intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xác định hệ protein màng trong huyết thanh của bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:136

Thêm vào BST
Báo xấu
13
lượt xem 4
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nhận diện các protein màng có trong huyết thanh bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp; xây dựng và phân tích dữ liệu cơ bản về các protein này; dự đoán số vùng xuyên màng trong cấu trúc các protein màng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xác định hệ protein màng trong huyết thanh của bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------- Trần Thái Thƣợng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỆ PROTEIN MÀNG TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------- Trần Thái Thƣợng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỆ PROTEIN MÀNG TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Lê Thị Bích Thảo PGS. TS. Trịnh Hồng Thái Hà Nội – 2013
  3. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Bích Thảo và PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại Trường. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới GS. TS. Phan Văn Chi, cùng toàn thể các anh chị làm việc tại Phòng Hóa sinh Protein, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hết lòng định hướng và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội đã cung cấp mẫu tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua. Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài Độc lập cấp Nhà nước số 03/2011 PTNTĐ/HĐ-ĐTĐL. Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Học viên Trần Thái Thượng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................................. v BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................ i MỞ ĐẦU............................................................................................................................................ 1 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ................................................................................................................. 3 1.1. HUYẾT THANH ................................................................................................................ 3 K20 – Sinh học thực nghiệm –i– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  4. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ 1.1.1. Khái niệm về huyết thanh ........................................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh ...................................................... 3 1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh ............................................................. 6 1.1.4. Phƣơng pháp proteomics và ứng dụng trong nghiên cứu hệ protein huyết thanh ....... 7 1.2. PROTEIN MÀNG VÀ CÁCH TIẾP CẬN PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU.... 12 1.2.1. Vai trò của protein màng........................................................................................... 12 1.2.2. Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu protein màng ....................................... 15 1.3. HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP ................................................................................. 17 1.3.1. Bệnh động mạch vành và hội chứng mạch vành cấp ................................................ 17 1.3.2. Các phƣơng pháp chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp ........................................... 18 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY VỀ PROTEIN MÀNG VÀ TIM MẠCH ................... 19 1.4.1. Những nghiên cứu trên thế giới ................................................................................ 19 1.4.2. Những nghiên cứu tại Việt Nam ............................................................................... 20 Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................................ 21 2.1. NGUYÊN LIỆU ................................................................................................................ 21 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................................... 21 2.2.2. Hóa chất .................................................................................................................... 21 2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................................... 22 2.2. PHƢƠNG PHÁP ............................................................................................................... 22 2.2.1. Loại albumin và IgG huyết thanh bằng “Aurum™Serum Protein Mini Kit” ........... 23 2.2.2. Xác định hàm lƣợng protein và tủa để tinh sạch mẫu ............................................... 24 2.2.3. Điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) ................................................... 25 2.2.4. Thủy phân protein bằng trypsin trong gel ................................................................. 26 2.2.5. Sắc kí đa chiều và phân tích khối phổ ....................................................................... 26 2.2.6. Nhận diện protein qua phổ khối lƣợng thu đƣợc ............................................................ 27 2.2.7. Nhận diện và phân loại protein màng huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp ......... 29 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................................... 31 3.1. KẾT QUẢ ......................................................................................................................... 31 3.1.1. Loại albumin và IgG trong huyết thanh .................................................................... 31 3.1.2. Tủa protein trong huyết thanh ................................................................................... 32 3.1.3. Phân tách các protein trong huyết thanh bằng SDS-PAGE ...................................... 34 3.1.4. Nhận diện protein màng trong huyết thanh ............................................................... 35 3.1.5. Phân tích dữ liệu vị trí dƣới tế bào của các protein màng ......................................... 40 3.1.6. Phân tích dữ liệu chức năng của các protein màng ................................................... 42 K20 – Sinh học thực nghiệm – ii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  5. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ 3.1.7. Phân tích dữ liệu các quá trình sinh học mà protein màng tham gia......................... 44 3.1.8. Phân tích dữ liệu khối lƣợng và cải biến sau dịch mã của các protein màng ............ 47 3.1.9. Dự đoán vùng xuyên màng qua các chƣơng trình tin sinh học ................................. 49 3.2. THẢO LUẬN ................................................................................................................... 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................ 61 PHỤ LỤC............................................................................................................................................ I Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân.................................................................................................. I Phụ lục 2. Danh sách các protein màng nhận diện đƣợc trong huyết thanh bệnh nhân ACS và kết quả dự đoán số vùng xuyên màng ...................................................................................... III K20 – Sinh học thực nghiệm – iii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  6. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Các hóa chất chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ...............................21 Bảng 2. Các thành phần tạo gel ............................................................................25 Bảng 3. Phân loại protein theo vị trí dƣới tế bào ..................................................40 Bảng 4. Phân loại protein theo chức năng ............................................................42 Bảng 5. Phân loại protein theo quá trình sinh học ................................................45 Bảng 6. Phân loại protein theo khối lƣợng ...........................................................47 Bảng 7. Phân loại protein theo cải biến sau dịch mã ............................................48 Bảng 8. Kết quả dự đoán vùng xuyên màng (TMD) ............................................53 Bảng 9. Kết quả dự đoán số lƣợng protein theo số vùng xuyên màng (TMD) ....54 K20 – Sinh học thực nghiệm – iv – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  7. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Một số kiểu định vị của các protein màng ..................................................14 Hình 2. Quy trình phân tích mẫu huyết thanh ...........................................................23 Hình 3. Quy trình nhận diện protein màng từ dữ liệu phổ khối lƣợng thu đƣợc ......28 Hình 4. Thông số tra cứu dữ liệu protein bằng phần mềm Mascot...........................29 Hình 5. Kết quả loại albumin và IgG bằng Aurum™ Serum Protein Mini Kit.........32 Hình 6. Hình ảnh điện di SDS-PAGE kết quả tủa protein bằng acetone. .................33 Hình 7. Hình ảnh điện di các mẫu huyết thanh bệnh nhân ACS sau tủa protein bằng acetone. ......................................................................................................34 Hình 8. Hình ảnh minh họa các phân đoạn huyết thanh bệnh nhân ACS đƣợc cắt trên bản gel SDS – PAGE ..........................................................................35 Hình 9. Hình ảnh minh họa kết quả nhận diện protein bằng phần mềm Mascot. .....37 Hình 10. Hình ảnh minh họa các thông số của một protein đƣợc nhận diện bằng phƣơng pháp khối phổ ...............................................................................37 Hình 11. Hình ảnh minh họa thông tin của một protein trên cơ sở dữ liệu UniProt .38 Hình 12. Hình ảnh minh họa kết quả tìm kiếm thông tin của các protein từ cơ sở dữ liệu UniProt ................................................................................................38 Hình 13. Hình ảnh minh họa thông tin chi tiết của các protein màng ......................39 Hình 14. Tỉ lệ phân bố dƣới tế bào của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp ...................................................................................41 Hình 15. Tỉ lệ theo chức năng của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp ...........................................................................................43 Hình 16. Tỉ lệ tham gia vào các quá trình sinh học của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp ................................................................46 Hình 17. Tỉ lệ theo khối lƣợng của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp ...........................................................................................47 Hình 18. Tỉ lệ các loại cải biến sau dịch mã của các protein màng trong huyết thanh bệnh nhân mạch vành cấp ..........................................................................49 K20 – Sinh học thực nghiệm –v– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  8. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ Hình 19. Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán vùng xuyên màng của chƣơng trình TMHMM....................................................................................................50 Hình 20. Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán vùng xuyên màng của chƣơng trình SOSUI ........................................................................................................51 Hình 21. Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán vùng xuyên màng của chƣơng trình Phobius .......................................................................................................52 Hình 22. Hình ảnh so sánh kết quả dự đoán TMD giữa các chƣơng trình tin sinh học ....................................................................................................................53 Hình 23. Hình ảnh so sánh kết quả dự đoán số lƣợng TMD của các chƣơng trình tin sinh học ......................................................................................................55 K20 – Sinh học thực nghiệm – vi – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  9. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên Tiếng Anh Tên Tiếng Việt ACN Acetonitrile ACS Acute Coronary Syndrome Hội chứng mạch vành cấp amu Atomic mass unit Đơn vị khối lƣợng nguyên tử APS Ammonium persulfate BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò CK Creatine kinase Da Dalton Đan tơn (Đơn vị khối lƣợng) DTT Dithiothreitol ESI Electrospray Ionization Ion hóa bằng phun điện FA Formic acid gi GenInfo Identifier Số định danh protein GO Gen Ontology HBPP Human Brain Proteome Project Dự án Hệ protein Não Ngƣời H-FABP Heart-type fatty acid binding Protein gắn acid béo của tim protein HLPP Human Liver Proteome Project Dự án Hệ protein Gan Ngƣời HPPP Human Plasma Proteome Project Dự án Hệ protein Huyết tƣơng Ngƣời HPLC High Performance Liquid Sắc kí lỏng hiệu năng cao Chromatography K20 – Sinh học thực nghiệm –i– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  10. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ HUPO Human Proteome Organization Tổ chức nghiên cứu Hệ protein Ngƣời IAA Indole-3-Acetic Acid KB Knowledgebase LC Liquid Chromatography Sắc kí lỏng LNCaP Lymph Node Carcinoma of Ung thƣ biểu mô hạch tuyến Prostate tiền liệt MDLC Multidimentional Liquid Sắc kí lỏng đa chiều Chromatography MS Mass Spectrometry Phổ khối lƣợng NCBI National Center for Biotechnology Trung tâm Thông tin Công Information nghệ sinh học Quốc gia NGEP_L New Gene Expressed in Prostate Gene mới đƣợc biểu hiện Long trong tuyến tiền liệt Nr non reducdant PIR Protein Information Resource Nguồn Thông tin Protein PSI Proteomics Standards Initiative Sáng kiến Proteomics chuẩn RP Reversed Phase Ngƣợc pha SCX Strong Cation Exchange Trao đổi cation mạnh SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide Gel Điện di trên gel Electrophoresis polyacrylamide có SDS SIB Swiss Institute of Bioinformatics Viện Tin sinh học Thụy Sĩ TEMED Tetramethylethylenediamine TFA Trifluroacetic acid K20 – Sinh học thực nghiệm – ii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  11. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ TMD Transmembrane Domain Vùng xuyên màng TMHMM Transmembrane Hidden Markov Chƣơng trình dự đoán TMD Model dựa trên thuật toán Markov TOF Time of Flight Thời gian bay TrEMBL Tranffered European Molecular Đã chuyển giao đến Phòng Biology Laboratory Thí nghiệm Sinh học Phân tử châu Âu K20 – Sinh học thực nghiệm – iii – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  12. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ MỞ ĐẦU Hội chứng mạch vành cấp (Acute Coronary Syndrome, ACS) thƣờng xảy ra bất ngờ, đột ngột, có tỉ lệ tử vong cao và để lại nhiều di chứng nặng nề nếu không đƣợc cấp cứu kịp thời. Ở Việt Nam, do áp lực công việc ngày càng tăng cao cùng với thói quen ăn uống không cân đối, tình trạng thừa cân, béo phì hay hút thuốc lá đã dẫn đến tỉ lệ các bệnh lí tim mạch nói chung và ACS nói riêng tăng lên rõ rệt trong những năm gần đây. Hội chứng mạch vành cấp thƣờng liên quan đến những biến đổi bất thƣờng xảy ra bên trong dòng máu. Hơn nữa, dòng máu tuần hoàn gần nhƣ khắp cơ thể, tiếp xúc với hầu hết các tế bào nên rất nhiều biến đổi trong cơ thể đƣợc phản ánh vào trong máu. Huyết thanh là thành phần chính của máu, là môi trƣờng cho các tế bào máu hoạt động nên những biến đổi này cũng đƣợc phản ánh trong huyết thanh. Do đó, huyết thanh đã đƣợc lựa chọn nhƣ một trong những đối tƣợng nghiên cứu chính trong nhiều bệnh lí, đặc biệt là tim mạch. Đã có rất nhiều nghiên cứu đƣợc thực hiện trên huyết thanh nhƣng gần đây hƣớng tiếp cận về protein màng đang thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học. Protein màng có vai trò then chốt trong các hoạt động sống của tế bào vì chúng thực hiện rất nhiều chức năng quan trọng. Những thay đổi bất thƣờng trong hoạt động của các protein này chính là dấu hiệu nhận biết sự phát sinh và phát triển bệnh lí. Những năm gần đây các nghiên cứu về protein đặc biệt là protein màng đang rất đƣợc quan tâm và đầu tƣ. Cùng với sự ra đời, phát triển của tin sinh học và các kĩ thuật phân tích dựa trên phổ khối lƣợng, cách tiếp cận proteomics đang cho thấy đây là một phƣơng pháp hữu hiệu và khó có thể thay thế trong việc phân tích các hệ protein trong cơ thể. Tại Việt Nam, những nghiên cứu proteomics đã đƣợc tiến hành trong một số năm qua và đạt đƣợc những kết quả nhất định. Trên cơ sở đó chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định hệ protein màng trong huyết thanh của bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp” với mục đích: K20 – Sinh học thực nghiệm –1– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  13. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ 1. Nhận diện các protein màng có trong huyết thanh bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp. 2. Xây dựng và phân tích dữ liệu cơ bản về các protein này. 3. Dự đoán số vùng xuyên màng trong cấu trúc các protein màng. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. K20 – Sinh học thực nghiệm –2– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  14. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. HUYẾT THANH 1.1.1. Khái niệm về huyết thanh Máu là dung dịch sinh lí quan trọng nhất trong cơ thể con ngƣời. Nhiệm vụ của máu là tuần hoàn khắp cơ thể, cung cấp oxi cũng nhƣ các chất dinh dƣỡng cần thiết cho các tế bào, đồng thời chuyển các chất thải từ chính những tế bào này đến các cơ quan bài tiết. Để có thể thực hiện những chức năng trên, máu đƣợc tạo nên nhờ hai thành phần cơ bản là các tế bào máu và một môi trƣờng bao quanh các tế bào này. Môi trƣờng này chính là huyết tƣơng. Huyết tƣơng là thành phần phi tế bào, là môi trƣờng sống của các tế bào máu, chiếm tới 55 – 60% thể tích máu [48]. Trong huyết tƣơng có nhiều nhân tố quan trọng tham gia vào quá trình đông máu. Khi các nhân tố này đƣợc tách khỏi huyết tƣơng, phần dịch còn lại chính là huyết thanh. Huyết thanh bao gồm nƣớc, muối, lipid, đƣờng, các enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác.... Nhƣ vậy, thành phần của huyết thanh rất giống huyết tƣơng và các protein của huyết thanh thực hiện các vai trò rất đa dạng nhƣ đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dƣỡng và nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể [11]. 1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh Một ngƣời trƣởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam protein. Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lƣợng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml. Trong đó, khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ ng/ml [12]. Các protein hiện diện trong huyết thanh với nhiều lí do khác nhau và đƣợc chia thành các nhóm nhƣ sau: K20 – Sinh học thực nghiệm –3– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  15. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ  Protein do mô đặc tiết ra và có hoạt động trong huyết thanh: Các protein này đƣợc tiết với số lƣợng lớn từ gan và các nội tạng, có khối lƣợng phân tử lớn hơn kích thƣớc lỗ lọc của thận (~ 45 kDa) nên không chui qua đƣợc màng lọc của thận, do đó thời gian cƣ trú trong huyết thanh thƣờng dài (thời gian tồn tại của albumin trong huyết thanh lên tới 21 ngày).  Các globulin miễn dịch (Immunoglobulin): Các phân tử giữ chức năng kháng thể điển hình trong huyết thanh.  Chất gắn thụ thể trung gian: Các hormone có bản chất là protein và peptide đều nằm trong nhóm này. Những protein này có kích thƣớc khác nhau, phù hợp với các cấp độ hoạt động điều hòa (với những hormone nhỏ nhƣ insulin việc điều chỉnh rất nhanh chóng, với những hormone lớn nhƣ erythropoietin thì việc điều chỉnh diễn ra chậm hơn).  Chất gắn thụ thể nội bộ: Bao gồm các cytokine và các chất dẫn truyền ở cự li gần khác trong con đƣờng truyền thông tin liên tế bào. Thông thƣờng, những protein này có kích thƣớc phân tử nhỏ hơn màng lọc của thận (do đó, thời gian cƣ trú trong huyết thanh khá ngắn), những chất này tạo ra các tƣơng tác cục bộ giữa các tế bào và đƣợc pha loãng trong huyết thanh khi không còn tác dụng.  Những chất lưu hành tạm thời: Bao gồm các protein không phải là hormone, hoạt động trong huyết thanh với thời gian ngắn và cũng theo máu đến vị trí cụ thể để biểu hiện chức năng. Ví dụ, các protein đƣợc tiết và hấp thụ bởi lysosome qua các thụ thể.  Sản phẩm giải phóng từ các mô: Là các protein thực hiện chức năng thông thƣờng trong tế bào nhƣng đƣợc giải phóng vào trong huyết thanh khi tế bào bị tổn thƣơng hoặc bị chết. Phần lớn những protein này là các chỉ thị chẩn đoán bệnh quan trọng.Ví dụ, troponin, creatinin kinase hoặc myoglobin sử dụng trong chẩn đoán bệnh nhồi máu cơ tim. K20 – Sinh học thực nghiệm –4– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  16. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ  Các chất tiết khác thường: Những protein này đƣợc giải phóng từ các khối u và những mô bệnh khác, không bắt nguồn từ những hoạt động chức năng của các cơ quan trong cơ thể.  Protein ngoại lai: Là những protein của các sinh vật lây nhiễm hay động vật kí sinh đƣợc tiết vào trong hệ tuần hoàn. Thành phần protein trong huyết thanh đa dạng, phức tạp và rất biến động. Các nhà khoa học đã đƣa ra ba lí do giải thích về số lƣợng của protein trong huyết thanh. Đầu tiên, do hầu hết các protein huyết thanh đều bị glycosyl hóa rất mạnh nên giả sử rằng trong huyết thanh thật sự chỉ có khoảng 500 protein, và mỗi protein lại có khoảng 20 dạng glycosyl hóa gồm 5 kiểu biến đổi (bao gồm tiền chất, dạng có hoạt tính, sản phẩm suy thoái và các biến đổi cắt nối), tổng cộng sẽ tạo ra khoảng 50.000 dạng khác nhau. Thứ hai, huyết thanh còn đƣợc bổ sung bởi thành phần giải phóng từ các mô, đây là tác động của hệ protein ngƣời (sản phẩm của bộ gen ngƣời), mỗi sản phẩm này có 10 biến thể cắt nối, cải biến sau dịch mã hay đứt gẫy, tổng cộng lên tới hơn 500.000 dạng. Cuối cùng với lớp immunoglobulin, theo tính toán cũng phải chứa khoảng 10.000.000 trình tự khác nhau [13]. Do đó, huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn và cũng là một mẫu nghiên cứu hấp dẫn [12]. Huyết thanh đƣợc sử dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh nhờ hai đặc trƣng: mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn; mẫu không chỉ phản ánh toàn diện kiểu hình ngƣời mà còn cho biết trạng thái của cơ thể trên từng thời điểm. Trong khi đó, những mẫu khác nhƣ nƣớc bọt, nƣớc mắt, nƣớc tiểu chỉ đƣợc coi là một tập con nhỏ của huyết thanh và phản ánh hoạt động của các tế bào địa phƣơng [1]. Bên cạnh đó, huyết thanh còn là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Chính vì thành phần protein của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công trình nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh nguy hiểm K20 – Sinh học thực nghiệm –5– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  17. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ nhƣ đái tháo đƣờng, ung thƣ và tim mạch. Trên thực tế, nhiều loại protein trong huyết thanh đã đƣợc nghiên cứu trƣớc khi chúng ta biết đến sự tồn tại của gen [12]. Những thay đổi bất thƣờng về thành phần protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lí. Nói cách khác, huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lí, đã và đang đƣợc minh chứng qua những thành tựu thu đƣợc trong nhiều thập kỉ qua. Các protein có hàm lƣợng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lƣợng protein tổng số, trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein… [31]. Ví dụ, albumin thông thƣờng thay đổi từ 35 – 50 mg/ml (chiếm 50 – 70%) do sự tổng hợp liên tục hàng ngày ở gan (khoảng 12 g/ngày) và có thời gian bán hủy là 21 ngày nên protein này đƣợc coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dƣỡng [14]. IgG có nồng độ khoảng 5 – 7 mg/ml chiếm 10%. Các protein còn lại tuy hàm lƣợng thấp, khoảng 1% hàm lƣợng protein tổng số nhƣ interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA-125), β2-microglobulin... nhƣng có thể lại là những protein có chức năng quan trọng và đƣợc coi là những chất chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lí [47]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein huyết thanh có thể là các chỉ thị sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh nhƣ: ung thƣ buồng trứng (CA 15-3), ung thƣ tuyến tiền liệt (PSA), ung thƣ gan (α-fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-reactive protein) [4]. Nhƣ vậy, các protein hiện diện trong huyết thanh với nhiều lí do khác nhau và điều này cũng gợi ý cho việc có thể phát hiện và nghiên cứu chúng bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. 1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh Huyết thanh đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể, là môi trƣờng trao đổi chất của các mô và cơ quan, đồng thời cũng là môi trƣờng phức tạp, chứa hàng nghìn loại protein với hàm lƣợng rất khác nhau. Theo chức năng, có thể phân chia protein huyết thanh thành các nhóm sau: K20 – Sinh học thực nghiệm –6– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  18. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ  Chức năng miễn dịch: Bao gồm các Ig (IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) và các bổ thể tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể nhƣ tăng thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên (peptide, vi khuẩn, virus…).  Duy trì áp suất keo, độ nhớt của máu: Trong huyết thanh, protein tạo thành dung dịch keo để duy trì áp suất thẩm thấu, sức căng bề mặt và tính đệm.  Chức năng xúc tác: Enzyme có chức năng xúc tác cho các phản ứng của các quá trình sinh học từ đơn giản đến phức tạp.  Vận chuyển các chất: Vận chuyển chất dinh dƣỡng, nƣớc, muối đến các tổ chức và vận chuyển các chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hoá nhƣ: transferrin vận chuyển sắt; haptoglobin vận chuyển HST tự do…  Chức năng điều hoà: Những protein này tuy có hàm lƣợng rất nhỏ (ng/ml) nhƣng có vai trò rất quan trọng trong mọi hoạt động của cơ thể. Chúng bao gồm các hormone, cytokine, các protein ức chế đặc hiệu enzyme [5]. 1.1.4. Phƣơng pháp proteomics và ứng dụng trong nghiên cứu hệ protein huyết thanh Một trong những tổ chức có đóng góp vô cùng lớn cho việc nghiên cứu hệ protein trong huyết thanh ngƣời là HUPO (Human Proteome Organization). Một số dự án về hệ protein ngƣời đã đƣợc HUPO khởi động rất thành công nhƣ: Dự án những Sáng kiến Proteomics Tiêu chuẩn (PSI); Dự án Hệ protein Gan Ngƣời (HLPP); Dự án hệ protein não ngƣời (HBPP), và đặc biệt là Dự án Hệ protein Huyết tƣơng Ngƣời (HPPP). Hệ protein huyết tƣơng là một trong những dự án lớn nhất của HUPO với 47 phòng thí nghiệm của 14 nƣớc tham gia. Dự án này có ba mục tiêu khoa học chính: phân tích toàn diện thành phần protein của huyết tƣơng và huyết thanh ngƣời; xác định nguồn gốc sinh học của các biến thể trong mỗi cá thể qua thời gian nhƣ trạng thái sinh lí, bệnh lí và dƣợc lí để xác định đƣợc những chỉ thị sinh học có giá trị; xác định mức độ mở rộng của các biến thể qua những quần thể và qua những cá thể trong các quần thể. Từ khi ra đời đến nay tổ chức HUPO đã có rất K20 – Sinh học thực nghiệm –7– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  19. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ nhiều đóng góp lớn trong việc ứng dụng proteomics trong việc nghiên cứu nhiều hệ protein [1]. Proteomics là một lĩnh vực khoa học nghiên cứu về hệ protein – sản phẩm của hệ gene đƣợc biểu hiện trong tế bào, mô hoặc cơ thể trong những điều kiện và thời gian xác định [1].Thuật ngữ proteomics lần đầu tiên đƣợc đƣa ra bởi Marc Wilkins và cộng sự vào những năm đầu của thập niên 90. Proteomics bao gồm những nghiên cứu có tính hệ thống nhằm cung cấp kiến thức tổng quan về cấu trúc, chức năng của protein và vai trò của chúng trong điều hòa hoạt động của các hệ sinh học. Những cải tiến về trang thiết bị và phƣơng pháp hiện nay đã cho phép mở rộng phạm vi nghiên cứu từ phân tích sinh hóa các protein đơn lẻ đến nhận dạng và xác định những phức hợp protein [50]. Mục đích của nghiên cứu proteomics là nhận diện tất cả các protein đựợc mã hóa trong hệ gene của sinh vật và xác định: phạm vi và phƣơng thức biểu hiện, hoạt động của hệ protein ở các kiểu tế bào và loại mô khác nhau; sự phân bố trong tế bào; những cải biến sau dịch mã; mối tƣơng tác với những protein và thành phần khác; mối quan hệ cấu trúc – chức năng. Ngoài ra, nghiên cứu proteomics cũng cung cấp những hiểu biết tổng thể về sự biểu hiện của các protein ở những trạng thái phát triển sinh lí và bệnh lí khác nhau [2]. Proteomics có bốn công cụ chính:  Các kĩ thuật phân tách protein Các tổ chức sống thƣờng có cấu tạo rất phức tạp với thành phần chủ yếu là protein, hơn nữa, đa số các protein không thể thực hiện chức năng nếu chúng chỉ tồn tại đơn lẻ. Điều này làm cho cấu trúc của mẫu nghiên cứu rất phức tạp. Do đó, phải phân tách protein nhằm mục đích làm đơn giản những phức hệ protein bằng cách phân tách chúng thành các phân tử hoặc các nhóm protein nhỏ hơn. Vì vậy, phân tách protein cho phép khảo sát, đơn giản hóa các mẫu nghiên cứu phân tích tiếp theo. Điện di là một trong những kĩ thuật thƣờng đƣợc sử dụng để phân tách các protein trong mẫu nghiên cứu. Hai loại điện di đƣợc dùng phổ biến là điện di một K20 – Sinh học thực nghiệm –8– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
  20. Trần Thái Thượng Luận văn Thạc sĩ chiều và hai chiều. Tuy là một kĩ thuật mạnh nhƣng điện di hai chiều vẫn có nhƣợc điểm là cần số lƣợng lớn nguyên liệu đầu vào và có độ nhạy thấp để phát hiện các protein có nồng độ không cao nhƣ các cytokine và những phân tử tín hiệu. Nhƣợc điểm thứ hai là mỗi mẫu khác nhau cần phân tách trên các gel khác nhau, vì vậy sẽ tốn rất nhiều gel để có đủ số lƣợng phục vụ cho các phƣơng pháp thống kê. Hơn nữa, trong các nghiên cứu tổng thể nhƣ xác định thành phần protein trong một mẫu không thể sử dụng điện di hai chiều đƣợc vì điện di hai chiều làm các protein trong mẫu tách nhau quá xa trên một bản gel điện di. Khi đó điện di một chiều sẽ phù hợp hơn.  Khối phổ Khối phổ (Mass Spectrometry, MS) là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo và phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động trong từ trƣờng và điện trƣờng. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc lựa chọn nhiều hơn để phân tích các phức hợp protein. Các thiết bị khối phổ trong thập kỉ vừa qua đã có những cải tiến mạnh mẽ với việc tăng độ nhạy lên rất cao để có thể phân tích đƣợc các phân tử sinh học với độ chính xác gần nhƣ tuyệt đối. Phân tích proteomics dựa trên các nguyên lí phổ học đã trở thành một môn khoa học thật sự nhờ có các dữ liệu về trình tự gene (đặc biệt là việc giải mã thành công bộ gene ngƣời) cùng với những thành tựu kĩ thuật vƣợt bậc trong nhiều lĩnh vực, trong đó đặc biệt là sự phát triển của những phƣơng pháp ion hóa năng lƣợng thấp, phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân. Cho đến nay những phân tích về protein (cấu trúc bậc một, những biến đổi sau dịch mã hay tƣơng tác protein – protein…) bằng hệ thống khối phổ đã không chỉ thành công với những nhóm protein riêng biệt mà còn cả với các phức hệ protein đƣợc biểu hiện trong tế bào [49].  Hệ thống phần mềm phân tích và xử lí Công cụ thiết yếu thứ ba của proteomics là một hệ thống phần mềm thực sự mạnh mẽ để có thể xử lí đƣợc một lƣợng lớn các dữ liệu thu trong các phân tích hệ protein. Đó là những phần mềm dùng để vận hành máy móc trong quá trình nghiên K20 – Sinh học thực nghiệm –9– Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học
320 tài liệu
1253 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2