intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân lập và thiết kế vector mang gen mã hóa NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) ở người

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST
Báo xấu
21
lượt xem 5
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu: Tạo ra vector tái tổ hợp chứa đoạn gen mã hóa enzyme NQO1; thiết kế vector biểu hiện tạm thời thành công đoạn gen đó trong tế bào động vật HEK. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân lập và thiết kế vector mang gen mã hóa NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) ở người

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn T T n N PHÂN LẬP VÀ T T T R N GEN MÃ HÓA NAD(P)H: N N R T N Ở NGƢỜ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014
  2. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn T T n N PHÂN LẬP VÀ T T T R N GEN MÃ HÓA N N N R T N Ở NGƢỜ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜ ƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NG N Đ NG T N TS. LÊ HỒNG Đ P Hà Nội – 2014 2
  3. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Nguyễn Đăng Tôn, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng TS. Lê Hồng Điệp, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN đã luôn hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Nông Văn Hải, Viện Trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen cùng các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đặc biệt, là TS. Nguyễn Hải Hà, Ths. Nguyễn Văn Phòng, Ths .Đỗ Mạnh Hưng đã chỉ bảo cho tôi từng bước thực hiện cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, cho tôi những lời khuyên quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa sinh học đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN đã tạo điệu kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Luận văn được hỗ trợ bởi đề tài “Nghiên cứu biến đổi gen, nhiễm sắc thể ở những người có nồng độ dioxin trong máu cao”, mã số KHCN-33.06/11-15 thuộc chương trình KHCN-33, do Bộ Tài nguyên và Môi trường quản lý. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Thanh Nga 1
  4. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm CÁC CHỮ VI T TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Amp Ampicilin ARE antioxidant response element BHA Butylated hydroxyanisole bp Base pair cDNA Compelementary DNA ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DMEM Dulbecco's modified eagle medium DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate DQ Duroquinone E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium Bromide EtOH Ethanol FAD flavin adenine dinucleotide GSH Glutathione HCT human colon cancer IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside JHH Human hepatocellular carcinoma Kb Kilo base 2
  5. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ kD Kilo Dalton KEAP1 Kelch-like ECH-associated protein 1 LB Luria Bertani L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine NRF2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2 NQO1 NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 MFC-7 Michigan Cancer Foundation-7 mRNA Messenger RNA ODC ornithine decarboxylase pcDNA3.1B his-myc Vector pcDNA3.1B his-myc PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease ROS Reactive oxygen species sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel SDS-PAGE electrophoresis UV Ultraviolet TAE Tris-Acetate-EDTA 3
  6. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang Bảng 1 Kích thước các exon và intron của gen mã hóa enzyme 5 NQO1 Bảng 2 Trình tự cặp mồi được sử dụng 24 Bảng 3 Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật 25 Bảng 4 Tương quan giữa nồng độ gel agarose và kích thước đoạn 29 DNA cần phân tách 4
  7. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hình Tên hình Trang Hình 1 Vị trí của gen mã hóa NQO1 trên NST số 16 4 Hình 2 Cấu trúc gen NQO1 với các intron và exon 5 Hình 3 Con đường Keap1/Nrf2/ARE. 6 Hình 4 Cấu trúc bậc hai dạng dimer của NQO1 15 Hình 5 Mật độ điện tích trên mô hình NQO1 tinh thể khi liên kết với 16 phân tử Hình 6 Cấu trúc vector biểu hiện pcDNA3.1(+)myc-his B 21 (Theo hãng Invitrogen). Hình 7 Sơ đồ quy trình phân lập và thiết kế vector biểu hiện mang 40 đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1 Hình 8 Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%. 41 Hình 9 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa NQO1 42 trên gel agarose 0,8%. Hình 10 Cấu trúc vector tái tổ hợp pcDNA3.1B myc-his-NQO1 44 Hình 11 Điện di sản phẩm PCR và vector pcDNA 3.1B sau khi xử lý 45 bằng enzyme giới hạn trên gel agarose 0,8% Hình 12 Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli 10β 47 Hình 13 Điện di kết quả tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8% 48 Hình 14 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới 49 hạn trên gel agarose 0,8% 5
  8. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm Số hình Tên hình Trang Hình 15 So sánh trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của các 53 dòng plasmid mang cDNA mã hóa protein NQO1 ở người Hình 16 Trình tự amino acid suy diễn của các plasmid pcDNA3.1- 55 NQO1-15 mang đoạn cDNA mã hóa NQO1 và trình tự đã công bố NM_000903.2 Hình 17 Tế bào được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung 56 huyết thanh Hình 18 Điện di kết quả biểu hiện tạm thời protein trên gel 58 polyacrylamide 12,6%. 6
  9. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 ƣơn TỔNG QUAN TÀI LI U ........................................................................ 3 1.1. Tổng quan về gen NQO1 .................................................................................... 3 1.1.1 Giới thiệu chung về gen NQO1 ..................................................................... 3 1.1.2. Cấu trúc gen NQO1 ...................................................................................... 4 1.1.3 Sự điều hòa NQO1 bởi con đường Keap/Nrf2/ARE. .................................... 5 1.1.4 Đa hình gen NQO1 ....................................................................................... 6 1.2 Tổng quan về protein NQO1 ............................................................................... 8 1.2.1 Vai trò của NQO1.......................................................................................... 8 1.2.2 Cấu trúc của phân tử protein NQO1 ........................................................... 14 1.2.3 Các trạng thái liên kết chuyển hóa để ổn định và hoạt hóa protein ............. 17 1.3. Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp ................................ 17 1.4. Vector biểu hiện pcDNA3.1 B myc-his B ........................................................ 19 1.5. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................... 22 ƣơn 2 ẬT LI À ƢƠNG Á NG ÊN ỨU .......................... 24 2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 24 2.2. Phương pháp ..................................................................................................... 25 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số ............................................................................. 25 2.2.2. Tổng hợp cDNA ......................................................................................... 26 2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR ...................................................... 27 2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose............................................... 28 2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn ............................................................. 30 2.2.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose ................................................... 31 2.2.7. Ghép nối DNA............................................................................................ 32 2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ....................... 32 2.2.9. Tách chiết DNA plasmid ............................................................................ 33 2.2.10. Xác định trình tự DNA ............................................................................. 34 2.2.11. Biểu hiện tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào động vật. ........... 36 7
  10. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm 2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE ................................ 38 ƣơn 3. T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 40 3.1. Sơ đồ thí nghiệm ............................................................................................... 40 3.2. Tách chiết RNA tổng số ................................................................................... 40 3.3. Tạo dòng và thiết kế vector biểu hiện gen NQO1 ............................................ 41 3.3.1 Thiết kế cặp mồi và PCR ............................................................................. 41 3.3.2 Thiết kế vector tách dòng và biểu hiện pcDNA3.1B-NQO1 ...................... 43 3.3.3 Tạo dòng đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1 trong vector pcDNA3.1B .. 44 3.4 Biểu hiện tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp trong tế bào động vật ................... 54 3.4.1 Nuôi cấy ổn định cho tế bào HEK 293........................................................ 54 3.4.2 Chuẩn bị vector pcDNA3.1-NQO1 cho chuyển gen ................................... 56 3.4.3 Biểu hiện nhanh NQO1 trong tế bào động vật. ........................................... 56 K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ .................................................................................. 59 TÀI LI U THAM KHẢO ........................................................................................ 60 8
  11. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Quinon đại diện cho một lớp các chất trung gian độc hại mà có thể tạo ra một loạt các tác động nguy hại trong cơ thể, bao gồm cả khả năng gây độc cấp tính, immunotoxicity, và ung thư. Các cơ chế tác động ảnh hưởng do quinon gây ra là rất phức tạp, và nó gây tổn hại cho tế bào có thể xảy ra thông qua quá trình alkyl hóa các protein quan trọng hay cả DNA của tế bào. Ngoài ra quinon là các phân tử hoạt động oxi hóa khử cao có thể tạo các semiquinone dẫn đến hình thành dạng phản ứng oxi hóa (ROS) đặc biệt bao gồm cả superoxide, hydrogen peroxide, và cuối cùng là gốc hydroxyl. Sự sản xuất ROS có thể gây bất lợi oxi hóa nghiêm trọng trong tế bào thông qua sự hình thành các phân tử lớn của tế bào bị oxi hóa bao gồm cả chất béo, protein và DNA, tạo cơ sở cho lão hóa và ung thư. Quinon phổ biến trong tự nhiên và là một phần quan trọng cuả các hợp chất tự nhiên có trong thực vật, nấm và vi khuẩn. Chúng ta tiếp xúc với quinon không chỉ thông qua chế độ ăn uống mà còn thông qua các chất gây ô nhiễm như benzen, các hydrocarbon mạch vòng hay do chính chúng ta tạo ra như estrogen, catecholamin. Nhiều bằng chứng mạnh mẽ cho thấy cơ chế độc tính của quinon liên quan tới các bệnh lý đã được biết đến của các hợp chất trên. Tế bào chúng ta cũng có rất nhiều cơ chế để chống lại những ảnh hưởng tiêu cực của quinon và một trong số đó chính là NAD(P)H:quinone oxidoreductae 1 (NQO1), một enzyme đi đầu trong hàng rào bảo vệ tế bào chống lại các tác động gây độc của các hợp chất quinon. Enzyme oxi hóa khử quinon chất nhận NADH- NQO1 là một flavoprotein được phân bố rộng rãi, phụ thuộc FAD, thúc đẩy sự khử 2 điện tử quinon, quioneimines, nitroaromatics, và azo dyes. Sự khử này làm giảm mức quinon và giảm thiểu cơ hội tạo phản ứng oxy trung gian và giảm các nhóm thiol nội bào. NQO1 là một enzyme cảm ứng mạnh được điều khiển bởi con đường Keap/Nrf2/ARE. Bằng chứng cho thấy tầm quan trọng chức năng chống oxi hóa của NQO1 trong stress oxi hóa được cung cấp bởi các mức độ biểu hiện cảm ứng NQO1 (knockout hoặc knockdown) liên quan đến tăng và giảm khả năng nhạy cảm tương ứng với stress oxi hóa. Hơn nữa độc tính benzen được tăng cường rõ rệt khi NQO1 1
  12. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm suy giảm hoạt tính. Ở người các đa hình ức chế hoạt động của NQO1 liên quan đến sự tăng cường khuynh hướng bệnh tật. Nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra vai trò bảo vệ mới của NQO1, dường như không liên quan đến hoạt động của enzyme. NQO1 bám vào giúp ổn định nhân tố ức chế khối u p53 chống lại sự phân hủy của proteasomal. Hơn nữa NQO1 xuất hiện để điều khiển tính phân hủy của protein khác. Những phát hiện này có thể cho thấy một vai trò chọn lọc “gatekeeping” trong việc điều khiển sự phân hủy proteasomal của các protein đặc hiệu, do đó mở rộng vai trò bảo vệ tế bào của NQO1 vượt xa khả năng chống oxi hóa hiệu quả cao của nó. Để cung cấp một mô hình nghiên cứu xác định vai trò của NQO1 trong hoạt hóa các yếu tố bioreductive, chúng tôi thực hiện đề tài phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa enzyme NQO1 với mục tiêu: 1. Tạo ra vector tái tổ hợp chứa đoạn gen mã hóa enzyme NQO1. 2. Thiết kế vector biểu hiện tạm thời thành công đoạn gen đó trong tế bào động vật HEK. 2
  13. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm ƣơn TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1. Tổng quan về gen NQO1 1.1.1 Giới thiệu chung về gen NQO1 Gen NQO1 mã hóa cho enzyme NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 là enzyme có nhiều vai trò bảo vệ tế bào, ngoài chức năng xúc tác còn có chức năng mở rộng [56]. NQO1 là một flavoprotein phụ thuộc FAD được phân bố rộng rãi xúc tác cho sự phân giải quinon, quinoneimines, nitroaromatics, và azo dyes. NQO1 đã được phát hiện và đặt tên DT-diaphorase (DPNH=NADH và TPNH=NADPH) bởi Lars Ernster vào năm 1958, và được thể hiện thông qua sự ức chế phản ứng oxi hóa khử vitamin K do dicoumarol đã được mô tả bởi Marki và Martius. Vai trò chống oxi hóa trực tiếp cơ bản của NQO1 trong cơ chế xúc tác: làm giảm 2 điện tử ở một loạt các quinon thành hydroquinone tương ứng bằng cách sử dụng NADPH hoặc NADH như chất cho điện tử [24]. Như vậy, NQO1 chuyển điện tử của quinon tham gia vào các phản ứng hoặc làm suy giảm sulfhydryl hoặc giảm sự mất 1 điện tử tạo ra semiquinone và các phản ứng khác nhau tạo ra các hợp chất oxi hóa trung gian như kết quả chu trình oxi hóa khử. Thêm vào đó, các sản phẩm hydroquinone của các phản ứng NQO1 có thể chuyển hóa glucuronide và các gốc sulfate do đó dễ dàng được bài tiết ra ngoài. Đáng chú ý, sự khử quinon được tìm thấy ở hàng loạt các sinh vật nhân chuẩn từ nấm men đến động vật có vú [27]. Mặc dù trong nhiều hệ thống, các chức năng và sự điều hòa của các enzyme phức tạp vẫn được tìm hiểu, nhưng rõ ràng là trong các trường hợp khử quinon là đi đầu trong bảo vệ tế bào với điều kiện là có nhiều lớp bảo vệ [28, 30, 34]. Xung quanh thời điểm khám phá ra NQO1, Williams-Ashman và Huggins [68] đã tìm thấy enzyme này đã phản ứng mạnh trong gan chuột bởi azo dye và các hydrocarbon mạch vòng. Hơn nữa với sự hiệu quả của NQO1 trong bảo vệ chống lại độc tố và khả năng gây ung thư của các hydrocarbon mạch vòng, Huggins cho thấy sử dụng định lượng hoạt tính NQO1 như một phương pháp sàng lọc để xác định hiệu quả các tác nhân bảo vệ. Trong những năm cuối thập niên 80 Hans Prochaska và các cộng sự [55] phát triển thử nghiệm sinh học định lượng cao trong đĩa 96 giếng cho NQO1 tế bào gan chuột. 3
  14. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm Thử nghiệm này hiện đang được sử dụng rộng rãi để sàng lọc cho hoạt tính gây cảm ứng NQO1 của các hợp chất tinh khiết hay hỗn hợp phức tạp, phân đoạn cho các hỗn hợp đó và xác định chính xác tác dụng của các chất gây cảm ứng [32]. Hơn nữa, nhiều hợp chất hóa học đã được tìm thấy cảm ứng NQO1 trong thử nghiệm này đã trực tiếp chỉ ra vai trò bảo vệ chống lại các độc tố và gây ung thư của hàng loạt chất gây ung thư trong một số tổ chức đích và ngược lại. 1.1.2. Cấu trúc gen NQO1 Gen NQO1 nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể 16 tại vị trí 16q22.1 (Hình 1). Gen NQO1 có kích thước khoảng 20 kb, trong đó kích thước mRNA là 2912bp và có sáu exon bị gián đoạn bởi năm intron. Hình 1. Vị trí của gen mã hóa NQO1 trên NST số 16 [72] Exon đầu tiên là dài 118 bp và mã hóa cho hai loại axit amin G, M và một codon khởi đầu đầu tiên của exon thứ hai. Exon thứ sáu là lớn nhất trong số các exon, có chiều dài là 1833 bp. Phân tích trình tự của exon thứ sáu cho thấy sự hiện diện của 4 chuỗi tín hiệu tiềm năng polyadenylation (AATAAA). Trong tất cả các intron, intron thứ hai là nhỏ nhất (116 bp). Trong đó, trình tự nucleotide mã hóa cho protein NQO1 chỉ chiếm có 4% tổng số nucleotide của gen (Bảng 1). Bảng 1. Kích thước các exon và intron của gen mã hóa cho enzyme NQO1. Exon íc t ƣớc(bp) Intron íc t ƣớc (bp) 1 519 1 7898 2 165 2 116 3 131 3 3045 4 114 4 1834 5 102 5 1746 6 1881 4
  15. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm Gen NQO1 được sắp xếp theo trình tự 20kb nhưng phần trình tự mã hóa cho protein chỉ là 825bp tương ứng với 274aa (không tính mã kết thúc). Trình tự gen và promoter NQO1 đã được xác định lần lượt là 2423bp và 2123bp. Trong nghiên cứu Asma Chinigarzadeh cùng cộng sự (2012) đã phân lập thành công đoạn 2.123 bp từ vị trí bắt đầu phiên mã tham gia vào điều hòa sự sao chép của gen NQO1 [21]. Các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu tiềm năng vị trí điều hòa ARE nằm ở - 477 tính từ vị trí bắt đầu phiên mã. Hình 2. Cấu trúc gen NQO1 với các intron và exon [72] 1.1.3 Sự điều hòa NQO1 bởi con đường Keap/Nrf2/ARE Một dãy các chất hóa học có khả năng cảm ứng [29] tăng cường NQO1 được thông qua con đường trung gian KEAP1/ Nrf2/ARE. Bằng cách kiểm soát biểu hiện một dãy hơn 100 gen bảo vệ tế bào, con đường này là cần thiết cho sự thích ứng của tế bào động vật và các sinh vật khác với rất nhiều tác nhân gây stress như ái lực và oxi hóa [44, 50, 51]. Như tên của con đường, ba thành phần tế bào là trung tâm quan trọng đối với các cơ chế bởi sự phiên mã của nhiều gen được điều hòa: - Yếu tố phản ứng chống oxi hóa (ARE), trình tự DNA có mặt ở vùng điều hòa trước của gen và liên ứng TGAG/CNNNGC. Trong trường hợp gen NQO1 chuột trình tự chính xác đã được sửa bởi John Hayes và cộng sự [39, 52] đã chỉ ra rằng các nucleotide nhất định trước đây được cho là dư thừa trong ARE chức năng có vai trò thiết yếu, trong khi những nucleotide khác trước đó được coi là thiết yếu thì không cần thiết. - Nrf2 một nhân tố phiên mã zitrer leucine cơ bản của họ cap-n’collar liên kết như một heterodimer với protein nhỏ Maf, tới ARE do đó tăng cường tín hiệu phiên mã. 5
  16. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm - Keap1 (Kelch- như protein liên kết ECH), protein cảm biến các tác nhân gây cảm ứng một protein ức chế đa domain họ Keap cái mà gắn với Nrf2 và thúc đẩy uquitination và phân hủy proteasomal [42] bởi chức năng như một adaptor nối Cul3 dựa trên E3 [70]. Hình 3. Con đường Keap1/Nrf2/ARE [15] Trong điều kiện cơ bản (mũi tên nét đứt), protein hai domain Keap1 nối kết yếu tố phiên mã Nrf2 qua miền Kelch và thúc đẩy sự ubiquitination và sự phân hủy proteasomal của yếu tố phiên mã có chức năng như một bộ chuyển đổi cho Cul3 dựa trên ligase E3. Gây cảm ứng cho tất cả đều phản ứng với nhóm sulfhydryl, thay đổi hóa học cụ thể phản ứng mạnh aa cysteine của Keap1 mà sau đó mất khả năng nhằm vào đích Nrf2 cho sự phân hủy. Do đó, Nrf2 được ổn định và di chuyển (mũi tên) vào nhân nơi mà nó liên kết với AREs và gây nên biểu hiện của NQO1 và một dãy > 100 gen bảo vệ tế bào khác. Một vài mô hình khác nhau được đề xuất cho cơ chế về sự điều hòa của con đường Keap/Nrf2/ARE. Mô hình phổ biến rộng rãi nhất là cảm ứng, tất cả các phản ứng với nhóm sulfhydryl [40], phản ứng mạnh thay aa cystein của chất cảm biến Keap cái mà sau đó mất khả năng phân hủy đích Nrf2. Do đó Nrf2 được ổn định và tích lũy trong nhân nơi mà nó liên kết với AREs và gây ra sự biểu hiện của các gen bảo vệ tế bào. Điều thú vị là mặc dù con đường Keap1/Nrf2/ARE đã được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây nhưng có nhiều điểm tương đồng giữa động vật và thực vật liên quan đến cảm ứng biểu hiện gen, và sự khử quinon đại diện cho một 6
  17. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm ví dụ điển hình của enzyme bảo vệ tế bào được cảm ứng ở cả động vật và thực vật trong đáp ứng với các ion. Hơn nữa, trong mô và tế bào chuột và người, NQO1 là một trong những gen cảm ứng mạnh mẽ giữa các thành viên trong họ gen bảo vệ tế bào. Phát hiện sớm này đã được xác định nhóm gen chung biểu hiện trong một số hệ thống sử dụng cả cảm ứng dược học của con đường Keap1/Nrf2/ARE và knockdown Keap1 hay knockout trực tiếp gen [15]. Mặc dù tác dụng bảo vệ tế bào hoạt hóa Nrf2 chống lại ung thư và các bệnh mãn tính khác đã được quan sát trong nhiều mô hình động vật là chắc chắn do hoạt động kết hợp của nhiều protein bảo vệ tế bào có sự biểu hiện gen được điều hòa bởi yếu tố phiên mã này, vai trò của NQO1 là nổi bật và nó được gọi là một ví dụ hoàn hảo enzyme bảo vệ tế bào. 1.1.4 Đa hình gen NQO1 Ở người có hai kiểu đa hình gen mã hóa cho NQO1. Nổi bật nhất là đột biến do bị thay thế một amino acid đơn lẻ (c: 609C-T) NQO1*2 [57]. Kết quả này thay thế nucleotide trong một proline để thay serine vị trí 187 của chuỗi axit amin của protein. Đột biến NQO1*2 tạo ra protein không ổn định, và nhanh chóng bị ubiquitin hóa và phân hủy bởi các proteasome. Do đó hoạt tính NQO1 hầu như không thể phát hiện ở người mang kiểu gen NQO1*2/2. Các cá nhân mang kiểu gen này dễ nhiễm độc và ung thư do tác động của benzen. Thiếu NQO1 tăng nguy cơ phát triển bệnh ung thư bạch cầu sau khi tiếp xúc với benzen. Tần xuất của tính đa hình gen trong những cộng đồng dân cư khác nhau khoảng 2 - 5%. Các nghiên cứu với knockout NQO1 ở chuột cũng tìm thấy tăng tính nhạy cảm nhiễm độc máu do benzen khi so với chuột thường [22]. Một điều tra dịch tễ lớn với dân cư tiếp xúc với benzen đã chỉ ra rằng đồng hợp tử NQO1*2 thể hiện nguy cơ nhiễm độc tủy cao gấp 7 lần so với bình thường, dẫn đến nguy cơ dễ mắc các bệnh như thiếu máu bất sản hay bệnh bạch cầu. Nhiều nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình NQO1*2 với nguy cơ mắc các bệnh như nhiễm độc máu, ung thư phổi, ung thư ruột kết, ung thư vú đang được thực hiện [46, 64]. Các ngiên cứu ở Anh đã chỉ ra rằng các đột biến NQO1 tăng nguy cơ bệnh bạch cầu lymphoblastic mãn tính đặc biệt là ở trẻ nhỏ, liên quan đến đột biến NQO1 (P187S). Một nghiên cứu ở Trung Quốc đã được thực 7
  18. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm hiện nghiên cứu đa hình 609 C-T gen NQO1 liên quan với khởi phát muộn bệnh Alzheimer. 1.2 Tổng quan về protein NQO1 1.2.1 Vai trò của NQO1 a- Các hoạt động chống oxi hóa của NQO1 Từ việc cộng tác giữa phòng thí nghiệm của Helmut Sies và Paul Talalay chỉ ra một minh chứng rõ ràng rằng NQO1 có hoạt tính chống oxi hóa trực tiếp. Khi phần nổi dịch mô gan được ủ với menadione trong sự có mặt của NADPH, quan sát thấy sự giải phóng mức thấp ánh sáng đỏ. Đây là sự phát quang bằng phản ứng hóa học từ sự hình thành superoxide và mức đơn oxy (singlet) trong vòng khử quinon kèm theo sự khử một điện tử của menadione được xúc tác bởi chất khử cytochrome P450- NADPH. Dịch mô gan từ những con chuột được cho ăn BHA (một chất chống oxi hóa), có hoạt tính NQO1 tăng lên 13 lần so với chuột đối chứng đã được sử dụng trong thí nghiệm tương tự, sự phát quang giảm rất nhiều. Ngược lại thêm chất ức chế dicumarol để điều hòa tăng tín hiệu phát quang cho thấy rõ rệt NQO1 đã xúc tác sự khử 2 điện tử menadione do đó chuyển nó từ oxi hóa 1 điện tử trong vòng phản ứng oxi hóa khử. Nghiên cứu này đã thiết lập bằng chứng sự NQO1 kết tinh trong ty thể dịch nổi gan chuột, kết quả ức chế quá trình phát quang hóa học phụ thuộc menadione. Mức độ ức chế là giống nhau giữa phần được chuẩn bị từ động vật xử lý BHA và với động vật đối chứng có mức tăng giống nhau về NQO1 ngoại sinh. Đáng chú ý hơn ngoài vai trò xúc tác cho trong sự khử quinon, NQO1 đã được báo cáo là khử superoxide trực tiếp, mặc dù ít hiệu quả hơn so với superoxide dismutase (SOD) [60, 71] b- Sự bảo vệ chống lại estrogen quinones Ngày nay chúng ta tìm ra NQO1 là cần thiết cho sự bảo vệ chống lại ảnh hưởng có hại không chỉ đối với quinines ngoại sinh mà cả nội sinh trong quá trình trao đổi chất như estrogen quinone. Mặc dù là một vấn đề cần cân nhắc [26], có bằng chứng vững chắc là NQO1 có khả năng khử estradiol-3,4-quinone [36]. Hơn nữa, sự cảm ứng NQO1 chống lại estrogen cảm ứng tạo ra sự khử N7- G và N3-A, 8
  19. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm oxi hóa gây hư hỏng DNA và gây ung thư vú [49]. Ngược lại sự điều hòa ngược NQO1 tăng mức trao đổi estrogen quinone và tăng cường sự chuyển thể của 17β- estradiol [49]. Thêm vào đó hoạt tính NQO1 thấp cùng với hoạt động cao của CYP1B1 trong mô vú đã được báo cáo trong 5 trường hợp ung thư vú người so với 4 đối chứng khỏe mạnh [62]. Kì lạ ở chỗ hoạt động NQO1 gan ở nữ cao hơn ở nam, hầu như các phản hồi xảy ra trong sự cảm ứng của biểu hiện gen bởi trao đổi quinon của estrogen như vai trò bảo vệ của enzyme chống lại độc tố các chất trao đổi. Hơn nữa, các tác giả đã chỉ ra rằng estradiol 3-4 quinone gây ra sự biểu hiện gen phụ thuộc ARE gần 6 lần ở các tế bào ung thư vú người MFC-7 được chuyển với một luciferase (một loại enzyme oxi hóa luciferin trong tế bào phát sáng) dưới sự kiểm soát của nhân tố phản ứng chống oxi hóa (ARE). Ngược lại, thể hiện 2- hydroxyestradiol, 4- hydroxyestradiol hay 4- hydroxyesrtrone chỉ có một ảnh hưởng vừa phải trên biểu hiện của luciferase; tuy nhiên sự cảm ứng có khả năng 4-5 lần dưới các điều kiện ủng hộ sự hình thành estrogen quinone trong sự có mặt của Cu 2+ và O2. Gần đây Singh cộng sự [63], đã tạo ra dòng tế bào biểu mô vú biểu hiện cả kiểu hoang dại và dạng đột biến NQO1. So sánh các tế bào chuyển với gen bình thường, các tế bào chuyển với biểu hiện của protein đột biến thấp hơn 2 lần, trong khi estradiol-3,4 quinone được biểu hiện thấp khả năng khử quinon và bao gồm mức thấp hơn 2 lần của catechol tự do, thấp hơn 3 lần của methylated catechol, và 2,5 lần tăng lượng đề purin DNA. Cùng với đó, đề xuất đa hình NQO1 có thể tăng khả năng xảy ra đột biến gen trong biểu hiện estrogen các tế bào biểu mô vú. Hơn nữa một nghiên cứu kết thúc gần đây đã đề xuất một dạng đa hình P187S trở thành yếu tố dự đoán tiên lượng trong ung thư vú và sự di căn [31]. Kì lạ hơn, Lu cùng cộng sự [48] đã báo cáo rằng trong dòng tế bào biểu mô vú MCF-10F, resveratrol được cảm ứng NQO1 thông qua sự ổn định của yếu tố phiên mã Nrf2 nhưng thêm nữa là dẫn đến sự tái phân bố dưới tế bào của các protein như NQO1 được quan sát không chỉ trong tế bào chất mà còn có trong nhân các tế bào. Như vậy có thể suy đoán rằng NQO1 trong nhân có thể quan trọng trong bảo vệ chống lại estrogen quinone gây cảm ứng đề purin DNA ở vị trí hình thành chúng. 9
  20. Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm c- Hướng bảo vệ thần kinh của NQO1 Lớp cơ chất khác của NQO1 là dẫn xuất của quinon trong dopamine, L- DOPA, norepinephrine, epinephrine,và 3,4-dihydroxyphenylacetic acid như các chất chuyển hóa vòng aminochrome, dopachrome, noradrenochrome, adrenochrome, và furanoquinone. Zafar cùng cộng sự [69] chứng minh như vòng quinon hoặc các phản ứng oxi trung gian trong suốt chu trình oxi hóa khử ức chế proteasome và NQO1 chống lại sự ức chế này. Thêm vào đó biểu hiện quá mức NQO1 đã bảo vệ các tế bào thần kinh người SK-N-MC chống lại hoạt tính gây độc tế bào của dopamine, ngược lại superoxide dismutase và catalase đã không có hiệu quả bảo vệ. Trước khi xử lý các tế bào thần kinh PC12 với dopamine, NQO1 và glutathione tăng cường bảo vệ tế bào khỏi bị chết bởi chất gây độc cô đặc của dopamine hay 6- hydrodopamine [43]. Tương tự sự cảm ứng của NQO1 và GSH bởi dimethyl fumarate, 3H-1,2-dithiole-3-thione or tert-butylhydroquinone (tBHQ) bảo vệ các tế bào thần kinh chống lại gây độc do dopamine, 6-hydroxydopamine, 4-hydroxy-2-nonenal, hoặc H2O2. Trong các tế bào PC12 được xử lý với H2O2, sự cảm ứng dược lý của NQO1 đã làm giảm sự hình thành các quinone protein-bound (bị giới hạn bởi protein) và bảo vệ tế bào chống lại tác hại oxi hóa [45]. Tương tự như vậy trong các tế bào SH- SY5Y, sự hình thành các phản ứng oxi hóa trung gian phụ thuộc vào H2O2 đã được khử do được xử lý với tác nhân bảo vệ thần kinh ladostigil, kèm theo sự cảm ứng của NQO1 và các enzyme chống oxi hóa khác. Trong một dòng tế bào liên quan dopamine có nguồn gốc từ u não của chuột gây nhiễm mang kháng nguyên SV40T dưới sự kiểm soát phiên mã của gen tyrosine hydroxylase chuột, xử lý methamphetamine đã được báo cáo là dẫn đến sự hình thành các quinines liên kết protein đi kèm bởi sự cảm ứng NQO1. Trước khi xử lý với BHA, NQO1 đã bảo vệ chống lại sự tạo ra quinone protein-bound phụ thuộc methamphetamine và tế bào chết sau đó. Đáng chú ý sự cảm ứng dược lý của NQO1 là thường đi kèm với sự phối hợp nâng cao sự biểu hiện của rất nhiều các protein bảo vệ tế bào và do đó tác dụng của các phân tử nhỏ gây cảm ứng là hầu như do ảnh hưởng kết hợp của các protein bảo vệ tế bào gây ra. Tuy nhiên, khả 10
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học
320 tài liệu
1257 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2