intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:77

Thêm vào BST
Báo xấu
152
lượt xem 19
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước ta, phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, tập trung nhiều ở các tỉnh miền Trung đặc biệt là Hà Tĩnh và Quảng Nam. Cây dó bầu mang lại giá trị kinh tế rất lớn với mục đích chủ yếu là khai thác trầm hương, một mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, trong dược liệu, trong tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ. Luận văn sau đây nhằm nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh

  1. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu LỜI CẢM ƠN Để  hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm  ơn PGS. TS. Chu   Hoàng Hà, Trưởng Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học,   Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi. Tôi cũng xin cảm  ơn GS. TS. Lê Trần Bình, TS. Phạm Bích Ngọc, TS. Vũ   Huyền Trang, NCS. Đỗ Tiến Phát cùng tập thể Phòng Công nghệ tế bào thực vật   đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin gửi lời cảm  ơn đến các thầy, các cô trong Khoa Sinh học, Trường   Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học   tập. Cuối cùng tôi xin bày tỏ  lòng cảm  ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn luôn   động viên tinh thần để tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, tháng 01 năm 2012 Học viên Hoàng Đăng Hiếu i
  2. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu MỤC LỤC Trang  MỞ ĐẦU                                                                                                                      ..................................................................................................................      1  Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU                                                                           .......................................................................      3  1.1. Tổng quan về cây dó bầu                                                                                  ..............................................................................      3  1.1.1. Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố của cây dó bầu                               ...........................      3  1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây dó bầu                                                       ...................................................      4  1.1.3. Giá trị kinh tế và sinh thái của cây dó bầu                                                 .............................................      6  1.1.4. Thực trạng trồng và khai thác cây dó bầu trong nước và trên thế giới    8   1.1.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới khả năng tạo trầm nhân tạo                         .....................       11 1.2. Một số phương pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan   hệ di truyền                                                                                                             .........................................................................................................       12  1.3. DNA barcode ­ quan điểm mới trong phân loại                                              ..........................................       13  1.3.1. Giới thiệu DNA barcode                                                                           ......................................................................       13  1.3.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode                                              ..........................................       15  1.4. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật 16      1.4.1. Trình tự gen nhân                                                                                      ..................................................................................       16  1.4.2. Vùng gen mã hóa ribosome                                                                       ...................................................................       17  1.4.3. Trình tự gen luc lạp                                                                                   ...............................................................................       18 Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục   lạp                                                                                                                       ...................................................................................................................       18  1.4.4. Trình tự gen rbcL                                                                                       ..................................................................................       19  1.4.5. Trình tự gen matK                                                                                     .................................................................................       20  1.4.6. Trình tự gen rpoB và rpoC1                                                                       ...................................................................       20  1.4.7. Trình tự gen ycf5                                                                                       ...................................................................................       20  1.4.8. Trình tự hai gen trnH­psbA                                                                       ...................................................................       21  1.4.9. Trình tự hai gen trnL(UAA)­trnF(GAA)                                                   ...............................................       21  1.5. Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật                                              ..........................................       22 ii
  3. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu 1.6. Một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế   giới                                                                                                                          ......................................................................................................................       23  Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP                                                            ........................................................       25  2.1.Vật liệu                                                                                                             .........................................................................................................       25  2.1.1. Thực vật                                                                                                    ................................................................................................       25  Bảng 2.1. Thông tin về các mẫu dó bầu dùng trong nghiên cứu                       ...................       25  2.1.2. Chủng vi khuẩn                                                                                         .....................................................................................       26  2.1.3. Hóa chất                                                                                                    ................................................................................................       26  2.1.4. Máy móc thiết bị                                                                                       ...................................................................................       26  2.1.5. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu                                                    ................................................       27  Bảng 2.2.Trình tự các cặp mồi nhân bản gen barcode                                       ...................................       27  2.2. Phương pháp nghiên cứu                                                                                 .............................................................................       27  2.2.1. Các bước nghiên cứu                                                                                ............................................................................       27  2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu                                                                    ................................................................       27  Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm rửa                                                         .....................................................       28  Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách                                                        ....................................................       28  Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR                                                               ...........................................................       29  Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR                                                                       ...................................................................       29  Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ligase                                                              ..........................................................       31 Bảng 2.8. Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái   tổ hợp                                                                                                                  ............................................................................................................       32  Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc                               ...........................       33  Bảng 2.10. Chu kỳ phản ứng PCR­ clony                                                          ......................................................       34  Bảng 2.11. Thành phần hóa chất tách plasmid                                                   ...............................................       34  Bảng 2.12. Thành phần hóa chất dùng trong phản ứng cắt enzyme                 .............       35  Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN                                                                   ...............................................................       37  3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số                                                ............................................       37  3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR                                      .................................       38 iii
  4. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu                                                                                                                            38 .........................................................................................................................      3.3. Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu                                       ...................................       40  3.3.1. Kết quả nhân bản gen rbcL                                                                      ..................................................................       40  3.3.2. Kết quả nhân bản gen rpoB                                                                      ..................................................................       41  3.3.3 Kế quả nhân bản gen psbA­trnH                                                               ...........................................................       41  3.3.4. Kết quả nhân bản gen ITS                                                                        ....................................................................       42  3.4. Kết quả tách dòng gen                                                                                     .................................................................................       43  3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel)                                             .........................................       43  3.4.2. Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng                                                ............................................       44  3.4.3. Kêt quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli                  ..............       44  3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp                                  ..............................       45  3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp                                                      ..................................................       46  3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp                                                  ..............................................       47  3.5. Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị              .........       48  3.5.1. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen trn­psbA                                ............................       49  Bảng 3.2. So sánh trình tự vùng trnH­psbA intergenic lục lạp                          ......................       50  3.5.2. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen rpoB                                      ..................................       52  Bảng 3.3. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB                                             .........................................       53  3.5.3. Kết quả xác định và phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL                 .............       55  Bảng 3.4. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL                                              ..........................................       57  Bảng 3.5. Vị trí sai có thể khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng rbcL   58   3.5.4. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen ITS                                        ....................................       59  Bảng 3.6. So sánh trình tự vùng gen ribosom ITS                                              ..........................................       61  Bảng 3.7. Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS           62 ......       KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ                                                                                     .................................................................................       65  TÀI LIỆU THAM KHẢO                                                                                           .......................................................................................       66 iv
  5. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu DANH MỤC BẢNG Trang  Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp   18   Bảng 2.1. Thông tin về các mẫu dó bầu dùng trong nghiên cứu                               ...........................       25  Bảng 2.2.Trình tự các cặp mồi nhân bản gen barcode                                              ..........................................       27  Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm rửa                                                                 .............................................................       28  Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách                                                                ............................................................       28  Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR                                                                       ...................................................................       29  Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR                                                                               ...........................................................................       29  Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ligase                                                                      ..................................................................       31 Bảng 2.8. Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ   hợp                                                                                                                              ........................................................................................................................       32  Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc                                       ...................................       33  Bảng 2.10. Chu kỳ phản ứng PCR­ clony                                                                  ..............................................................       34  Bảng 2.11. Thành phần hóa chất tách plasmid                                                           .......................................................       34  Bảng 2.12. Thành phần hóa chất dùng trong phản ứng cắt enzyme                         .....................       35  Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu            38 .......       Bảng 3.2. So sánh trình tự vùng trnH­psbA intergenic lục lạp                                  ..............................       50  Bảng 3.3. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB                                                     .................................................       53  Bảng 3.4. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL                                                      ..................................................       57  Bảng 3.5. Vị trí sai có thể khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng rbcL            ........       58  Bảng 3.6. So sánh trình tự vùng gen ribosom ITS                                                      ..................................................       61  Bảng 3.7. Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS                  ..............       62 v
  6. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu DANH MỤC HÌNH Trang  Hình 1.1. Lá cây dó bầu                                                                                                ............................................................................................      3  Hình 1.2. Hoa và quả cây dó bầu                                                                                  ..............................................................................      6  Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT                                                                                        ....................................................................................       31  Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu dó bầu nghiên cứu          38 .....      Hình 3.2. Kết quả chạy PCR ­ gradient của chỉ thị rpoB  ở các ngưỡng nhiệt độ từ 49oC tới 58oC                                                                  .............................................................       39 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rbcLcủa các mẫu dó bầu nghiên   cứu                                                                                                                              ..........................................................................................................................       41 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rpoB của các mẫu dó bầu nghiên   cứu                                                                                                                              ..........................................................................................................................       41 Hình 3.5.Kết quả điện di sản phẩm PCR gen psbA­trnH của các mẫu dó bầu   nghiên cứu                                                                                                                   ...............................................................................................................       42 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen ITS của các mẫu dó bầu nghiên   cứu                                                                                                                              ..........................................................................................................................       42  Hình 3.7. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB                                              ..........................................       43  Hình 3.8. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến                          ......................       44  Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR ­ clony khuẩn lạc mồi rbcL                   ...............       45  Hình 3.10. Kết quả điện di plasmid tách chiết                                                          ......................................................       46  Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI mồi rbcL.             .........       47  Hình 3.12. Cây phân loại giữa trên kết quả mồi ITS                                                 .............................................       63 vi
  7. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid IPTG Isopropylthio­beta­D­galactoside ITS­rDNA Internal Transcribed Spacer­rDNA Kb Kilobase LB Luria Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rDNA Ribosome deoxyribonucleic acid RAPD Random Amplyfied Polymorphism DNA RFLP  Restriction Fragment Length Polymorphism  Rnase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate Sol Solution STS Sequence­Tagged Site TAE Tris ­ Acetic acid ­ EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TE  Tris ­ Ethylenediaminetetraacetic acid X­gal X ­ 5 ­ brom ­ 4 ­ chloro3 ­ indolyl ­ β ­ D ­ galactosidase vii
  8. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu MỞ ĐẦU Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của  nước ta, phân bố rải rác từ  Bắc tới Nam, tập trung nhiều  ở các tỉnh miền Trung   đặc biệt là Hà Tĩnh và Quảng Nam. Cây dó bầu mang lại giá trị  kinh tế  rất lớn   với mục đích chủ  yếu là khai thác trầm hương, một mặt hàng có giá trị  kinh tế  cao sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, trong dược liệu, trong tôn giáo, chế tác  đồ thủ công mỹ nghệ. Ở  nước ta hiện đã phát hiện ra 6 loài dó bầu phân bố  rải rác trong rừng  rậm nhiệt đới thường xanh,  ẩm nguyên sinh:  A. crassna  (Dó bầu, Dó tía, Dó  trắng), A. baillonii  (Dó Gạch),  A. rugosa  (Dó Quả  Nhăn),  A. malaccensis  (Dó Mã Lai), A. sinensis (Dó Trung Quốc), A. banaensis (Dó Bà Nà). Trong đó A. crassna là loài  được trồng phổ biến nhất do có khả năng tạo ra loại trầm  Kỳ tốt nhất thế giới.  Tuy nhiên, hiện nay các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa   chọn giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm  của mỗi cá nhân, dẫn đến năng suất và chất lượng trầm thu được không ổn định.   Do vậy, việc chọn lọc giống cây ban đầu để  đưa vào triển khai là hết sức quan   trọng và là nhiệm vụ  cấp thiết trong công tác bảo tồn, khai thác và phát triển   nguồn gen quý.  Hiện nay phương pháp DNA barcode là một trong những công cụ phục vụ  định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng  DNA chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode). Việc   xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực   vật [16] trong đó có dó bầu  ở  Việt Nam [18] khi những quan sát hình thái, sinh   trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài.  Xuất phát từ những yêu cầu đặt ra như vậy chúng tôi quyết định thực hiện  đề  tài “Sử  dụng các kỹ  thuật sinh học phân tử  trong phân tích đa dạng và  1
  9. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh.” 2
  10. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây dó bầu 1.1.1. Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố của cây dó bầu Cây dó bầu (Aquilaria sp.) là một trong những loài thực vật có giá trị  kinh  tế cao. Ở Việt Nam, cây dó bầu phân bố rải rác từ  Bắc tới Nam, có nhiều ở các  tỉnh miền Trung. Cây dó bầu có rất nhiều tên gọi tùy theo mỗi địa phương như:  cây Trầm Hương, Dó Trầm, Dó Bầu Hương, cây Tóc [43].  Cây dó bầu thuộc chi trầm  Aquilaria, họ  Thymeleaceae, bộ Thymelaeales,  lớp cây gỗ lớn Magnoliopsida, ngành Mộc Lan Magnoliophyta [41], [42]. Hình 1.1. Lá cây dó bầu Chi Trầm Aquilaria gồm 24 loài khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 loài có khả  năng   cho   trầm   hương   gồm:  Aquilaria   crassna;   A.   baillonii;   A.   sinensis   hoặc A.   chinesis;   A.   borneensis;   A.   Malaccensi;   A.   gollocha;   A.   hirta;   A.   rostrata; A.   beccariana;   A.   cummingiana;   A.   filaria;   A.   khasiana;   A.   microcarpa; A. grandiflora; A. bancana; A. Rugosa.  Trong đó loài  A. rugosa  mới đây được TS. Lê Công Kiệt và TS. Paul Kessler người Hà Lan phát hiện năm 2005 [18]. Trên thế  giới, chi trầm phân bố  chủ  yếu  ở  khu vực nhiệt đới từ   Ấn Độ  đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc.  Ở nước ta, dó bầu phân bố  rải rác   3
  11. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu trong   rừng  rậm   nhiệt   đới   thường   xanh,   rừng   ẩm   nguyên  sinh  thuộc   các   tỉnh  Tuyên Quang, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng   Trị,   Thừa   Thiên   Huế,   Quảng   Nam,   Đà   Nẵng,   Quãng   Ngãi,   Bình   Định,   Ninh  Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc  [42]. Trong số các loài có khả năng tạo trầm thì  Aquilaria crassna là loài cây nổi  tiếng có khả năng tạo ra loại trầm kỳ tốt nhất thế giới [5]. 1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây dó bầu Dó bầu là một loại cây gỗ  thường xanh, cao 20 ­ 30 m, đường kính thân  đạt 60 ­ 80 cm, thân thường thẳng, đôi khi có rãnh dạng lòng máng, vỏ  ngoài  nhẵn, màu nâu xám, thịt vỏ  màu trắng có nhiều chất xơ  (cellulose), nứt dọc lăn   tăn, dễ  bóc và tước ngược từ  gốc lên, cành mảnh, cong queo, màu nâu nhạt, có  lông hoặc nhẵn, tán thưa. Lá đơn, mọc cách (so le), cuống lá dài 4 ­ 6 mm, phiến  lá hình trứng, bầu dục thuôn đến mác thuôn, kích thước 8 ­ 15 x 2,5 ­ 9 cm, mặt  trên màu lục bóng, mặt dưới nhạt hơn và có lông mịn, gốc lá thon nhọn dần hay   tù; chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tận cùng có mũi, gân bên 15 ­ 18 đôi, thay đổi thất   thường, khá rõ ở mặt dưới. Cụm hoa hình tán hoặc chùm tán, mọc ở nách lá hoặc   ở đầu cành, cuống cụm hoa mảnh, dài 2 ­ 3 cm. Hoa nhỏ, mẫu 5, đài hợp ở phần   dưới, hình chuông, màu vàng lục, trắng nhạt hoặc vàng xám, phía ngoài có lông  thưa; mặt trong gần như nhẵn, có 10 đường gân rõ, tồn tại ở quả, 5 thùy dài hình   trứng thuôn, dài 12 ­ 15 mm. Phần phụ  dạng cánh hoa, gốc bầu có tuyến mật.  Quả  nang gần hình trứng ngược hoặc hình quả  lê, dài 4 cm, đường kính 2,5 ­ 3   cm, có lông mềm, ngắn, có mang dài tồn tại, khi khô nứt làm 2 mảnh, thường   mỗi quả  chỉ có một hạt. Mùa hoa vào tháng 7 ­ 8, quả chín vào tháng 9 ­ 10 [3],   [43]. Dó bầu sinh trưởng rải rác trong rừng thường xanh ẩm nhiệt đới, nguyên  sinh hoặc thứ sinh, trên sườn núi hoặc trên đất bằng ở độ cao 50 ­ 1.000 m có khi   4
  12. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu lên tới 1.200 m so với mặt biển.  Ở nước ta, dó bầu thường phân bố  rải rác trên   sườn núi có độ  dốc nhỏ, thoát nước. Trong quần xã của dó bầu thường gặp các  cây gỗ  lớn: Táu, Huỳnh , Gụ  mật … Đôi khi cũng gặp cây dó bầu mọc trong   rừng thứ sinh cùng các loài Thánh thất, Mò lưng bạc, Bưởi bung, Mít nài và Ràng  ràng. Dó bầu (A. crassna)  ưa đất feralit điển hình, feralit trên núi phong hóa từ  đá kết, đá phiến hay đá granit. Lớp đất mặt trung bình hay mỏng, hơi  ẩm, chua   hoặc gần trung tính (pH vào khoảng từ 4 ­ 6). Tại Malaysia và vùng Đông Bắc  Ấn Độ, dó bầu (A. malaccensis) phân bố  khá rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể trên một hecta. Ở Đông Bắc Ấn Độ, loài dó  bầu này thường mọc rải rác ở độ cao từ 200 ­ 700 m, đôi khi lên tới 1.000 m. Dó   bầu sinh trưởng trong các khu vực có lượng mưa hàng năm thay đổi từ  1.500 ­  6.500 mm, nhiệt độ  trung bình tối đa năm 22 ­ 28 oC. Những kết quả  quan sát  ở  vùng Đông Bắc  Ấn Độ  còn cho biết, loài này phân bố  chủ  yếu trong rừng  ẩm  thường xanh hoặc rừng thường xanh, rất  ít gặp trong rừng nửa rụng lá. Tuy  nhiên, trong thực tế, cây dó bầu trước và sau khi tái tạo trầm vẫn sinh trưởng tốt   ở  những nơi có độ  cao trên dưới 40 m so với mực nước biển.   A. malaccensis  thích ứng với các loại đất phong hóa trên nham thạch, trên các loại đá biến tính,  nhưng cũng sinh trưởng tốt trên đất phong hóa từ sa thạch [42]. Tại Malaysia, từ  lâu đã đưa cây dó bầu vào trồng trọt, những quần thể  rừng trầm A. malaccensis 67 năm tuổi đã có chiều cao trung bình 27 m, và đường   kính thân trung bình 38 cm. Những cây dó bầu có độ trưởng thành 80 năm tuổi tại  miền Đông Bắc  Ấn Độ, có chiều cao cây 25 ­ 30 m, thân to nhất có đường kính  55 ­ 70 cm.  Ở  miền Tây Bắc  Ấn Độ  (Arunachal Pradesh), các quần thể  trầm 8   năm tuổi đã có chiều cao gần 5 m, và đường kính thân gần 30 cm. Cũng  ở  Tây  Bắc Ấn Độ, chúng thường bắt đầu ra hoa, kết quả  ở thời kỳ đạt 7 ­ 9 năm tuổi.   Những cá thể có kích thước trung bình cho năng suất hạt tốt, mỗi cây có thể cho   tới 1,5 kg hạt [42]. 5
  13. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu Các khối trầm thường được tạo thành trong thân cây hoặc trong những   cành lớn, chúng là kết quả của cả một quá trình chuyển hoá các hoạt động bệnh  lý  ở  những nơi bị  bệnh, bị thương… Nấm là một thành phần có tác dụng trong  các hoạt động đó, ngoài ra các côn trùng đục thân cây cũng có thể có mối liên hệ  nào đó. Có giả thuyết cho rằng, trước tiên cây bị nấm gây bệnh tại những chỗ bị  thương làm cho cây bị suy yếu, tiếp đó nấm thâm nhập vào cây và tạo thành các   khối trầm. Nhựa trầm là sản phẩm từ cây hay do nấm tạo ra? Lý giải diễn biến  của quá trình chuyển hóa để tạo thành các hợp chất hóa học trong nhựa trầm thế  nào vẫn còn là vấn đề nan giải và vẫn chưa hiểu biết tường tận [1]. Đến nay đã xác định được nấm Cytosphaera mangiferae có ở trầm của loài  A.   Malaccensis  và   nấm  Melanotus   flavolives  chứa   trong   khối   trầm   từ   loài A. sinensis [42]. Hình 1.2. Hoa và quả cây dó bầu 1.1.3. Giá trị kinh tế và sinh thái của cây dó bầu Giá trị kinh tế quan trọng nhất của cây dó bầu là để khai thác trầm hương.   Từ  thời xa xưa trầm hương đã được coi là sản vật hết sức quí hiếm, ngày nay  trầm hương vẫn là lâm sản ngoài gỗ có giá trị thương mại quốc tế lớn. Trên thế  giới  trầm  hương  được   sử  dụng  để   chưng cất  tinh dầu  trầm,   một  chất  định  hướng quan trọng trong ngành công nghiệp để  sản xuất các loại mỹ  phẩm cao   cấp. Tinh dầu trầm có giá trị  đặc biệt, được dùng trong công nghệ chế biến các  6
  14. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu loại chất thơm, các loại nước hoa cao cấp, giá trị. Trầm hương là sản phẩm văn   hóa vật chất tín ngưỡng tâm linh của dân tộc Việt Nam đã tồn tại từ xa xưa đến  thời nay [9]. Theo CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of  Wild Fauna and Flora ­ Công ước về buôn bán quốc tế những loài động thực vật   hoang dã nguy cấp) khối lượng mua bán trầm hương trên thị trường thế giới thời   kỳ 1995 ­ 1997 khoảng 1.350 tấn. Giá mua bán trầm hương được tính theo kg tùy  thuộc vào chất lượng. Giá bán trầm tại thị trường Dubai (Arabia Saudi) vào năm  1993 giao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại   tốt nhất) [11]. Theo ước tính của Liên hiệp Khoa học sản xuất tinh dầu ­ hương   liệu ­ mỹ  phẩm Việt Nam thì trong những năm từ  1980 đến 1990, khối lượng  trầm hương các loại đã bị  khai thác và xuất khẩu từ  nước ta khoảng 300 tấn.  Trong đó có 2.000 kg trầm từ loại 1 ­ 4 trị giá khoảng 1,5 triệu USD và 300.000   kg Trầm loại 5 ­ 9 trị giá khoảng 4,5 triệu USD; đặc biệt là 200 g kỳ nam loại 1 ­   3 trị  giá 0,5 triệu USD và tới 2.800 kg kỳ  nam loại 4 ­ 8 trị giá 2,52 triệu USD.   Với giá trị  kinh tế  cao, trầm hương đã đem đến những hứa hẹn triển vọng cho   ngành sản xuất lâm nghiệp khi 1 ha trồng cây dó bầu, tạo trầm hương có thể làm  ra giá trị 1,5 ­ 1,8 tỷ đồng/ 10 năm, bình quân giá trị tạo ra 150 ­ 180 triệu/ ha/năm,   trong đó lợi nhuận từ 50 ­ 60 % [11]. Ngoài ra trong y học, trầm hương còn được sử dụng để chữa một số bệnh  hiểm nghèo. Theo Đông y, trầm hương là vị  thuốc quý hiếm, có vị  cay, tính ôn,  vào 3 kinh: tì, vị, thận; có tác dụng dáng khí, nạp thận, bình can, tráng nguyên  dương, chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyễn, lợi tiểu, giảm   đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục… Theo tây y, trầm   hương có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn Mycobacterium  tuberculosis  và  Shigella flexneri,  có tính khánh sinh, tạo kháng thể  mạnh (diệt   khuẩn, làm lành vết thương), có tác dụng chữa một số  bệnh như  bệnh về  tim   mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về  hô hấp (hen suyễn), bệnh về  thần kinh (an   7
  15. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….), bệnh về  tiêu hoá (đau bụng, buồn nôn,   tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện). Đặc biệt, có thể dùng trầm hương để  chữa ung thư tuyến giáp [42]. Cũng giống như  một số cây lâm nghiệp khác, dó bầu là một trong những  cây lâm nghiệp cung cấp nguyên liệu làm giấy có chất lượng cao. Theo các kết   quả  nghiên cứu thực nghiệm nhiều năm của Trung tâm nghiên cứu lâm đặc sản   thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, dó bầu là loài cây thích nghi tốt với  khí hậu nhiệt đới nóng  ẩm mưa nhiều và cho năng suất khai thác khá cao, được  ngành công nghiệp giấy xác định là một trong những nguồn nguyên liệu chính  trong các dự án đầu tư phát triển sản xuất của ngành từ nay đến năm 2010 [6].  Bên cạnh đó đối với môi trường sinh thái và phát triển bền vững thì việc  đưa dó bầu vào cơ cấu cây rừng với mục tiêu 5 triệu hecta rừng tại tỉnh Hà Tĩnh   nói riêng và trong cả nước nói chung đã góp phần thúc đẩy tăng độ  che phủ  của  rừng, chống xói mòn đất và bảo vệ môi trường. Đồng thời góp phần bảo tồn và  phát triển loài cây đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị về khoa học và kinh tế của nước   ta. Đây còn là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi với bảo vệ  môi  trường, kết hợp lợi ích trước mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu trên cơ sở khai thác   và tái tạo lợi thế đặc hữu, ưu việt của tài nguyên quốc gia. Hơn nữa, cây dó bầu  còn có ý nghĩa tạo công ăn việc làm cho người lao động, mở ra hướng phát triển   kinh tế bền vững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa [5]. 1.1.4. Thực trạng trồng và khai thác cây dó bầu trong nước và trên thế giới  Với  giá trị  kinh tế  cao và nhu cầu ngày càng tăng nên trên thế  giới nói  chung và Việt Nam nói riêng, trầm hương tự nhiên bị khai thác đến cạn kiệt [13].   Năm 1994, cây dó bầu được ghi trong công ước quốc tế CITES quy định về việc  buôn bán các sinh vật có nguy cơ tuyệt chủng [31].  ­ Trong nước Theo thống kê của ngành thương mại, nước ta từ năm 1986 ­ 1990 đã khai  8
  16. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu thác và xuất khẩu khoảng 1.163,9 tấn trầm hương. Nhưng cũng giống như  các  nước trên thế giới, số lượng này ngày càng giảm sút, năm 1985 khai thác và xuất   khẩu 216,1 tấn đến năm 1990 chỉ còn 73,4 tấn. Do có giá trị kinh tế cao và những thành công ban đầu trong các nghiên cứu  tạo trầm trên cây dó bầu mà hiện nay, các dự án trồng cây dó bầu đã và đang thu  hút sự quan tâm của các địa phương trên cả nước. Việc nhân giống cây dó bầu và  sản xuất trầm bền vững là một vấn đề cần thiết về mặt kinh tế và xã hội nhằm   đem lại nguồn lợi lớn từ trầm hương đồng thời góp phần bảo vệ môi trường và   ngăn   ngừa   tình   trạng   khai   thác   cây   dó   bầu   trong   tự   nhiên.  Quyết   định  16/2005/QĐ­BNN ngày 15/03/2005 của Bộ NN­PTNT đã cho phép 6 trên 9 vùng  sinh thái cả  nước được trồng rừng sản xuất bằng cây dó bầu. Kết quả  trong  vòng 3 ­ 4 năm gần đây diện tích cây dó bầu tăng nhanh góp phần đa dạng hóa   loại cây trồng rừng và cây đặc sản, hứa hẹn nhiều triển vọng lớn cho nền lâm  nghiệp nói riêng và nền kinh tế nói chung [44]. Theo thống kê của Hiệp hội trầm hương, năm 2002, diện tích trồng cây dó  bầu  ở  các tỉnh phía Nam là 2.340 ha đến năm 2004 đã lên đến 5.527 ha, số liệu   này chủ  yếu do tư nhân trồng cung cấp [7]. Số liệu thống kê của hiệp hội trầm  hương cho thấy chỉ qua 2 năm diện tích trồng cây dó bầu ở các tỉnh phía Nam đã   tăng thêm 70%, đến năm 2007 đã có trên 22 tỉnh, thành trồng cây dó bầu với diện   tích khoảng 15.000 ­ 18.000 ha, phân bố trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam [4]. Tuy nhiên, do diện tích trồng cây dó bầu ngày càng tăng, trong khi đó   nguồn cung cấp hạt giống chủ yếu là những cây dó bố mẹ còn lại trong rừng tự  nhiên và từ  một số  cây trồng vào thập niên 80, 90 của thế  kỷ  XX dễ  dẫn đến   thoái hóa giống. Ngoài ra, phần lớn các cơ sở sản xuất giống cây là của tư nhân,   hạt giống thu hái từ  những cây chưa tuyển chọn đầu dòng hoặc cây chưa thành  thục sinh dục, kỹ  thuật gieo  ươm hạn chế, làm cho chất lượng giống cây còn  những điều đáng lo ngại. Hơn nữa, hiện nay, các loài dó bầu ở  Việt Nam bị  lai   tạp rất nhiều, công tác lựa chọn giống đưa vào trồng dựa chủ  yếu vào quan sát  9
  17. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi cá nhân dẫn đến năng suất và chất lượng  trầm thu được không ổn định.  ­ Trên thế giới Tại Malaysia và vùng Đông Bắc  Ấn Độ, dó bầu (Aquilaria crassna) phân  bố khá rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể trên một hecta. Thái Lan được biết đến  là quốc gia trồng và khai thác trầm hương nổi tiếng. Ở miền đông Thái Lan phát   hiện thấy loài  A. subintegra, theo số  liệu cho biết loài này rất phổ  biến  ở  tỉnh   Trad. Trước đây, do người nông dân không biết khai thác trầm từ loài này nên đã  đem một số loài từ nơi khác về trồng như loài  A. crassna . Vì vậy, hiện nay loài  A. subintegra đã bị lai tạp rất nhiều. Tính đến năm 2003, loài cây này được trồng  rất nhiều  ở  tỉnh Trad và đã trở  thành nơi cung cấp tinh dầu trầm có chất lượng   tốt nhất thế giới. Đồng thời các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều loài có khả năng  tạo trầm thuộc chi Aquilaria đều có nguồn gốc từ các miền Đông­Bắc­Nam của   Thái Lan [15]. Có thể  thấy, nhu cầu trầm hương trên thế  giới ngày càng cao và trầm   hương mua bán trên thị  trường hầu hết là khai thác từ  thiên nhiên. Nhưng một  thực tế cho thấy việc khác thác trầm hương vào những thập niên cuối thế kỷ XX   có tính chất huỷ  diệt cây dó bầu, làm cho nguồn cung cấp trầm hương trên thị  trường ngày càng cạn kiệt. Năm 1993, Indonesia khai thác và xuất khẩu hơn 661  tấn đến năm 1997 con số  ấy chỉ còn 302 tấn; tương tự  như  Indonesia, Malaysia   từ  43,6 tấn còn 21,6 tấn; Campuchia năm 1995 khai thác và xuất khẩu 133,8 tấn  sau 3 năm chỉ  còn 13,2 tấn;  Ấn Độ  năm 1995 xuất khẩu 15,1 tấn đến năm 1997  còn 1,4 tấn. Những số  liệu này cho thấy một thực tế  khối lượng trầm hương   mua bán trên thị trường đang giảm sút nghiêm trọng do cây dó bầu từ thiên nhiên   bị khai thác nặng nề. Yêu cầu cấp thiết đặt ra cho các quốc gia phải có biện pháp  cũng như  kế hoạch trồng và nghiên cứu tạo trầm trên cây dó bầu đảm bảo nhu  cầu lớn của thị trường thế giới [5]. 10
  18. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu 1.1.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới khả năng tạo trầm nhân tạo Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử  gỗ do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…xảy ra   một cách tự nhiên năm này sang năm khác. Khi bị nhiễm bệnh ở một vùng nào đó,  cây sẽ tích tụ nhựa đến đây để tự băng bó vết thương, xem như một khả năng tự  đề kháng để chống lại bệnh nên tạo ra trầm kỳ. Căn cứ vào sự hóa nhựa nhiều  hay ít mà có những sản phẩm như: Tóc, Trầm hương và Kỳ  nam.  Để  sản xuất  trầm hương nhân tạo thách thức lớn nhất là công nghệ tạo trầm, chất lượng cây  giống, các chỉ tiêu về lâm sinh đối với cây dó trồng, sự tương thích giữa các cây  trồng xen, bệnh của cây [43]. Trong đó, dựa trên cơ chế hình thành trầm trong tự nhiên, hiện nay về cơ  bản có 3 kỹ thuật cấy tạo trầm nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên   cứu: Phương pháp vật lý (gây vết thương cơ giới); Phương pháp hóa học (xúc tác  hóa chất); Phương pháp sinh học (xử  lý với men vi sinh). Một số cách tạo trầm  khác như kết hợp một số phương pháp trên với nhau.  Nhìn chung mỗi phương pháp tạo trầm hương cho kết quả  không giống  nhau về số lượng, chất lượng, thời gian và chi phí, nhưng có thể khẳng định con   người đã tạo được trầm hương trên cây dó bầu là rõ ràng. Ngoài ra, các nghiên   cứu tạo các chromone invitro (thành phần chính trong tinh dầu trầm) từ nuôi cấy  huyền phù tế bào của dó bầu đã bước đầu có kết quả [23], [20]. Bên cạnh các nghiên cứu về  các kỹ  thuật cấy tạo trầm nhân tạo, một   hướng nghiên cứu cũng rất quan trọng nhưng còn bị bỏ ngỏ đó là các nghiên cứu   ở  mức độ  sinh học phân tử  quần thể  dó bầu để  xác định nhóm các cá thể  hay  giống dó bầu có khả năng tạo trầm hiệu quả, vì ngay trong tự nhiên không phải   bất kỳ thân cây dó bầu nào cũng có trầm và khả năng tạo trầm, chất lượng trầm   ở  các loài khác nhau cũng là rất khác nhau. Hơn nữa, việc đầu tư  trồng cây dó  bầu đến khi thu hoạch là khá lâu, đòi hỏi thời gian khoảng 7­10 năm (sau 5­7 năm  mới có thể  cấy tạo trầm nhân tạo, và sau 2­3 năm mới có thể  hạ  cây để  thu  11
  19. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu trầm). Trong hội nghị  về  cây trầm hương ngày 24/9/2004 tại thành phố  Hồ  Chí   Minh, các chủ trại trầm cũng đưa ra những băn khoăn về công tác lựa chọn giống   để  có được trầm chất lượng cao, do chất lượng trầm tạo được thật sự  chỉ  tạo  trầm loại 4, loại 5 ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế [5]. 1.2. Một số  phương pháp sử  dụng trong việc định danh loài và xác định  quan hệ di truyền Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định  loài  ở  động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc  như  những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần  nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình   thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với thực vật, đặc điểm hình  thái học của các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân  cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan nhưng chỉ dựa vào thống  kê phân tích một hoặc nhiều tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả  thấp. Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không   còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan   sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng   các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại.  Các phương pháp phân loại học phân tử  và xác định loài là hướng nghiên   cứu được phát triển mạnh trên thế  giới hiện nay, được xây dựng dựa trên việc  nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật.  Hiện nay, các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp có hiệu quả cao   trong việc định loại và giám định loài.  Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen   nhân, hệ  gen của các bào quan như  ti thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen  như  protein, enzyme. Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối  tượng và mục đích nghiên cứu khác nhau. Do đó, việc lựa chọn gen nào, loại  12
  20. Luận văn thạc sĩ Sinh học                                                                           Hoàng Đăng  Hiếu protein nào có ý nghĩa lớn đối với sự thành công của mỗi hướng nghiên cứu. Các  kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzyme), các kỹ  thuật phân tích so sánh trình tự  nucleotide các đoạn DNA như  phương pháp đa  hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism   ­ RFLP), các kỹ  thuật trên cơ  sở  phản  ứng PCR  như  SSR (Simple  Sequence   Repeats),   đa   hình   các   đoạn   DNA   nhân   bản   ngẫu   nhiên   ­   RAPD   (   Random  Amplified Polymorphic DNA) [17], [24], đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân  bản ­ AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), phân tích trình tự  DNA   … [7], [8] đã giúp giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy  đủ  về  tính đa dạng di truyền, quan hệ  chủng loại và tiến hoá của nhiều loài   động, thực vật và vi sinh vật. Thêm vào đó các kỹ thuật này cũng được sử  dụng  như  những chỉ  thị  phân tử  để  xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan  đến tính trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm loài. Gần đây, việc sử  dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để  định danh   loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những  đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài. Để nhận dạng gen hay đánh giá mức  độ  tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử  dụng là gen ribosome   rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA 18S, 5S và 16S  hay được dùng để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật. So với chỉ thị  hình thái và chỉ thị  hoá học, chỉ  thị  DNA cho độ  chính xác cao hơn mà không lệ  thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào. 1.3. DNA barcode ­ quan điểm mới trong phân loại 1.3.1. Giới thiệu DNA barcode  Kỹ thuật DNA barcode (DNA mã vạch) là một tên mới cho một khái niệm  cũ.  Thuật ngữ  “  DNA  mã  vạch  ”  lần đầu tiên được  sử  dụng  vào năm 1993  (Arnon, 1993),  trong một  bài báo mà  không nhận được  sự  chú ý nhiều  từ  cộng  đồng khoa học, và gần đây thuật ngữ này được sử  dụng lại trong nhiều nghiên  13
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.15: Bộ Đồ Án Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Cơ Khí
65 tài liệu
2431 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
3=>0