Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:75

Thêm vào BST

Báo xấu

77
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện nhằm mục đích phân tích protein ty thể, microsome và phần còn lại của tế bào tách từ mô gan ung thư và mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan; phân tích và so sánh sự biểu hiện của các protein ty thể, microsome và phần còn lại trong mô gan ung thư và mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan nhằm tìm ra các protein đặc trưng có liên quan đến bệnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát

MỞ ĐẦU Ung thư gan là một trong năm dạng ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đứng hàng thứ ba về nguyên nhân gây chết do ung thư trên toàn cầu. Cơ hội sống sót của bệnh nhân mắc ung thư gan là rất thấp, tỷ lệ sống sót khoảng 36%, đặc biệt ở một số nơi tỷ lệ này chỉ là 17% sau 1 đến 3 năm được chẩn đoán mắc bệnh []. Hàng năm có khoảng 600.000 người được chẩn đoán mắc ung thư gan và gần bằng con số đó là số lượng người đã chết vì nó mỗi năm . Từ những con số trên cho thấy một thực tế rằng việc chẩn đoán và điều trị ung thư gan trên thế giới hiện nay gặp rất nhiều khó khăn. Proteomics là công cụ số một trong phân tích hệ protein của cơ thể sinh vật. Kỹ thuật proteomics đã được áp dụng cho các nghiên cứu chỉ thị sinh học của các bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi, ung thư thanh quản, ung thư vòm họng, ung thư gan, ung thư máu... Việc nghiên cứu bằng kỹ thuật proteomics đang ngày càng được mở rộng, đem lại kết quả ngày càng lớn ứng dụng trong sinh học, y học, dược học và nghiên cứu cơ chế của các quá trình sinh học . Ung thư gan nguyên phát là dạng ung thư xuất phát từ các tế bào gan và nó chiếm đến hơn 90% các trường hợp ung thư gan. Nhiễm virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV) mạn tính và xơ gan được cho là các nguyên nhân chính dẫn đến ung thư gan . Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát cao do nhiễm HBV và HCV. Do đó, việc phát hiện sớm ung thư gan rất quan ̣ trong đối với việc điều trị loại ung thư này. Thực hiện luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát” với mục đích: -1-
 Phân tích protein ty thể, microsome và phần còn lại của tế bào tách từ mô gan ung thư và mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan.  Phân tích và so sánh sự biểu hiện của các protein ty thể, microsome và phần còn lại trong mô gan ung thư và mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan nhằm tìm ra các protein đặc trưng có liên quan đên b ́ ệnh. Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme va Protein, Tr ̀ ường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. -2-
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VÊ UNG TH ̀ Ư GAN Ung thư gan là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế giới. Bệnh này khó chẩn đoán, tiên lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao và tử vong trong thời gian ngắn kể từ khi phát hiện. Trong năm 2008 ước tính có 12 triệu trường hợp được chẩn đoán mắc ung thư, 7 triệu người chết và khoảng 25 triệu người đang sống chung với ung thư trên thế giới. Tại My, năm 2009 ̃ ước tính có 22.620 trường hợp được chuẩn đoán mắc ung thư, 18.160 người chết. Ung thư gan (UTG) gồm hai loại là nguyên phát và thứ phát. Dạng nguyên phát hình thành từ các mô của gan, trong khi dạng thứ phát tạo nên bởi các tế bào từ những cơ quan khác trong cơ thể di căn thông qua máu, hạch bạch huyết tới gan và tạo khối u (nên còn gọi là ung thư gan do di căn). Dưới kính hiển vi, các tế bào ung thư di căn gan nhìn giống như các tế bào ung thư mà chúng xuất phát. Do đó, trong phạm vi khoá luận này, chúng tôi chỉ xin đề cập đến ung thư gan nguyên phát với dạng ung thư phổ biến nhất của nó là ung thư biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma HCC) []. 1.1.1 Phân loại ung thư gan nguyên phát Các khối u ác tính nguyên phát của gan có thể phát sinh từ thành phần biểu mô hoặc không phải biểu mô, trong đó ung thư biểu mô là loại hay gặp nhất, chiếm vị trí quan trọng nhất trong bệnh học UTG. Dựa vào các đặc điểm hình thái và sinh hoá tế bào, UTG nguyên phát được phân loại thành các dạng sau []: -3-
Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma – HCC) là dạng ung thư ác tính xuất phát từ các tế bào gan, chiếm khoảng 90% các dạng UTG nguyên phát. Bệnh nhân mắc HCC có nguy cơ tử vong rất cao. Ung thư biểu mô đường mật (Cholangio carcinoma) là dạng có những khối u ác tính trong gan bao gồm các tế bào giống tế bào biểu mô đường mật. Bệnh thường gặp ở lứa tuổi cao hơn so với ung thư tế bào gan, trung bình khoảng 65 tuổi. Dạng này có thể chia thành 2 thể cơ bản là thể ngoại vi và thể trung tâm. Ung thư hỗn hợp tế bào gan – đường mật (hepatocholangiocarcinoma) là dạng mang đặc điểm mô bệnh học của cả hai loại nói trên, nói chung ít gặp. Ung thư nguyên bào gan (hepatoblastoma) là dạng thường gặp ở trẻ em, rất hiếm ở người trưởng thành. Ung thư nội mạch máu dạng biểu bì (Epithelioid hemangioendothelioma) là loại mới được mô tả, thường gặp ở tuổi 50, 2/3 số trường hợp phát hiện là ở phụ nữ. 1.1.2. Các giai đoạn của ung thư gan Ung thư gan được chia làm 4 giai đoạn: Trong giai đoạn I, có một khối u và không lây lan sang các mạch máu gần đó. Trong giai đoạn II, có một khối u đã lan ra các mạch máu gần đó; hoặc nhiều hơn một khối u, không cái nào trong số đó lớn hơn 5 cm. Giai đoạn III được chia thành các giai đoạn IIIA, IIIB, và IIIC; Trong giai đoạn IIIA, một trong những điều sau đây được tìm thấy: -4-
nhiều hơn một khối u lớn hơn 5 cm hoặc một khối u đã lan rộng đến một chi nhánh chính của các mạch máu gần gan. Trong giai đoạn IIIB, có một hay nhiều khối u của bất kỳ kích thước mà có một trong hai: lây lan đến các cơ quan lân cận khác với các túi mật, hoặc bị hỏng thông qua các màng của khoang phúc mạc. Trong giai đoạn IIIC, ung thư đã lan đến hạch bạch huyết gần đó. Trong giai đoạn IV, ung thư đã lan tràn vượt ra ngoài gan đến những nơi khác trong cơ thể, chẳng hạn như xương hay phổi. Các khối u có thể có kích thước bất kỳ và cũng có thể đã lan ra các mạch máu gần đó và các hạch bạch huyết []. 1.1.3. Nguyên nhân ung thư gan Mỗi một tác động xấu đều làm tăng nguy cơ mắc một căn bệnh bất kì và có thể là ung thư. Các bệnh ung thư khác nhau có các tác nhân gây bệnh khác nhau. Ví dụ, để làn da tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời mạnh là tác nhân dẫn đến ung thư da. Hút thuốc là một tác nhân dẫn đến ung thư phổi, miệng, thanh quản, bàng quang, thận, và nhiều cơ quan khác. Nhưng việc có một, hay có vài tác nhân không có nghĩa rằng một người sẽ mắc bệnh. Các nhà khoa học đã tìm thấy một số tác nhân làm tăng khả năng dẫn đến ung thư biểu mô tế bào gan. UTG được xem là biến chứng phổ biến nhất của các bệnh mãn tính thường gặp ở gan. Chúng thường được gặp ở nhiều độ tuổi khác nhau, hàng năm có khoảng 5,5–14,9/100.000 người mắc bệnh và ước tính khoảng 600.000 – 1.000.000 ca tử vong . Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh khác nhau nhiều tuỳ theo khu vực địa lý trên thế giới, nhất là giữa phương Đông và phương Tây. Khu vực có tỷ lệ phát bệnh cao nhất là Đông Á, Đông Nam Á và khu vực Nam sa mạc Sahara. Nghiên cứu dịch tễ học đã xác định được các yếu tố nguy cơ chính của UTG bao gồm: nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus – HBV), viêm gan C (Hepatitis C -5-
virus – HCV) dẫn đến viêm gan mãn tính; xơ gan; nhiễm độc aflatoxin (AF); các loại hoá chất gây ung thư như rượu, asen, dioxin (hình 1),… và các rối loạn chuyển hoá apocphirin, thiếu hụt α–1 antitrypsin, bệnh Wilson, chứng nhiễm sắc tố sắt di truyền. Ngoài ra những yếu tố như độ tuổi, giới tính, yếu tố di truyền, … cũng ảnh hưởng đến nguy cơ mắc bệnh. Mặc dù các yếu tố nguy cơ gây UTG tác động đến tế bào gan theo các con đường khác nhau nhưng cuối cùng đều dẫn đến biến đổi di truyền và hình thành tế bào ung thư. Hình 1: Các nguyên nhân chính gây ung thư gan [] Nhiễm virus HBV là yếu tố nguy cơ hàng đầu của UTG trên toàn thế giới, sự phân bố địa lý giữa tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính và tỷ lệ mắc bệnh có mối tương quan chặt chẽ. Ví dụ như Trung Quốc, các nước thuộc khu vực Đông Nam Á, Nam sa mạc Sahara có những tỉ lệ này đều ở mức cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization WHO), tiêm vaccine dự phòng HBV có thể ngăn ngừa được khoảng 70% UTG ở các vùng có tỷ lệ nhiễm HBV cao. HBV là một retrovirus có vật chất di truyền dạng ADN sợi đơn. Những báo cáo từ đầu thập niên 80 cho thấy sự hiện diện của ADN của HBV trong hệ gen các tế bào gan của khoảng 90% trường hợp bệnh nhân ung thư gan []. Nhiều nghiên cứu đã -6-
chứng minh rằng khi ADN của HBV chèn vào hệ gen của người làm biến đổi ADN nhiễm sắc thể, hoạt hoá các gen ung thư như c–Myc, c–Fos,… và bất hoạt một số gen ức chế khối u như TP53. Ngoài ra, các sản phẩm protein của hệ gen HBV như HBx, protein của gen pre S/S cũng hoạt hoá các gen ung thư dẫn tới thúc đẩy nhanh chu trình tế bào và ức chế quá trình chết theo chương trình (apoptosis). Nhiễm virus HCV là yếu tố nguy cơ thứ 2 của UTG. Có khoảng 2–4% số trường hợp nhiễm HCV mạn tính phát triển thành UTG. Ở những quốc gia, vùng lãnh thổ tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính thấp thường cũng có tần suất UTG thấp hoặc trung bình, trừ Nhật Bản (nơi mà virus HCV là yếu tố nguy cơ số 1). Số ca tử vong do UTG ở Nhật tăng mạnh từ năm 1975 trở đi, cùng thời gian đó tỷ lệ nhiễm HBV là không đổi, chỉ có viêm gan HCV là tăng lên tương ứng với tỷ lệ tử vong. Những nghiên cứu gần đây cho thấy sản phẩm protein của HCVcó thể tương tác với các protein vật chủ tham gia vào quá trình phát triển, tăng sinh và điều hòa hoạt động tế bào dẫn đến hình thành tế bào ác tính. Có ba protein được xem là bằng chứng tham gia vào quá trình này đó là protein lõi (core protein), NS3 va NS5A. ̀ Aflatoxin (AF) là một mycotoxin được tiết ra từ các chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, thường mọc trên lạc và các hạt ngũ cốc ẩm ướt, đã được chứng minh là có thể gây UTG thực nghiệm trên súc vật (hình 2). AF là chất tương tác với virus HBV tăng đáng kể nguy cơ mắc UTG. AF gây ra các đột biến gen, trong đó đột biến gen p53 được quan sát thấy nhiều nhất. Hàng loạt nghiên cứu đã chỉ ra đột biến gen này, đặc biệt là đột biến G/T ở codon 249 luôn được tìm thấy ở bệnh nhân UTG tại những khu vực có sự phơi nhiễm AF cao . -7-
Hình 2: Cơ chế gây ung thư của các tác nhân ung thư gan [] Ngoài các nguyên nhân trên thì các yếu tố khác như tuổi, giới tính, chủng tộc hay nhiễm vinyl chlorid, anabolic steroid, hoặc các rối loạn trao đổi chất như nhiễm sắt ở mô, thiếu hụt α1antitrypsin cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thư gan []. 1.1.4. Chẩn đoán và điều trị ung thư gan 1.1.4.1.Chẩn đoán Gan được cấu tạo chủ yếu bởi các tế bào biểu mô gan, loại tế bào này có khả năng tái sinh mạnh, do đó ung thư gan phát triển rất nhanh. Đồng thời, các triệu chứng của ung thư gan thường biểu lộ khi bệnh đã nghiêm trọng, do đó, việc điều trị ung thư gan gặp rất nhiều khó khăn. Đây chính là nguyên nhân chính dẫn đến tỷ lệ tử vong do ung thư gan rất cao. -8-
Việc chẩn đoán ung thư gan ở giai đoạn sớm là vô cùng cần thiết. Có hai phương pháp thông dụng nhất hiện nay để chẩn đoán ung thư gan là các xet́ ̣ ̉ ́ ật lý và xét nghiệm máu tìm alpha fetoprotein (AFP) trong nghiêm chân đoan v huyết thanh bệnh nhân bị ung thư. Để chẩn đoán khi có các triệu chứng của ung thư gan, một số phương pháp chẩn đoán vật lý được áp dụng như: siêu âm, chụp cắt lớp (CT), chụp cộng hưởng từ (MRI Magnetic Resonance Imaging), chụp X quang. Tuy nhiên, những phương pháp này tốn kém, phụ thuộc nhiều vào máy móc và không hiệu quả để phát hiện khối u ở giai đoạn sớm. Cách chẩn đoán thứ hai rất thông dụng đó là việc xét nghiệm chỉ thị AFP trong huyết thanh. AFP là một glycoprotein có khối lượng 70kDa, được tổng hợp ở gan và túi noãn hoàng trong giai đoạn thai nhi, và sau đó nó được tiết vào huyết thanh ở tuần thứ 13 của thai kỳ. Sau khi sinh, nồng độ AFP trong huyết thanh giảm và hầu như không phát hiện được ở người trưởng thành khỏe mạnh. AFP có thể được dùng để sàng lọc người có nguy cơ bị ung thư gan cao. AFP mất đi ngay sau khi trẻ sinh ra, nếu hiện diện ở máu người lớn có nghĩa là có biến đổi về tế bào gan và có khả năng mắc ung thư gan cao []. Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trưng cho ung thư gan vì có thể nó cũng tăng ở những người bị viêm gan. Hơn nữa, độ nhạy của phương pháp AFP cũng không cao, có khoảng 20% bệnh nhân bị ung thư gan mà hàm lượng AFP trong máu vẫn bình thường (đặc biệt ở những bệnh nhân có khối u nhỏ hơn 3cm) []. Hàm lượng AFP cao có thể cho chúng ta nghi ngờ chứ không thể chắc chắn bệnh nhân đã mắc ung thư gan. Các xét nghiệm có thể giúp chẩn đoán ung thư gan, nhưng trong đa số trường hợp cách duy nhất để chắc chắn là lấy một -9-
mảnh của khối u và xem xét nó dưới kính hiển vi. Điều này được gọi là sinh thiết. Có nhiều cách khác nhau để có được những mẫu khối u. Trong một số trường hợp, một mẫu sinh thiết có thể được thực hiện trong khi phẫu thuật. Nếu khối u đã lớn hoặc đã lan rộng khắp gan, một kim rỗng có thể được đặt qua da trong bụng và vào trong gan. Sinh thiết mẫu cũng có thể được thực hiện trong thời gian phẫu thuật nội soi. 1.1.4.2 Điều trị Có 2 nhóm điều trị chính: phẫu thuật và không phẫu thuật. Nhóm phẫu thuật là phương thức điều trị triệt căn, có dự hậu tốt hơn hẳn, và trong đó cắt gan là điều trị chọn lựa, tuy nhiên chỉ có khoảng 1020% bệnh nhân có khả năng cắt bỏ UTG. Ghép gan nhằm loại bỏ gan bị xơ hóa và UTG, tuy nhiên, vấn đề là thiếu gan cho để ghép.  Điều trị không phẫu thuật có thể dùng: Thuyên tắc mạch hóa trị, chích cồn qua da, phá hủy u bằng nhiệt, phá hủy u bằng sóng tần số radio, hóa trị toàn thân với Doxorubicin, xạ trị qui ước, điều trị nhắm đích.  Điều trị phẫu thuât: Phẫu thuật cắt gan, ghép gan, ngoài ra có thể hủy u bằng laser hay đông lạnh cho các u bề mặt. 1.2 CÁC CHỈ THỊ SINH HỌC 1.2.1 Khái quát Như chúng ta biết, việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư gặp rất nhiều khó khăn. Những phương pháp áp dụng hiện thời hầu như không đủ khả năng để có thể tạo những bước đột phá trong việc chẩn đoán sớm ung thư, đặc biệt là ung thư gan. Trong những năm gần đây có một hướng nghiên cứu trọng yếu đó là việc nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị sinh học. -10-
Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử biểu hiện một dữ kiện sinh học. Chỉ thị sinh học có thể đơn thuần là một chất, như glucose là chỉ thị của bệnh tiểu đường, hoặc phân tử protein, như các kháng thể là chỉ thị của bệnh nhiễm trùng, hay các dấu ấn ADN là chỉ thị cho các bệnh liên quan đến di truyền. Với phát triển của những kỹ thuật sinh học hiện đại, người ta có thể nghiên cứu nhiều phân tử trên cùng một mẫu bệnh phẩm như microarray, proteonomics [. Trong nghiên cứu bệnh học, chỉ thị sinh học có thể là những phân tử gây bệnh hay những phân tử được tạo ra sau khi bệnh phát triển. Biomarker còn được gọi là “chỉ thị” của một hiện tượng sinh học, những nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu dụng của chỉ thị sinh học cho nhiều bộ môn sinh học từ nghiên cứu đến ứng dụng. Các nhà nghiên cứu chỉ thị sinh học tin tưởng rằng chỉ thị sinh học chứa đựng những bí ẩn về bệnh lý, cho nên việc truy tìm chỉ thị sinh học sẽ giúp đạt được những kết quả có tầm ứng dụng hữu hiệu và lớn lao trong y học. Những ứng dụng này gồm các phương pháp chẩn đoán chính xác cho các bệnh phức tạp liên hệ đến nhiều gene (ung thư, tiểu đường, tim mạch, thần kinh...), hoặc các bệnh miễn nhiễm, di truyền, nhiễm trùng hay bệnh do yếu tố môi trường. Chỉ thị sinh học cũng có nhiều kỳ vọng trong ứng dụng đo lường hiệu ứng của thuốc . 1.2.2 Các phương pháp nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thư Các chỉ thị ung thư là những đại phân tử xuất hiện ở bệnh nhân ung thư, có nồng độ thay đổi liên quan đến sự phát sinh và tăng trưởng của những khối u ác tính. Chỉ thị ung thư là những chất do các tế bào hoặc mô ung thư tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc được tạo ra từ các phản ứng của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị ung thư dạng tế bào bao gồm các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể hormon và những biến đổi di truyền của tế bào. Chỉ thị ung thư dạng thể dịch bao gồm các chất -11-
hóa sinh phát hiện ở những nồng độ không bình thường có mặt trong huyết thanh, nước tiểu, và các loại dịch của cơ thể. Hiện nay, có ba phương pháp chính đang được tiến hành để nghiên cứu các chỉ thị phân tử phục vụ cho việc chẩn đoán sớm ung thư: Sử dụng kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng các gen lạ thường có liên quan đến các loại ung thư riêng biệt. Tuy nhiên, các kết quả của những nghiên cứu này mới chỉ cung cấp thông tin về khả năng mắc bệnh chứ chưa tìm được cơ chế thực sự của bệnh. Có hai lý do chính về giới hạn phương pháp genomics trong nghiên cứu chỉ thị ung thư. Thứ nhất, phần lớn các gene liên hệ đến di truyền có tần số rất thấp trong quần thể đa dạng sinh học; thứ hai, các bệnh đều có sự tham gia của một phức hệ gene, mà phần lớn chưa biết tới, chứ không phải từ một gene. Phương pháp proteomics xác định được hầu hết các protein có triển vọng trở thành các protein chỉ thị ung thư. Các kỹ thuật proteomics có thể xác định chính xác các đặc điểm bệnh học phân tử của khối u, tiên lượng bệnh, dự đoán được các ảnh hưởng của việc điều trị và giúp phát triển y học cho từng cá nhân. Hạn chế của phương pháp này là nhiều protein chỉ thị ung thư chỉ được tìm thấy ở mô ung thư mà không có mặt trong máu. Phương pháp sử dụng các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận dạng các kháng nguyên ung thư. Tuy nhiên, do có hiện tượng phản ứng chéo trong phản ứng miễn dịch, do đó kết quả của phương pháp này không đảm bảo tính đặc hiệu . Proteomics trong nghiên cứu chỉ thị ung thư -12-
Proteomics ung thư là từ được dùng để chỉ các ứng dụng của kỹ thuật proteomic trong nghiên cứu ung thư. Như chung ta đêu biêt ung th ́ ̀ ́ ư là một bệnh kì lạ bởi các đột biến diễn ra ở tế bào ung thư. Nhưng thay đ ̃ ổi ADN ở các tế bào này được dùng trong chẩn đoán nguy cơ bệnh, chẩn đoán sớm và đưa ra hướng điều trị. Viêc s ̣ ử dụng kỹ thuật proteomic để xác định các tế bào người bệnh sẽ ̣ ̣ ̣ mang lai môt cuôc cách mạng trong y học. Việc tìm các chỉ thị sinh học hiệu quả nhất là việc tìm các chỉ thị protein, vì protein là sản phẩm cuối cùng của gene và tác động trực tiếp đến các hiện tượng sinh học. Lý do quan trọng hơn nữa là protein là thành phần sinh học phong phú nhất của tế bào so với mRNA hay xa hơn nữa là gene. Một gene có thể có nhiều bản sao mRNA, biến đổi dịch mã và sau dịch mã thường tạo ra nhiều protein hơn số bản sao mRNA. Theo ước lượng hiện nay, có khoảng từ 300.000 đến 500.000 protein từ số lượng khoảng 30.000 gene của bộ gene người []. Trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các chỉ thị ung thư đã trở thành mục đích chính của các nghiên cứu ung thư. Thành công trong ứng dụng của kháng nguyên tuyến tiền liệt (PSA) trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt đã thúc đẩy các nghiên cứu để tìm ra những chỉ thị thích hợp cho các loại ung thư khác. Các chỉ thị sinh học cũng được ứng dụng trong chẩn đoán, theo dõi ung thư, chẩn đoán sự tái phát bệnh, và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh. Với các đích đa đ ̃ ược ̣ cać thuôć điều trị như imatinib (Novartis’ Gleevec), trastuzumab xać đinh, ̃ ược tao ra đê tac đông (Roche’s Herceptin), và rituximab (Roche’s Mabthera) đa đ ̣ ̉ ́ ̣ ̣ ̣ ̀ ̣ ́ ̣ ̉ ̣ đăc hiêu nhăm điêu tri co hiêu qua bênh ung th ̀ ư. Hiên nay, xu h ̣ ướng lựa chọn các chỉ thị và bệnh nhân để tiến hành điều trị sẽ tốt cho việc dự đoán tình trạng kháng thuốc. Các chỉ thị sinh học thực sự rất cần cho việc phát triển điều trị cho từng cá nhân. Các protein có thể được tiết ra một cách tích cực hoặc được giải phóng ra bởi các tế bào khối u như là kết quả của sự hoại tử hay quá trình -13-
apoptosis và sau đó chúng được lưu thông trong máu. Điều này dẫn đến sự thay đổi hệ thống protein. Sự khác biệt về cường độ tín hiệu có thể được tìm ra bằng cách so sánh với huyết tương của những người bình thường. Các kỹ thuật như Antibody Microarray, điện di hai chiều và khối phổ là những kỹ thuật chính được sử dụng để tìm các chỉ thị cho bệnh ung thư . Kết quả từ Viện nghiên cứu Y học Hoa Kỳ (NIH) đã cho biêt co 14 protein ́ ́ có khả năng dùng làm chỉ thị cho bệnh ung thư vú từ các phân tích khối phổ với mẫu sữa lấy từ vú bệnh nhân[9]. Trong các nhóm được thử nghiệm, độ chính xác của các chỉ thị này rất cao so với việc dùng các gene BRCA (BRCA là gene của bệnh ung thư vú di truyền, tuy nhiên gen này chỉ có tỉ lệ thấp từ 25% của bệnh này khi dùng để chẩn đoan chung). M ́ ột số chỉ thị protein khác cũng đã được phát hiện từ nghiên cứu các bệnh ung thư tiền liệt tuyến, ung thư phổi, ung thư bàng quang, và ung thư buồng trứng; về các bệnh tim mạch đã có một số chỉ thị protein được cho là có liên quan đến bệnh nghẽn động mạch. 1.2.3 Nghiên cứu chỉ thị sinh học với ung thư gan Với ung thư gan, việc nghiên cứu các chỉ thị sinh học đã và đang được tiến hành với cả ba hương, bao g ́ ồm việc dò tìm các chỉ thị ADN, protein và các kháng thể đặc hiệu. Trong đó, một trong những hướng nghiên cứu quan trọng nhất là phân tích tìm ra các chỉ thị phân tử để nhận dạng kiểu hình ác tính của các tế bào ung thư gan. Các phân tử chỉ thị này bao gồm: các phân tử tham gia vào quá trình tăng sinh tế bào, gây biến đổi ADN (protein PCNA, Ki67, Mcm2, MIB1, MIA, và CSE1L/CAS); gen TP53 và phân tử liên quan đến MDM2; các protein khác tham gia điều khiển chu trình tế bào (cyclin A, cyclin E, cdc2, p27, p73); các gen gây ung thư và các thụ thể của chúng (ras, cmyc, cfms, HGF, cmet, và erbB); các yếu tố liên quan đến sự chết theo chương trình của tế bào (Fas và FasL) và sự hoạt động của các telomerase. Một hướng nghiên cứu khác là tìm ra các chỉ thị -14-
phân tử liên quan đến quá trình xâm lấn và di căn của ung thư, các chỉ thị phân tử loại này gồm các phân tử bám dính (Ecadherin, catenins, các dạng CD44 khác nhau), các enzyme thủy phân protein làm giảm chất gian bào (MMP2, MMP9, Upa, Upar, PAI), các yếu tố sinh trưởng tham gia vào sự hình thành mạch giúp khối u phá vỡ vỏ bọc, di căn đến các vị trí khác trong cơ thể … 1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU CÁC CHỈ THỊ UNG THƯ GAN 1.3.1. Proteomics Thuật ngữ “proteomics” lần đầu tiên được Marc Wilkins và cộng sự đưa ra năm 1994 đã mở ra một thời kỳ phát triển mạnh mẽ các nghiên cứu về protein. Proteomics là ngành khoa học nghiên cứu hệ protein, tập hợp tất cả các protein được mã hóa và biểu hiện bởi hệ gen của cơ thể sinh vật . Proteomics là một nhánh của nghiên cứu chức năng hệ gen, nó được sinh ra khi các nhà nghiên cứu về gen đối mặt với câu hỏi “chức năng của tất cả các protein là gì ?”. Proteomics có thể được định nghĩa là những nghiên cứu rộng rãi mọi mặt protein như là sự biểu hiện, những tương tác của protein trong tế bào cũng như việc mô hình hóa protein. Protein là sản phẩm của ARN thông tin, nó thực hiện phần lớn các phản ứng của tế bào và nó không có một mối quan hệ tuyến tính nào giữa mức độ cấu trúc ARN thông tin và protein hay “proteome”trong tế bào. Ngoài ra, hầu hết các đích tác dụng của thuốc là protein; do đó, các phương pháp để nghiên cứu có hiệu quả phức hợp protein trong tế bào có thể đóng vai trò trực tiếp cho việc phát triển thuốc. Ngày nay, các nghiên cứu proteomics tập trung vào ba mặt chính là: nhận dạng protein, mô tả sự biểu hiện protein, mô hình hóa hệ thống và sự cải biến protein. -15-
Nhận dạng protein là nhiệm vụ cơ bản của proteomics nhằm xác định tất cả các protein có trong mẫu nghiên cứu. Mục đích của việc này là đưa ra một danh sách các protein hoàn chỉnh đã được biểu hiện trong thực tế chứ không phải là suy ra từ dữ liệu về biểu hiện gen. Mô tả sự biểu hiện protein là việc xác định sự biểu hiện của các protein trong một thời điểm nhất định của tế bào, mô. Mô tả protein thực chất là một trường hợp đặc biệt của việc nhận dạng. Ứng dụng phổ biến nhất là các phân tích sự khác biệt, trong đó có hai trạng thái riêng biệt của hệ được so sánh với nhau. Ví dụ như việc nghiên cứu so sánh các mô bình thường và mô bệnh để xác định xem protein nào biểu hiện khác nhau trong các trạng thái đó. Các protein biểu hiện khác nhau đó có thể trở thành chỉ thị sinh học của bệnh. Mô hình hóa hệ protein là xác định xem các protein liên hệ như thế nào với các thành phần khác trong hệ thống sống. Hầu hết các protein thực hiện chức năng của nó trong việc kết hợp chặt chẽ với các protein khác. Nghiên cứu các tương tác này giúp xác định được chức năng của protein. Mô hình hóa sự cải biến protein là nhiệm vụ xác định xem các protein biến đổi như thế nào. Nói chung, nhiều cải biến sau dịch mã đã chi phối cấu trúc, chức năng và hoạt động của các protein. 1.3.2. Hệ protein gan người Gan là cơ quan lớn nhất trong cơ thể người. Gan có vai trò quan trọng trong các quá trình tiêu hóa, trao đổi chất và cũng là nơi sản sinh ra nhiều loại protein sinh chất, là vị trí có hiệu quả nhất để phân giải các chất ngoại sinh, cho quá trình thực bào đối với các chất rắn, tham gia bảo vệ bộ máy tiêu hóa và các bộ phận khác của cơ thể. Gan có vai trò chính trong việc xác định động dược học -16-
của thuốc, vì đây là cơ quan chính để đào thải nhờ khả năng chuyển hóa và bài tiết của mật, và cũng là vị trí chính có ảnh hưởng đến sự phân bố do có quá trình tổng hợp các protein gắn với thuốc. Tại hội thảo khoa học của Tổ chức Proteome người (Human Proteome Organisation_HUPO) diễn ra ngày 2829/04/2002 ở Bethesda (Hoa Kỳ), đã đánh dấu cho sự ra đời của dự án Proteome gan người (Human Liver Proteome Project, HLPP) với sự tham gia của đông đảo của các viện, trường đại học và các công ty trên thế giới. Tại hội thảo này đã có sự thống nhất về phương hướng, mục đích, tương lai khoa học của dự án HLPP và đặc biệt nhấn mạnh các mục tiêu khoa học của dự án, bao gồm: tạo được bức tranh tổng thể của proteomics gan; xác định sự phân bố và bức tranh tổng thể của các protein ở mức độ dưới tế bào; lập bản đồ liên kết của các protein gan; làm sáng tỏ các biến đổi tổng thể của proteome gan; liên kết giữa các dự án proteome gan và dự án proteome huyết tương để phát hiện các chỉ thị sinh học của các bệnh về gan []. 1.3.3. Proteomics trong nghiên cưu ung th ́ ư gan Tác hại của ung thư gan đối với sức khỏe con người và xã hội là vô cùng lớn. Việc phân tích proteomics ung thư gan hứa hẹn sẽ cung cấp cho chúng ta sự hiểu biết đầy đủ hơn về các tác nhân gây ung thư gan, quá trình tiến triển bệnh và hơn nữa là đưa ra các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới cho bệnh nhân HCC. Việc phân tích proteomics không chỉ dừng lại ở việc xác định các chỉ thị trong mô, hay chỉ với nghiên cứu proteomics huyết tương. Việc tìm kiếm các chỉ thị trong huyết tương kết hợp với nghiên cứu trên mô sẽ giúp chúng ta tiến gần hơn đến việc chẩn đoán ung thư một cách đơn giản và chính xác hơn chỉ với một xét nghiệm máu đơn giản. Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics trên các dòng tế bào ung thư, phân tích trực tiếp trên huyết tương và mô gan của bệnh nhân ung -17-
thư gan đã và đang được tiến hành rộng khắp trên toàn thế giới và đã thu được một số kết quả khả quan . Vì nguyên nhân chính của ung thư gan là viêm gan B, C nên rất nhiều nghiên cứu đã tập trung vào đối tượng là bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan. Để tìm hiểu khác biệt trong biểu hiện protein trong mô ung thư gan có tiền sử viêm gan B nhằm giải thích cơ chế biến đổi của tế bào gan ung thư, cac nha ́ ̀ ̣ khoa hoc Trung Quôc đa tiên hanh phân tich h ́ ̃ ́ ̀ ́ ệ protein cac tê bao gan ung th ́ ́ ̀ ư ̀ ̃ ̣ ̣ băng ki thuât điên di 2 chiêu DIGE (đi ̀ ện di 2 chiều cac mâu khac nhau trên cung ́ ̃ ́ ̀ ̣ ̉ ̃ ́ ư 12 bênh nhân HCC co tiên s môt ban gel). Mâu lây t ̀ ̣ ́ ̀ ử viêm gan B được phân tich. ́ Hàm lượng protein tương đương từ 12 căp mâu (bênh va binh th ̣ ̃ ̣ ̀ ̀ ương) đ ̀ ược trôn ̣ ̣ ơi nhau lam thanh nôi chuân va đ lai v ́ ̀ ̀ ̣ ̉ ̀ ược đanh dâu băng Cy2 trong khi đo mâu ung ́ ́ ̀ ́ ̃ thư va không ung th ̀ ư được đanh dâu ngâu nhiên băng Cy3 hoăc Cy5. Tông sô 61 ́ ́ ̃ ̀ ̣ ̉ ́ spot được xac đinh la biêu hiên tăng lên trong cac mâu ung th ́ ̣ ̀ ̉ ̣ ́ ̃ ư trong khi đo 158 ́ ́ ̉ ̣ ̉ ̉ ̉ ̉ ̃ ược xac đinh t spot co biêu hiên giam. Có 71 san phâm cua gen đa đ ́ ̣ ừ nhưng spot ̃ ̉ ̣ nay. Cac thanh viên cua ho protein s ̀ ́ ̀ ốc nhiệt 70 va 90 co biêu hiên tăng, trong khi ̀ ́ ̉ ̣ ̉ ́ ̣ ̉ ở bênh nhân HCC. S cac protein chuyên hoa lai giam ́ ̣ ự giam cac protein ti thê va ̉ ́ ̉ ̀ protein peroxisom trong nghiên cưu nay đ ́ ̀ ưa ra cho chung ta môt g ́ ̣ ợi y răng co s ́ ̀ ́ ự mât đi nh ́ ưng ch ̃ ưc năng chuyên biêt cua c ́ ̣ ̉ ơ quan tử trong tê bao gan ung th ́ ̀ ư. 4 ̉ ́ ở gan biêu hiên giam enzyme chuyên hoa trong chu trinh methyl hoa ́ ̀ ̉ ̣ ̉ ở cac mô gan ́ ung thư, biêu thi băng s ̉ ̣ ̀ ự thiêu hut Sadenomethionine trong ung th ́ ̣ ư gan. Hai san̉ ̉ cuả gen là glycerandehyde3phosphate dehydrogenase và phâm formimidoyltransferase cycledeaminase được xac đinh t ́ ̣ ư cac spot biên đôi nghich, ̀ ́ ́ ̉ ̣ từ đo chi ra răng cac đông phân hoăc cac dang cai biên sau dich ma cua hai protein ́ ̉ ̀ ́ ̀ ̣ ́ ̣ ̉ ́ ̣ ̃ ̉ ̀ ́ ̉ ́ nay co thê đong vai tro khac nhau trong ung th ̀ ́ ư gan. Nghiên cứu nay lân đâu tiên ̀ ̀ ̀ chỉ ra răng ̀ sự biêu ̉ hiên ̣ tăng cuả protein Hsp70/Hsp90 và cać thể dị hợp ̉ ̣ ribonulceoprotein nhân C1/C2 trong cac mô HCC la cac chi thi ung th ́ ̀ ́ ư, được -18-
̉ ̣ ̀ ̀ ̃ ̣ ̣ ́ ̃ ̣ ́ ̀ ở 70 mâu khăng đinh băng Western blot va ki thuât nhuôm hoa miên dich tê bao ̃ HCC . Ung thư gan la môt trong nh ̀ ̣ ưng bênh ung th ̃ ̣ ư phô biên nhât trên thê gi ̉ ́ ́ ́ ới, ́ ́ ộng đên nhiêu n no tac đ ́ ̀ ước trong nhưng năm gân đây. Theo thông kê co khoang ̃ ̀ ́ ́ ̉ ́ ương h 53% cac tr ̀ ợp HCC trên thê gi ́ ới co liên quan đ ́ ến HBV. Nguy cơ tiên triên ́ ̉ thanh HCC t ̀ ừ nhưng ng ̃ ươi mang HBsAg cao gâp 25~37 lân so v ̀ ́ ̀ ơi nh ́ ưng ng ̃ ươì ̣ ̃ ]. Khi các virus viêm gan xâm nhập vào cơ thể sẽ làm cho cơ thể không bi nhiêm [ sinh ra các kháng thể chống lại chúng. Bằng việc nghiên cứu sự biểu hiện các protein huyết thanh của người bình thường, người nhiễm virus và người bị ung thư gan đã chi ra răng s ̉ ̀ ự tôn tai cua t ̀ ̣ ̉ ưng khang thê t ̀ ́ ̉ ự miễn nay co liên quan v ̀ ́ ới ̀ ̀ ́ ́ ̉ ́ ớm hiêu qua đôi v HCC va la yêu tô chân đoan s ̣ ̉ ́ ới cac tr ́ ường hợp viêm gan nguy cơ cao . Nghiên cứu được thực hiện trên huyêt thanh cua 37 bênh nhân HCC va 31 ́ ̉ ̣ ̀ trương h ̀ ợp viêm gan B/C không bi HCC. Huyêt thanh lây t ̣ ́ ́ ừ cac bênh nhân bi ung ́ ̣ ̣ thư không phai HCC va 24 tr ̉ ̀ ương h ̀ ợp khoe manh đ ̉ ̣ ược dung lam đôi ch ̀ ̀ ́ ứng. Có 8 ̣ ̣ ́ ưng thê dich trong huyêt thanh t loai protein tao ra đap ́ ̉ ̣ ́ ừ 70% trong tông sô 37 bênh ̉ ́ ̣ nhân trong nghiên cưu, v ́ ơi ti lê biêu hi ́ ̉ ̣ ̉ ện cua t ̉ ưng protein riêng biêt t ̀ ̣ ừ 11~27%. ́ ́ ̉ ự miễn khang Cac khang thê t ́ βtobulin, creatine kinase B, hsp60 va cytokeratin18 ̀ được phat hiên trong huyêt thanh cua cac bênh nhân viêm gan B/C, trong khi đo, ́ ̣ ́ ̉ ́ ̣ ́ ́ ̉ khang thê khang calreticulin, cytokeratin8, F ́ 1ATP synthase βsubunit va NDPKA ̀ ̉ ́ ̣ ̀ ở bênh nhân HCC. Calretibulin va môt dang bi căt cua no chi thây xuât hiên nhiêu ́ ̣ ̀ ̣ ̣ ̣ ́ ̉ ́ ̃ ược xac đinh la phô biên nhât (Crt32) đa đ ́ ̣ ̀ ̉ ́ ́ ở cac bênh nhân HCC v ́ ̣ ơi tân suât biêu ́ ̀ ́ ̉ ̣ ̀ hiên la 27% . Việc lựa chọn nguồn bệnh nhân để lấy mẫu và cách lấy mẫu sinh phẩm là rất quan trọng, có vai trò quyết định đến kết quả của một nghiên cứu. Năm ́ ̀ ̣ ̣ ̀ ́ ́ ̀ ̣ 2003, Cac nha khoa hoc tai Seoul, Han Quôc tiên hanh môt ph ương phap lây mâu ́ ́ ̃ ̣ ́ ới 21 căp mâu (cac mô ung th đôc đao v ̣ ̃ ́ ư va cac mô không ung th ̀ ́ ư xung quanh gan) được lây t ́ ừ 21 bênh nhân ung th ̣ ư gan. Cac bênh nhân nay đ ́ ̣ ̀ ượ c chia ra lam ̀ -19-
̣ 3 dang HCC b ởi cac chi thi virus: 7 HBsAg d ́ ̉ ̣ ương tinh (HCC dang B), 7 anti ́ ̣ HCV dương tinh (HCC dang C) va 7 HBsAg va antiHCV âm tinh. Protein tông ́ ̣ ̀ ̀ ́ ̉ ́ ược phân tich băng điên di 2 chiêu va khôi phô MALDITOFMS va nh sô đ ́ ̀ ̣ ̀ ̀ ̉ ̉ ̀ ưng ̃ ̉ ̣ ̃ ược chi ra. Kêt qua nghiên c thay đôi trong hê protein đa đ ̉ ́ ̉ ứu cho thây co 60 ́ ́ ́ ưc đô biêu hiên khac nhau gi protein co m ́ ̣ ̉ ̣ ́ ữa cac mâu ung th ́ ̃ ư va không ung th ̀ ư, ̣ ̉ ̉ ̣ trong sô đo 14 protein bi thay đôi trong ca 3 dang HCC, trong khi đo, 46 protein ́ ́ ́ ̣ ̀ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ̃ ́ ̣ lai la chi thi đăc hiêu vê virus. Tom lai, cac protein đa xac đinh đ ̀ ́ ́ ượ c phân loaị ́ ́ ́ ̣ ̀ ́ ́ ̉ ̀ ̉ theo tac nhân virus co liên quan đên HCC dang B va C. Cac kêt qua nay chi ra ̣ ̀ ự biêu hiên cua hê protein cua cac mô trong HCC liên môt cach ro rang răng s ́ ̃ ̀ ̉ ̣ ̉ ̣ ̉ ́ ̣ ́ ới cac yêu tô gây bênh va c quan mât thiêt v ́ ́ ́ ̣ ̀ ơ chê ung th ́ ư gan co thê diên ra khac ́ ̉ ̃ ́ nhau do cac yêu tô HBV va HCV . ́ ́ ́ ̀ Cũng trên đối tượng các bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan B, ̀ ̣ thang 4 năm 2008, Min He va công s ́ ự đa công bô kêt qua nghiên c ̃ ́ ́ ̉ ứu phat hiên va ́ ̣ ̀ ́ ̣ xac đinh NAP2 nh ư la môt chi thi sinh hoc cua ung th ̀ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ư gan liên quan đên viêm ́ ̣ gan B băng ki thuât proteomic. Nghiên c ̀ ̃ ưu đ ́ ược tiên hanh trên 81 bênh nhân HCC ́ ̀ ̣ ́ ̀ ử HBV va 33 ng co tiên s ̀ ươi khoe manh v ̀ ̉ ̣ ơi ki thuât SELDITOFMS đa mô ta hê ́ ̃ ̣ ̃ ̉ ̣ ̉ protein cua cac mâu huyêt thanh. ́ ̃ ́ ́ ́ ̀ ̣ ̃ ứng đâu la Mary Ann Comunale đa Năm 2006, nhom cac nha khoa hoc My đ ̀ ̀ ̃ ́ ̀ ́ ́ ́ ̣ tiên hanh phân tich proteomic cac glycoprotein huyêt thanh bi fuco hoa trong giai ́ ̣ đoan đâu ung th ̀ ư gan. Cac tac gia đa chi ra răng v ́ ́ ̉ ̃ ̉ ̀ ới sự gia tăng cac m ́ ưc đô fuco ́ ̣ ́ ́ ̉ ược quan sat qua phân tich polysaccharide v hoa co thê đ ́ ́ ơi huyêt thanh tông sô va ́ ́ ̉ ́ ̀ ́ ự tiên triên HCC. Nh co liên quan đên s ́ ́ ̉ ư đa biêt AFP la môt chi thi sinh hoc trong ̃ ́ ̀ ̣ ̉ ̣ ̣ ung thư gan (trên 50ng/mL găp ̣ ở 30~60% trương h ̀ ợp HCC tai th ̣ ơi điêm chân ̀ ̉ ̉ ̣ đoan), tuy vây, AFP th ́ ương biêu thi không đây đu ̀ ̉ ̣ ̀ ̉ ở nhưng mô nho. Trong nghiên ̃ ̉ cưu nay, cac nha khoa hoc đa tiêp cân ph ́ ̀ ́ ̀ ̣ ̃ ́ ̣ ương phap glycoproteomics đê xac đinh ́ ̉ ́ ̣ cac glycoprotein huyêt thanh liên quan t ́ ́ ơi tiên triên ung th ́ ́ ̉ ư va GP73 đa đ ̀ ̃ ược phat́ ̣ ơi m hiên v ́ ưc đô gia tăng trong cac đôi t ́ ̣ ́ ́ ượng HCC. Protein nay đa đ ̀ ̃ ược phân tich ́ -20-