổ sung cho việc nghiên cứu phân loại bằng sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử [7, 36]. 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong một vài thập kỉ trước và ngày nay vẫn còn là cơ sở quan trọng trong phân loại xạ khuẩn. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật. Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau: Typ thành tế bào: Dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptid và đường trong thành tế bào hay các polysaccarid gắn vào thành tế bào. 8
Typ peptidoglycan (PG): dựa trên các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptid của PG, của cầu nối peptid và cách liên kết giữa các mắt xích của PG. Axit mycolic: là các phần tử có mạch dài hay phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium và Corynebacter. Đây là đặc điểm phân loại cơ bản của các chi đó. Axit béo: thường được sử dụng trong phân loại là các axit béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso được methyl hóa ở phân tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10methyloctadecanoid là đặc điểm phân loại đến chi. Menaquinon: Xạ khuẩn giống vi khuẩn Gram dương và khác vi khuẩn Gram âm ở chỗ tổng hợp menaquinon và dimethylmenaquinon, không tổng hợp ubiquinon. Phần lớn các chi xạ khuẩn có thành phần menaquinon xác định. Photpholipid: có 5 typ photpholipid (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng và có ý nghĩa trong phân loại xạ khuẩn [7]. 1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Khi phân loại xạ khuẩn người ta thường sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cũng như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng. Ngoài ra còn các chỉ tiêu khác cũng được xác định như pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối, tính chất đối kháng và mẫn cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất khác đặc trưng của xạ khuẩn. Tuy nhiên, do xạ khuẩn thường xuất hiện nhiều biến dị nên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường có giá trị thấp về mặt phân loại. Nhưng để phát hiện loài mới người ta thường sử dụng các đặc điểm này dựa trên phân loại số [7, 34]. 9
1.2.4. Phân loại số (Numerical Taxonomy) Phân loại số được Williams và cs, (1983) sử dụng để phân loại chi Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi. Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng, mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath (1973) đề nghị tính hệ số giống nhau S (Similarity) theo phương trình sau: N S x100 %S = NS + Nd Ns: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của 2 chủng so sánh. Nd: Tổng số các đặc điểm (khác nhau) dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia. Kết quả phân tích được biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng tùy theo mức độ giống nhau được nhóm thành từng cụm (Cluster). Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất định [7, 27, 31]. 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16SrDNA Từ cuối thế kỷ XX, đặc biệt là những năm 80 trở lại đây, với sự sinh trưởng mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao. Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gene, hoặc các sản phẩm của gene. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 phương pháp chính đó là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gene mã hóa 16SrRNA. Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rRNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao. Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta 10