Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:92

Thêm vào BST

Báo xấu

129
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với 2 mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm; xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN o0o NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Hà Nội – 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đỗ Tuấn Đạt PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà
Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến: TS. Đỗ Tuấn Đạt, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Là những người Thầy đã tận tình quan tâm dạy bảo cùng những kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giảng dạy và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành nhiệm vụ học tập của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày 18 tháng 11 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Kim Dung
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU Bệnh cúm đã và đang đe dọa toàn cầu. Trong ba thế kỷ qua, cứ khoảng 10 đến 40 năm, thế giới lại chứng kiến một đại dịch cúm. Trước khi có vắcxin, mỗi đợt dịch có hàng triệu người chết. Năm 1918 chứng kiến đại dịch cúm nghiêm trọng nhất lịch sử thế giới, thậm chí còn được cho là đại dịch kinh hoàng nhất trong các loại bệnh dịch. Tác nhân gây dịch là vi rút cúm A/H1N1 đã gây tổn thất chưa từng thấy. Dịch cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện từ giữa tháng 12/2003 tại Hàn Quốc, sau đó lan rộng ra một số nước châu Á trong đó có Việt Nam. Từ đầu tháng 4/2009, Mexico đã thông báo trường hợp nhiễm cúm A/H1N1. Vi rút này nhanh chóng lan ra rất nhiều quốc gia trên thế giới và đã có thời điểm Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) phải đưa ra các cảnh báo coi đây như là một đại dịch cúm mới. Gần đây nhất, vào năm 2013, trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 đầu tiên được thông báo ở Trung Quốc và đang tiếp tục dấy lên một mối lo ngại cho châu Á nói riêng cũng như toàn Thế giới nói chung về một căn nguyên cúm mới nguy hiểm đối với sức khoẻ con người. Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo nên gánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40% quốc gia trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm. Do vậy, phát triển các vắcxin cúm cho người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp bách hiện nay. Là một cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắcxin cho người ở Việt Nam, Công ty TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 đã tiến hành xây dựng các quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 và tiến tới là vắcxin cúm A/H7N9 trên nuôi cấy tế bào. Một trong những thông số rất quan trọng để đánh giá chất lượng vắcxin trong phòng thí nghiệm đó là đặc tính của kháng nguyên vi rút cúm có mặt trong 9
các sản phẩm của quá trình sản xuất vắcxin. Xây dựng các phương pháp để đánh giá, từ đó đưa ra các tiêu chuẩn về chất lượng kháng nguyên là một việc làm hết sức cần thiết. Điều này giúp cho việc đánh giá được chất lượng vắcxin và kiểm tra độ ổn định của quy trình sản xuất. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm” trên sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 và cúm A/H1N1, với 2 mục tiêu : 1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm. 10
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm chung của vi rút cúm Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, genom là ARN đơn, (), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó, vi rút cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và động vật khác như lợn, ngựa…là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B và C chỉ lưu hành ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Các vi rút cúm A, B và C rất giống nhau về cấu trúc. Thể vi rút có chiều ngang từ 80120 nm, và thường có hình gần như tròn, ngoài ra vi rút cũng có thể hiện diện một số dưới dạng hình sợi. Thể vi rút cúm được cấu tạo từ một vỏ vi rút bao gồm 2 loại glycoprotein, quấn quanh một phần nhân trung tâm. Phần nhân trung tâm chứa bộ gene RNA và các protein khác có chức năng đóng gói và bảo vệ thể RNA này. Đối với 1 vi rút, thông thường bộ gene không chỉ có 1 mảnh nucleic acid; thay vào đấy, sẽ chứa 7 hoặc 8 mảnh RNA có chiều âm và phân đoạn. Vi rút cúm A có bộ gene mã hoá cho 11 protein trên 8 đoạn RNA: hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), M1, M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1F2 và PB2. 1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80120 nm. Các hạt virion của vi rút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một số protein dạng trần không được glycosyl hóa. Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, ở typ A và B có 8 đoạn ARN() với tổng khối lượng 5x10 6, còn ở typ C có 7 đoạn. Trong virion có chứa enzyme ARN polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme 11
này cần cho quá trình phiên mã vì genom ARN chuỗi (). Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsit đối xứng xoắn. Hình 1.1. Cấu trúc hạt vi rút cúm [10] Nucleocapsit được bao bọc bởi màng protein nền M1 (M: matrix), phía ngoài màng được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ. Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH của endosom thay đổi. Bề mặt vi rút có hai loại gai mọc nhô ra: hemaglutinin (H) và neuraminidaza (N). Gọi là hemaglutinin vì vi rút gây ngưng kết hồng cầu ở một số loài. Gai H dài 10 nm gồm 3 tiểu đơn vị glycoprotein giống nhau gộp lại (trimer). Mỗi tiểu đơn vị cấu tạo gồm 2 chuỗi polypeptit kí hiệu là HA1 và HA2, gắn với nhau bởi cầu nối disunphua. Trong hạt vi rút, phân tử hemaglutinin gắn vào màng lipit của vỏ ngoài ở vùng kỵ nước, phía đầu –COOH của HA2. Epitop của kháng nguyên hemaglutinin rất dễ bi biến đổi do luôn có sự biến đổi trong 12
ARN genom, làm thay thế axit amin tại một số vị trí trên phân tử HA1. Sự thay đổi này nằm ở vị trí gắn hemaglutinin vào thụ thể của tế bào. HA chứa peptit dung hợp, khi ở pH trung tính vùi vào trong gai, nhưng ở pH thấp thì peptit lại nhô ra ngoài. Các peptit dung hợp tạo lỗ, lồng vào lớp lipit kép của màng tế bào chủ làm cho màng tế bào chủ và vỏ ngoài của vi rút dung hợp với nhau. Xen giữa các gai H là các N hình nấm. Đầu gai có cấu trúc hình hộp do 4 tiểu đơn vị có dạng hình như cầu giáp nối với nhau mà thành. Đầu được nối với cuống chứa vùng kỵ nước, nhờ thế mà gai N cắm sâu vào vỏ ngoài của vi rút. Thụ thể của tế bào dành cho hemaglutinin có cấu tạo từ axit sialic (còn gọi là neuraminic) liên kết với gốc đường trong glycol protein bằng dây nối glycozit. Enzym neuraminic (silidaza) phân giải thụ thể ở màng nhầy đường hô hấp bằng cách cắt liên kết glycozit, giải phóng axit neuraminic. Động tác này cho phép vi rút đi qua màng nhầy và thoát khỏi các chất ức chế “không đặc hiệu”. Neuraminidaza phá hủy thụ thể của hemaglutinin trên bề mặt hồng cầu mặc dù tế bào này không phải là đối tượng gây nhiễm. Neuraminidaza cũng tham gia vào giải phóng vi rút ra khỏi tế bào. Vi rút typ A có 16 loại gai H và hầu hết các loại gai này có ở vi rút gây nhiễm ở động vật (chim, gà, vịt, ngỗng, gà tây, lợn ngựa và một số loại động vật có vú khác). Ba loại gai H quan trọng có ở vi rút gây bệnh cho người là H1, H2 và H3. Trước đây có H0 và HW (H lợn), nhưng về sau 2 gai này được coi là H1. Có 9 loại gai N, trong đó N1 và N2 là quan trọng nhất vì gây bệnh cho người. 13
Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm B [1]. Vi rút cúm B với virion dạng hình cầu điển hình với đường kính hạt vi rút thay đổi từ 80 120nm. Bên ngoài vỏ bao ngoài hạt vi rút là các gai ngắn dài khoảng 12nm rõ nét bám xung quanh. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo 100nm). Hình 1.3. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1]. 14
Hình 1.4. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1]. Vi rút cúm A/H1N1 đa dạng về hình thái (hình cầu 1.3.; hình que 1.4.) và kích thước thay đổi, đường kính hạt vi rút từ 80120nm, dài đến 1μm. Trên bề mặt hạt vi rút là các gai ngắn xếp đều đặn. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo 100nm). Hình 1.5. Hình ảnh vi rút cúm A/H5N1 [1] Vi rút cúm A/H5N1 với hình dạng và kích thước 15
thay đổi: hình cầu, hình que, đường kính hạt vi rút khoảng 100nm, dài đến 1 μm. Các gai ngắn sắp xếp đều trên bề mặt hạt vi rút với chiều dài của gai khoảng 17nm. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo 100nm). 1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7 đoạn gen ( không có gen NA). Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã được tìm hiểu nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit. Cấu trúc gen của vi rút cúm như sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho PB1, đoạn gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2. Trình tự nucleotit của ARN vi rút cúm PR8/34 và rất nhiều phân typ khác được công bố từ năm 1982 [28]. Vi rút R8/34 có 13.588 nucleotit. Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng [26] Chiều dài Số Phân Kích TLPT chuỗi phân tử đoạn Protein thước Chức năng (kDa) polypeptit trên 1 ARN (bp) (axit amin) virion 1 PB2 85 700 2341 759 3060 Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARNtt. Đóng vai trò làm enzyme phiên mã: gắn kết, kéo 2 PB1 86 500 2341 757 3060 dài, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp vi rút thế hệ mới trong tế bào chủ. Tìm thấy trong quá trình tổng 3 PA 84 200 2233 716 3060 hợp ARN virion (vARN) 16
Phân tử có cấu trúc trimer, cắt bởi enzyme thủy phân thành HA1 và HA2, là cơ sở cho khả năng nhiễm trùng. HA gắn với 4 HA 61 468 1778 566 500 tế bào túc chủ, dung hợp giải phóng phức hợp RNP, mở đầu cho quá trình nhân lên của vi rút. Là thành phần protein chủ yếu của phức hợp RNP, chứa một 5 NP 56 101 1565 498 1000 trong các khàng nguyên đặc hiệu typ, phân biệt 3 typ cúm A,B,C. Phân tử có cấu trúc tetramer, thủy phân bằng protease, cho phép vi rút tiến qua lớp niêm mạc tới các tế bào của đường hô hấp trong quá trình nhiễm 6 NA 50 087 1413 454 100 trùng. Loại bỏ phân tử axit sialic của phân tử HA từ các virion mới được tổng hợp, làm lộ HA ra ngoài, tăng khả năng nhiễm trùng. M1 27 801 252 3000 M1: là kháng nguyên đặc hiệu typ, có chức năng ổn định vrrus, điều khiển hoạt tính ARN 7 1027 M2 11 010 97 2060 protease và tham gia vào quá trình lắp rắp vi rút (70%). M2: kênh ion. NS1 26 815 230 2060 Là protein không cấu trúc, kết thúc quá trình tổng hợp protein 8 890 130 NS2 14 216 121 của tế bào túc chủ, chỉ có trong 200 tế bào nhiễm vi rút. 17
Đoạn ARN đơn của vi rút cúm C mã hóa cho protein liên kết haemaglutinin esteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor), hoạt động hòa mạng của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở vi rút cúm A và B những đặc tính do các đoạn gen riêng biệt mã hóa. Chiều dài của các đoạn gen và các protein mã hóa được liệt kê trong bảng trên. Đoạn gen ngắn không mã hóa ở mỗi đầu bao gồm chuỗi 1113 nucleotit tại đầu 5’ và 912 nucleotit tại đầu 3’ có tính ổn định cao hơn so với các đoạn gen khác và giống nhau ở cả 3 loại vi rút A, B và C [44]. Ba gen lớn nhất mã hóa cho các thành phần của ARN polymeraza PB1, PB2 và PA của vi rút A và vi rút cúm B, C [ 66]. Đoạn gen 1 và 2 đều dài 2341 nucleotit mã hóa cho protein PB2 gồm 759 axit amin và PB1 757 axit amin. Đoạn gen 3 dài 2233 nucleotit mã hóa cho protein PA có 716 axit amin. NP là protein cấu trúc chính tạo thành RNP. NP còn là kháng nguyên đặc hiệu typ, khác nhau giữa vi rút cúm A, B và C. NP được đoạn ARN 5 dài 1565 nucleotit mã hóa [64]. NP chứa 498 axit amin và có trọng lượng phân tử 56.101 dalton. NP của vi rút cúm B chứa 560 axit amin và tương đồng 47% so với vi rút cúm A trong khi NP của vi rút cúm C có 565 axit amin và có một số vùng tương đồng với vi rút cúm A và B [28]. Tên gọi của protein HA (hemagglutinin) xuất phát từ khả năng gây ngưng kết hồng cầu của vi rút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit sialic. HA có 3 vai trò quan trọng trong quá trình sao chép vi rút: 18
1. HA gắn với thụ thể có chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và tạo thành sự gắn kết giữa vi rút và tế bào. 2. HA chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập của vi rút vào tế bào bằng cách gián tiếp tạo nên sự hòa mạng endocytose của vi rút và màng nội bào làm cho nucleocapsit vi rút giải phóng vào trong bào tương. 3. HA là kháng nguyên chính tạo nên kháng thể trung hòa và các vụ dịch cúm đều liên quan đến sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên. Đoạn ARN 4 có chiều dài 1.742 đến 1.778 nucleotit và mã hóa cho 562 đến 566 axit amin. HA do đoạn ARN 4 mã hóa và được tổng hợp nên ribosom gắn màng và di chuyển vào lumen của lưới nội chất (ER) tế bào bị nhiễm như là polypeptit đơn HA0 (trọng lượng phân tử 76.000 dalton). Phụ thuộc vào phân typ vi rút, loại tế bào chủ và điều kiện nuôi cấy HA tồn tại cả 2 dạng: Dạng tiền thân không phân tách HA0 hoặc dạng phân tách với hai chuỗi có cầu nối disulfit (HA1 có trọng lượng 47.000 dalton và HA2 29.000 dalton). Quá trình phân tách là điều kiện quyết định để vi rút có khả năng lây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khả năng lây truyền [42]. HA chính là đoạn gen đầu tiên của vi rút cúm được xác định trình tự. HA1 có từ 319 đến 326 axit amin và HA2 có từ 221 đến 222 axit amin. Tùy thuộc vào các phân typ HA, số lượng các axit amin bị phân tách giữa HA1 và HA2 là 1 đến 6. HA nguyên vẹn có thể tách chiết từ hạt virion vi rút cúm hoặc từ tế bào bị nhiễm bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy bị loại bỏ, vùng transmembrane kỵ nước kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị. Tuy nhiên, xử lý vi rút bằng promelin sẽ giải phóng ra HA bảo toàn tính kháng nguyên và cấu trúc ba chiều, có khả năng hòa tan trong nước và chứa toàn bộ HA1 cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221 axit amin của HA 2 [61] . Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu đơn vị phân tử. Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân typ (Tyr 98, Tyr – 153, His – 183, Glu – 190, Leu – 194) [41, 63]. Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ thể khác nhau giữa khí quản người (α 2, 3) và khí quản lợn (α 2, 3 và α 2, 6), số lượng các phân tử 19
có thể chuyển từ loài này sang loài khác và có thể bị giới hạn [18]. Sự phân tác HA0 thành HA1 và HA2 là cần thiết để chuyển dạng pH thấp và do vậy cần thiết đối với hoạt tính gây nhiễm của vi rút. Những HA đó đều chứa chuỗi RXK/R R ở cầu nối peptit và được phân tách trong tế bào bằng furin, một proteaza của mạng transGolgi [25, 43]. HA chỉ có arginnine đơn ở cầu nối peptit không bị phân tách khi nuôi cấy trên tế bào (trừ chủng A/WSN/33) nhưng sẽ bị phân tách bởi tpypsin ngoại sinh. Khi nuôi cấy trên trứng gà có phôi, HA có arginine đơn ở cầu nối peptit sẽ bị phân tách do proteaza [ 25]. Nhiều nghiên cứu cho rằng vị trí phân tách có liên quan đến độc tính vi rút và chủng vi rút độc lực có chứa kiểu nhận biết furin trong khi chủng vi rút không độc lực chỉ chứa arginine đơn [22, 25, 42]. Tuy nhiên cũng có một số chủng cúm H5 không độc lực có vị trí nhận biết furin. Những chủng không độc lực này có chuỗi oligosaccharit ở gần vị trí phân tách, điều này có ảnh hưởng đến hoạt tính của proteaza khi phân tách và chuỗi này không tìm thấy ở những chủng H5 độc lực [21, 22]. Trong các chủng vi rút cúm người chỉ có A/WSN/33 có khả năng nuôi cấy trên nhiều loại tế bào mà không cần có trypsin và các nghiên cứu về hệ gen đã cho thấy NA của WSN cần thiết cho sự phân tách HA của WSN . NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân typ của vi rút cúm A, B. NA/PR/8/34 đoạn gen ARN 6 có 1413 nucleotit mã hóa cho 453 axit amin. Đoạn ARN thứ bảy mã hóa cho 2 protein M1 và M2. Đoạn có 1027 nucleotit mã hóa cho M1 có 252 axit amin, trọng lượng phân tử 27.801 dalton [29]. M1 là kháng nguyên đặc hiệu typ của vi rút cúm và có tính ổn định giữa các phân typ của vi rút cúm và có tính ổn định giữa các phân typ [28]. Protein M2 có hoạt động kênh trao đổi ion nhờ hoạt hóa pH. Kênh này được chặn đặc hiệu bởi thuốc kháng vi rút cúm amantadin. Hoạt động của kênh ion cần thiết cho việc bỏ lớp ngoài của vi rút trong khoang nội bào của tế bào bị nhiễm. Đột biến của vùng M2 liên quan đến việc kháng amantadin [16]. 20