Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:123

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn "Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm" nêu lên việc tối ưu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các SAs. Tối ưu quá trình xử lý mẫu. Ứng dụng phân tích trên một số mẫu thực tế. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI 1
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Vũ Thị Trang PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM SULFONAMIDES TRONG THỊT GIA SÚC GIA CẦM Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG Hà Nội - 2012 2
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS. Nguyễn Xuân Trung đã tận tình hƣớng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn. Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích, đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em đƣợc học tập và nghiên cứu trong môi trƣờng hiện đại. Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi đƣợc học tập và hoàn thành đề tài này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi. Hà Nội, năm 2012 Học viên Vũ Thị Trang 3
MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN……………………… ………………………….… 3 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)……………………………...3 1.1.1 Lịch sử phát hiện…………………………………………………………...….3 1.1.2 Phân loại SAs……………………………………………………………….....3 1.1.3 Cấu tạo của SAs……………………………………………………………….4 1.1.4 Tác dụng của SAs……………………………………………………………..6 1.1.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid........................................................8 1.1.6 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm...............................9 1.2 Các phƣơng pháp xác định SAs............................................................................9 1.2.1 Trong nƣớc.......................................................................................................10 1.2.2 Thế giới.......................................................................................................... .10 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................19 2.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu.....................................................................19 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................19 2.2.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng………………………………………..…19 2.2.2 Detector khối phổ………………………………………………………….…21 2.2.3. Phân tích định tính và định lƣợng bằng LC/MS…………………………….26 2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu……………………...…26 2.3.1 Thiết bị và dụng cụ………………………………………………………...…26 2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn……………………………………………………....…27 2.4. Lấy mẫu .............................................................................................................28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................29 3.1. Tối ƣu điều kiện tách và xác định Sulfonamid trên thiết bị LC/MS/MS...........29 3.1.1. Tối ƣu các điều kiện của detector khối phổ (MS)…………………………...29 3.1.2. Lựa chọn cột tách………………………………………………………...…32 3.1.3 Khảo sát chƣơng trình gradient…………………………………………....…32 3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động.................................................................................36 3.1.5 Khảo sát thành phần acid formic trong pha động............................................38 4
3.2 Tối ƣu quá trình xử lý mẫu phân tích các SAs ..................................................40 3.2.1 Khảo sát qui trình chiết....................................................................................43 3.2.2 Khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết.........................................46 3.2.3 Khảo sát thành phần MeOH trong dung môi chiết..........................................48 3.2.4 Khảo sát khối lƣợng pha rắn PSA....................................................................49 3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích.......................................................................52 3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn...........................................52 3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp......56 3.3.2 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi)...................................58 3.3 Phân tích mẫu thực .............................................................................................65 KẾT LUẬN..............................................................................................................73 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................75 PHỤ LỤC.................................................................................................................80 Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic trong pha động..............................80 Phụ lục 2: Kết quả khảo sát qui trình chiết mẫu.......................................................82 Phụ lục 3: Kết quả khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết....................87 Phụ lục 4: Kết quả khảo sát nồng độ MeOH trong dung môi chiết và khối lƣợng PSA................................................................................................ ....92 Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phƣơng pháp (độ lặp lại, độ thu hồi)...........................94 Phụ lục 6: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực tế......................................................104 5
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs đƣợc xác định trong đề tài 4 Bảng 1.2: Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép đối với SAs tại một số thị trƣờng 9 Bảng 3.1: Các thông số tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh 29 Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu cho nguồn và khí 31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nồng độ acid formic tới diện tích píc SAs 38 Bảng 3.4: Các qui trình chiết dự kiến chiết các SAs 44 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của qui trình chiết đến hiệu suất thu hồi các SAs 45 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi các SAs 46 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi các SAs 48 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng của khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi của các SAs 49 Bảng 3.9 : Cách pha các dung dịch chuẩn để lập đƣờng chuẩn có chứa IS 53 Bảng 3.10: Đƣờng chuẩn của các SAs (có IS) 53 Bảng 3.11: Đƣờng chuẩn các SAs (không có IS) 55 Bảng 3.12: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các SAs 56 Bảng 3.13: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các SAs trên nền mẫu thịt lợn tại 5ppb 59 Bảng 3.14: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các SAs trên nền mẫu thịt lợn 61 tại 10ppb Bảng 3.16: Qui định độ chụm của các phƣơng pháp định lƣợng phụ thuộc 65 nồng độ chất theo 2002/657/EC Bảng 3.17: Kết quả phân tích mẫu thực 67 6
DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 2.1: Sơ đồ khối của khối phổ kế 21 Hình 2.2: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI 23 Hình 2.3: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực MS/MS 25 Hình 3.1: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 1 33 Hình 3.2: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 2 34 Hình 3.3: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 3 34 Hình 3.4: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 4 35 Hình 3.5: Sắc ký đồ các SAs theo chƣơng trình gradient 5 35 Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,2 ml/phút 36 Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút 37 Hình 3.8: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,4 ml/phút 37 Hình 3.9: Sắc đồ rửa giải các SAs tại tốc độ dòng 0,5 ml/phút 37 Hình 3.10: Sắc đồ các SAs tại nồng độ acid formic 0,15% 39 Hình 3.11: Ảnh hƣởng của quy trình chiết đến hiệu suất thu hồi của SIM 45 Hình 3.12: Đồ thị ảnh hƣởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi 47 các SAs Hình 3.13: Sắc đồ 10SAs tại nồng độ acid acetic 1% 47 Hình 3.14: Đồ thị sự ảnh hƣởng của nồng độ MeOH đến hiệu suất thu hồi 49 của các SAs Hình 3.15: Ảnh hƣởng của khối lƣợng PSA đến hiệu suất thu hồi của các 50 SAs Hình 3.16: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ STZ trong khoảng 52 0,5-500ppb Hình 3.17: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ SDM trong khoảng 52 0,5-500ppb 7
Hình 3.18: Đƣờng chuẩn SMM (R2 = 1,0000) 54 Hình 3.19: Đƣờng chuẩn SSA (R2 = 0,9991) 54 Hình 3.20: Đƣờng chuẩn SIM (R2 = 0,9999) 55 Hình 3.21: Đƣờng chuẩn SSA (R2 = 0,9998) 56 Hình 3.22: Sắc đồ SMM tại giới hạn phát hiện LOD 0,025ppb (S/N = 3,5) 57 Hình 3.23: Sắc đồ STZ tại giới hạn phát hiện LOD 0,025ppb (S/N = 3,3) 57 Hình 3.24: Sắc đồ SP tại giới hạn định lƣợng LOQ 0,05ppb (S/N = 10,5) 58 Hình 3.25: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs tại mức nồng độ 5ppb 60 Hình 3.26: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs tại mức nồng độ 10ppb 62 Hình 3.27: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn 10 SAs tại mức nồng độ 20ppb 64 Hình 3.28: Sắc đồ mẫu gan lợn không nhiễm SAs 72 Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phủ tạng gà nhiễm SDM 73 8
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile CE Collision energy Năng lƣợng va chạm EI Electron Ionization Ion hóa bằng dòng electron ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử EU European Union Châu Âu HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography IUPAC International Union of Pure and Liên minh quốc tế về hóa học Applied Chemistry cơ bản và ứng dụng LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantity Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol metanol MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dƣ lƣợng tối đa PSA Primary and secondary amine Các amin bậc 1, bậc 2 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SPE solid phase extraction Chiết pha rắn U.S. NRP United States National Residue Chƣơng trình quốc gia về tồn Program dƣ chất độc của Mỹ UPLC- Ultral performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết MS/MS chromatography tandem mass nối khối phổ spectrometry UV Ultraviolet Tử ngoại 9
MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm đang là mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội. An toàn thực phẩm trong sản phẩm chăn nuôi không chỉ đơn thuần là sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà còn ở chỗ sản phẩm chứa các chất gây ra ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trƣờng diễn (hocmon, kháng sinh, độc chất). Trong vô số các nguyên nhân dẫn đế n viê ̣c mấ t an toàn vê ̣ sinh thƣ̣c phẩ m , thì vấn đề về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh và tồn dƣ chất kích thí ch tăng tro ̣ng trong thịt gia súc gia cầm cũng là thực trạng nan giải và đáng báo động . Với mô ̣t lƣơ ̣ng thƣ̣c phẩ m khổ ng lồ tƣ̀ đô ̣ng vâ ̣t đang đƣơ ̣c tiêu thu ̣ trên thi ̣trƣờng , ít ai nghĩ đến viê ̣c mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đa ng phải dần tić h lũy dƣ lƣơ ̣ng chấ t kić h thić h tăng tro ̣ng và thuố c kháng sinh . Nguyên nhân do ngƣời dân sƣ̉ du ̣ng rấ t tùy tiê ̣n các loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chó ng lớn. Hâ ̣u quả là dƣ lƣơ ̣ng chấ t kích thích và thuố c kháng sinh trong thiṭ gia súc, gia cầ m vƣơ ̣t ngƣỡng cho phép gấ p nhiề u lầ n , tuy không gây ngô ̣ đô ̣c cấ p tiń h tƣ́c thời, nhƣng sẽ gây nguy ha ̣i về lâu dài cho sƣ́c khỏe của ngƣờ i tiêu dùng. Sulfonamid (SAs) là một nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng một vai trò quan trọng và hiệu quả trong việc hạn chế sự nhiễm trùng do vi khuẩn và vi sinh vật trong hệ thống tiêu hóa của vật nuôi. Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng, ngăn chặn và điều trị một loạt các bệnh ở gia súc gia cầm nhƣ các bệnh về tiêu hóa hay hô hấp... Song hệ quả không thể tránh khỏi khi sử dụng nhóm các chất kháng sinh này là tồn dƣ của chúng trên thịt gia súc gia cầm, gây nguy cơ kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật, làm giảm sức đề kháng của vật nuôi, và gây hại cho sức khỏe con ngƣời nhƣ: ung thƣ tuyến giáp, sốc phản vệ và kháng thuốc [1]. Ngộ độc thực phẩm thƣờng xảy ra do thiếu sót trong công tác kiểm tra, thanh tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, do sơ xuất trong nấu nƣớng, vệ sinh. 10
Việc nghiên cứu xác định dƣ lƣợng SAs trong thịt gia súc gia cầm đã đƣợc nhiều tác giả trên thế giới quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, vấn đề này vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu sâu. Việc nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp xác định nhanh, chính xác SAs giúp cho công tác thanh tra kiểm tra đƣợc chặt chẽ, đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là phƣơng pháp hiện đại, có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh và chính xác. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ(LC-MS/MS) xác đinh dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamid trong thịt gia súc gia cầm ”. Với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: - Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các SAs - Tối ƣu quá trình xử lý mẫu. - Ứng dụng phân tích trên một số mẫu thực tế. 11
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs) 1.1.1 Lịch sử phát hiện [6] Năm 1935 ngƣời ta thấy chất màu prontosil đƣợc chuyển hóa invitro thành hoạt chất sulfanilamide, một dẫn xuất ngăn ngừa đƣợc nhiễm liên cầu ở chuột. Sau đó các sulfonamid khác đƣợc tổng hợp, là những chất chuyển hóa của sulfanilamide với các vị trí thế N1 và N4. Trong đó sulfanilamide và sulfadiazine đƣợc cấp phép vào năm 1939 và 1941. Theo các nhà Dƣợc học phân loại thì Sulfonamid là một nhóm thuốc có tác động tĩnh khuẩn miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong việc loại bỏ tận gốc sự nhiễm trùng. Do đó, các sulfonamid trở thành những tác nhân hóa trị liệu đầu tiên đƣợc dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiễm khuẩn toàn thân ở ngƣời. Từ đó tới nay, một loạt sulfonamid khác đƣợc cấp phép, mặc dù hiện nay, hiếm khi chúng đƣợc dùng đơn độc mà thƣờng hay kết hợp với một vài chất khác. 1.1.2. Phân loại SAs Các SAs đƣợc phân loại theo khả năng hấp thu và thời gian bài thải chúng ra khỏi cơ thể, đa số bài thải qua đƣờng thận bằng cách khuếch tán thụ động. Tuy nhiên, có một số bị tái hấp thụ ở ống thận làm cho chúng duy trì lâu hơn trong cơ thể [8]. Dựa vào thời gian tác dụng có thể chia SAs thành 4 nhóm nhƣ sau: - SAs tác động toàn thân, bao gồm: + SAs tác động nhanh (3-6 giờ), bài thải nhanh: sulfamerazin, sulfadimidin, sulfathiazole... + SAs nửa chậm (6-10 giờ): sulfapyridin, sulfamethoxazol, sulfadiazine... 12
+SAs bài thải chậm (10-12 giờ): sulfamethoxypyridazin, sulfadimethoxin, sulfadoxin... - SAs kháng khuẩn đƣờng ruột: sulfaguanidin,phtalylsulfathiazon... - SAs tác động tại chỗ (thuốc nhỏ mắt): sulfacetamid,sulfadiazine bạc... - SAs trị cầu trùng (thƣờng kết hợp với nhóm diaminopyrimidin): sulfadimidin, solfaquinoxalin, sulfadimethoxin,sulfadoxin.... 1.1.3 Cấu tạo của SAs Thay thế các gốc R1, R2, R3 khác nhau, sẽ cho các SAs khác nhau Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs đƣợc xác định trong đề tài Khối SAs Công thức lƣợng STT pKa Công thức cấu tạo phân tử phân tử (g/mol) Sulfisomidine (SIM) 1 C12H14N4O2S 278,331 7,35 4-amino-N-(2,6- dimethylpyrimidin-4-yl) benzenesulfonamid Sulfadiazine (SD) 2 C10H10N4O2S 250,278 6,5 4-amino-N-pyrimidin- 2-yl-benzenesulfonamid Sulfathiazole 3 C9H9N3O2S2 255,319 7,24 (STZ) 13
4-amino-N-(1,3-thiazol- 2-yl)benzenesulfonamid Sulfapyridine (SP) 4 C11H11N3O2S 249,29 8,54 (4-amino-N-pyridin-2- ylbenzenesulfonamid) Sulfamerazine (SM) 5 C11H12N4O2S 264,305 6,98 4-amino-N-(4- methylpyrimidin-2-yl) benzenesulfonamid Sulfamonomethoxine (SMM) 4-Amino-N-(6- 6 C11H12N4O3S 280,30 6,05 methoxy-4- pyrimidinyl)benzenesulf onamid Sulfachloropyridazine (SCP) 7 C10H9ClN4O2S 284,72 5,90 N’-(6-Chloro-3- pyridazinyl)sulfanilamid e Sulfamethoxazole (SMX) 8 C10H11N3O3S 253,279 5,81 4-amino-N-(5- methylisoxazol-3-yl)- benzenesulfonamid 14
Sulfisoxazole (SSA) 9 C11H13N3O3S 267,30 4,83 4-amino-N-(3,4- dimethyl-1,2-oxazol-5- yl)benzenesulfonamid Sulfadimethoxine (SDM) 4-amino-N-(2,6- 10 dimethoxypyrimidin-4- C12H14N4O4S 310,33 6,21 yl) benzenesulfonamid đồng vị của SDM: trong phân tử có Sulfadimethoxine-d4 C12H10D4N4O4 bốn nguyên tử hidro 1H bị thay thế 11 314 6,21 (IS) S bởi bốn nguyên tử deuteri 2H, đƣợc dùng làm nội chuẩn 1.1.4 Tác dụng của SAs  Cơ chế tác động: SAs là một hợp chất hữu cơ có chứa các gốc SO2NH2 (amid của acid sulfonic). Cấu trúc phân tử của nó tƣơng tự nhƣ p-aminobenzoic acid (PABA) là cần thiết trong các vi khuẩn sinh vật, nhƣ một chất nền của enzym dihydropteroat cho sự tổng hợp của acid tetrahydrofolic (THF). Cơ chế tác dụng kìm khuẩn của SAs là do nó cạnh tranh với acid PABA trong tế bào vi khuẩn, làm cho việc tổng hợp và vận chuyển acid folic (động vật có vú dùng acid folic có trong thực phẩm còn vi khuẩn phải tổng hợp folic) thành nucleoprotein cần cho mọi tế bào sống của vi khuẩn bị ngƣng trệ, gây rối loạn sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn. PABA kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic để tạo pteroylglutamic acid (PGA), chất này nhƣ một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin. PGA cũng là một phần của phân tử B12 có liên quan tới sự biến dƣỡng acid amin và purin. Do đó khi thiếu 15
PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic. Điều này cũng giải thích tại sao các vi khuẩn tự tổng hợp đƣợc PABA thì đề kháng với SAs và tại sao thymin, purin, methionin, và một số amin khác lại đối kháng hiệu quả với SAs. Do đó vi khuẩn bị tiêu diệt trƣớc sức đề kháng của cơ thể hoặc nhờ tác dụng của thuốc.. Chúng đƣợc sử dụng trong phòng và điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn, đái tháo đƣờng, phù, tăng huyết áp, và bệnh gút… Các sulfonamid có tác dụng kháng khuẩn cho hệ miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong loại trừ tận gốc sự nhiễm trùng. Sulfonamid có hiệu quả cao trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng cấp tính vì giai đoạn này vi khuẩn có mức biến dƣỡng cao, dễ kết hợp với Sulfonamid, thêm vào đó khả năng thực bào còn mạnh và sự khuếch tán của thuốc chƣa bị cản trở bởi quá trình xơ hóa trong viêm mãn tính. Chúng có khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm, Protozoa [9].  Tác dụng phụ của SAs: Các loại SAs đƣợc các nhà sản xuất đƣa vào trong thức ăn gia súc, gia cầm, các thuốc chống mốc, thuốc chống oxy hóa giúp sinh vật tăng sức đề kháng, phòng trị nhiễm khuẩn đồng thời giống nhƣ một chất kích thích tăng trƣởng đem lại lợi ích cho ngƣời chăn nuôi. Tuy nhiên những năm gần đây xảy ra hiện tƣợng kháng kháng sinh và tồn dƣ kháng sinh trong thịt, cá, tôm…do ngƣời nông dân sử dụng không đúng cách và quá nhiều thuốc kháng sinh và không đảm bảo thời gian ngƣng sử dụng trƣớc khi thu hoạch, làm cho kháng sinh tích tụ trong thịt. Khi ngƣời tiêu dùng sử dụng thực phẩm có chứa dƣ lƣợng kháng sinh SAs trong thịt, tôm, cá, trứng, sữa...sau một thời gian dài sử dụng chúng sẽ tích lũy trong cơ thể, có thể gây hiện tƣợng kháng kháng sinh ở ngƣời, làm mất đi cả vi khuẩn có lợi, ngoài ra SAs dễ bị acetyl hóa ở gan thành N4- acetyl sulfonamid khó tan trong nƣớc, đồng thời từ quản cầu thận tới ống dẫn tiểu, SA đƣợc làm đậm đặc 50 lần, sự bài tiết H+ vào ống thận làm nƣớc tiểu càng acid hơn, giảm tính tan của sulfonamid từ đó trở thành tinh thể trong ống thận, gây hiện tƣợng kết tinh ở đƣờng tiết niệu gây viêm thận và sỏi thận, tiểu ra máu. Sulfonamid có khả năng gây ra một loạt các phản ứng bất lợi, bao gồm cả rối loạn đƣờng tiết niệu, rối loạn tạo máu , rối loạn chuyển hóa porphyrin, và 16
phản ứng quá mẫn cảm. Khi sử dụng với liều lƣợng lớn, chúng có thể gây ra phản ứng dị ứng mạnh mẽ. Hai hội chứng nghiêm trọng nhất là hội chứng Stevens- Johnson và hoại tử biểu bì độc hại (cũng đƣợc gọi là hội chứng Lyell). SAs hấp thu tốt qua đƣờng tiêu hóa, ngoại trừ các SAs có tác động tại chỗ. 1.1.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid SAs là một trong những nhóm chất lâu đời nhất của các hợp chất kháng khuẩn. Chúng đƣợc sử dụng lâm sàng trong 50 năm và lần đầu tiên đƣợc đăng ký tại Úc năm 1940. Tại nhiều quốc gia, việc sử dụng SAs trong chăn nuôi đƣợc xem xét trên nhiều khía cạnh nhƣ dƣ lƣợng còn lại trong thịt sau giết mổ, mức độ ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời…trở thành vấn đề khá nhạy cảm trong thƣơng mại quốc tế. Tại Hoa Kỳ, trong suốt 25 năm, dƣ lƣợng SAs trong thịt gia súc, đặc biệt là trong thịt lợn, thịt bê và thịt gia cầm rất cao là vấn đề đƣợc quan tâm bởi mức độ tồn dƣ vi phạm nhiều hơn bất cứ một loại thuốc kháng sinh nào khác. Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) bắt đầu tiến hành điều tra các SAs trong đầu những năm 1970, và tiến hành thủ tục thu hồi đối với sulfadimidine (SA đƣợc sử dụng rộng rãi nhất), bởi nó đã đƣợc chứng minh gây ra khối u cho động vật. Năm 2009 chƣơng trình kiểm soát dƣ lƣợng Hoa Kỳ (viết tắt là U.S. NRP) [25] tiến hành kiểm tra 17.241 mẫu thịt gia súc, gia cầm phân tích 128 hợp chất thuốc thú y và thuốc trừ sâu thì mẫu có chứa SAs có tỉ lệ cao nhất, trong tổng số 2496 mẫu kiểm tra SAs có tới 0,24% mẫu vi phạm. Kết quả phân tích trên gan các loài gia súc gia cầm trong 101 mẫu gan lợn và 99 mẫu thịt lợn quay có hai mẫu vi phạm hàm lƣợng trong khoảng 1,01-2,51 ppm, lấy 53 mẫu gan bê phân tích có một mẫu nhiễm hàm lƣợng lên tới 0,31-0,5 ppm. Một mẫu gan lợn nhiễm sulfamethazine lên tới 2,39 ppm và một mẫu nhiễm sulfadimethoxine trong thịt bò là 0,38ppm. Tại Việt Nam, kháng sinh đƣợc sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản với mục đích kích thích tăng trƣởng, phòng và điều trị bệnh. Mới đây, trên website của Cục Quản lý chất lƣợng nông lâm thủy sản, trong các báo cáo 17
Kết quả thực hiện chƣơng trình kiểm soát dƣ lƣợng các chất độc hại hàng tháng [1] cho thấy: trong tháng 2, tiến hành kiểm tra 250 mẫu phát hiện dƣ lƣợng nhóm Sulfonamid có Sulfadimidine hàm lƣợng 4,18 ppb và Sulfadiazine là 4,16 ppb trên 1 mẫu cá lóc thƣơng phẩm tại vùng nuôi Vị Thủy (Hậu Giang), kết quả phân tích 400 mẫu vào tháng 3 phát hiện dƣ lƣợng Sulfadimidine là 123,26 ppb và Sulfadiazine có hàm lƣợng 15,26 ppb trên 1 mẫu cá rô đồng thƣơng phẩm tại tỉnh Hậu Giang. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi rất phổ biến, khi dƣ lƣợng kháng sinh trong các sản phẩm thịt cao, thì hậu quả tất yếu là chất lƣợng thịt kém, không đáp ứng đƣợc yêu cầu của thị trƣờng, điều này ảnh hƣởng không nhỏ tới xuất khẩu. 1.1.6 Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm Giới ha ̣n tồ n dƣ tố i đa (MRL – Maximum Residue Limit ) của từng loại kháng sinh cho phép sử dụng đối với từng loại thực phẩm có thể đƣợc qu y đinh ̣ rấ t khác nhau ở các nƣớc , căn cƣ́ vào đă ̣c điế m sinh lý , sinh thái, nhấ t là đă ̣c điể m dinh dƣỡng, thói quen ăn uống của ngƣời dân từng nƣớc . Qua tham khảo một số tài liệu [7, 11, 12] có mức MRL nhƣ bảng dƣới đây. Bảng 1.2: Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép đối với SAs tại một số thị trƣờng Nƣớc Đối tƣợng MRL (µg/kg) Liên minh Châu Âu Thịt, gan gia súc, gia cầm 100 (EU) Thủy hải sản Thịt, gan, thận Hoa Kì 100 Thủy hải sản Thịt, gan, thận Việt Nam 100 Thủy hải sản 18
Thịt, gan , thận 20 Nhật Bản Sữa 10 Thịt, gan, thận Hàn Quốc 10 Thủy hải sản 1.2 Các phƣơng pháp xác định SAs Vấn đề tồn dƣ kháng sinh SAs trong thực phẩm đã và đang đƣợc nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm. Rất nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu nhóm kháng sinh này bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau trên các đối tƣợng nhƣ thịt, sữa, trứng, mật ong, nƣớc thải… Dƣới đây là một số phƣơng pháp phổ biến đã đƣợc tiến hành thực nghiệm và ban hành thành tiêu chuẩn. 1.2.1 Trong nƣớc Tổng Cục Tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng đã ban hành TCVN 8345-2010 [10] xác định 10 SAs (bao gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin, sufamethoxypiridazin, sulfacloropyridazin, sulfadoxin, sulfamethoxazol, sulfadimethoxin và sulfachinoxalin) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Các chất nhóm SAs có trong mẫu sản phẩm thủy sản đƣợc chiết tách bằng hỗn hợp axetonitril và diclometan. Dịch chiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch fluorescamin để tạo dẫn xuất huỳnh quang. Hàm lƣợng các dẫn xuất đƣợc xác định trên hệ thống HPLC pha đảo: cột C18, pha động: dung dịch H3PO4 0,02 M, acetonitril, metanol theo chƣơng trình gradient, phát hiện và định lƣợng bằng detector huỳnh quang tại bƣớc sóng kích thích Ex: 405 nm và bƣớc sóng phát xạ Em: 495 nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp nhỏ hơn 5 g/kg 1.2.2 Thế giới 1.2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV 19
Phƣơng pháp sắc ký lỏng rất phù hợp cho việc xác định SAs nên nó đƣợc sử dụng rộng rãi. Các tác giả nghiên cứu bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng trên nhiều loại detector khác nhau. Trong đó detector UV là loại detector thông dụng nhất. Chất phân tích sau khi đƣợc tách khỏi cột sắc ký, dẫn vào flowcell đo đƣợc chiếu bởi một chùm tử ngoại. Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert- Beer. Tác giả Rodrigo H.M.M. Granja [20] và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV để xác định 3 SAs trong mật ong. Các SAs đƣợc chiết từ mật ong với diclometan sau khi đƣợc hòa tan với NaCl 30%, làm sạch qua cột chiết pha rắn Florisil. Dịch rửa giải đƣợc phân tích trên hệ thống HPLC: cột C18 (4µm×3.9mm×150mm), pha động: Natri acetate 0,005mol/L, pH 4,5 (kênh A), metanol (kênh B), acetonitril (kênh C) theo chƣơng trình gradient; detector UV tại bƣớc sóng 280nm. Giới hạn phát hiện lần lƣợt là: sulfathiazole: 3µg/kg, sulfamethazine: 4µg/kg và sulfadimethoxine: 5µg/kg. Hiệu suất thu hồi lần lƣợt là: 61% (sulfathiazole), 94,5% (sulfamethazine) và 86% (sulfadimethoxine). Tác giả W. Hela [24] và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp HPLC với detector DAD để xác định 12 SAs trong thịt, gan, thận động vật (lợn, bò, gà). Mẫu đƣợc đồng nhất với acetonitril, loại béo với n-hexan, làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi cation OASIS MCX. Dịch rửa giải đƣợc bơm vào hệ thống HPLC-DAD: cột Phenomenex Luna C18 (250×2mm; 5µm) , pha động: amoni acetate 0,01M ; pH 4,6 (kênh A) và acetonitril (kênh B) theo chƣơng trình gradient. Detector DAD tại bƣớc sóng 260nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 1ppb cho tất cả các SAs. Sử dụng bƣớc sóng 270 nm phân tích trên đối tƣợng mẫu sữa bò tại Hàn Quốc nhóm nghiên cứu Hyun-Hee Chung, Jung-Bin Lee,Yun-Hee Chung [15] qua kiểm tra 269 mẫu sữa phát hiện có 21 mẫu nhiễm kháng sinh SAs. Trong đó sulfamethazine lên tới 12ng/g vƣợt quá giới hạn cho phép. Nhóm tác giả Nancy T. Malintan [18] xác định 8 SAs trên đối tƣợng mẫu nƣớc tiểu của lợn tại Malaysian. Mẫu đƣợc làm sạch, làm giàu bằng chiết qua cột 20