Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu một số thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây dung lụa – Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don (Symplocaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

---------------------

NGUYỄN QUỐC THẮNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY DUNG LỤA –

Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don (Symplocaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CHUYÊN NGÀNH KỸ THUẬT HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN THU HƯƠNG

Hà Nội - 2017

LỜI CAM ĐOAN

ôi xin cam đoan nội dung trong đề tài luận văn “ Nghiên cứu

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Dung lụa –

T

Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don (Symplocaceae) là công trình

nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần

Thu Hương. Số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung

thực và chưa được bất kỳ tác giả nào công bố.

Hà Nội, tháng 6 năm 2017.

Học viên

Nguyễn Quốc Thắng

Lêi c¶m ¬n

B¶n luËn v¨n nµy ®îc hoµn thµnh t¹i Phßng thÝ nghiÖm Ho¸ häc c¸c

hîp chÊt thiªn nhiªn, Bé m«n Ho¸ häc h÷u c¬, ViÖn Kü thuËt Ho¸ häc,

Trêng §¹i häc B¸ch Khoa Hµ néi vµ Phßng thÝ nghiÖm Ho¹t chÊt sinh häc, ViÖn Hãa sinh biÓn, ViÖn Hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ ViÖt Nam.

§Ó hoµn thµnh b¶n luËn v¨n nµy, t«i ®· nhËn ®îc sù gióp ®ì hÕt søc

nhiÖt t×nh cña c¸c thÇy c« gi¸o, c¸c anh chÞ vµ b¹n bÌ. Qua ®©y t«i xin ®îc bµy

tá lßng kÝnh träng vµ biÕt ¬n s©u s¾c ®Õn:

PGS. TS. TrÇn Thu H¬ng, C« ®· giao ®Ò tµi, lu«n tËn t×nh híng dÉn,

chØ b¶o vµ t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi nhÊt gióp t«i trong suèt qu¸ tr×nh lµm

luËn v¨n.

PGS.TS. NguyÔn TiÕn §¹t, ThÇy ®· lu«n chØ b¶o, híng dÉn t«i mét

c¸ch tËn t×nh trong qu¸ tr×nh thùc hiÖn, gióp t«i hoµn thµnh b¶n luËn v¨n nµy.

T«i xin c¶m ¬n c¸c thÇy, c« gi¸o trong bé m«n Ho¸ h÷u c¬ nãi riªng vµ

c¸c thÇy, c« gi¸o thuéc ViÖn Kü thuËt Ho¸ häc nãi chung ®· híng dÉn, d¹y

b¶o thªm cho t«i nh÷ng tri thøc míi; vµ c¸c anh chÞ thuéc phßng Ho¹t chÊt

sinh häc, ViÖn Hãa Sinh BiÓn ®· lu«n ®éng viªn, gióp ®ì vµ trao ®æi víi t«i

nh÷ng kinh nghiÖm s©u s¾c vÒ chuyªn m«n trong suèt thêi gian qua.

Hµ Néi, th¸ng 6 n¨m 2017

NguyÔn Quèc Th¾ng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................. v

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN ....................................... vii

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN ...................................... viii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN ...................................... ix

LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ......................................................................... 3

1.1 Vài nét về họ Symplocaceae .................................................................... 3

1.2 Chi Symplocos và cây Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don ....... 3

1.2.1 Đặc điểm thực vật .................................................................................. 3

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học chi Symplocos và cây

Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don) ............................... 5

1.2.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Symplocos ............................ 18

1.2.4 Ứng dụng của một số cây họ Dung trong y học dân gian ...................... 20

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .......... 21

2.1 Quá trình chiết thực vật ............................................................................. 21

2.1.1 Chọn dung môi chiết .............................................................................. 21

2.1.2 Quá trình chiết ........................................................................................ 21

2.2 Tổng quan chung về phương pháp sắc ký ................................................. 22

2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký .............................................. 22

2.2.2 Phân loại các phương pháp sắc ký ......................................................... 23

2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất .............................. 24

2.3.1 Phổ hồng ngoại IR .................................................................................. 25

2.3.2 Phổ tử ngoại UV-VIS ............................................................................. 25

2.3.3 Phổ khối lượng MS ................................................................................ 25

2.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ........................................................ 26

iii

2.4 Đo điểm chảy ............................................................................................ 27

2.5 Các phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học cây Dung lụa ............. 28

2.5.1 Tách chiết hợp chất ............................................................................... 28

2.5.2 Xác định tính chất vật lý và cấu trúc hóa học các hợp chất ................... 28

2.6 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học ................................................... 29

2.6.1 Phương pháp thử hoạt tính giảm đau ..................................................... 29

2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm ................................................. 29

2.7 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 31

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM..................................................................... 32

3.1 Điều chế các phần chiết từ cây Dung lụa .................................................. 32

3.2 Phân lập các chất từ các phần chiết ........................................................... 34

3.2.1 Phân tách phần chiết EtOAc .................................................................. 34

3.2.2 Phân tách phần chiết E 1.5 ..................................................................... 34

3.2.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được ............ 38

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 40

4.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được ......................................... 40

4.1.1 Chất SS-1 (betulinic acid) ...................................................................... 40

4.1.2 Chất SS-2 (maslinic acid) ....................................................................... 50

4.1.3 Chất SS-3 (arctigenin) ............................................................................ 60

4.2 Hoạt tính sinh học của cây Dung lụa ........................................................ 77

4.2.1 Hoạt tính giảm đau ................................................................................. 77

4.2.2 Hoạt tính kháng viêm ............................................................................. 77

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN .............................................................................. 81

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐƯỢC CÔNG BỐ ...................................... 82

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................... 83

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Các phương pháp sắc ký:

CC :Sắc ký cột (Column Chromatography)

TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin-layer Chromatography)

Các phương pháp phổ:

MS : Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)

EI-MS : Phổ khối lượng va chạm electron

(Electron Impact Mass Spectroscopy)

ESI-MS : Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử

(Electrospray Ionization Mass Spectroscopy)

APCI-MS

: Phổ khối lượng ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectroscopy)

HR-MS : Phổ khối lượng phân giải cao

(High Resolution Mass Spectroscopy)

IR : Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H-NMR

(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

: Phổ cộng hưởng từ proton

13C-NMR

(Proton Magnetic Resonance Spectroscopy)

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13

(Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

δ(ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (parts per million)

J(Hz) : Hằng số tương tác (Hertz)

s : singlet br s : singlet tù

d : doublet q : quartet

t : triplet m : multilet

Các phương pháp thử hoạt tính sinh học:

: Nồng độ ức chế 50% (50% Inhibitory Concentration) IC50

MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration)

HIV :Virut gây suy giảm miễn dịch ở người

(Human Immunodeficiency Virus)

Các dung môi:

EtOAc : Ethyl acetate

MeOH : Methanol

: Dimethyl Sulfoxide DMSO

Trang DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Phổ 1H-NMR của hợp chất SS-1 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất SS-1 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất SS-1 Phổ 13C-NMR của hợp chất SS-1 Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất SS-1 Phổ DEPT và 13C-NMR của hợp chất SS-1 Phổ DEPT và 13C-NMR giãn của hợp chất SS-1

vii

Hình 1: Một vài hình ảnh cây Dung lụa Hình 2: Cấu trúc hóa học của hợp chất SS-1 (betulinic acid) Hình 3: Hình 4: Hình 5: Hình 6: Hình 7: Hình 8: Hình 9: Hình 10: Cấu trúc hóa học của hợp chất SS-2 (maslinic acid) Hình 11: Phổ 1H-NMR của hợp chất SS-2 Hình 12: Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất SS-2 Hình 13: Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất SS-2 Hình 14: Phổ 13C-NMR của hợp chất SS-2 Hình 15: Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất SS-2 Hình 16: Phổ DEPT và 13C-NMR của hợp chất SS-2 Hình 17: Phổ DEPT và 13C-NMR giãn của hợp chất SS-2 Hình 18: Cấu trúc hóa học của hợp chất SS-3 (arctigenin) Hình 19: Phổ 1H-NMR của hợp chất SS-3 Hình 20: Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất SS-3 Hình 21: Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất SS-3 Hình 22: Phổ 13C-NMR của hợp chất SS-3 Hình 23: Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất SS-3 Hình 24: Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất SS-3 Hình 25: Phổ HMBC của hợp chất SS-3 Hình 26: Phổ HMBC giãn của hợp chất SS-3 Hình 27: Phổ HMBC giãn của hợp chất SS-3 Hình 28: Phổ HMBC giãn của hợp chất SS-3 Hình 29: Phổ HMBC giãn của hợp chất SS-3 Hình 30: Phổ HSQC của hợp chất SS-3 Hình 31: Phổ HSQC giãn của hợp chất SS-3 Hình 32: Phổ HSQC giãn của hợp chất SS-3 4 40 43 44 45 46 47 48 49 50 53 54 55 56 57 58 59 60 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76

Trang

40 50

Bảng 1: Bảng 2: Bảng 3: 61 DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của hợp chất SS-1 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của hợp chất SS-2 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và các tương tác trên HMBC của hợp chất SS-3

Bảng 4: Hiệu quả giảm đau của dịch chiết trên mô hình gây đau bằng 77 acetic acid

viii

Bảng 5: Kết quả hoạt tính kháng viêm của mẫu nghiên cứu 77

Trang DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN

Sơ đồ 1: Quy trình chiết mẫu thực vật và chiết các phân đoạn Sơ đồ 2: Quy trình phân tách phần chiết EtOAc của Dung lụa Sơ đồ 3: Quy trình phân tách phân đoạn E 1.5 33 36 37

LỜI MỞ ĐẦU

Từ nhiều thế kỷ nay các sản phẩm thiên nhiên luôn là nguồn chủ yếu cung

cấp các thuốc chữa bệnh cho con người, trong đó có tới một nửa các dược phẩm

được sử dụng ngày nay bắt nguồn từ các sản phẩm thiên nhiên. Hiện nay các sản

phẩm thiên nhiên vẫn tiếp tục đóng một vai trò trung tâm trong việc phát hiện và

phát triển các dược phẩm mới, do nhiều nguyên nhân, cũng như nhu cầu điều trị

các loại bệnh khác nhau và tính đa dạng đặc biệt cả về cấu trúc hóa học lẫn hoạt

tính sinh học của chúng.

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, có gió mùa nên có hệ thực vật rất

phong phú và đa dạng. Hiện nay, đã có trên 12.000 loài thực vật bậc cao được

thống kê, trong số đó cây làm thuốc chiếm khoảng 26 – 30%. Từ lâu, nhân dân

ta đã biết sử dụng nhiều loài cây cỏ để phòng bệnh và chữa bệnh. Tuy nhiên, có

rất nhiều cây thuốc chỉ mới được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo

y học cổ truyền, mà còn chưa được nghiên cứu về mặt hóa học và hoạt tính sinh

học để có cơ sở khoa học vững chắc cho việc sử dụng một cách hợp lý và có

hiệu quả nhất [1].

Các nghiên cứu của chi Symplocos tới nay đã được công bố, nhưng chủ yếu

tập trung vào thành phần hóa học, còn hoạt tính sinh học của phần lớn các loài

trong chi này thì chưa được nghiên cứu rộng rãi. Trên thế giới, nhiều nước cũng

đã dùng một số loài thuộc chi này như những vị thuốc dân gian để chữa các

bệnh như đắp trị bỏng, chữa sốt, lỵ, ỉa chảy, rong kinh, đau bụng, đau ruột, bệnh

về mắt,…[1].

Qua các nghiên cứu đã công bố, các cây thuộc chi Symplocos có chứa các

lớp chất chính như terpenoid, flavonoid, lignan, phenol, steroid, alkaloid và

iridoid, đây là những lớp chất giàu hoạt tính sinh học. Các terpenoid tách từ các

cây thuộc chi Symplocos có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế bào trong khối

u (antiproliferative). Một số dẫn xuất phenolic glycoside tách được từ các cây

thuộc chi Symplocos cho thấy hoạt động ức chế chống lại nọc rắn độc (phosphodiesterase I).

Cây Dung lụa (hay Dung dẻo) tên khoa học là Symplocos sumuntia Buch.-

Ham. Ex D. Don (Symplocaceae) có các đặc điểm của chi “Symplocos”. Hiện

nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam có rất ít công trình khoa học nghiên cứu

về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây này. Do vậy, việc

thực hiện đề tài là cơ hội để có thể phân lập được các hoạt chất mới và (hoặc) có

hoạt tính sinh học lý thú. Đề tài sẽ góp phần nghiên cứu thành phần hóa học

cũng như hoạt tính sinh học của cây Dung lụa.

Theo hướng nghiên cứu trên, luận văn này có nhiệm vụ:

1. Chiết tách, phân lập một số thành phần hóa học từ các dịch chiết của cây

Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don).

2. Khảo sát cấu trúc các hợp chất phân lập được.

3. Khảo sát hoạt tính sinh học (hoạt tính kháng viêm) của các phần chiết.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

1.1 Vài nét về họ Symplocaceae

Ngành :Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp :Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Bộ :Thạch Nham (Ericales)

Họ :Dung (Symplocaceae)

Chi :Symplocos Dung lụa

Họ Symplocaceae (họ Dung) thuộc bộ Ericales (bộ Thạch nam) chỉ có 1 chi

Symplocos với khoảng 320 loài, có nguồn gốc châu Á, Trung Mỹ và Nam Mỹ.

Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới trừ châu Phi, châu Âu và Tây Á.

Theo các tài liệu tra cứu thì ở Việt Nam hiện nay có khoảng 35 loài thuộc họ

này. Các loài trong họ này thường là cây gỗ hay cây bụi, với các lá đơn, dày, có

khía răng cưa, mọc cách, thiếu lá kèm, thường có màu hơi vàng, khi khô có màu

xanh vàng. Hoa mọc thành cụm với các hoa nhỏ. Có 1 lá hoa và 2 lá hoa con

mọc đối nhau hay mọc ở đỉnh cuống hoa. Cánh hoa hợp sinh tại gốc và bầy nhụy

nhỏ. Đài từ 5 – 2 hợp, tràng 5 – 4 cánh trắng, sớm rụng. Nhị đính thành bó hay

thành ống và đính trên ống tràng, bầu dưới. Quả là loại quả hạch, thường có hình

bầu dục hay hình thoi với vết tích đài chụm rất lớn ở đỉnh [8].

1.2 Chi Symplocos và cây Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Theo các nhà phân loại thực vật chi Symplocos có khoảng 320 loài trong

đó có khoảng 35 loài phân bố ở Việt Nam như Dung đất (Symplocos racemosa),

cây Dung lá táo (S. chinensis), Dung đắng (S. cochinchinensis),…

Cây Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don) còn có tên

dân gian là cây Dung dẻo, Dung trứng, Dung đuôi, Nhỏ la, Mat no (Mọi). Ngoài

ra còn một số tên khoa học khác tương đương như:

Symplocos caudata Wall.ex G. Don, S. botryantha Franh, S. tonkinensis

Brand, S. punctara Brand.

Dung lụa là loại cây bụi hay cây gỗ cao 8m, thân to 25cm, gỗ vàng; nhánh

non không lông. Lá có phiến hơi dai, không lông, dài 7 – 8cm, dầu có mùi, lúc

khô màu lục; cuống dài 5mm. Chùm hoa dài 1,5 – 2cm, hoa có cuống; lá đài có

lông ở mép; tràng 3mm, nhị khoảng 40 bông; bầu 3 ô. Quả xoan bầu dục, dài 6-

10mm, vỏ mỏng, có một hột bên trong. Ra hoa, quả gần như quanh năm [9].

Cây Dung lụa mọc rải rác trong rừng thưa, rừng thứ sinh ở độ cao 1.200

đến 1.700m ở nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Lào,

Campuchia, Thái Lan, Malaysia… Ở Việt Nam, cây phân bố rải rác từ Bắc vào

Nam, mọc nhiều ở các khu vực từ Quảng Nam – Đà Nẵng đến Kontum, Gia Lai,

Đắc Lắc, Lâm Đồng (theo Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam) [9].

Hình 1: Một vài hình ảnh cây Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don)

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã có 28 công

trình công bố liên quan đến thành phần hóa học của chi Symplocos với khoảng

90 hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc. Thành phần hóa học là các lớp

chất flavonoid,lignan, phenolic, steroid, alkaloid và iridoid và nổi bật nhất là

lớp chất triterpenoid.

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học chi Symplocos và cây Dung lụa

(Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don)

1.2.2.1 Thành phần triterpenoid

Triterpenoid là một nhóm chất thuộc lớp chất terpenoid, có công thức phân

tử là C30H48.Thành phần phân tử chứa 6 đơn vị isopren (C5H8) và chứa 6 nối đôi

cô lập. Tất cả các triterpen có cấu tạo mạch thẳng (squalene) hoặc mạch vòng

đều có quan hệ chặt chẽ về cấu trúc với squalene. Các squalen đầu tiên được

phân lập từ dầu gan cá voi và được gọi tên theo nguồn gốc sinh học này, nó

cũng xuất hiện với lượng nhỏ trong động vật có vú khác, tuy nhiên sau đó được

nhận thấy là chất thường gặp [4, 6].

Triterpenoid là lớp chất chính được tìm thấy trong chi Symplocos, lớp chất

này có hoạt tính sinh học quan trọng tuy vậy chỉ một số là có giá trị hấp dẫn đối

với ngành y học, dược học. Những nghiên cứu gần đây cho thấy các triterpenoid

thể hiện các hoạt tính chống khối u và chống HIV. Tuy nhiên trong các sàng lọc

sơ bộ theo hướng nghiên cứu trên, các hợp chất chỉ thể hiện hoạt tính yếu và cần

nghiên cứu thêm [6].

Năm 2004, Pierre và cộng sự đã công bố nghiên cứu phân lập được 34

triterpenoid từ một số loài thuộc chi Symplocos gồm các dẫn xuất có khung

lupane, oleanane, ursane (1-34) [59]. Trong đó có 9 chất mới được phân lập (1-

9) oleanolic axit 3-O-glucuronide bidesmosidic từ vỏ thân S. glomerata và 2

saponin đã biết là salsoloside C (10) và copteroside E (11). Các chất được xác

định cấu trúc bằng phương pháp quang phổ.

Cũng trong năm 2004, Tang và cộng sự đã phân lập từ phần chiết n-BuOH

của rễ cây S. chinensis được 6 triterpenoid saponin và đã đặt tên

symplocososides A – F (12 – 17). Trong số chúng, hợp chất symplocososide A

(12), C (14) và F (17) có tính chống lại một số dòng tế bào ung thư (KB) [35].

Bên cạnh đó 5 dẫn xuất oleanane (18 – 22), 9 dẫn xuất ursane (23 – 31), và

3 dẫn xuất khung lupane (32 – 34) cũng được tìm thấy từ các loài trong chi

HOOC

R1O

R2O

OR3

Symplocos [22, 25, 26, 32, 40, 44, 56, 57].

R1 Xyl Xyl Xyl Ara Ara Xyl Xyl Ara Xyl Xyl R2 H Ac Ac H H Ac Ac Ac H H R3 Ac Ac Ac H Ac Xyl Glc Glc H Xyl 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11

HOOC

O HO

OAc

9

R4 Me

R5 COOGlc

R6 OH

R1 OH

R2 Oglc

18

R3 HOCH2

COOH

19

Oac

COOH

20

21

22

COOGlc

α-OH

β-Oglc

23

HOCH2

β-OH

24

COOH

β-OH

25

HOCH2

COOH

26

HOCH2

COOH

α-OH

β-OH

27

HOCH2

COOH

α-OH

β-OH

28

HOCH2

COOH

β-OH

29

β-Oac

30

HOCH2

COOH

31

R HOCH2 COOH Me

32 33 34

1.2.2.2 Thành phần flavonoid

Flavonoid là các hợp chất dạng polyphenol, đa dạng về cấu trúc hóa học và

hoạt tính sinh học. Chúng có ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt là trong các

tế bào thực vật quang hợp. Các flavonoid không được tổng hợp ở người và động

vật.

Năm 1989, Dhaon và cộng sự đã phân lập được 6 dẫn xuất flavan (35-40),

5 dihydrochalcone glucoside (41-45) và 8 flavonol (46-53) từ các loài của chi

Symplocos. Cùng với đó là công trình nghiên cứu đã công bố của các nhà khoa

R4 H H

R2 OH Oglc Oglc Oglc Oglc

R4 OH OH OH OH OH

R5 H H H OH OH

R3 OH OH H OH OH

học theo trích dẫn [26, 34, 40, 41, 46, 50, 52, 53, 54].

R1 41 Oglc OH 42 OH 43 H 44 OH 45

R2 H H H OH OH OH

R3 α-OH α-OH α-OH Ome Oglc Oglc Oglc

H H H

R5 OH OH OH OH Me OH

R1 35 Oglc 36 OH 37 Oglc 38 Ome 39 OH 40 OH

Oglc

46

Ogal

47

48

Oglc

49

Orha

50

Ogla

51

52

Ome

Ogal(1-4)Gal

53

1.2.2.3 Thành phần lignan

Một dibenzylbutane lignan (54), hai dibenzyltyrolactone lignans (55-56),

được biết đến từ cây S. setchuensis và S. lancifolia. Sáu ditetrahydrofuran

lignans (57-62), hai benzofurans lignans (63-64), và 8-O-4’-neolignan (65),

MeO

được phân lập từ chi Symplocos. [19, 22, 23, 24,26, 59].

54 55: R=H 56: R=Glc

OMe

OR5

OR4

R2O

R1O

OMe

Ome

57

60

Glc

Ome

58

Glc

61

Ome

59

Ome

62

OMe

63: R=Api 64: R=H

OMe

65

1.2.2.4 Thành phần phenolic

Vào khoảng thời gian 2003 – 2004, nhóm nghiên cứu của tác giả Ahmad và

cộng sự đã phân lập được 7 phenolic glycoside mới và 1 phenolic glycoside đã

biết từ cây S. racemora (66-73). Những hợp chất này thể hiện tính ức chế, chống

lại nọc rắn độc có phosphodiesterase I và nucleotide pyrophosphatase

phosphodiesterase của con người [31, 55, 56].

Những dẫn xuất phenol khác (74 – 81) được phân lập từ S. lancifolia, S.

OR5

OR6

R4O

R3O

R2O

OR1

racemosa, và S.caudata [23, 25, 26].

R1 H H H Me

R2 PhCO H PhCO Glc

R3 H H 3,4-(MeO)2C6H3 H

R4 H H H H

R5 H H H H

R6 PhCO PhCO PhCO PhCO

66 67 68 69

PhCO

70

2-OH-3-COOH-C6H3

H H

PhCO PhCO

H H

H PhCO

4-OH-C6H4CO H

71 72

PhCO

73

3,4-(MeO)2C6H3

OMe

COOH

MeO

75

74

COOH

76

77

MeO

OMe

78

OMe

79: R=H 80: R=MeO

OMe

81

1.2.2.5 Thành phần steroid

Năm 1983, Frotan cùng cộng sự đã phân lập được một α-spinasterol (82) từ

cây S. spicata, hợp chất thể hiện khả năng kháng viêm tốt (anti-inflammatory)

với thử nghiệm trên chuột [33].

Năm 2005, Abbasi cùng cộng sự đã phân lập được một số ethyl glucoside [83,

84] từ cây S. rasemosa. Cấu trúc của hai hợp chất này được xác định bằng các

phương pháp phân tích 2D-NMR như COSY, HMQC và HMBC. Hai glucoside

này thể hiện tiềm năng ức chế enzyme lipoxygenase và urease [40, 56].

1.2.2.6 Thành phần alkaloid

Năm 2001, Junko và cộng sự đã khảo sát tính chất của chất harman (87) được

phân lập từ cây S. setchuensis có tác dụng ức chế sự nhân đôi của virut HIV

trong tế bào bạch cầu H9 với liều lượng thích hợp [22].

Tiếp đó, Tschesche và cộng sự đã phân lập từ vỏ cây S. celastrinea chất

caaverin (88) và một chất được chứng minh có cấu trúc giống với N-

methyllaurelliptin và isoboldin. Caaverin được chứng minh qua tương quan và

tổng hợp có cấu trúc giống 5-hydroxy-6-methoxy-noraporphine [45].

1.2.2.7 Thành phần iridoid

Năm 1980, Tanaka và cộng sự đã phân lập được 6-dihydroverbenalin (89) từ

cây S. glauca [53]. Tiếp theo đó vào năm 1990, Junko và cộng sự cũng đã phân

lập được hợp chất verbenalin (90) từ cây S. glauca [20].

82 83: R=H 84: R=Glc

N H

87 85: R=H 86: R=Glc

COOMe

MeO

89: R=OH 90: R= -O

OGlc

N H

88

1.2.2.8 Thành phần hóa học từ cây S. sumuntia

Năm 2005, Jiang và cộng sự đã phân lập thành công 4 phenolic (78-81) từ rễ

cây S. caudata (hay còn gọi là S. sumuntia). Cấu trúc các chất được xác định

bằng các phương pháp quang phổ và phương pháp hóa học khác [23].

Trong năm 2007, Huo và các cộng sự đã xác định và mô tả 4 đồng phân

quang học của các lignan glycoside (65), 1 lignan lactone glycoside, 1

phenylpropanoid glycoside cũng như 2 hợp chất đã biết [16].

Tên và nguồn gốc phân lập được của các hợp chất nêu trên được thể hiện ở

bảng dưới đây:

Stt Lớp chất và tên Nguồn gốc

Triterpenoid

3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→ 4)-O-(2-O-acetyl-β-D- S. glomerata 1

S. chinensis

S. spicata S. racemosa S. setchuensis

S. racemosa glucuronopyranosyl)]-28-O-(β-D-glucopyranosyl) oleanolic acid 3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→4)-O-(3-O-acetyl-β-D- glucuronopyranosyl)]-28-O-(β-D- glucopyranosyl)oleanolic acid 3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→4)-O-(2,3-O-diacetyl-β- D-glucuronopyranosyl)]-28-O-(β-D- glucopyranosyl)oleanolic acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-O-β-D- glucuronopyranosyl)]- 28-O-(β-D-glucopyranosyl)oleanolic acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-O-(2-O-acetyl-β- D-glucuronopyranosyl)]-28-O-(β-D- glucopyranosyl)oleanolic acid 3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)-O-β-D- xylopyranosyl-(1→4)- O-(3-O-acetyl-β-D-glucuronopyranosyl)]-28-O-(β-D- glucopyranosyl)oleanolic acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D- xylopyranosyl-(1→4)- O-(3-O-acetyl-β-D-glucuronopyranosyl)]-28-O-(β-D- glucopyranosyl)oleanolic acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-α-L- arabinofuranosyl- (1→4)-O-(3-O-acetyl-β-D-glucuronopyranosyl)]-28- O-(β-D-glucopyranosyl)oleanolic acid 3β –O-[β-D-xylopyranosyl-(1→4)-O-(2-O-acetyl-β- D-glucuronopyranosyl)-28-O-(β-D- glucopyranosyl)morolic acid Salsoloside C Copteroside E Symplocososide A Symplocososide B Symplocososide C Symplocososide D Symplocososide E Symplocososide F 19α-hydroxyarjunolic acid 3,28-O-bis[glucoside] Oleanolic acid 3-O-acetyloleanolic acid 24-hydroxyolean-12-en-3-one β-amyrin 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

S. spicata S. racemosa 23 24

S. chinensis

S. lancifolia

S. racemosa

S. setchuensis S. racemosa 19α –hydroxyasiatic acid 3,28-O-bis[glucoside] α –amyrin 2β,3β,19α,24-tetrahydroxy-23-norurs-12-en-28-oic acid 3-oxo-19α,23,24-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid 2α,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid 2α,3α,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid Ursolic acid 28-hydroxy-20α-ursa-12,18(19)-dien-3β-yl acetate 3-oxo-20α –ursa-12,18(19)-dien-28-oic acid Betulin Betulinic acid Lupeol 26 27 28 29 30 31 32 33 34

Flavonoid

S. racemosa

S. uniflora 35 36 37

S. racemosa

S. spicata S. lancifolia

S. microcalyx S. vacciniifolia S. confusa

S. lancifolia

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

S. spicata 53

Symposide ( - )-epiafzelechin Symplocoside 5,4’-dihydroxy-7-methoxyflavan-3,4-diol 3-O-β-D- glucofuranoside 5,7-dihydroxy-4’-methoxyflavan-3,4-diol 3-O-β-D- glucofuranoside 5,7,4’-trihydroxyflavan-3,4-diol 3-O-β-D- glucopyranoside Phloridin Trilobatin Confusoside Vacciniifolin Sieboldin quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside Quercetin kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside kaempferol 3-O-α-L-rhamnoside kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside Kaempferol rhamnetin 3-O-β-D-galactosyl-4-O-β-D- galactopyranoside Lignan

( +)-isolariciresinol 54

S. setchuensis S. lancifolia S. setchuensis S. lancifolia Matairesinol Matairesinoside 55 56

(+)-pinoresinol (+)-pinoresinol β-D-glucoside Symplocosigenol (-)-pinoresinol 57 58 59 60

(-)-pinoresinol β-D-glucoside 61

S. setchuensis S. lucida S. glomerata S. glomerata S. lucida S. lancifolia

62 63

64 S. caudata

65 Syringaresinol Symplolignanoside A dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4’-O-β-D- glucoside 7,9,9’-trihydroxy-3,3’-dimethoxy-8-O-4’-neolignan- 4-O-β-D-glucopyranoside

S. racemosa

Phenolic Benzoyl salireposide Salireposide Symploracemoside Symplomoside Symplocomoside Symplonoside Symplososide Symploveroside 1,2-di-O-galloyl-β-D-glucopyranose 4-hydroxy-3,5-dimethoxycinnamic acid 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 S. lancifolia

Gallic acid 76

Ellagic acid S. racemosa 77

(1S,2R )-1-(4-O-β-D-glucopyranosyl-3- methoxyphenyl)-2-(4-hydroxy- 3-methoxyphenyl)propane-1,3-diol

79 S. caudata 3,4-dimethoxyphenol β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranoside

Kelampayoside A 80

81 2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]propane- 1,3-diol 1-O-glucoside

Steroid

α-spinasterol S. spicata 82

β-sitosterol 83

S. racemosa S. caudata β-sitosterol 3-O-β-D-glucoside 84

Stigmasterol 85 S. setchuensis Stigmasterol 3-O-β-D-glucoside 86

Alkaloid

Harman S. setchuensis 87

Caaverine S. celastrinea 88

Iridoid

6-dihydroverbenalin 89 S. glauca Verbenalin 90

1.2.3 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Symplocos

1.2.3.1 Hoạt tính chống tụ máu (Antifirinolytic)

Năm 1989, Dhaon và cộng sự đã đưa ra kết quả nghiên cứu cho rằng trong

phần chiết EtOH từ S. racemora thể hiện hoạt tính chống tụ máu

(antifibrinolytic). Hoạt tính bắt nguồn từ thành phần có trong dịch chiết gồm 2

flavan, symposide (35) và glycone của nó, (-)epiafzelechin (36) [40].

1.2.3.2 Hoạt tính kháng khuẩn, ngăn ngừa nhiễm trùng

Phần dịch chiết MeOH từ lá, rễ, vỏ thân cây S.cochinensis và những phân

đoạn của chúng thu được bằng sự phân lớp các dung môi có độ phân cực khác

nhau (như ete dầu mỏ, CH2Cl2, và EtOAc) đã thể hiện hoạt tính chống vi trùng

và kháng khuẩn. Tất cả những dịch chiết và phân đoạn đều cho thấy khả năng

chống vi trùng, kháng khuẩn [38].

1.2.3.3 Hoạt tính ức chế nọc rắn độc Phosphodiesterase

Trong năm 2003 – 2004, 4 phenolic glycoside (66-69) từ S.racemosa được

đánh giá thể hiện qua tính ức chế nọc rắn độc có phosphodiesterase I. Hợp chất

symploracemoside (68) thể hiện tính ức chế vừa phải với giá trị IC50 là 590µM,

trong khi hợp chất symplomoside (69) thể hiện yếu với giá trị IC50 là 998 µM,

hợp chất benzoyl salireposide (66) thể hiện tính ức chế mạnh (IC50 = 171µM)

[35, 55, 56].

Những nghiên cứu lại gần đây trên cây S .racemosa đã phân lập được ra 4

glicoside mới (70-73). Những glycoside này cũng thể hiện tính chống lại

phosphodiesterase đáng để xem xét [31].

1.2.3.4 Hoạt tính chống HIV

Năm 2001, Ishida và cộng sự đã công bố nghiên cứu phần chiết EtOH từ

cây S. setchuensis có ý nghĩa quan trọng trong các thí nghiệm lặp lại nhiều lần

về khả năng chống lại virut HIV trong các tế bào bạch cầu H9. Tiếp theo đó là

những thử nghiệm trực tiếp lên cơ thể sống của những phần chiết này được gọi

là matairesinol (55) và harman (87) là nguồn gốc của tác dụng chống virut HIV

[22].

1.2.3.5 Hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của các tế bào khối u

Theo một nghiên cứu về phần chiết từ rễ cây S.chinensis cho thấy tính chất

ức chế các tế bào độc hại. Từ các phân đoạn, một ursane triterpenoid (25) thể

hiện tính chất trên một cách đáng kể đặc biệt với tế bào độc hại B16 và BGC-

823. Năm 2004, Tang cùng cộng sự cũng công bố nghiên cứu 5 triterpenoid

saponin được phân lập từ S. chinensis trong đó có hợp chất symplocososide (12)

thể hiện tác dụng gây độc tế bào trên một số dòng tế bào như ung thư biểu mô

người (KB, IC50 1.72µg/ml), ung thư tuyến tụy đường ruột (HCT-8, IC50

4.31µg/ml), ung thư phổi kháng thuốc (A549, IC50 0.67µg/ml), ung thư dạ dày

(BGC-823) và tế bào nguyên sợi phổi ở người HELF (IC50 4.62µg/ml) [36].

1.2.4: Ứng dụng của một số cây họ Dung trong y học dân gian

Trong chi Symplocos có nhiều loài được sử dụng làm thuốc như rễ và hoa

cây Dung lụa được sử dụng để chữa một số bệnh như ho, tê đau phong thấp, lá

dùng trị viêm amygdal cấp tính và lở miệng [1].

Đọt Dung đắng (S. cochinchinensis) đắp trị bỏng. Vỏ cây cây dùng chữa

sốt, lỵ, ỉa chảy, hậu bối.

Vỏ Dung đất (S. racemosa) dùng chữa rong kinh, đau bụng, đau ruột, bệnh

về mắt, loét. Nước sắc còn dùng để làm thuốc súc miệng chữa lợi răng chảy máu

và cũng được dùng để chữa đái đường.

Rễ cây Dung lá táo (S. chinensis) có tác dụng giải cảm sốt, làm long đờm,

khỏi phiền khát. Ở Trung Quốc còn dùng rễ cây này như một vị thuốc chữa cảm

mạo phát sốt, miệng khô, tâm phiền, sốt rét, đau lưng mỏi gối.

Ngoài ra còn cây chè Dung (S. laurina) có tác dụng đặc biệt chữa bệnh dạ

dày, đại tràng, tá tràng, đau bụng, đầy bụng, tiêu chảy, đắp vết bỏng. Trong y

học dân gian Ấn Độ, bột được làm từ vỏ cây chè Dung trộn cùng mật ong được

dùng để chữa các bệnh tiêu chảy, kiết lị, bệnh gan, viêm kết mạc với liều dùng

từ 1 đến 2g – Theo trang y dược Việt Nam [10].

Với những tác dụng phong phú như vậy mà nhiều loài trong chi Symplocos

đã là đối tượng nghiên cứu chính của các nhà khoa học để tìm kiếm thành phần

hóa học, hoạt tính sinh học và tác dụng y – dược của nó.

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1 Quá trình chiết thực vật

2.1.1 Chọn dung môi chiết

Dung môi dùng cho quá trình chiết phải được chọn lựa rất cẩn thận, nó

cần hòa tan các chất nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản

ứng với chất nghiên cứu), không độc hại, khó bốc cháy.

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các

hydrocarbon thế. Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn

lên mang tế bào, do vậy quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng

lớn các thành phần trong tế bào.

Ngược lại, khả năng phân cực của chloroform thấp hơn, có thể rửa các

chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực

cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết với ancol thì

các chất này sẽ bị hòa tan đồng thời. Thường dung môi cồn trong nước có đặc

tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ, thường dùng dung dịch nước của

methanol.

Sau khi chiết, dung môi được tách ra dưới áp suất giảm bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30 ÷ 40oC, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể

thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.

2.1.2 Quá trình chiết

Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau

a, Quá trình chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Soxhlet :

Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất

rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết

kiệm dung môi.

B, Chiết ngâm :

Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra

(chiết nguội). Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình

chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều về thiết bị, kỹ thuật. Việc kết thúc quá

trình được xác định bằng một số cách như sau :

• Với các ankaloid, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này

bằng sự tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như : Dragendorff, Mayer,…

• Với các alkaloid thường là những chất màu, nên khi dịch chảy ra mà

không có chất màu thì cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết.

• Trong trường hợp các lacton của sesquitecpen và các glucozit trợ tim có

thể biểu thị sự xuất hiện của chúng khi cho phản ứng với aniline axetat, sẽ cho

biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể biết khi nào quá trình

chiết kết thúc.

Như vậy tùy thuộc mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi

cho thích hợp, và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao.

2.2 Tổng quan chung về phương pháp sắc ký [2]

2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân

bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh.

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha

động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan).

Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá

trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha

tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất

có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với

các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này ta có thể tách các

chất qua quá trình sắc ký.

2.2.2 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái

khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào

trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn : Sắc ký

khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký người ta chia thành các

phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

a, Sắc ký cột

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm

các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,

ODS, Dianion,… Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột thủy

tinh).

Kích thước hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì khả năng phân tách càng

cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc

độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu trọng lực không đủ lớn sẽ gây

hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó ta phải sử dụng áp suất

(áp suất trung bình – MPC, hoặc áp suất cao – HPLC).

Tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L), L/D phụ thuộc vào yêu

cầu tách – tức là phụ thuộc vào lượng chất và chất cụ thể.

Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên

cột bằng phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến

nhất là tẩm chất lên silica gel rồi làm khô, đến tơi hoàn toàn thì đưa lên cột. Nếu

tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi

chạy cột với lượng thể tích tối thiểu.

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

(1) Nhồi cột khô

(2) Nhồi cột ướt

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ

dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Nếu tốc độ chảy quá thấp sẽ kéo

dài thời gian, ảnh hưởng nhiều đến tiến độ công việc.

b, Sắc ký lớp mỏng (SKLM)

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tích dung dịch chất phân

tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một

chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc

độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở các vị trí khác

nhau. Chất hấp phụ thường được sử dụng trong SKLM là silica gel tráng sẵn

trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Để tiến hành sắc ký, chất tan được chấm lên bản

thành từng vết chấm nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ

dung môi thích hợp trong một bình triển khai kín. Để kiểm tra vết chất có thể sử

dụng thuốc thử hiện màu hoặc soi bằng đèn UV. Thuốc thử hiện màu có thể là

hơi amoniac hoặc dung dịch acid sunfuric 10%. Để hiện vết người ta nhúng bản

vào thuốc thử hoặc phun lên bản mỏng, sau đó hơ bản mỏng trên bếp điện hoặc

sấy nóng để vết xuất hiện từ từ. Phương pháp này được sử dụng để kiểm tra và

định hướng cho sắc ký cột.

Một hình thức SKLM khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu các hợp

chất tự nhiên là SKLM điều chế, dùng để điều chế, thu chất trực tiếp (thường

triển khai khi lượng hợp chất mong muốn là ít). Ở phương pháp này, quá trình

thực hiện tương tự SKLM và sau khi triển khai xong, tiến hành soi UV để xác

định vết chất rồi cạo lấy lớp silica gel chứa chất cần điều chế, tiến hành rửa giải

để thu chất.

2.2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất [3]

Khi đã phân lập được một hợp chất hữu cơ, điều quan trọng là phải xác

định được cấu trúc của chúng. Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ được xác

định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp. Trong một số trường hợp để xác

định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các

phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa học, kết hợp với các phương pháp

sắc kí so sánh,…

2.2.4 Phổ hồng ngoại IR [7]

Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng 10.000 ÷ 100.000 cm-1 và biến thành năng lượng của dao động phân tử.

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa trên sự khác nhau về dao động của các

ong kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại.

Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng

tương đối của nguyên tử, liên kết và vào cấu trúc hình học của chúng. Mỗi kiểu

liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ

hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví

dụ, dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong nhóm hydroxyl là 3300 ÷ 3450

cm-1, của nhóm cacbonyl trong khoảng 1700 ÷ 1750 cm-1.

2.2.5 Phổ tử ngoại UV-VIS [7]

Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến của hợp chất hữu cơ phụ

thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Sự hấp phụ ấy gây ra sự chuyển dịch các

điện tử từ orbitan ở trạng thái cơ bản lên các orbitan có năng lượng cao hơn ở

trạng thái kích thích. Tuy nhiên chỉ có một số dạng cấu trúc trong hợp chất hữu

cơ mới có sự hấp thụ ấy nên việc ứng dụng phổ UV cũng bị giới hạn trong một

số chất mà chủ yếu là các hợp chất có hệ thống nối đôi liên hợp.

2.2.6 Phổ khối lượng MS [7]

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của

phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các peak

ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh

và dựng lại được cấu trúc của hợp chất. Hiện nay có rất nhiều các loại phổ khối

lượng, phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây :

1.Phổ khối lượng va chạm điện tử EI-MS : dựa vào sự phân mảnh ion dưới

tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV.

2.Phổ phun mù điện tử ESI-MS : phổ này được thực hiện với năng lượng bắn

phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là peak ion

phân tử và các peak đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng

thấp, dễ bị phá vỡ.

3.Phổ bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp FAB-MS : với việc bắn

phá nguyên tử nhanh, do đó phổ thu được cũng thường là các peak ion phân tử.

4.Phổ khối lượng phân giải cao HR-MS : cho phép xác định các peak ion

phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.

Ngoài ra hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký

kết hợp với phổ khối lượng khác như : GC-MS (sắc ký khí – khối phổ), LC-MS

(sắc ký lỏng – khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu dụng

khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành

dược).

2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [7]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu

nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai

chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả

cấu trúc lập thể của phân tử.

*Phổ 1H-NMR:

Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học δ của các proton được xác

định trong thang đo ppm, phổ biến trong khoảng 0 ÷14 ppm tùy thuộc vào mức

độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào

những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học δ và tương tác spin mà ta có thể

xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất.

*Phổ 13C-NMR:

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một từ trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo phổ 13C-

NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 ÷230 ppm.

*Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer):

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ

DEPT, tín hiệu của các loại cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135o. Trên phổ DEPT 90o chỉ xuất hiện phổ của các CH.

*Phổ 2D-NMR:

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của

các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 1H-NMR hoặc 13C-NMR. Các tương tác nằm trên

đỉnh các ô vuông trên phổ. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như

*Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) : biểu diễn các

tương tác trực tiếp H-C.

*Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) : Đây là phổ biểu

diễn các tương tác xa giữa C và H trong không gian phân tử (qua 2 hoặc 3 liên

kết). Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như

toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.

2.4 Đo điểm chảy (MP) [7]

Đối với chất rắn kết tinh thì điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan

trọng, nó là tiêu chuẩn để đo mức độ tinh khiết của hợp chất. Nếu điểm chảy của

hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chênh lệch không quá 2-3oC thì có

thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết.

2.5 Các phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học cây Dung lụa

2.5.1 Tách chiết hợp chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên

bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức). Các vết

chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 366 nm, hoặc

dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt

độ cao cho đến khi hiện màu.

Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silicagel

240÷430 mesh, Merck) hoặc pha đảo (ODS-60-14/63, YMC-RP18, Fujisilica-

Nhật Bản).

2.5.2: Xác định tính chất vật lý và cấu trúc hóa học các hợp chất

Điểm nóng chảy được xác định bằng máy Mel-Temp 3.0 (Thermo

Scientific) của Viện Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Độ quay cực được đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter của Viện Hoá

sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ NMR được ghi bằng máy BRUKER AVANCE 500 MHz của Viện Hóa

học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR): 1H-, 13C-NMR, DEPT.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR): HSQC, HMBC.

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: DMSO-d6, CD3OD, CDCl3.

Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên

tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử.

2.6 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.6.1 Phương pháp thử hoạt tính giảm đau [17, 39, 47, 49]

a, Vật liệu

Mẫu nghiên cứu: mẫu cao chiết tổng từ bột cành, lá cây Dung lụa.

Hoá chất: acetic acid, nước muối sinh lý 0.9%, nước cất

Động vật thí nghiệm: Chuột BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, không

phân biệt giống, có khối lượng từ 20- 22g được nuôi tại khu nuôi động vật của

Viện Công nghệ sinh học.

Dụng cụ thí nghiệm: pipet, cân, dụng cụ cho uống, thước kẹp và các thiết bị

phụ trợ khác

b, Phương pháp

Phương pháp xác định hoạt tính giảm đau được tiến hành theo phương pháp

của Shah S. M et al., (2015). Cụ thể như sau: động vật được chia làm các lô (6

con/lô). Tất cả các chuột được tiêm dung dịch acetic acid (10 ml/kg, 0,6%, tiêm

vào xoang bụng) 30 phút sau khi uống dịch chiết nghiên cứu (250 và 500 mg/kg)

hoặc uống nước cất hoặc Aspirin (100 mg/kg). Đếm cơn đau quặn sau 5 phút

tiêm acetic acid và đếm trong thời gian 20 phút. Phần trăm ức chế được xác định

bằng cách so sánh kết quả của nhóm uống dịch chiết với nhóm đối chứng.

2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm [30, 39, 47]

a, Vật liệu

Mẫu nghiên cứu: mẫu cao chiết tổng từ bột cành, lá cây Dung lụa.

Hóa chất: Carrageenin (Sigma), Acetyl salicylic acid (ASA).

Động vật: Chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, đạt

tiêu chuẩn thí nghiệm có khối lượng từ 22-24g.

Dụng cụ thí nghiệm: Kim uống, thước kẹp.

b, Phương pháp

*Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm

Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm được tiến hành theo phương

pháp của Shah S. M et al., (2015).

Bố trí thí nghiệm: 24 chuột chia 4 lô (6 con/lô).

- Lô 1: uống nước 0,2-0,3 ml/con.

- Lô 2: uống Acetic salicylic acid (ASA) liều 100mg/kg.

- Lô 3: uống mẫu liều 250 mg/kg.

- Lô 4: uống mẫu liều 500 mg/kg.

Pha hóa chất và mẫu nghiên cứu: Carrageenin pha trong nước muối ở nồng

độ 1%.

Cách tiến hành: Gây viêm bằng cách tiêm Carrageenin 1% vào mô đệm chân

chuột trước khi uống mẫu hoặc thuốc 1 giờ. Đo độ dày của khối viêm sưng tại

các thời điểm 0.5, 1, 2, 3, 4 và 5 giờ sau khi gây viêm.

*Phương pháp xác định interleukin

Được thực hiện dựa trên ELISA Kit (Abcam) theo đúng hướng dẫn của nhà

sản xuất với các thành phần đi kèm trong bộ kit.

*Thêm 100 µl mẫu thử (huyết thanh chuột thí nghiệm, pha loãng 100 X) vào

các giếng thí nghiệm của đĩa ELISA (trong bộ kit) và 100 µl môi trường DMEM làm đối chứng âm. Ủ bản ở 37oC trong 90 phút.

*Loại bỏ dịch nổi và thêm100 µl kháng thể IL gắn biotin vào các giếng thí

nghiệm. Ủ đĩa ELISA thí nghiệm ở 37oC trong 60 phút.

*Rửa bản 5 lần bằng PBS 0.01M, thêm100 µl Avidin- Peroxidase Complex

vào các giếng thí nghiệm. Ủ bản ở 37oC trong 30 phút.

*Rửa bản 5 lần bằng PBS 0.01M, thêm 90 µl cơ chất TMB vào các giếng thí nghiệm. Ủ bản ở 37oC, tránh ánh sáng trong 20-25 phút. Dừng phản ứng bằng

100 µl stop solution.

*Đọc kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader ở bước sóng

450 nm.

2.7 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu cây Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham ex D. Don) được thu

hái tại vùng núi Tam Đảo, Vĩnh Phúc vào tháng 3 năm 2013. Mẫu cây được

PGS. TS. Trần Huy Thái - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học. Tiêu bản mang ký

hiện BK-B02 và được lưu giữ tại Bộ môn Hoá Hữu cơ, trường Đại học Bách

khoa Hà Nội.

Mẫu cành và lá cây Dung lụa được hong khô ở ngoài không khí, rồi sấy

khô ở 40 oC, sau đó được xay thành bột mịn.

CHƯƠNG 3

THỰC NGHIỆM

3.1 Điều chế các phần chiết từ cây Dung lụa

Phương pháp chiết có một ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các

hợp chất thuộc các lớp chất mong muốn. Các phần chiết giàu mỗi lớp chất nhất

định được điều chế bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi có độ

phân cực tăng dần.

Bột cành lá cây Dung lụa (4kg) được đưa vào bình thủy tinh dung tích 20 lít, ngâm với 10 lít methanol cho ngập mẫu, sau đó sử dụng máy siêu âm ở 40oC

trong vòng 30 phút, để lắng trong khoảng 20 phút sau đó gạn lọc 3 lần lấy phần

dịch chiết. Phần bã tiếp tục được thêm 10 lít methanol để ngâm. Lặp lại quá

trình trên 3 lần. Các dịch chiết methanol được gộp chung lại và cô quay dưới áp

suất giảm để loại bỏ dung môi, thu được 300 g cặn chiết tổng. Phần cặn được

cho thêm 02 lít nước rồi chiết với 1,5 lít n-hexane (lặp lại quy trình 3 lần), gạn

lọc lấy dịch chiết n-hexane rồi cô quay để đuổi dung môi. Phần cặn còn lại được

chiết tiếp với 1,5 lít EtOAc (lặp lại quy trình 3 lần), gộp dịch chiết. Sau đó lọc

thu dịch chiết phân đoạn EtOAc, tiến hành cô quay dưới áp suất giảm để loại bỏ

dung môi thu được phần chiết EtOAc (63,70 g – ký hiệu E) và phần dịch nước.

Quy trình chiết phân đoạn mẫu thực vật được thể hiện ở sơ đồ dưới đây.

Sơ đồ 1: Quy trình chiết mẫu thực vật

Ngâm chiết với 10l MeOH, siêu âm 30’ ở 400C, lặp lại 3 lần. Thu dịch chiết.

Bột cành lá Dung lụa (4kg)

Cất loại dung môi dưới áp suất giảm

Bã Dịch chiết MeOH tổng

Hòa tan cặn chiết bằng 2l nước cất

Cặn chiết

Chiết bằng 1,5l n-hexane x 3 lần

Cặn dịch chiết pha nước

Dịch chiết

Cặn dịch chiết pha nước

n-hexane

Chiết bằng 1,5l EtOAc x 3 lần

Cất loại dung môi

Phần chiết EtOAc (E) 63,70g

Dịch chiết EtOAc

Cặn dịch chiết pha nước

3.2 Phân lập các chất từ các phần chiết

3.2.1 Phân tách phần chiết EtOAc

Kết quả khảo sát trên sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau

cho thấy để phân tách phần chiết EtOAc (E) trên chất hấp phụ này thì hệ dung

môi n-hexane/acetone và hệ dichloromethane/methanol cho kết quả tốt nhất. Vì

vậy tôi lựa chọn 2 hệ dung môi này làm dung môi rửa giải cho sắc ký cột. Hệ n-

hexane/acetone (gradient, 0/100 – 100/0, v/v) và hệ dichloromethane/methanol

(gradient, 10/1-1/10, v/v) được tiến hành kế tiếp nhau.

(Tên các phần chiết E x.y được đặt theo quy tắc: x- số lần phân tách; y-

phân đoạn nhỏ trong lần phân tách x)

Tiến hành phân tách cặn EtOAc (63,70 g) trên cột sắc ký silica gel

(Merch, cỡ hạt 40-63 µm) với hệ dung môi rửa giải n-hexane/acetone (gradient,

0/100-100/0, v/v) và hệ dichloromethane/methanol (gradient, 10/1-1/10, v/v)

thu được 10 phân đoạn từ E 1.1 đến E 1.10.

Phân đoạn E 1.4 (2,36 g) tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký silica gel

pha thường, hệ dung môi dichloromethane/EtOAc có tỷ lệ thể tích 25/1 thu được

các phân đoạn khác nhau ký hiệu là E 2.1 đến E 2.12. Từ phân đoạn E 2.6 thu

được các tinh thể dạng bột, tiếp đó tiến hành rửa chất rắn bằng dichloromethane

thu được một chất tinh khiết, ký hiệu là SS-1 (31 mg).

Quy trình phân tách phần chiết EtOAc được trình bày ở sơ đồ 2.

3.2.2: Phân tách phần chiết E 1.5 (12,8 g)

Phân đoạn E 1.5 (12,8 g) được phân tách trên cột silica gel pha thường với

hệ dung môi lần lượt là n-hexane/acetone = (4/1) và n-hexane/acetone = (1/1,

v/v) thu được các phân đoạn E 3.1 đến E 3.6. Tiếp tục xử lý phân đoạn E 3.5

(3,3g) trên cột silica gel pha thường, hệ dung môi n-

hexane/dichlorometan/EtOAc có tỷ lệ thể tích 2/6/1 thu được các phân đoạn từ E

4.1 đến E 4.6.

Bằng phương pháp sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel (cỡ hạt 40-63 µm)

với hệ dung môi n-hexane/dichlorometan/EtOAc có tỷ lệ thể tích 1/4/3, kết hợp

với phương pháp kết tinh phân đoạn thu được chất tinh khiết ký hiệu là SS-2

(46mg) từ phân đoạn E 4.6.

Phân đoạn E 4.2 được phân tách tiếp trên cột sắc ký pha thường với hệ

dung môi n-hexane/Dichloromethane/EtOAc có tỷ lệ thể tích 2/16/0,5 (v/v/v)

thu được chất sạch SS-3 (885,8 mg).

Quá trình phân tách phân đoạn E 1.5 được trình bày ở sơ đồ 3.

Phần chiết EtOAc (E) 63,70g

100% H

H/A 10/1

D/M 1/10

H/A 30/1

D/M 10/1

H/A 50/1

H/A 3/1

H/A 1/1

D/M 6/1

D/M 1/1

E 1.1

E 1.6

E 1.2

E 1.7

E 1.8

E 1.9

E 1.10

E 1.3

E 1.4

E 1.5

CC, silica gel, D/E=25/1, v/v

E 2.1 – 2.5

E 2.8 – 2.10

E 2.11

E 2.12

E 2.6

Rửa bằng CH2Cl2

E 2.7

SS-1 (31mg) Dạng bột, màu trắng

Sơ đồ 2: Quy trình phân tách phần chiết EtOAc của Dung lụa

E 1.5 (12,8 g)

CC, Silica gel, H/E=4/1, v/v

CC, Silicagel, H/E=1/1, v/v

E 3.1-3.4

E 3.6

E 3.5 (3,293 g)

CC, Silicagel, H/D/E=2/6/1, v/v/v

E 4.1

E 4.3

E 4.4

E 4.5

E 4.2

E 4.6

CC, Silicagel, H/D/E=1/4/3, v/v/v

SS-2 (46 mg) Dạng bột màu trắng

SS-3 (885,8 mg) Dạng keo, màu nâu

Sơ đồ 3: Quy trình phân tách phân đoạn E 1.5

3.2.3: Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được

a, Hợp chất SS-1: betulinic acid

Dạng bột màu trắng, không hiện màu dưới bước sóng UV 254 nm và 365

nm. Khối lượng thu được là 31 mg và đạt độ tinh khiết cao.

Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất SS-1:

1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δH (ppm): 0,77 (3H, s); 0,88 (3H, s);

0,97(3H, s); 0,99 (3H, s); 1,03 (3H, s); 1,72(3H, s); 3,15 (1H, d, J=2,0, 2,6 Hz,

H-3); 4,61 (1H, br s, H-29a); 4,73 (1H, br s, H-29b).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δC (ppm): 40,09 (C-1); 26,90 (C-2); 79,68

(C-3); 39,96 (C-4); 56,89 (C-5); 19,45 (C-6); 35,61(C-7); 41,94 (C-8); 52,01 (C-

9); 38,42 (C-10), 22,10 (C-11); 28,05 (C-12); 39,69 (C-13); 43,59 (C-14); 30,85

(C-15); 33,35 (C-16); 57,50 (C-17); 49,51 (C-18); 48,49 (C-19); 151,99 (C-20);

31,72 (C-21); 38,14 (C-22); 28,61 (C-23); 16,10 (C-24); 16,65 (C-25); 16,73 (C-

26); 15,11 (C-27); 180,05 (C-28); 110,16 (C-29); 19,56 (C-30).

b, Hợp chất SS-2: maslinic acid

Dạng chất bột màu trắng, không hiện màu dưới bước sóng UV 254 nm và 365 nm. Điểm nóng chảy 248 – 2500C. Khối lượng thu được là 46 mg và đạt độ

tinh khiết cao.

Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất SS-2:

1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δH (ppm): 0,69(3H, s); 0,70 (3H, s);

0,87(3H, s); 0,89(3H, s); 0,90 (3H, s); 0,92 (3H, s); 1,09(3H, s).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δC (ppm): 46,91 (C-1); 67,38 (C-2); 82,37

(C-3); 39,00 (C-4); 54,87 (C-5); 18,16 (C-6); 32,22 (C-7); 39,05 (C-8); 47,18

(C-9); 38,42 (C-10), 23,11 (C-11); 121,86 (C-12); 144,02 (C-13); 41,47 (C-14);

27,27 (C-15); 22,70 (C-16); 45,58 (C-17); 40,92 (C-18); 45,80 (C-19); 30,79

(C-20); 33,42 (C-21); 32,44 (C-22); 28,90 (C-23); 17,21 (C-24); 16,40 (C-25);

16,99 (C-26); 25,74(C-27); 178,76 (C-28); 32,94 (C-29); 23,47 (C-30).

c, Chất SS-3: arctigenin

Chất SS-3 dạng keo màu vàng nâu, hiện màu tím dưới sóng UV 254nm, hiện

màu vàng cam khi nhúng bản mỏng vào thuốc thử Cerin sulfate. Khối lượng thu

được là 885,8 mg.

Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất SS-3:

1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δH (ppm): 6,64 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2),

6,75 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5), 6,61 (1H, d, J=2,0, H-6), 2,91 (1H, m, H-7,7’),

2,49 (1H, m, H-8,8’), 3,88 (1H, m, H-9a), 4,13 (1H, m, H-9b), 6,46 (1H, d, J =

2,0 Hz, H-2’), 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), 6,55 (1H, d, J = 2,0, H-6’), 3,88

(3H, m, 3-OCH3), 3,81 (3H, m, 3’-OCH3) và 3,86 (3H, m, 4-OCH3).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δC (ppm): 130,45 (C-1); 111,55 (C-2);

149,02 (C-3); 147,83 (C-4); 111,33 (C-5); 122,06 (C-6); 38,14 (C-7); 46,56 (C-

8); 71,23 (C-9); 179,72 (C-10); 129,42 (C-1’); 111,81 (C-2’); 146,70 (C-3’);

144,53 (C-4’); 114,22 (C-5’); 120,57 (C-6’); 34,49 (C-7’); 40,90 (C-8’); 55,87

(3-OCH3); 55,82(3’-OCH3); 55,82 (4-OCH3).

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

H 24

4.1.1 Chất SS-1 (betulinic acid)

Hình 2: Cấu trúc hóa học của hợp chất SS-1 (betulinic acid)

Bảng 1: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất SS-1 (betulinic acid)

Vị trí

13C-NMR b)

13C-NMRRef[48] c)

1H-NMR (multiplicity, J=Hz) a) 0,92 (m) 1,59 (m) 3,15 (dd, 5,0; 11,5) - 0,73 (br d, 9,0) - 1,71 (m) - 1,44 (m) 1,46 (m) 1,37 (m) 1,06 (m) 2,25 (m) - 1,56 (m) 2,32 (m) - 1,56 (m) 3,03 (m) - 1,45 (m) 1,18 (m)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

40,09 26,90 79,68 39,96 56,89 19,45 35,61 41,94 52,01 38,42 22,10 28,05 39,69 43,59 30,85 33,35 57,50 49,51 48,49 151,99 31,72 38,14

38,7 27,4 78,9 38,8 55,3 18,3 34,3 40,7 50,5 37,2 20,8 25,5 38,4 42,4 30,5 32,1 56,3 46,8 49,2 150,3 29,7 37,0

23 24 25 26 27 28

28,61 16,10 16,65 16,73 15,11 180,05

27,9 15,3 16,0 16,1 14,7 180,5

110,16

109,6

0,99 (s) 0,77 (s) 0,88 (s) 1,03 (s) 0,97 (s) - 4,73 (d, 1,5) 4,62 (d, 1,5) 1,74 (s)

19,56

19,4

b) CD3OD, 125MHz, ppm

a) CD3OD, 500MHz, ppm c) CDCl3, 125MHz, ppm

Trên phổ khối lượng ion hóa hóa học dưới áp suất khí quyển negative - Atmospheric pressure chemical ionization (APCI-MS negative) xuất hiện pic giả ion m/z 455 ứng với mảnh [M-H]-. Từ dữ kiện trên kết hợp với sự xuất hiện của 30 cacbon trên phổ 13C-NMR và phổ khối phân giải cao HR-MS cho phép

dự đoán công thức phân tử của hợp chất SS-1 là C30H48O3.

Phổ 1H-NMR cho biết sự có mặt của các proton có mặt trong phân tử, trên phổ 1H-NMR của hợp chất SS-1 (hình 3, 4, 5) nhận thấy sự xuất hiện tín hiệu

doublet của hai proton olefin gemi tại δH 4,73 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-29a) và 4,61

(1H, d, J = 1,5 Hz, H-29b); một tín hiệu của cacbon bậc hai liên kết với nhóm -

OH tại δH 3,15 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-3), giá trị J = 6,5 Hz cho thấy nhóm OH

nằm ở vị trí axial. Ngoài ra, còn có sự xuất hiện 6 tín hiệu singlet của nhóm

metyl tại δH 0,77 (3H, s), 0,88 (3H, s), 0,97 (3H, s), 0,99 (3H, s), 1,03 (3H, s),

1,72 (3H, s), những tín hiệu này đặc trưng cho cấu trúc của một hợp chất

triterpenoid khung lupane.

Phổ 13C-NMR cho biết sự chuyển dịch hóa học của nguyên tử C-13 có mặt trong phân tử hợp chất, trên phổ 13C-NMR của hợp chất SS-1 (hình 6, 7) và

DEPT (hình 8, 9) xuất hiện tín hiệu của 30 cacbon, trong đó có 6 cacbon nhóm

metyl tại δC 16,10 (C-23); 28,61 (C-24); 16,65 (C-25); 16,73 (C-26); 15,11 (C-

27) và 19,56 (C-30); tín hiệu của 2 cacbon olefin tại δC 151,99 (C-20) và 110,16

(C-29). Bên cạnh đó còn có tín hiệu của nhóm cacboxyl tại δC 180,05 (C-28) và

một tín hiệu cacbon liên kết với nhóm hydroxyl tại δC 79,68 (C-3). Từ các dữ

kiện trên, kết hợp với tài liệu công bố trước đó có thể kết luận hợp chất SS-1 là

betulinic axit [48], hay 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid, công thức phân

tử C30H48O3, khối lượng phân tử M = 456 đvC. Các tín hiệu C-13 của hợp chất

SS-1 được so sánh với tài liệu công bố trước đó ở bảng 1.

Betulinic acid lần đầu tiên được phân lập từ cây Betula alba (Betulaceae).

Hợp chất này được phân tách từ một số chi thực vật khác như Ziziphus

(Rhamnaceae), Syzygium (myrtaceae), Diospyros (Ebenaceae), Paeonia

(Paeoniaceae) [5].

Hình 3: Phổ 1H-NMR của hợp chất SS-1

Hình 4: Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất SS-1

Hình 5: Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất SS-1

Hình 6: Phổ 13C-NMR của hợp chất SS-1

Hình 7: Phổ giãn 13C-NMR của hợp chất SS-1

Hình 8: Phổ DEPT và 13C-NMR của hợp chất SS-1

Hình 9: Phổ DEPT giãn và 13C-NMR của hợp chất SS-1

4.1.2 Chất SS-2: maslinic acid

Hình 10: Cấu trúc hóa học của hợp chất SS-2 (maslinic acid) Bảng 2: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất SS-2 (maslinic acid)

Vị trí

13C-NMR b)

13C-NMRRef[11] c)

46,91

48,1

2 3 4 5 6 7 8 9 10

67,38 82,37 39,00 54,87 18,16 32,22 39,05 47,18 38,42

69,5 84,4 40,5 56,7 19,6 33,8 40,6 49 39,3

23,11

24,6

12 13 14

121,86 144,02 41,47

123,5 145,3 42,9

27,27

28,8

16 17 18

22,70 45,58 40,92

24 47,6 42,7

45,80

47,2

20 21

30,79 33,42

31,6 34,9

32,44

33,9

1H-NMR (multiplicity, J=Hz)a) 2,42 (d, 7,5) 1,04-1,40 (m) 4,11 (dd, 5,0; 10,0) 4,38 (d, 3,5) - 1,04-1,40 (m) 1,40-1,66 (m) 1,40-1,66 (m) - 1,40-1,66 (m) - 2,07 (d, 9,5) 1,90 (m) 5,16 (m) - - 1,04-1,40 (m) 1,56-1,82 (m) 1,40-1,66 (m) - 2,74 (dd, 3,5; 10,0) 1,04-1,40 (m) 1,40-1,66 (m) - 1,04-1,40 (m) 1,40-1,66 (m) 1,56-1,82 (m) 1,09 (s) 0,96 (s) 2,08 (s) 0,91 (s) 0,89 (s)

23 24 25 26 27

28,90 17,21 16,40 16,99 25,74

29,3 17,1 17,5 17,7 26,5

- 0,70 (s) 0,70 (s)

178,76 32,94 23,47

b) CD3OD, 125MHz, ppm

a) CD3OD, 500MHz,ppm c) CD3OD, 75MHz, ppm

28 29 30

181,8 33,6 24

Trên phổ khối lượng APCI-MS xuất hiện pic giả ion m/z 471 [M-H]-. Kết hợp dữ kiện trên với phổ khối phân giải cao HR-MS và phổ 13C-NMR cho phép

dự đoán công thức phân tử hợp chất SS-2 là C30H48O4.

Phổ 1H-NMR cho biết sự có mặt của các proton có mặt trong phân tử, trên phổ 1H-NMR của hợp chất SS-2 (hình 11, 12, 13) nhận thấy sự xuất hiện 7

tín hiệu singlet của nhóm metyl ở vùng trường cao: δH 0,69 (3H, s); 0,70 (3H,

s); 0,87 (3H, s); 0,89 (3H, s); 0,90 (3H, s); 0,92 (3H, s); 1,09 (3H, s) ppm và 1

tín hiệu doublet của proton olefinic tại δH 5,17 (1H,t, J=3,0 Hz, H-12). Ngoài ra trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu 2 nhóm hydroxy metin ở δH 4,11 (1H,

m, H-2); 2,74 (1H, d, J=9,5 Hz, H-3).

Phổ 13C-NMR cho biết sự chuyển dịch hóa học của nguyên tử C-13 có mặt trong phân tử hợp chất, trên phổ 13C-NMR của hợp chất SS-2 (hình 14, 15)

và DEPT (hình 16, 17) nhận thấy sự xuất hiện tín hiệu của 30 cacbon trong đó

có 7 nhóm methyl, 9 nhóm methylen, 6 nhóm methin và 8 cacbon không liên

kết với hydro, trong đó có 1 tín hiệu của nhóm cacboxyl tại 178,76 ppm (C-28),

hai tín hiệu của cacbon metin liên kết với oxy ở δC 67,38 (C-2) và 82,37 (C-3).

Điều này cho phép gợi ý hợp chất có cấu trúc của một triterpenoid dạng khung

oleane.

Từ các dữ kiện trên, kết hợp với tài liệu công bố trước đó có thể kểt luận

hợp chất SS-2 là maslinic acid [11], với công thức phân tử C30H48O4, khối lượng

phân tử M = 472 g/mol, tên gọi khác là crategolic acid hoặc (2α,3β)-2,3-

dihydroxyolean-12-en-28-oic acid. Các tín hiệu C-13 của hợp chất SS-2 được so

sánh với tài liệu công bố trước đó ở bảng 2.

Về tên gọi trong lịch sử, maslinic axit được đặt tên là “crategolic acid” do

lần đầu tiên được phân lập từ cây Crataegus oxyacantha L. vào năm 1927 [12].

Đến năm 1951, Tschesche và cộng sự đã mô tả nó là một triterpene acid với

công thức phân tử C30H48O4, có mặt chủ yếu trong lá của loài cây trên [51].

Năm 1961, Caglioti và cộng sự phân lập từ quả o liu (Olea europaea L.) một

triterpene acid mới, đặt tên nó là maslinic acid [14]. Mặc dù có một số tranh cãi

do maslinic acid có công thức và cấu trúc giống hệt với crategolic acid, nhưng

hơn ba thập kỷ sau đó, cấu trúc của maslinic acid mới được làm sáng tỏ khi các

thiết bị và phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ phát

triển hơn. Tên gọi maslinic acid vẫn được chấp nhận khi công trình nghiên cứu

của Bianchi và cộng sự (năm 1994) đã phân lập và định lượng được maslinic

axit, một hợp chất triterpenoid có hàm lượng lớn trong quả Olea europaea L. [5,

13].

Hình 11: Phổ 1H-NMR của hợp chất SS-2 trong CD3OD

Hình 12: Phổ 1H giãn của hợp chất SS-2

Hình 13: Phổ 1H giãn của hợp chất SS-2

Hình 14: Phổ13C-NMR của hợp chất SS-2

Hình 15: Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất SS-2

Hình 16: Phổ DEPT giãn và 13C của hợp chất SS-2

Hình 17: Phổ DEPT giãn và 13C giãn của hợp chất SS-2

4.1.3 Chất SS-3 (arctigenin)

Hình 18: Cấu trúc hóa học của hợp chất SS-3 (arctigenin)

Phổ 1H-NMR cho biết sự có mặt của các proton có mặt trong phân tử, trên phổ 1H-NMR của hợp chất SS-3 (hình 19, 20, 21) nhận thấy sự có mặt của 6 tín hiệu

proton vòng thơm bao gồm 6,82 ppm (1H, d, J5’,6’ = 7,5 Hz, H-5’); 6,64 ppm (1H, d,

J6,2= 1,5 Hz, H-2); 6,61 ppm (1H, d, J6,5 = 8 Hz, J6,2 = 2,0 Hz, H-6); 6,55 ppm (1H,

d, J6’,5’ = 8,0 Hz, J6’, 2’ = 2,0 Hz, H-6’); 6,75 ppm (1H, d, J5,6= 8,0 Hz, H-5); 6,46

ppm (1H, d, J2’,6’= 2,0 Hz, H-2’). Các proton của nhóm metoxy cho độ chuyển dịch

hóa học ở 3,81 ppm; 3,86 ppm và 3,88 ppm. Các tín hiệu proton khác trong hợp chất

được trình bày trong Bảng 3.

Phổ 13C-NMR cho biết sự chuyển dịch hóa học của nguyên tử C-13 có mặt trong phân tử hợp chất, trên phổ 13C-NMR của hợp chất SS-3 (hình 22, 23, 24) xuất

hiện tín hiệu của nhóm cacbonyl có tín hiệu cộng hưởng ở 179,72 ppm, tín hiệu cộng

hưởng của một oximethylene là 71,23 ppm, 3 nhóm methoxy có độ chuyển dịch hóa

học ở vùng 55,87 ppm; 55,82 ppm và 55,82 ppm, các nguyên tử C-13 của vòng thơm

có độ chuyển dịch hóa học nằm ở vùng 111,55 ppm đến 149,02 ppm. Các tín hiệu C-

13 khác trong hợp chất được trình bày trong Bảng 3.

Để chứng minh cấu trúc của phân tử, hợp chất SS-3 đã được ghi thêm phổ

tương tác gần HSQC cho thấy sự tương tác giữa C-13 và proton liên kết trực tiếp với

nguyên tử cacbon đó (hình 25, 26, 27) ví dụ tín hiệu của proton H-5’ (6,82 ppm)

tương tác với tín hiệu cộng hưởng của C-5’ (114,2 ppm); độ chuyển dịch hóa học

của proton H-6 (6,61 ppm) tương tác với C-6 (122,06 ppm); tín hiệu proton H-5

(6,75 ppm) tương tác với tín hiệu cộng hưởng của C-5 (111,33 ppm). Phổ tương tác

xa HMBC cho biết sự tương tác xa giữa nguyên tử C-13 và proton cách nguyên tử C-

13 đó 2 đến 3 liên kết (hình 28, 29, 30, 31, 32) ví dụ H-5’ (6,82 ppm) tương tác xa

với C-1’ (129,4 ppm), H-5 (6,75 ppm) tương tác với C-1 (130,5 ppm). Các tương tác

xa khác trên phổ HMBC của hợp chất SS-3 được thể hiện ở Bảng 3.

Bảng 3: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và các tương tác trên HMBC của hợp chất SS-3

HMBC

Vị trí

δC (ppm)

δH (ppm)

(H C)

130,45

111,55

6,64 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2)

4, 6, 7

149,02

147,83

1, 3

111,33

6,75 (1H, d, J= 8 Hz, H-5)

2, 4, 7

122,06

6,61 (1H, d, J=8,0, H-6)

2, 6, 9

2,91 (1H, m, H-7)

38,14

1, 10

2,49 (1H, m, H-8)

46,56

3,88 (1H, m, H-9a),

7, 10

71,23

4,13 (1H, m, H-9b)

179,72

129,42

1’

111,81

6,46 (1H, d, J=7,5 Hz, H-2’)

4’, 6’, 7’

2’

146,70

3’

144,53

4’

5’

114,22

6,82 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-5’)

1’, 3’

6’

120,57

6,55 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6’)

2’, 4’, 7’

7’

34,49

2,91 (1H, m, H-7’)

2, 6’, 10

8’

40,90

2,49 (1H, m, H-8’)

1’

55,87

3-OCH3

3,88 (3H, m, 3-OCH3)

55,82

3’

3’-OCH3

3,81 (3H, m, 3’-OCH3)

55,82

4’

4-OCH3

3,86 (3H, m, 4-OCH3)

5,61 (1H, s, 4’-OH)

5’, 3’

Từ các dữ kiện trên, kết hợp với tài liệu công bố trước đó có thể kểt luận hợp

chất SS-3 là arctigenin [29], công thức phân tử C21H24O6, khối lượng phân tử M =

372 g/mol.

Hình 19: Phổ 1H của hợp chất SS-3

Hình 20: Phổ 1H giãn của hợp chất SS-3

Hình 21: Phổ 1H giãn của hợp chất SS-3

Hình 22: Phổ 13C của hợp chất SS-3

Hình 23: Phổ 13C giãn của hợp chất SS-3

Hình 24: Phổ 13C giãn của hợp chất SS-3

Hình 25: Phổ HMBC của hợp chất SS-3

Hình 26: Phổ HMBC giãn của hợp chất SS-3

Hình 27: Phổ HMBC giãn của hợp chất SS-3

Hình 28: Phổ HMBC giãn của hợp chất SS-3

Hình 29: Phổ HMBC giãn của hợp chất SS-3

Hình 30: Phổ HSQC của hợp chất SS-3

Hình 31: Phổ HSQC giãn của hợp chất SS-3

Hình 32: Phổ HSQC giãn của hợp chất SS-3

4.2 Hoạt tính sinh học của cây Dung lụa

4.2.1 Hoạt tính giảm đau

Kết quả nghiên cứu về hoạt tính giảm đau của dịch chiết được trình bày ở

bảng 4:

Bảng 4. Hiệu quả giảm đau của dịch chiết trên mô hình gây đau bằng acetic acid

Aspirin: đối chứng dương

Lô Đối chứng Liều 1: 125 mg/kg Liều 2: 250 mg/kg Liều 3: 500 mg/kg Aspirin: 100 mg/kg Số cơn đau quặn 82.75 ± 7.85 77.12 ± 6.15 73.00 ± 5.35 51.00* ± 4.58 33.52* ± 5.97 % ức chế - 6.80 11.78 38.36 59.49

Kết quả trên các liều thử nghiệm được thể hiện trên Bảng 4 cho thấy

trong số ba liều nghiên cứu, tác dụng dịch chiết nghiên cứu ở liều 500 mg/kg đã

làm giảm số cơn đau quặn của động vật so với lô đối chứng và sự giảm này là

có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Hay nói cách khác mẫu nghiên cứu ở liều 500

mg/kg có tác dụng giảm đau khá tốt.

4.2.2 Hoạt tính kháng viêm

Bảng 5: Kết quả hoạt tính kháng viêm của mẫu nghiên cứu

Độ phù theo thời gian (mm)

Liều (mg/kg)

0,5 giờ

1 giờ

2 giờ

3 giờ

4 giờ

5 giờ

Đối chứng

1.145 ± 0.092

1.380 0.194

1.350 ±0.210

1.320 ±0.214

1.235 ±0.147

1.108 ±0.100

ASA: 100mg/kg

0.745 ± 0.129*

0.630 ± 0.070*

0.673 ± 0.080*

0.660 ± 0.104*

0.615 ± 0.106*

0.513 ±0.070*

Mẫu: 250 mg/kg

1.115 ± 0.059

1.343 ± 0.120

1.273 ± 0.080

1.210 ± 0.040

1.158 ± 0.079

1.015 ± 0.117

Mẫu: 500 mg/kg

1.023 ± 0.270

1.110 ± 0.068

1.130 ± 0.068

1.125 ± 0.085

1.055 ± 0.099

0.935 ± 0.112

Ghi chú: * Sự sai khác có ý nghĩa thống kê, P<0,05.

Bảng trên cho thấy mẫu Dung lụa ở các liều nghiên cứu chưa thể hiện rõ

hoạt tính kháng viêm theo đường uống trong thí nghiệm này.

Kết quả xác định cytokine IL-6 trong huyết thanh chuột

Huyết thanh chuột sau khi được xử lí mẫu sẽ được phủ lên giếng ELISA

của bộ KIT xác định IL-6. Lượng IL-6 tiết ra trong huyết thanh chuột được

uống mẫu được so sánh với chuột không được uống mẫu. Nếu giá trị OD thu

được của huyết thanh chuột được uống mẫu nhỏ hơn giá trị OD của giếng đối

chứng ở mức có ý nghĩa thống kê thì được coi là có tác dụng ức chế sản sinh

IL-6 (một cytokine gây viêm quan trọng).

Kết quả cho thấy mẫu có tác dụng ức chế IL-6, tốt nhất ở liều 250mg/kg

và có sự sai khác so với đối chứng ở mức có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Chất

đối chứng tham khảo cũng thể hiện tác dụng ức chế IL-6 so với lô đối chứng

(P<0,05).

Hoạt tính sinh học của hợp chất SS-1 (betulinic acid)

Các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy, betulinic axit

có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý, có những đóng góp quan trọng vào hoạt

tính sinh học chung của cây Dung lụa.

Năm 2004, Cichewicz cùng các cộng sự đã công bố nghiên cứu phát hiện

khả năng chống lại virut HIV-1 và gây độc tế bào một cách chọn lọc đối với

một số dòng gây ung thư ác tính [32].

Đến năm 2012, Moghaddam cùng cộng sự đã khẳng định lại kết quả

nghiên cứu trên và công bố thêm nhiều hoạt tính sinh học quý của betulinic axit

như hoạt tính kháng HIV, kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và

kháng một số vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Đặc biệt, betulinic axit có hoạt

tính chống ung thư rất mạnh với các dòng tế bào gây ung thư ở người như ung

thư máu (HL-60, U-937 và K-562), ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (A-

549) và được sử dụng là một tác nhân dự phòng trong điều trị các bệnh ung thư

kể trên [37].

Ngoài ra, betulinic axit thể hiện là một hợp chất có tiềm năng khi các sản

phẩm biến cải của nó cho hiệu quả tích cực như bevirimat của nó đã là một

thuốc thử chống HIV ở giai đoạn III [6].

Qua những hoạt tính sinh học và tác dụng dược học kể trên, betulinic axit

hứa hẹn là một chất sẽ được các nhà khoa học đi sâu vào nghiên cứu để đóng

góp thêm nhiều thành tựu cho ngành y học, hóa học.

Hoạt tính sinh học của hợp chất SS-2 (maslinic acid)

Ngoài khả năng kháng viêm, giảm đau thể hiện qua hoạt tính chung của

cây Dung lụa, hợp chất maslinic axit còn được biết đến với nhiều hoạt tính quý

khác qua nhiều công trình nghiên cứu.

Năm 2008, Reyes cùng cộng sự đã công bố nghiên cứu maslinic axit có

khả năng ức chế dòng tế bảo ung thư ruột (HT-29) một cách đáng kể. Bên cạnh

đó, nó cũng có khả năng chống lại các dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung

thư phổi (MCF-7) [42].

Mới đây, trong năm 2014 Lozano-Mena cùng cộng sự đã chứng minh

rằng maslinic axit còn có nhiều hoạt tính sinh học khác như chống tiểu đường

type II, hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ tim, kháng viêm, kháng khuẩn và kháng

kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum [28].

Hiện nay, maslinic axit được sử dụng làm một tác nhân hỗ trợ và điều trị

các bệnh như ung thư ruột, ung thư gan, ung thư phổi, viêm dây chằng, sốt rét.

Hoạt tính sinh học của hợp chất SS-3 (arctigenin)

Năm 2009, Feng cùng cộng sự đã công bố hiệu quả chống viêm của

arctigenin. Kết quả cho thấy arctigenin có tác dụng gây ức chế mạnh đối với

việc sản xuất quá nhiều oxit nitric (NO), sản sinh các yếu tố hoại tử khối u alpha

như TNF-alpha và interleukin-6 (IL-6) [18].

Năm 2010, Lee cùng cộng sự đã công bố rằng arctigenin có tác dụng

chống oxi hóa, chống viêm, và giảm đau. Nghiên cứu còn chỉ ra arctigenin có

tác dụng đáng kể với chứng viêm dị ứng loại I-IV [27].

Gần đây, trong năm 2016, Xiao cùng cộng sự đã công bố tác dụng bảo vệ

dạ dày của arctigenin trên mô hình loét dạ dày. Hoạt tính chống loét của

arctigenin do ethanol và axit axetic được đánh giá trong mô hình chuột Sprague-

Dawley. Kết quả nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng arctigenin có hoạt động chống

loét, có thể kết hợp với sự giảm oxy hóa và viêm tổn thương [58].

Công dụng của arctigenin được biết đến từ lâu trong y học cổ truyền

Trung Quốc với hoạt tính kháng virut hiệu quả [21]. Đến nay, arctigenin vẫn

được dùng làm tác nhân trong hỗ trợ và điều trị nhiều bệnh trong y học.

CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN

Từ các kết quả thu được trong quá trình thực hiện các nhiệm vụ của luận

văn, tôi đã rút ra được các kết luận sau:

1.Đã khảo sát và tìm ra quy trình chiết tách thích hợp để điều chế các

phần chiết từ cây Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D. Don).

2.Từ bột cành lá cây Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham. Ex D.

Don), bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập được 3 chất có độ tinh

khiết cao SS-1, SS-2, SS-3 từ phần chiết EtOAc với hàm lượng lần lượt là 7,8.10-4%, 11,5.10-4% và 22,15.10-3%.

3.Cấu trúc của các hợp chất đã được xác định bằng các phương pháp hiện

đại như phổ MS, phổ NMR 1 chiều và 2 chiều. Các hợp chất đó là:

- Hợp chất SS-1: betulinic acid hay 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic

acid.

- Hợp chất SS-2: maslinic acid hay (2α,3β)-2,3-dihydroxyolean-12-en-28-

oic acid.

-Hợp chất SS-3: arctigenin.

Những chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây Dung lụa.

4.Kết quả thử hoạt tính kháng viêm và giảm đau cao chiết tổng MeOH

của cây Dung lụa đã cho thấy hoạt tính giảm đau ở liều 500 mg/kg có tác dụng

khá tốt và có ý nghĩa thống kê. Mẫu Dung lụa chưa thể hiện hoạt tính kháng

viêm theo đường uống ở liều 250 và 500 mg/kg tuy nhiên liều 250 mg/kg đã thể

hiện hoạt tính ức chế IL-6 so với nhóm đối chứng.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐƯỢC CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

Trần Thu Hương, Nguyễn Quốc Thắng, Lê Huyền Trâm, Nguyễn Văn

Thông, Nguyễn Hoàng Minh, Trần Thị Minh, Nguyễn Tiến Đạt, Đỗ Hoàng

Giang – Hai hợp chất Triterpene pentacyclic từ cây Dung lụa Symplocos

sumuntia. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 54 (2B) (2016) 258 – 262.

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

[1] Võ Văn Chi – Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Tập 1, 2012.

[2] Nguyễn Văn Đàn, Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB

Y học , TP Hồ Chí Minh, (1985).

[3] Đỗ Bích Huy và cộng sự ; Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt

Nam; NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, (2004).

[4] Trần Thu Hương, Phan Minh Giang, Giáo trình hóa học các hợp chất

thiên nhiên, NXB Bách Khoa Hà Nội, (2016), tr 58.

[5] Trần Thu Hương, Nguyễn Quốc Thắng, Lê Huyền Trâm, Nguyễn Văn

Thông, Nguyễn Hoàng Minh, Trần Thị Minh, Nguyễn Tiến Đạt, Đỗ Hoàng

Giang – Hai hợp chất Triterpene pentacyclic từ cây Dung lụa Symplocos

sumuntia. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 54 (2B) (2016) 258 - 262.

[6] Phan Tống Sơn, Phan Minh Giang, Hóa học các hợp chất thiên nhiên,

Tập I, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội (2016), tr 298.

[7] Nguyễn Đình Triệu, Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, NXB

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, (2001)

[8]Cơ sở dữ liệu online - Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam.

http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Symplocaceae&list=familia

[9] Cơ sở dữ liệu online - Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam.

http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Symplocos%20sumuntia&lis

t=species.

[10]Bách khoa toàn thư y dược Việt Nam

http://ydvn.net/contents/view/11179.cay-dung-lua-symplocos-sumuntia.html.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

[11] Antonio Martinez et al, Biotransformation of oleanolic acid and

maslinic acids by Rhizomucor miehei, Phytochemistry, Vol 94 (1990), 229-

237.

[12]Bachler L. – Chemisch

Untersuchungen über die Früchte von Crataegus oxyacantha L.

(Monographie der Mehlbeeren), Universitat Basel Basel, Switzerland (1927).

[13] Bianchi G., Pozzi N., Vlahov G.-Pentacyclic triterpene acids in

olives, Phytochemistry 37 (1) (1994) 205-207.

[14] Caglioti L., Cainelli G., Minutilli F.- Constitution of maslinic acid,

Chim. Ind. 43 (1961) 278.

[15] Cichewicz R. H., Kouzi S. A. – Chemistry, biological activity, and

chemotherapeutic potential of betulinic acid for the prevention and

treatment of cancer and HIV infection, Medicinal Research Review 24 (1)

(2004) 90-114.

[16] Changhong Huo, Hong Liang, Yuying Zhao, Bin Wang, Qingying

Zhang - Neolignan glycosides from Symplocos caudata. Phytochemistry 69

(2008) 788–795.

[17] Choi, E. M., & Hwang, J. K. (2004). Antiinflammatory, analgesic

and antioxidant activities of the fruit of Foeniculum

vulgare. Fitoterapia, 75(6), 557-565.

[18] Feng Zhao, Lu Wang, Ke Liu - In vitro anti-inflammatory effects of

arctigenin, a lignan from Arctium lappa L., through inhibition on iNOS

pathway, Journal of Ethnopharmacology, Vol 122, Issue 3 (2009), 457–462.

[19] I. Hiroyuki, T. Yoshio, N. Hiroshi - Yakugaku Zasshi 1973, 93,

44.

[20] I. Junko, H. Merimasa, M. Takeshi, O. Masami, I. Kenichiro, F.

Tetsuro - Chemical Constituents of Plants from the Genus Symplocos - J. Chromatogr. 1990, 515, 503.

[21] Jie Chen, Wentao Li, Erguang Jin, Qigai He, Weidong Yan, Hanchun

Yang, Shiyu Gong, Yi Guo, Shulin Fu, Xiabing Chen, Shengqiang Ye, Yunguo

Qian - The antiviral activity of arctigenin in traditional Chinese medicine

on porcine circovirus type 2, Research in Veterinary Science, Vol 106 (2016),

159-164.

[22] J. Ishida, H. K. Wang, M. Oyama, M. L. Cosentino, C. Q. Hu, K. H. Lee - Anti-AIDS agents. 46. Anti-HIV activity of harman, an anti- HIV principle from Symplocos setchuensis, and its derivatives - J. Nat. Prod. 2001, 64, 958.

[23] J.-S. Jiang, Z.-M. Feng, Y.-H. Wang, P.-C. Zhang - New phenolics from the roots of Symplocos caudata Wall - Chem. Pharm. Bull. 2005, 53, 110.

[24] K. Ogiyama, T. Kondo, Nippon Mokuzai Gakkaishi 1965, 11, 65.

[25] L. B. Desilva, U. L. L. Desilva, M. Mahendran – Wound healing properties of Symplocos racemosa - J. Natl. Sci. Counc. Sri Lanka 1979, 7, 1. [26] L. C. Lin, W. J. Tsai, C. J. Chou - Vasorelaxing Alkaloids and Flavonoids from Cassytha filiformis - Chin. Pharm. J. (Taipei) 1996, 48, 441.

[27] Lee JY, Kim CJ - Arctigenin, a phenylpropanoid

dibenzylbutyrolactone lignan, inhibits type I–IV allergic inflammation

and pro-inflammatory enzymes, Archives of Pharmacal Research, Vol

33, Issue 6 (2010), 947–957.

[28] Lozano-Mena G., Sanchez-Gonzalez M., Juan M. E., Planas J. M.-

Maslinic Acid, a Natural Phytoalexin-Type Triterpene from Olives – A

Promising Nutraceuticals, Molecules 19 (2014) 11538-11559.

[29] Maiada M. A. Rahman et al, Lignans of Forsythia intermedia,

Phytochemistry, Vol 29, No. 6 (1990), 1971-1980.

[30] Manjamalai, A., Narala, Y., Haridas, A., & Grace, V. B. (2011).

Antifungal, anti-inflammatory and GC-MS analysis of methanolic extract

of Plectranthus amboinicus leaf. International Journal of Current

Pharmaceutical Research, 3(2).

[31] M. A. Abbasi, V. U. Ahmad, M. Zubair, N. Fatima, U. Farooq, S. Hussain, M. A. Lodhi, M. I. Choudhary - Phosphodiesterase and thymidine phosphorylase-inhibiting salirepin derivatives from Symplocos racemosa - Planta Med. 2004, 70, 1189.

[32] M. Ali, K. K. Bhutani, T. N Srivastava - Triterpenoids

from Symplocos racemosa bark - Phytochemistry 1990, 29, 3601.

[33] M. H. Frotan, S. B. Acharya, R. Frotan, N. K. R. Pathak, M.

Biswas - Pharmacological investigations on a-spinasterol isolated from

symplocos spicata - Indian J. Pharmacol. 1983, 15, 197.

[34] M. Hiroshi, K. Yoshie, S. Michiyasu, Shoyakugaku Zasshi 1985,

39, 312.

- Phosphodiesterase and

[35] M. I. Choudhary, N. Fatima, M. A. Abbasi, S. Jalil, V. U. Ahmad, Atta-ur-Rahman thymidine phosphorylase-inhibiting salirepin derivatives from Symplocos racemosa - Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 5793.

[36] M. J. Tang, D. D. Shen, Y. C. Hu, S. Gao, S. S. Yu, J. Nat.

Prod. 2004, 67, 1969.

[37] Moghaddam M. G., Ahmad F. B. H., Samzadeh-Kermani A. –

Biological Activity of Betulinic Acid: A Review, Pharmacology & Pharmacy

3 (2) (2012) 119-123.

[38] M. R. Khan, M. Kihara, A. D. Omoloso - Antimicrobial activity

of Cassia alata - Fitoterapia 2001, 72, 825.

[39] Okokon, J. E., & Nwafor, P. A. (2010). Antiinflammatory,

analgesic and antipyretic activities of ethanolic root extract of Croton

zambesicus. Pak J Pharmaceut Sci, 23(4), 383-390.

[40] R. Dhaon, G. K. Jain, J. P. S. Sarin, N. M. Khanna, Indian J.

Chem., Sect. B 1989, 28, 982.

[41] R. D. Tiwari, H. L. Tripathi- A new flavonol glycoside from the

leaves of Symplocos spicata - Phytochemistry 1976, 15, 833.

[42] Reyes Z. F. J., Rufino P. E. E., Lupianez J. A., Cascante zM. –

Maslinic acid, a natural triterpene from Olea europaea L., induces

apoptosis in HT29 human colon-cancer cells via the mitochondrial

apoptotic pathway, Cancer Letter 273 (1) (2009) 44-54.

[43] R. Hegnauer, ‘Symplocaceae’, in ‘Chemotaxonomie der Pflanzen,

Band VI’, Ed. R. Hegnauer, BirkhNuser Verlag, Basel, Stuttgart, 1973, p. 478.

[44] R. Higuchi, T. Kawasaki, M. Biswas, V. B. Pandey, B. Dasgupta -

Triterpenoid saponins from the stem bark of Symplocos spicata -

Phytochemistry 1982, 21, 907.

[45] R. Tschesche, P. Welzel, R. Moll, G. Legler - Über 2 alkaloide

aus der rinde von symplocos celastrinea mart- Tetrahedron 1964, 20, 1435.

[46] R. Tschesche, T. M. Braun, W. V. Sassen - Symplocoside, a

flavanol glycoside from Symplocos uniflora - Phytochemistry 1980, 19,

1825.

[47] Shah, S. M., & Shah, S. M. (2015). Phytochemicals, antioxidant,

antinociceptive and anti-inflammatory potential of the aqueous extract of

Teucrium stocksianum bioss. BMC complementary and alternative

medicine, 15(1), 351.

[48] Shashi B. Mahato, Asish P. Kundu, 13C NMR spectra of pentacyclic

triterpenoids-a compilation and some salient features, Phytochemistry, Vol.

37, No. 6 (1994), 1548.

[49] Tasleem F, Azhar I, Ali S. N, Perveen S, Mahmood Z. A (2014)

Analgesic and anti-inflammatory activities of Piper nigrum L. Asian Pacific

journal of tropical medicine, 7: 461-468.

[50] T. J. Ling, L. D. Lin, P. Wu, W. H. Zhou, H. G. Ye, M. F. Liu, X.

Y. Wei, Chin. Chem. Lett. 2004, 15, 1182.

[51] Tschesche R., Fugmann R. – Crataegolsaure, ein neues triterpenoid

aus Crataegus oxyacantha. Ein beitrag zur konstitution der α-amyrine, Chem.

Ber. 84 (1951) 810-826.

[52] T. Tanaka, K. Kawamura, H. Kohda, K. Yamasaki, O. Tanaka - Glycosides of the Leaves of Symplocos spp. (Symplocaceae) - Chem. Pharm. Bull. 1982, 30, 2421.

[53] T. Tanaka, K. Yamasaki, H. Kohda, O. Tanaka, S. B. Mahato,

Planta Med. 1980, suppl, 81.

[54] V. Naintara, M. Krishna, R. D. Tiwari, Univ. Allahabad Stud.

(Chem. Sect.) 1968, 32.

[55] V. U. Ahmad, M. A. Abbasi, M. Zubair, N. Fatima, U. Farooq,

M. I. Choudhary, Helv. Chim. Acta 2004, 87, 67.

[56] V. U. Ahmad, M. A. Abbasi, H. Hussain, M. N. Akhtar, U.

Farooq, N. Fatima, M. I. Choudhary - Phenolic glycosides

from Symplocos racemosa: natural inhibitors of phosphodiesterase I-

Phytochemistry 2003, 63, 217.

[57] X. H. Li, D. D. Shen, N. Li, S. S. Yu - Bioactive triterpenoids

from Symplocos chinensis - J. Asian Nat. Prod. Res. 2003, 5, 49.