Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính của chủng nấm đảm thu thập từ vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ THU HIỀN

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG NẤM ĐẢM THU THẬP TỪ VƢỜN QUỐC GIA BIDOUP- NÚI BÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hà Nội tháng 12 năm 2015

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Lời Cảm Ơn

Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Đặng Thị

Cẩm Hà đã tận tình chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình

học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh

nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.

Xin cám ơn Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ kinh phí

từ đề tài: “Phân lập và chọn lọc vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào ở vườn Quốc gia

Bidoup- Núi Bà để tạo nguồn nguyên liệu cho phát triển các chế phẩm ứng dụng trong

nông nghiệp, lâm nghiệp” để tôi hoàn thành công trình này. Tôi cũng xin cám ơn chủ

nhiệm đề tài và các thành viên tham gia đã tạo điều kiện giúp tôi thu thập số liệu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đinh Thị Thu Hằng, Th.S Đào Thị Ngọc Ánh,

Th.S. Nguyễn Thị Lan Anh, Th.S Phạm Quang Huy, Th.S Ngô Thị Huyền Trang, KS.

Nguyễn Hải Vân, KS. Nguyễn Đăng Thắng, KS. Hoàng Thị Nhung, CN. Nguyễn Văn

Huynh phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho

tôi trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với thầy cô viện Sinh thái và Tài nguyên

sinh vật, viện Công nghệ sinh học đã tận tình dạy dỗ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn

thành khóa học và thực hiện luận văn này.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn bố mẹ, chồng và những người thân yêu nhất đã tạo

điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành

khóa luận này.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Trần Thị Thu Hiền

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi

kết quả thu được không sao chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu, sơ đồ kết quả

của luận văn này chưa từng được công bố.

Mọi dữ liệu hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được

thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Trần Thị Thu Hiền

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1

CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3

1.1. Đặc điểm tự nhiên của Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà ........................................... 3

1.2. Enzyme laccase ............................................................................................................... 4

1.2.1. Giới thiệu về laccase ................................................................................................ 4

1.2.2. Cấu trúc của phân tử laccase .................................................................................. 5

1.2.3. Cơ chế xúc tác của laccase ...................................................................................... 7

1.2.4.Chất gắn kết .............................................................................................................. 8

1.2.5. Tính chất của laccase .............................................................................................. 8

1.2.5.1. pH tối ưu và độ bền pH ...................................................................................... 8 1.2.5.2. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt .......................................................................... 9 1.2.5.3. Hằng số động học của phản ứng laccase .......................................................... 9 1.2.5.4. Chất ức chế laccase .......................................................................................... 9 1.2.6. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase ................................ 10

1.2.7. Gene mã hóa enzyme laccase ................................................................................ 12

1.2.8. Ứng dụng của laccase ............................................................................................ 13

1.2.8.1. Xử lý rác thải và loại màu thuốc nhuộm .......................................................... 13 1.2.8.2. Ứng dụng xử lý khí độc môi trường ô nhiễm và chuyển hóa polymer mạch dài ...................................................................................................................................... 14 1.2.8.3. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm ............................................................ 15 1.2.8.4. Ứng dụng trong công nghệ dược phẩm và công nghệ nano ............................ 15 1.2.8.5. Các ứng dụng khác của laccase ...................................................................... 16 1.2.9. Chi Polyporus và những đặc tính của nó ............................................................. 17

1.3. Thuốc nhuộm và các đặc tính cơ bản của chúng ...................................................... 20

1.3.1 Khái quát và phân loại về thuốc nhuộm ................................................................ 20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

1.3.2. Khả năng phân hủy, loại màu thuốc nhuộm bởi vi sinh vật sinh laccase........... 23

1.3.3. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và tác hại ............................................................. 26

1.3.3.1. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm do thuốc nhuộm .............................................. 26 1.3.3.2. Tác hại của ô nhiễm thuốc nhuộm .................................................................. 26 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................. 28

2.1 Vật liệu và phƣơng pháp .............................................................................................. 28

2.1.1. Vật liệu ................................................................................................................... 28

2.1.2 Hóa chất .................................................................................................................. 28

2.1.3 Thiết bị ..................................................................................................................... 28

2.1.4 Các môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 28

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................................ 29

2.2.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ................................................ 29

2.2.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ................................................. 29

2.2.3. Phương pháp thu dịch laccase trên môi trường lên men lỏng để xác định hoạt tính .................................................................................................................................... 29

2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase ............................................................ 30

2.2.5. Phân loại chủng nấm ............................................................................................ 30

2.2.5.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống ...................................................... 30 2.2.5.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS ............. 31 2.2.5.3. Phương pháp xác định trình tự vùng ITS ......................................................... 31

2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp laccase ....................................................................................................................... 31

2.2.6.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ............................................................... 32 2.2.6.2. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng .................................................................... 32 2.2.6.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ........................................................ 32 2.2.6.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ......................................................................... 32 2.2.6.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ ..................................................................... 32 2.2.6.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ .................................................................. 32

2.2.7. Đánh giá hiệu quả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase thô từ chủng nấm FBD154 .................................................................................................................... 33

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………..34 3.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ...................................................... 34

3.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào ....................................................... 35

3.3. Đặc điểm hình thái, phân loại và định danh chủng nấm FBD154........................... 38

3.3.1. Đặc điểm hình thái................................................................................................. 38

3.3.2. Phân loại chủng FBD154 ...................................................................................... 39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

3.3.2.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống ..................................................... 39 3.3.2.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2) ........................................................................................................................ 39 3.4. Chọn lọc môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy ............................................................... 41

3.4.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp. FBD154................................................................................... 41

3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 43

3.4.3. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp. FBD154 .......................................................................................... 44

3.4.4. Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 46

3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 47

3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 48

3.4.6.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ ..................................................................... 48 3.4.6.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ .................................................................. 50

3.5. Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng enzyme thô sinh tổng hợp từ chủng nấm Polyporussp. FBD154 .......................................................................................................... 51

3.5.1. Khả năng loại màu nhóm anthraquinone (RBBR, NY5) bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 52

3.5.2. Khả năng loại màu azo (NY1, NY7) bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 ............................................................................................................................ 54

3.5.3. Khả năng loại màu thương mại (CLS và LF-2B) bởi laccase thô của chủng Polyporus sp. FBD154 ..................................................................................................... 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 60

Kết luận ................................................................................................................................ 60

Kiến nghị .............................................................................................................................. 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 62

Tiếng Việt ............................................................................................................................. 62

Tiếng Anh ............................................................................................................................ 62

PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 74

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid

Acetosyringone Ace

Base pair bp

Dimaren Black CLS CLS

Chất gắn kết CGK

Dichloro - Trichloroethane Diphenyl DDT

Deoxyribonucleic acid DNA

Đtg Đồng tác giả

Hexachlorocyclohexane HCH

Hydroxybenzotriazole HBT

Internal transcribed spacer ITS

Laccase Lac

LF-2B Everzol Red

Lignin peroxidase LiP

Manganese peroxidase MnP

Acid red 299 NY1

Acid blue 281 NY5

Acid red 266 NY7

Polymerase Chain Reaction PCR

RBBR Remazol brilliant blue R

Sinapic acid Si

Syringaldehyde Sy

Violuric acid VIO

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Vi sinh vật VSV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase .................................................. 11 Bảng 1.2. Một số loại thuốc nhuộm hoạt tính ................................................................ 23 Bảng 3.1. Các chủng nấm sinh enzym ngoại bào .......................................................... 35 Bảng 3.2. Hoạt tính laccase và hình ảnh khuẩn lạc của 7 chủng nấm trên môi trường PDA …………………………………………………………………………………..36 Bảng 3.3. Hiệu suất loại màu của thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase của FBD154 khi có mặt các chất gắn kết khác nhau ................................................................................. 58 Bảng 3.4. So sánh hiệu suất loại màu bởi laccase của chủng nấm FBD154 so với laccase thu được của các chủng nấm khác ..................................................................... 59

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh không gian ba chiều của laccase từ M. albomyces .......................... 6 Hình 1.2. Trung tâm hoạt động của laccase ..................................................................... 6 Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của laccase [40] ....................................................................... 7 Hình 3.1. Hoạt tính tự nhiên của các mẫu nấm từ Bidoup ............................................. 34

Hình 3.2. Hoạt tính laccase của 7 chủng nấm phân lập từ Bidoup – Núi Bà ................ 38

Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm FBD154 ................................................ 38 Hình 3.4. Hệ sợi nấm dưới kính hiển vi quang học ...................................................... 39 Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loài của chủng FBD154 ................................................ 40 Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh laccase ở chủng

Polyporus sp. FBD154 ................................................................................................... 42 Hình 3.7. Ảnh hưởng pH môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus

sp.FBD154 ..................................................................................................................... 43

Hình 3.8. Ảnh hưởng của chất cảm ứng lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus

sp. FBD154 .................................................................................................................... 45 Hình 3.9. Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus sp. FBD154 ................................................................................................... 46

Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh laccase của chủng .......... 47

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ lên khả năng sinh laccase của chủng

Polyporus sp.FBD154 .................................................................................................... 49

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ lên khả năng sinh laccase của chủng

Polyporus sp.FBD154 .................................................................................................... 50

Hình 3.13. Khả năng loại màu thuốc nhuộm RBBR (A); NY5 (B) của dịch enzyme thô của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không cómặt các chất gắn kết ................. 52 Hình 3.14. Sự thay đổi màu RBBR bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi

có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 52 Hình 3.15. Sự thay đổi màu NY5 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 52 Hình 3.16. Khả năng loại màu thuốc nhuộm NY1 (A); NY7 (B) của enzyme thô của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết ....................... 54

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Hình 3.17. Sự thay đổi màu NY1 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi

có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 54

Hình 3.18. Sự thay đổi màu NY7 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi

có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 54 Hình 3.19. Khả năng loại màu thuốc nhuộm CLS (A); LF-2B (B) của dịch enzyme thô

của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết ................ 55

Hình 3.20. Sự thay đổi màu CLS bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi

có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.21. Sự thay đổi màu LF-2B bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết .............................................................................. 56

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

MỞ ĐẦU

Hiện nay, ô nhiễm môi trường ngày càng trở nên nghiêm trọng và đang là một

vấn đề cấp thiết được toàn thế giới quan tâm. Sự ô nhiễm ngày càng gia tăng do tác

động của thiên tai và do các hoạt động của con người. Việt Nam cũng là một trong

những nước mà tình trạng ô nhiễm môi trường đang trở nên báo động, trong đó có tình

trạng ô nhiễm bởi nguồn thuốc nhuộm không được xử lý. Cùng với sự phát triển của

nhiều ngành công nghiệp khác nhau sử dụng màu tổng hợp như giấy in, photo màu hay

được thêm vào các sản phẩm dầu mỏ, đặc biệt là ngành công nghiệp dệt nhuộm thì một

lượng lớn nước thải màu cũng được thải ra môi trường. Thông thường, các chất có

trong thuốc nhuộm không bám hết vào sợi vải trong quá trình nhuộm mà bao giờ cũng

còn lại một lượng dư nhất định tồn tại trong nước thải. Đây chính là nguyên nhân làm

cho nước thải dệt nhuộm có độ màu cao và nồng độ chất ô nhiễm lớn, nếu không được

xử lý triệt để chúng sẽ gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm.Cụ thể là thuốc

nhuộm gây nên rất nhiều bệnh hiểm nghèo đặc biệt là bệnh ung thư và gây nên đột

biến.

Do những ảnh hưởng xấu đến môi trường nên xử lý thuốc nhuộm đang là vấn đề

được toàn xã hội rất quan tâm. Một số phương pháp xử lý nước thải từ các nhà máy dệt

nhuộm được sử dụng hiện nay là phương pháp vật lý và hóa học thường không triệt để.

Loại màu và phân hủy thuốc nhuộm bằng con đường sinh học đang được quan tâm

trong những năm gần đây vì công nghệ sinh học vừa mang lại hiệu quả kinh tế và rất

thân thiện với môi trường. Trong các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm bằng vi

sinh vật thì sử dụng hệ enzyme ngoại bào từ đại diện của hai ngành Basidomycota và

Ascomycotanhư laccase, manganese peroxidase (MnP), lingnin peroxidase (LiP) đang

được quan tâm bởi hiệu quả về cả kinh tế và môi trường.

Những năm gần đây việc nghiên cứu sàng lọc để tiến tới sản xuất enzyme ngoại

bào từ nấm đảm đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu

1

và giành được sự quan tâm đăc biệt là laccase. Các nguyên cứu tìm kiếm và khai thác

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoredase và peroxidase từ nấm đảm đã đạt được

thành tựu cao. Đã phát hiện trên 100 loại laccase có trọng lượng phân tử khác nhau với

hoạt tính và tính chất khác nhau. Chúng có khả năng phá vỡ các liên kết trong các hợp

chất hữu cơ hoặc xúc tác chuyển hóa chúng thành các chất ít độc hơn và các dạng dễ

phân hủy hơn để tiến tới khoáng hóa hoàn toàn chất ô nhiễm. Laccase xuất hiện ở các

loại thực vật bậc cao và nhiều nhất ở nấm lớn, có dải pH tối thích rộng và cũng có loại

laccase có khả năng chịu nhiệt cao. Chúng có khả năng phân hủy phenol và các hợp

chất của phenol. Ngoài ra, laccase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như khử

độc và loại màu thuốc nhuộm và các màu khác do các ngành công nghiệp thải ra, xử lý

nước thải, làm trắng giấy và có ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, công

nghệ nano, dược phẩm v.v.

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu

một số đặc tính của chủng nấm đảm thu thập từ vƣờn quốc gia Bidoup - Núi Bà”

đã được tiến hành. Luận văn bao gồm những nội dung chủ yếu sau:

- Phân lập và sàng lọc các chủng nấm đảm có khả năng sinh laccase cao từ

vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng;

- Phân loại chủng nấm đã được chọn lọc có hoạt tính cao nhất bằng phương

pháp truyền thống và xác định trình tự vùng ITS;

- Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy phù hợp để chủng đã được chọn sinh tổng

hợp laccase với hoạt tính cao;

- Đánh giá khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính (tổng hợp và

2

thương mại)bởi laccase thô thu được từ chủng nghiên cứu có và không có chất gắn kết.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm tự nhiên của Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà

Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà là một trong hai mươi tám vườn quốc gia nằm

trong hệ thống các khu rừng đặc dụng Việt Nam. Khu vực Bidoup – Núi Bà thuộc địa

giới hành chính Huyện Lạc Dương Tỉnh Lâm Đồng chiếm gần trọn cao nguyên

Langbiang (còn gọi là cao nguyên Lâm Viên), cách thành phố Đà Lạt 50 km theo tỉnh

lộ 273. Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà nằm trong tọa độ địa lý Từ 12 độ 00' 00” đến

12 độ 52' 00” vĩ độ Bắc và từ 108 độ 17'00” đến 108 độ 42' 00” kinh độ Đông.

Địa hình núi trung bình và núi cao, chia cắt mạnh, độ cao phổ biến từ 1.500m - 1.800m. Ðịa hình thấp dần theo hướng Nam Bắc. Nhiệt độ trung bình năm là 180C.

Lượng mưa trung bình 1.755 mm/năm, mùa khô lượng mưa chiếm khoảng 20%, mùa

mưa lượng mưa chiếm khoảng 80%; số ngày mưa trung bình 170 ngày/năm. Số ngày

có sương mù khoảng 80 ngày/năm, tập trung vào các tháng 2, 3, 4, 5. Khu vực Vườn

quốc gia Bidoup-Núi Bà là thượng nguồn của các hệ sông Krông-Knô, sông Ða Nhim,

duy trì nguồn nước cho một loạt hồ của Ðà Lạt như: hồ Ðan Kia, hồ Ða Thiện, hồ Than

Thở, hồ Xuân Hương.

Vườn quốc gia Bidoup-Núi Bà là một mẫu chuẩn hệ sinh thái rừng kín thường

xanh mưa ẩm á nhiệt đới của Việt Nam đặc trưng cho vùng cao nguyên, là một địa

điểm lý tưởng trong nghiên cứu khoa học, bảo tồn và đa dạng sinh học.

Đa dạng sinh học về loài thực vật: với khoảng 1.468 loài bao gồm họ Lan 250 loài; họ

Cúc 78 loài; họ Ðậu 65 loài; họ Cỏ 58 loài; họ Cà phê 45 loài; họ Dẻ 41 loài; họ Thầu

dầu 35 loài; họ Cói 33 loài; họ Hoa hồng 33 loài; họ Long não 29 loài; họ Dâu tằm 28

loài; họ Ðơn nem 25 loài; họ Bạc hà 22 loài; họ Ðỗ quyên 21 loài; họ Chè 21 loài…

Đa dạng về nguồn gene: có nhiều nguồn gene quý hiếm và đặc hữu; riêng về đặc hữu

hẹp đã thống kê được 91 loài: Thông tre, Thông đỏ, Du sam, Pơ mu Bách xanh, Thông

hai lá dẹt, Thông 5 lá Ðà Lạt, Ðỉnh tùng, Hoàng đàn giả. Côm Bidoup, Chè gò đồng

3

Bidoup, Lan Hoàng Thảo Ðà Lạt, Lan Hoàng thảo Lang Biang, Trà hoa Langbiang,

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Chân chim Langbian, Cung nữ Langbian, 250 loài phong lan, cho hoa đẹp và quý, 9

loài Ðỗ quyên, 5 loài Thu hải đường, 6 loài Thích là các nguồn gen quý.

Đa dạng về loài động vật: Về thú: Bao gồm các họ: họ Cầy, họ Chuột, họ Khỉ, họ Mèo,

họ Sóc cây, họ Chồn, họ Hươu nai, họ Gấu, họ Trâu bò, họ Nhím, họ Chuột chù, Chồn

bay, họ Dơi quả, họ Cu li, họ Vươn, họ Chó, họ Lợn, họ Cheo cheo, họ Tê tê, họ Sóc

bay, họ Dúi. Về Chim: họ Khướu, họ Trĩ , họ Cu cu, họ Chào mào, họ chim chích; đặc

biệt có những loài đặc hữu hẹp như: Mi Langbian, Khướu đầu đen, Khướu má xám, Sẻ

thông họng vàng. Về Bò sát: họ Rắn nước, họ Nhông, họ Rắn hổ, họ Tắc kè, họ Kỳ đà,

họ Rùa núi, họ Thằn lằn bóng, họ Trăn, họ Rắn mống, họ Rắn lục, họ Ba ba. Về Ếch

Nhái: có các họ: họ Ếch nhái, họ Nhái bầu, họ Cóc nhà, họ Ếch cây; … vv.

Tuy nhiên cho đến nay, các nghiên cứu về hệ nấm tại vườn quốc gia Bidoup –

Núi Bà còn ít, mới chỉ có đề tài điều tra, đánh giá, phân loại các loài nấm dưới tán rừng

thông tập trung vào điều tra các loài nấm cộng sinh ngoại bào của ThS Tôn Thất Minh,

còn hệ nấm ngoại sinh và các nhóm vi sinh khác chưa có một nghiên cứu cụ thể. Đặc

biệt, với đặc điểm rừng cây tán lá rộng, độ che phủ cao, ẩm quanh năm thì hệ vi sinh

vật nơi đây được kỳ vọng là khá đa dạng, cần được nghiên cứu và khai thác bền vững.

Vì vậy đề tài mở ra một hướng nghiên cứu mới, vừa góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu

đa dạng sinh học cho Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà, vừa đưa ra hướng khai thác

hiệu quả hệ sinh thái rừng phục vụ cho việc phát triển kinh tế và môi trường bền vững.

1.2. Enzyme laccase

1.2.1. Giới thiệu về laccase

Laccase (p–benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2 ) thuộc nhóm

enzyme oxy hóa khử. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ

chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các enzyme khác,

laccase có phổ cơ chất rất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất

phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin và cả các hợp chất vô cơ như

4

iot. Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

phân tử, tính chất glycosyl hóa và tính chất động học.

Trong những năm gần đây, laccase đặc biệt được quan tâm bởi các enzyme này

có những ứng dụng hữu ích trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau trong xử lý khử

độc bằng công nghệ phân hủy sinh học, dệt nhuộm, tổng hợp hữu cơ, thực phẩm, dược

phẩm v.v.

1.2.2. Cấu trúc của phân tử laccase

Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme

này khác nhau về trình tự axit amin và một số tính chất về động học xúc tác. Nấm có

thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức độ glycosyl hóa và cả

thành phần các gốc cacbonhydrat. Loài nấm Trametes versicolor có 5 dạng isozyme

chỉ khác nhau về thành phần cacbonhydrat, thành phần cacbonhydrat của chúng thay

đổi từ 10-45% so với khối lượng của thành phần protein. Phân tử laccase thường là

monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein, có khối lượng phân tử dao động

trong khoảng 60-90 kDal. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với

hàm lượng cacbonhydrat chiếm khoảng 10-25% [35]. Ngoài ra còn có nhiều loại

enzyme giống laccase (laccase-like).

Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4

nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: Loại 1 (T1),

loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện

tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử

mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể

5

được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Hình 1.1. Hình ảnh không gian ba chiều của laccase từ M. albomyces Tiểu phần A, B, C được kí hiệu đỏ, xanh lam và xanh lá cây

Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, C có khối

lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của

laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một

nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung

của vùng A và vùng C. Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa một nguyên tử

đồng T1, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein. Liên kết

giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử lưu huỳnh của cystein là liên kết đồng hóa trị

bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển

đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng

T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi các nguyên tử

Hình 1.2. Trung tâm hoạt động của laccase

6

đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ (Hình 1.2).

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

1.2.3. Cơ chế xúc tác của laccase Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất

có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các loại

enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rộng. Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase

quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử

đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất

và enzyme. Các đại lượng này phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của cơ chất. Thế oxy

hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V [43]. Cơ chất khử bị mất một

điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này

tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không

cần xúc tác enzyme như hydrat hóa, phân ly hoặc polymer hóa.

Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa

cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4

electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptit bảo

thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất

Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của laccase [40]

7

trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước (Hình 1.3)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Ngoài ra, cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau. Cơ chế

đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt

động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu

tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung

tâm phản ứng của laccase. Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian

đó là chất gắn kết (CGK). Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản

ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do [77]. Sự tham gia của các

chất trung gian đã làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của

laccase.

1.2.4.Chất gắn kết

Như đã trình bày ở trên, laccase có khả năng loại và khử độc nhiều màu trong

công nghiệp [45]. Tuy nhiên, một số màu không thể bị oxy hóa, hoặc chỉ bị oxy hóa

một phần bởi laccase. Bởi vì các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có

thế oxi hóa khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của

laccase. Trong trường hợp này cần một chất gắn kết (mediator) có vai trò quan trọng để

có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng

gốc tự do [77]. Sau đó CGK ở dạng oxy hóa nhận một điện tử của cơ chất và trở thành

dạng khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác. Ngược lại, laccase sau khi cho CGK

một điện tử thì trở thành dạng khử, sau đó bị oxy hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục

tham gia vào chu kỳ tiếp theo. Do đó, các CGK có vai trò quan trọng đối với các phản

ứng enzyme trong những trường hợp này. Hơn 100 loại CGK được biết đến nhưng các

CGK thường được sử dụng nhiều nhất là HBT,VIO, ABTS, Ace, Si, Sy. Những CGK

này đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc oxy hóa các loại màu khác nhau

[45].

1.2.5. Tính chất của laccase

1.2.5.1. pH tối ưu và độ bền pH

8

Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4-6 đối với cơ chất phenolic. Khi

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm, nguyên

nhân do anion nhỏ là ion hydroxyt đã ức chế laccase. Mặt khác, tăng pH còn làm giảm

thế oxy hóa khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi

laccase hơn. Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng

đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase-cơ chất và tác dụng ức

chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxit. Đối với các cơ chất không phải

phenolic như ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion và

do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2-3. Ngược lại, tính bền của laccase cao nhất

trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8-9.

1.2.5.2. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt

Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của VSV. Nhìn chung, laccase bền ở 30-50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC.

Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc sinh vật nhân sơ. Ví dụ thời gian bán hủy của laccase của Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70oC và của protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC. Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc từ nấm thường dưới 1 giờ ở 70oC và dưới 10 phút ở 80oC [43].

1.2.5.3. Hằng số động học của phản ứng laccase

Hoạt tính xúc tác của enzyme được đặc trưng bởi hằng số Michaelis-Menten

(Km). Hằng số này của laccase dao động trong một giới hạn khá rộng, trong khoảng 2-

500 µM phụ thuộc vào nguồn enzyme và cơ chất. Giá trị Km thấp nhất đối với cơ chất

là syringaldazine. Ái lực đối với oxy ít phụ thuộc vào enzyme hơn và chỉ dao động

trong khoảng 20-50µM.

1.2.5.4. Chất ức chế laccase

Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azit, cyanit, fluorit. Các

ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên và cản trở các dòng điện tử đi đến các

nguyên tử này. Các chất ức chế laccase khác là ethylenediaminetetraaxetic axit, axit

9

béo, tropolon và axit coumaric nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Các hợp chất chứa sulfhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic axit cũng

được coi là các chất ức chế laccase.

1.2.6. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase

Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực vật,

nấm, một số vi khuẩn và côn trùng. Laccase lần đầu tiên được phát hiện ở cây Rhus

vernicifera. Nghiên cứu laccase trên đối tượng đầu tiên là thực vật và nấm đảm là các

cơ thể sinh tổng hợp laccase rất phổ biến. Laccase từ nấm được nghiên cứu và khảo sát

rất kỹ đặc biệt là laccase từ nấm đảm thuộc chi Basidiomyces. Ngoài ra, laccase còn

được phát hiện trong các loài nấm của các chi Ascomyces,Deuteromyces và các loài

nấm có khả năng phân hủy lignocellulose như Agaricus bisidomyces, Botrytis cinerea,

Chaetomiumthemophilum, Coprius cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiate,

Pleurotusostreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor v.v. Tuy nhiên, các

nghiên cứu về laccase trên các đối tượng nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn lại không

10

nhiều. Một số VSV có khả năng tạo laccase được trình bày ở bảng 1.1.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase

VSV

Tên chủng

Tài liệu tham khảo

Phanerochaete chrysosporium

Viswanath et al., 2008 [96]

Pycnoporus coccineus

Jaouani et al. 2005 [33]

Pycnoporus sanguineus

Pointing et al. 2000 [67]

Pycnoporus cinnabarinus

Recordet al. 202 [74]

Cerrena unicolor

Michniewicz A et al., 2005 [53]

Nấm đảm

Trametes versicolor

Moldes et al., 2012 [54]

Pleurotus ostreatus

Hou Het al., 2004 [30]

Pleurotus florida

Sathishkumaret al., 2010 [81]

Polyporus pseudobetulinus

Songserm et al., 2012 [89]

Polyporus arcularius

Jegatheesan, Eyini, 2014 [34]

Coriolopsis polyzona

Cui et al., 2009 [18]

Aspergillus ochraceus

Saratale et al., 2006 [64]

Trichoderma harzianum

Sadhasivam S et al., 2008 [63]

Aspergillus niger

Téllez-Juradoet al., 2006 [94]

Nấm sợi

Penicillium simplicissimum

Zenget al., 2006 [67]

Penicillium pinophilum

Dhakar et al.,2014 [21]

Myrothecium verrucaria 24G-4

Sulistyaningdyahet al.,2003 [92]

Streptomyces lavendulae

Suzuki et al., 2003 [93]

Streptomyces psammoticus

Niladeviet al., 2009 [56]

Xạ khuẩn

Streptomyces lydicus

Mahmoud et al., 2013 [50]

Streptomyces coelicolor

Machczynski et al., 2004 [49]

Bacillus halodurans

Ruissenaars, Hartmans, 2004[78]

Bacillus subtilis

Wang et al., 2011 [99]

Vi khuẩn

Stenotrophomonas maltophilia

Galai, Marzouki, 2009 [24]

Azospirillum lipoferum

Givaudan et al., 1993 [26]

11

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

1.2.7. Gene mã hóa enzyme laccase

Trong vài thập kỷ gần đây, gene mã hóa laccase đã bắt đầu được nghiên cứu.

Cho đến nay đã có hơn 100 gene mã hóa laccase được đánh giá và so sánh, các nghiên

cứu chủ yếu tập trung trên đối tượng VSV. Năm 1998 gene mã hóa laccase đầu tiên

được phân lập và xác định trình tự từ nấm đảm Neurospora crassa và nấm sợi

Aspergillus nidulans. Tuy nhiên các gene tương ứng với các laccase hoàn chỉnh mới

chỉ có khoảng 20 gen, phần lớn trong số đó là nấm đảm. Gene mã hóa cho laccase cũng

đã được xác định từ vi khuẩn cổ [1].

Đối với nấm đảm và thực vật bậc cao, các gene mã hóa laccase thường có nhiều

intron. Số lượng intron trong mỗi gene thường từ 8-13 đoạn, mỗi đoạn có kích thước

khoảng 50-90 nucleotit. Ngoài ra cũng có những gene laccase chỉ có một intron như

Neurospora crassai, ngược lại Pleurotus ostreatus lại có đến 19 đoạn intron. Các gene

điển hình mã hóa protein laccase thường có kích thước khoảng 500-600 axit amin [1].

Ở nhiều chủng nấm trong bộ gene chứa nhiều gene mã hóa sinh tổng hợp

laccase. Trametes villosa chứa ít nhất 5 gene mã hóa cho laccase, Coprinus cinereus

chứa ít nhất 8 gene và Rhizoctonia solani, Pleurotus sajor-caju chứa ít nhất là 4 gene

mã hóa laccase. Tuy nhiên, các gene này nằm ở các allen khác nhau trên nhiễm sắc thể

và các trình tự bảo thủ liên quan đến vị trí liên kết với các nguyên tử đồng lại đồng thời

cũng có mặt trong các gene mã hóa các enzyme oxidase chứa nhiều nguyên tử đồng

khác, chính những đặc điểm này đã gây khó khăn trong việc phân lập và xác định

chính xác số gene mã hóa cho laccase.

Sự biểu hiện của gene sinh tổng hợp laccase phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện

môi trường. Với mỗi chủng khác nhau thì đòi hỏi điều kiện môi trường thích hợp cho

sinh tổng hợp laccase khác nhau. Môi trường giàu nitơ làm tăng quá trình sinh tổng

hợp laccase ở chủng Pleurotus sajor-caju PI27 nhưng chủng Lentinula edodes UFV52

12

lại có khả năng sinh tổng hợp laccase tốt hơn trên môi trường có hàm lượng nitơ thấp.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Đồng và các ion kim loại khác như Hg2+, Mg2+, Cd2+ và một số hợp chất vòng thơm

được xem là những nhân tố hoạt hóa mạnh quá trình sinh tổng hợp laccase. Quá trình

hoạt hóa gene sinh tổng hợp bởi các ion kim loại hoặc các hợp chất chứng minh là

được điều khiển bởi một trình tự điều hòa của vùng promoter của gen [1].

Trình tự gene mã hóa laccase có thể chia thành ba nhóm chính và nằm trong

Ascomycete, Basidomycete và thực vật bậc cao. Tuy nhiên các nghiên cứu về gene mã

hóa laccase ở vi sinh vật nhân sơ đang được quan tâm. Các nhà khoa học tìm kiếm

gene laccase mới và các đặc tính của các enzyme laccase nhằm ứng dụng trong phát

triển kinh tế cũng như trong xử lý môi trường.

1.2.8. Ứng dụng của laccase

1.2.8.1. Xử lý rác thải và loại màu thuốc nhuộm

Laccase được quan tâm nhiều hơn cả do có tiềm năng ứng dụng cao cho nhiều

ngành công nghiệp và xử ý ô nhiễm môi trường và họ ligninase có tiềm năng to lớn

trong tiền xử lý lignocellulose [66]. Với tốc độ tăng dân số nhanh và đời sống con

người ngày càng được nâng cao thì lượng rác thải sinh hoạt cũng tăng nhanh chóng.

Xử lý rác thải sinh hoạt là một trong những vấn đề rất được chú ý và quan tâm ở nhiều

nước trên thế giới. Rác thải sinh hoạt đa phần có nguồn gốc hữu cơ, chủ yếu là

lignocellulose, tinh bột, chất béo, ngoài ra còn có kim loại nặng, dầu mỡ, PAH và các

loại vi sinh vật gây bệnh. Do lignocellulose chứa lượng lignin nhất định nên tương đối

khó bị phân huỷ, lượng lignin này có thể liên kết với các polysacarit tạo nên hàng rào

vững chắc ngăn chặn sự tấn công của các enzyme từ vi sinh vật. Vì vậy, khi sử dụng hệ

enzyme phân huỷ lignin trong xử lý rác thải sẽ tạo tiền đề cho các vi sinh vật khác mà

đặc biệt là hệ vi sinh vật phân huỷ cellulose, hemicellulose lên men ưa nhiệt và chịu

nhiệt để tạo ra các đường đơn giản làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp khác

cũng như làm phân bón hữu cơ hay thức ăn cho động vật [34].

Theo thống kê, khoảng 90% chất màu từ cơ sở dệt nhuộm không bị phân huỷ

13

sau quá trình xử lý nước thải bằng biện pháp lý – hoá học. Nhiều chất ngoài tác động

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

về mặt màu sắc còn là tác nhân gây đột biến hoặc ung thư và gây độc cho đa số vi sinh

vật. Loại bỏ những hợp chất này luôn là vấn đề cần quan tâm, đặc biệt là về việc tìm

kiếm những phương pháp cũng như các tác nhân xử lý thích hợp. Hiện nay đã có nhiều

công trình nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy hệ enzyme phân huỷ lignin có

khả năng phân huỷ các loại thuốc nhuộm [62]. Các enzyme laccase và MnP từ vi sinh

vật đã được ứng dụng trong các nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm công nghiệp như

RBBR, Poly –R, Poly-B, có hiệu quả rất cao. Laccase còn được sử dụng để tẩy trắng

giấy trong công nghiệp chế biến giấy, tẩy màu vải sợi trong công nghiệp dệt nhuộm

[28, 54]. Việc sử dụng các enzyme thay thế làm giảm đi một lượng lớn hóa chất cũng

như lượng thải các chất hữu cơ khó phân hủy là sản phẩm của các biến đổi hóa học từ

các nhà máy sản xuất các sản phẩm giấy và dệt may [28].

1.2.8.2. Ứng dụng xử lý khí độc môi trường ô nhiễm và chuyển hóa polymer mạch dài

Những enzyme peroxidase và laccase từ các chủng nấm đảm cũng được nghiên

cứu khả năng phân hủy các hợp chất có trong thuốc diệt cỏ như dioxin, 2,4,5-T;

2,3,7,8-TCDD; PCDDs v.v. thu được hiệu quả cao. Nấm P. chrysosporium có khả năng

khoáng hóa 2,2% 2,3,7,8-TCDD thành CO2 sau 30 ngày. Cajthaml và đtg [61] đã sử

dụng enzyme thô để nghiên cứu khả năng phân hủy một vài PAH như anthracene,

phenanthrene, pyrene, fluoranthene. Sau 50 ngày ủ với dịch môi trường nuôi cấy chứa

enzyme thì anthracene còn lại 1%, phenanthrene 5%, fluorathene 32% và pyrene 7%.

Đã không tìm thấy chất chuyển hóa trung gian nào có độc tính được tích tụ trong dịch

sau xử lý. Levin và đtg [46] nghiên cứu khả năng phân hủy nitrobenzene và anthracene

khi sử dụng chủng nấm đảm Trametes trogii. Chủng này chịu được 2 chất ô nhiễm này

với nồng độ cao từ 250 – 500 mg/l và chuyển hóa được 90 – 97% trong quá trình sinh

trưởng và phân hủy hoàn toàn sau khi chuyển sang giai đoạn cân bằng. Trong môi

trường nuôi cấy xác định được laccase và MnP trong suốt quá trình sinh trưởng của

chủng nấm. Ngoài ra rất nhiều chất ô nhiễm bền vững khác cũng được chứng minh là

14

bị phân hủy bởi 3 enzyme ngoại bào này. Như vậy 3 enzyme laccase, MnP và LiP đóng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

vai trò rất quan trọng trong phân hủy sinh học và phục hồi sinh học các vị trí bị ô

nhiễm trong môi trường tự nhiên. Đặc biệt sẽ có hiệu quả cao hơn nếu nhân rộng và

thúc đẩy sự phát triển mạnh của tập đoàn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp 3

enzyme này một cách mạnh hơn.

1.2.8.3. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Laccase còn có khả năng oxy hóa các hợp chất phenol và không thuộc phenol

mà không phụ thuộc vào các yếu tố đồng trao đổi chất đắt tiền. Chính vì tính không đặc

hiệu và có tới hơn 100 loại laccase khác nhau nên chúng đã được sử dụng trong công

nghiệp thực phẩm. Hiệu quả rõ ràng nhất là sử dụng laccase để làm trong nước hoa quả

ép, rượu vang, bia. Đặc biệt là tăng chất lượng tinh bột và các vật liệu tương tự cho

công nghiệp thực phẩm.Gần đây các nghiên cứu cho thấy laccase còn một khả năng

nữa đó là khử được các hormone và các chất làm giảm miễn dịch trong thực phẩm và

nước.

1.2.8.4. Ứng dụng trong công nghệ dược phẩm và công nghệ nano

Laccase đã được ứng dụng có hiệu quả trong sinh tổng hợp các chất trong công

nghiệp dược phẩm [7, 11, 64]. Ngày nay, laccase đã được sử dụng nhiều hơn trong

chẩn đoán bệnh. Đặc biệt, enzyme này không thể thiếu trong quá trình sản xuất các loại

thuốc chống ung thư và ức chế các loại virus, đặc biệt là HIV. Laccase có thể được sử

dụng trong sản xuất các dược phẩm mới khác nữa như chất kháng sinh, kháng virus,

chống viêm và chống ô xy hóa. Thường laccase loại này được sản xuất và thu nhận từ

nấm thuốc như Clitocybe maxima, Hericium erinaceum, Pleurotus eryngii, Tricholoma

giganteum, Lentinus tigrinus, Agrocybe cylindracea[31, 97,100]. Laccse còn là thành

phần tạo nên mỹ phẩm và lọc nước để tạo ra hệ nước sạch bởi tính xúc tác của enzyme.

Đặc biệt laccase có tiềm năng rất cao trong công nghệ nano sinh học. Nhờ sử dụng các

bề mặt có kích thước nano để cố định laccase nên người ta đã tạo ra các sensor sinh

học đa chức năng và có độ chính xác cao, sử dụng để phát hiện các chất như

15

catecholamine, dopamine dẫn truyền xung thần kinh, epinephrine và norepinephrin v.v.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Các laccase sử dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau hiện nay đều có nguồn

gốc chủ yếu từ nấm đảm [16, 42, 66, 78].

1.2.8.5. Các ứng dụng khác của laccase

Ứng dụng của laccase vào các lĩnh vực khác nhau được Kunamneni và đtg [43]

tổng quan từ các sáng chế. Các tác giả đã tổng hợp các ứng dụng hiện nay của laccase

trên thế giới thể hiện ở các phát minh sáng chế trong vài chục năm gần đây. Laccase có

thể được tổng hợp để tạo thành các loại thuốc chống ưng thư. Ví dụ như katarantme,

vindoline đến sản phẩm vinblastine hiện sử dụng hữu hiệu để điều trị bệnh máu trắng.

Loại thuốc khác chống ưng thư có thể tổng hợp được khi sử dụng laccase của phát

minh liên quan đến laccase có tên là actinocin.

Laccase sử dụng để tạo ra các chất tẩy rửa như rửa bát đĩa và giặt quần áo, loại

bỏ sơn, rõ nhất là loại bỏ vết chè và cà phê. Laccase còn có thể loại bỏ được rất nhiều

chất hóa học ô nhiễm dạng trơ và tạo nên các chất polyme là công cụ rất hữu hiệu cho

mục đích tái tạo môi trường.Laccase có thể giảm nồng độ của các chất tổng hợp khác

vòng, làm hạn chế mùi hôi từ các bãi rác thải, phế thải chăn nuôi gia súc.

Đặc biệt laccase trong tổ hợp với một hay nhiều các enzyme khác như

xylanase, amylase, glucosidase, cellulolase, pectinase, esterase, glucuronidase,

acetaldehyde dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, pyruvate dehydogenase sẽ có

hiệu quả cao hơn trong các ứng dụng kể trên.

Laccase hiện là một trong các enzyme được quan tâm nhất trong tiền xử lý

lignocellulose. Laccase tham gia vào quá trình phá vỡ cấu trúc polymer của lignin, là

chất xúc tác bước đầu và cùng với các enzyme khác để tạo nên nguyên liệu đầu vào

của rất nhiều chuyển hóa tạo đường cho các sản phẩm cuối cùng là nhiên liệu sinh học

hay các cụm các chất hóa học kiến tạo (12 chemical building blocks).

Với tiềm năng ứng dụng cao cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, máy

móc thiết bị công năng cao để giải trình tự gene, protein, tin sinh học, nano sinh học và

16

tinh chế sinh học chúng ta có thể tạo nên các cơ thể tái tổ hợp “vi sinh vật robot” chứa

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

nhiều gene có thể biểu hiện cao để sản xuất công nghiệp tạo nên các vật liệu và sản

phẩm theo mong muốn.

1.2.9. Chi Polyporus và những đặc tính của nó

Polyporus là một chi nấm làm mục gỗ và là chi điển hình của họ Polyporaceae.

Các loài trong chi này phân bố khắp thế giới, có quả thể với cuống, có các lỗ giống như

cấu trúc mang bào tử. Mặc dù hầu hết các loài được phát hiện trên gỗ mục nhưng một

số loài như Polyporus admirabilis, P. coronadensis and P. squamous có thể sinh

trưởng trên các cây gỗ sống. Các loài trong chi này có quả thể với mũ và cuống. Quả

thể dạng thịt hoặc dai khi còn tươi và rắn hoặc dễ vỡ khi bị khô. Phía trên bề mặt mũ

có thể nhẵn hoặc có vảy, hầu hết có màu nâu vàng hoặc nâu với các lỗ ở mặt dưới có

màu trắng hoặc màu kem. Các lỗ có dạng hình tròn hoặc dạng góc, và các ống thường

không đính kèm, chạy dọc theo chiều dài của thân cây nấm. Bào tử trong như pha lê,

nhẵn và thành dày. Các loài trong chi Polyporus được phân thành 6 nhóm dựa theo

hình thái và các phân tích sinh học phân tử (Sotome et al., 2008). Dựa trên đặc điểm

hình thái, 2 loài Polyporus (P. dictyopus, and P. tuberaster) đã được phát hiện lần đầu

tiên ở Hàn Quốc .

Các loài Polyporus sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào có khả năng phân hủy

cellulose và lignin. Đồng thời, nhiều loài trong chi này cũng có khả năng chuyển hóa

hay phân hủy nhiều hợp chất độc hại khác như thuốc nhuộm và các hợp chất PAH

(polycyclic aromatic hydrocarbon). Nhiều loài trong số chúng đã được nghiên cứu về

thành phần hóa học và thu được các alkaloid, quinone pyrone, terpenoid từ quả thể

hoặc từ dịch nuôi cấy. Một vài hợp chất này đã được tách chiết bằng kỹ thuật phân tách

dựa trên thử nghiệm sinh học thông qua hoạt tính kháng khuẩn hoặc miễn dịch.

Polyporus sanguineus tạo lignin peroxidase, manganese peroxidase với hiệu

suất cao nhất trên môi trường chứa 0,5% cao malt và petone hoặc cao malt có bổ sung

17

muối khoáng còn laccase trên môi trường chứa cao malt có bổ sung bã mía. Polyporus

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

tenuiculus đã được chứng minh có khả năng sinh trưởng trên lignocellulose và phân

hủy chất thải loại này. Do đó, loài Polyporus tenuiculus có tiềm năng được sản xuất

thương mại và sử dụng để xử lý lignocellulose và các chất thải hữu cơ sinh học khác.

Ngoài ra, khả năng sinh laccase của 2 chủng P. arcularius DSH92132 và P. arcularius

JZB2115031 chưa được ghi nhận trong các công bố trong những năm gần đây.

P. brumalisi brc05015 có khả năng sinh tổng hợp laccase cao với hoạt tính

7.720 U/L trên môi trường lỏng. Theo Nakade và cộng sự hoạt tính laccase được sinh

bởi chủng P. brumalis ibrc05015 có khả năng sinh tổng hợp laccase cao nhất đạt

34.600 U/L khi bổ sung 0,25 mM CuSO4 vào môi trường sau 29 nuôi cấy. Laccase ở

chủng này cũng đã được tách chiết và xác định đặc tính. Đặc biệt là nó có khả loại màu

một số thuốc nhuộm công nghiệp như Poly R-478 với sự có mặt của chất gắn kết

violuric acid -VIO. Hiệu suất laccase tăng đáng kể (102,2 U/L) trong quá trình loại

màu azo amaranth và phân hủy benzo[a] pyrene bởi chủng S133[27]. Do đó, laccase và

1,2-dioxygenase có thể giữ vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa và phân hủy

các hợp chất vòng thơm. Laccae từ Polyporus rubidus có khả năng loại 4 màu hoạt tính

bao gồm Reactive bue, Reactive orange, Ramazol black and Congo red. Đồng thời,

nước thải nhuộm cũng được xử lý ở quy mô phòng thí nghiệm với laccase của chủng

này được cố định trên Na-alginate.

P. brumalis có khả năng phân hủy dibutyl phthalate thành phthalic acid

anhydride và một số hợp chất thơm khác. Từ đó phân hủy hợp chất này bởi P.

brumalis đã được giả định đi theo hai con đường là chuyển vị ester và ester hóa.

Laccase từ chủng Polyporus sp. có khả năng phân hủy indigo thành isatin (indole-2,3-

dione), rồi tiếp theo thành anthranilic acid (2-aminobenzoic acid). Chủng Polyporus sp.

S133 được phân lập từ đất ô nhiễm, có khả năng phân hủy 92% hợp chất hydrocarbon

thơm (phenanthrene) trong môi trường nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng, chủng

S133 sinh tổng hợp một số enzyme như manganese peroxidase, lignin peroxidase,

18

laccase, 1,2-dioxingenase và 2,3-dioxygenase. Chủng Polyporus sp. S133 cũng có khả

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

năng phân hủy 90% pyren theo cơ chế đồng trao đổi chất với hàm lượng 5 mg trong

môi trường sau 30 ngày nuôi cấy. Trong quá trình phân hủy pyren bởi chủng này, pH

tối ưu cho sinh tổng hợp laccase, 1,2-dioxygenase và tạo sinh khối lần lượt là 3, 5 và 4,

trong khi đó nhiệt độ tối ưu cho laccase là 25ºC , 1,2-dioxygenase và tạo sinh khối là

50 ºC [27].

Laccase từ Polyporus sp. đã được tinh sạch và xác định đặc tính. Cùng với

laccase, 2 enzyme mannanase và xylanase cũng được phát hiện trong quá trình sinh

trưởng của chủng này. Gene laccase đã được tách dòng thành công từ P.

grammocephalus TR16 và được biểu hiện ở Pichia pastoris. Đồng thời các đặc điểm

của laccase tái tổ hợp cũng đã được khảo sát. Ryu và đtg (2008) đã bước đầu xác định

được các đặc tính phân tử của 2 enzyme laccase liên quan đến khả năng phân hủy

lignin ở nấm đảm P. blumalis (KFRI 20912) cũng như phân hủy nhiều hợp chất độc

hại khác.

Bên cạnh đó, Polyporus thuộc ngành Basidiomycota và cùng với một số nấm sợi

thuộc ngành Ascomycota được coi là nguồn dược liệu quan trọng như các chất kháng

khuẩn. P. arcularius đã được ghi nhận có khả năng sinh tổng hợp các cấu trúc

norsesquiterpene như drimane với hoạt tính kháng khuẩn Gram dương như

Staphylococcus aureus. Đã có một vài nghiên cứu được tiến hành về các phân đoạn

kháng khuẩn khác nhau của Polyporus và tối ưu hóa các thông số nuôi cấy trong điều

kiện lên men chìm đối với 2 loài Polyporus (P. tricholoma and P. tenuiculus) cũng đã

được thực hiện. Hợp chất isodrimenediol được sản sinh từ Polyporus tricholoma có

hoạt tính kháng Staphylococcus aureus. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng P.

arcularius có khả năng sản sinh acid cryptoporic H, các acid isocryptoporic H và I.

Hơn nữa, dịch chiết của nấm nuôi trong môi trường dịch thể có khả năng kháng khuẩn.

Otaka đã tách chiết được hoạt chất sesquiterpene mới (1 và 2) từ sợi nấm P. arcularius

19

nuôi trong môi trường dịch thể. Tám hợp chất steroid chính có thể được sử dụng làm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

dược phẩm đã được xác định ở Polyporus umbellatus bằng sắc ký lỏng cao áp kết hợp

với quang phổ khối.

1.3. Thuốc nhuộm và các đặc tính cơ bản của chúng

1.3.1. Khái quát và phân loại về thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như thực

phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, in ấn, công nghiệp dệt nhuộm và công nghiệp thuộc da.

Ước tính có hơn 10.000 loại thuốc màu và chất màu khác nhau thường được sử dụng.

Tổng sản lượng màu hữu cơ của thế giới lên tới hơn 100.000 tấn/năm. Hai phần trăm

màu được tạo ra bị thất thoát trực tiếp vào nguồn nước và hơn 10% sau đó bị mất mát

trong quá trình nhuộm màu vải do khả năng hấp thụ kém của chúng vào sợi vải [11].

Do đó, nước thải dệt nhuộm có tác động tiêu cực về tổng hàm lượng cacbon hữu cơ

(Total Organic Carbon - TOC), nhu cầu oxy sinh học (Biological Oxygen Demand -

BOD), nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand - COD), chất rắn lơ lửng, độ

mặn, màu sắc, giá trị pH (5-12) và các hợp chất hữu cơ khó phân hủy, chẳng hạn như

thuốc nhuộm azo. Tỷ lệ BOD / COD dao động từ 0,2 đến 0,5 và cho thấy rằng nước

thải dệt nhuộm có chứa một tỷ lệ lớn chất hữu cơ khó phân hủy [38,40]. Nước thải sinh

ra từ dệt nhuộm thường có nhiệt độ cao, pH lớn, chứa nhiều loại hóa chất, thuốc nhuộm

khó phân hủy, độ màu cao. Nếu không được xử lý tốt, nước thải do dệt nhuộm sẽ gây ô

nhiễm môi trường, đặc biệt là gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm [7]. Bởi vậy,

việc loại bỏ thuốc nhuộm trước khi thải vào môi trường là hết sức cần thiết. Việc xử lý

các màu khó phân hủy và các chất độc bằng công nghệ thông thường luôn không hiệu

quả hoặc không thân thiện với môi trường và có thể gây ô nhiễm thứ cấp. Ngày nay

việc sử dụng công nghệ sinh học trong loại màu và phân hủy thuốc nhuộm đang được

20

quan tâm và phát triển.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Thuốc nhuộm tổng hợp rất đa dạng về thành phần hóa học, màu sắc, phạm vi sử

dụng. Tùy thuộc cấu tạo, tính chất và phạm vi sử dụng, thuốc nhộm được phân chia

thành các họ, các loại khác nhau. Cách phân loại theo cấu trúc hóa học dựa trên bản

chất của nhóm mang màu (chromogen), có 12 chromogen chính, từ đây phân thành 20-

30 họ thuốc nhuộm khác nhau. Các nhóm thuốc nhuộm liệt kê dưới đây hiện đang

được sử dụng phổ biến trên phạm vi quốc tế.

Thuốc nhuộm azo: Nhóm mang màu là nhóm azo (-N=N-), phân tử thuốc nhuộm có

một (monoazo) hay nhiều nhóm azo (diazo, triazo, polyazo). Đây là họ thuốc nhuộm

quan trọng nhất và có số lượng lớn nhất, chiếm khoảng 60-70% số lượng các thuốc

nhuộm tổng hợp, chiếm 2/3 các màu hữu cơ trong Color Index, dùng để nhuộm vải,

sợi, giấy, da, cao su, chất dẻo v.v.

Nhóm này gồm hầu hết các loại thuốc nhuộm theo phân lớp kĩ thuậtđó là thuốc

nhuộm hoạt tính, thuốc nhuộm trực tiếp, thuốc nhuộm basic, thuốc nhuộm cation,

thuốc nhuộm phân tán, thuốc nhuộm azo không tan và pigment.

Phẩm màu azo và pigment azo được tạo thành từ 2 phản ứng gồm phản ứng diazo hóa

và phản ứng ghép đôi.Phản ứng diazo là phản ứng giữa acid nitro và muối của amin

thơm bậc 1 gọi là diazonium.

Thuốc nhuộm anthraquinon: Trong phân tử thuốc nhuộm chứa một hay nhiều nhóm

21

anthraquinon hoặc các dẫn xuất của nó.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Họ thuốc nhuộm này chiếm vị trí thứ 2 sau thuốc nhuộm azo và chiếm đến 15%

số lượng thuốc nhuộm tổng hợp.

Thuốc nhuộm triarylmethane: Triarylmethane là dẫn xuất của methane mà trong đó nguyên

tử C trung tâm sẽ tham gia liên kết vào mạch liên kết của hệ mang màu.

diarylmethane

triarylmethane

Họ thuốc nhuộm này phổ biến thứ 3, chiếm 3% tổng số lượng thuốc nhuộm.

Thuốc nhuộm phtaloxianin: Hệ mang màu trong phân tử của chúng là hệ liên hợp

khép kín. Đặc điểm chung của họ thuốc nhuộm này là những nguyên tử H trong

nhóm imin dễ dàng bị thay thế bởi ion kim loại còn các nguyên tử N khác thì tham

gia tạo phức với kim loại làm màu sắc của thuốc nhuộm thay đổi. Họ thuốc nhuộm

này có độ bền màu với ánh sáng rất cao, chiếm khoảng 2% tổng số lượng thuốc

22

nhuộm.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Ngoài ra, còn các họ thuốc nhuộm khác ít phổ biến, ít quan trọng hơn nhưthuốc

Bảng 1.2. Một số loại thuốc nhuộm hoạt tính

nhuộm nitroso, nitro, polymethyl, arylamin, azomethyn, thuốc nhuộm lưu huỳnh v.v.

Nhóm Màu C.I Ký hiệu λmax (nm)

Trọng lƣợng phân tử (g/mol) Độ hòa tan (g/l)

Axit xanh 62 62045 NY3 400,5 40 595

Axit xanh 281 - NY5 580,6 20 600 Anthraquinone Remazol Brilliant 61200 RBBR 626,5 - 595 Blue R

Axit đỏ 299 - NY1 519,6 10 520

Azo Axit đỏ 266 17101 NY7 4678 15 499

Axit xanh 113 26360 IN13 637,7 45 560

Dimaren Black CLS 600 Màu thương

mại Everzol Red LF-2B 595

1.3.2. Khả năng phân hủy, loại màu thuốc nhuộm bởi vi sinh vật sinh laccase

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và công nghệ sinh học nói

23

riêng việc sử dụng các vi sinh vật và enzyme từ vi sinh vật để giảm thiểu lượng clo tiêu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

thụ và hóa chất tẩy đã được nhiều nhóm tác giả nghiên cứu và chứng minh là giải pháp

công nghệ có tính khả thi và mang lại hiệu quả kinh tế cao. Chủng Aspergillus sojae

B10 thể hiện khả năng loại màu azo amaranth, congo red và sudan III trong môi trường

nghèo nitơ sau 3-5 ngày nuôi cấy [79]. Nhiều chủng nấm phân hủy gỗ khác như

Aspergillus fumigatus G-2–6 và Aspergillus oryzae, có khả năng loại màu một phạm vi

lớn các màu có cấu trúc khác nhau đã được phân lập và tìm thấy hiệu quả loại màu cao

hơn loài nấm đảm P. chrysosporium [41]. Aspergillus ochraceus NCIM-1146 thể hiện

hiệu quả loại màu thuốc nhuộm malachite green và cotton blue bằng cách sử dụng hệ

sợi sau khi phát triển 96 h [82]. Nấm đảm P. chyrsosporium có khả năng loại 90% màu

hỗn hợp niken phthalocyanin, xanh reactive (200 mg/L) và hỗn hợp màu hoạt tính Cu

phthalocyanin theo thứ tự sau 17 và 20 ngày [29]. Nghiên cứu chứng minh sự loại màu

và phân hủy màu thuốc nhuộm Reactive blue-25 bởi A. ochraceus NCIM-1146 và xác

định sản phẩm phân hủy của nó cũng như giám sát việc sinh tổng hợp enzyme ngoại

bào laccase, tyrosinase và LiP trong dịch nuôi cấy trong quá trình loại màu [59]. Chang

và đtg [15] tìm thấy chủng Escherichia coli đột biến có khả năng loại màu azo

Reactive red 22. Rhodobacter sphaeroides loại màu Methyl orange [90]. Rất ít nghiên

cứu về khả năng loại màu của nấm men. Chỉ tìm thấy một vài chi nấm men thuộc

Ascomycetous như Candidazeylanoides, C. tropicalis, Debaryomyces polymorphus và

Issatchenkia occidentalis có khả năng phân hủy bằng hệ enzyme và loại màu các thuốc

nhuộm azo khác nhau [52, 69].

Theo kết quả phân tích LC-MS, laccase từ chủng nấm Polyporussp. S133 có khả

năng phân hủy màu RBBR thành hai sản phẩm nhỏ là sodium 1-amino-9,10-dioxo-

9,10-dihydroanthracene-2-sulfonate vàsodium 2-((3-aminophenyl)sulfonyl)ethyl

sulfate. Tuy khối lượng phân tử của những sản phẩm phân hủy nhỏ hơn nhưng độc tính

không hề ít hơn so với hợp chất ban đầu [27]. Vì vậy, hiệu quả loại màu có thể cao

nhưng quá trình xử lý màu thuốc nhuộm vẫn cần được tiếp tục nghiên cứu cho đến khi

24

loại bỏ được hoàn toàn các sản phẩm trung gian nguy hại với sức khỏe con người.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Nấm có khả năng phân hủy thuốc nhuộm hiệu quả bởi enzyme ngoại bào như

peroxidase và phenol oxidase. LiP và MnP có cơ chế phản ứng tương tự các enzyme

oxy hóa bởi H2O2 đến một trạng thái oxy hóa trong chu kỳ xúc tác của nó. LiP xúc tác

cho phản ứng oxy hóa các hợp chất không chứa phenol như rượu veratryl. MnP ưu tiên oxy hóa Mn2+ thành Mn3+, và Mn3+ chịu trách nhiệm oxy hóa rất nhiều hợp chất phenol

[25].

Trên thế giới hiện nay đã có các quy trình xử lý màu thuốc nhuộm của nước thải

bằng vi sinh vật. Selvam và đtg [85] đã công bố hai chủng là Schizophyllum commune

và Lenzites eximia có khả năng loại màu nước thải trong công nghiệp nhuộm. Trong

đó, chủng Schizophyllum commune loại được 76,15% khi xử lý theo mẻ và ở điều

kiện xử lý liên tục loại được 55,92% màu; còn chủng Lenzites eximia loại được lần lượt

là 75,23% và 54,60% màu sau 5 ngày xử lý. Một nghiên cứu khác của Rani và đtg [70]

sử dụng chủng nấm Daedalea flavida đã loại bỏ được 80% màu metani yellow sau 10

ngày với nồng độ ban đầu 50 ppm. Một nghiên cứu khác đã chứng minh được chủng

nấm Coriolus versicolor có khả năng loại được 82 % màu Everzol T Blue G sau 50 h

với qui mô 10 lít [39]. Theo Selvam và đtg [84], hai loài nấm Schizophyllum commune

và Lenzites eximia có khả năng loại màu nước thải trong công nghiệp nhuộm. Trong

đó, chủng Schizophyllum commune loại được 76,15% xử lý theo mẻ và ở điều kiện

nước chảy liên tục loại được 55,92%, còn Lenzites eximia loại được lần lượt là 75,23%

và 54,60% sau 5 ngày xử lý. Ở Việt Nam Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã nghiên cứu ở qui mô hiện trường (50±3 m3), sử dụng chủng nấm đảm Cerrena sp. FBV25 cố định

trên vật liệu polypropylene đã loại bỏ 97% màu hoạt tính với nồng độ ban đầu là 280

mg/l trong nước thải ở nhà máy Nhuộm Nam Định sau 8 ngày xử lý [2].

Việc sử dụng các vật liệu và nguồn vi sinh vật nhập khẩu phức tạp bởi các qui

định an toàn sinh học và đôi khi VSV hoạt động không có hiệu quả do không cạnh

tranh được với VSV bản địa. Ngoài ra, điều kiện kinh tế của các doanh nghiệp hạn chế

25

trong chi phí cho xử lý nước thải chứa thuốc nhuộm. Hơn nữa, nước ta là nước nhiệt

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

đới, có đa dạng vi sinh vật cao và đặc biệt là nấm có khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme

oxidoreductase và peroxidase như Lac, LiP và MnP v.v. Do đó việc tìm kiếm, phát

hiện và khai thác enzyme ngoại bào ở Việt Nam để xử lý các chất đa vòng thơm trong

đó có PAH, phenol và thuốc nhuộm sẽ mở ra triển vọng lớn trong việc làm sạch các

chất ô nhiễm nhằm giảm bớt tác hại mà chúng gây ra đối với môi trường sống của con

người.

1.3.3. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và tác hại

1.3.3.1. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm do thuốc nhuộm

Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm phụ thuộc vào các hóa chất, chất trợ, thuốc

nhuộm và công nghệ sử dụng. Trong đó ô nhiễm do thuốc nhuộm trở thành vấn đề chủ

yếu đối với nước thải dệt nhuộm. Thuốc nhuộm sử dụng hiện nay là các sản phẩm tổng

hợp hữu cơ. Nồng độ thuốc nhuộm trong môi trường nước tiếp nhận đối với công đoạn

dệt-nhuộm phụ thuộc vào một số yếu tố: mức độ sử dụng hàng ngày của thuốc

nhuộm,độ gắn màu của thuốc nhuộm lên vật liệu dệt, mức độ xử lý trong các công

đoạn xử lý nước thải, hệ số pha loãng trong nguồn nước tiếp nhận.

Mức độ gắn màu là một yếu tố quan trọng, nó phụ thuộc vào độ đậm màu, công

nghệ áp dụng, tỷ lệ khối lượng hàng nhuộm và dung dịch nước dùng trong máy nhuộm,

vật liệu và thuốc nhuộm sử dụng. Tổn thất thuốc nhuộm đưa vào nước trung bình là

10% với màu đậm, 2% với màu trung bình và < 2% với màu nhạt.

1.3.3.2. Tác hại của ô nhiễm thuốc nhuộm

Họ thuốc nhuộm azo và các sản phẩm phân hủy thứ cấp có vòng thơm mang

nhóm amine độc và gây đột biến đối với các cơ thể sống.

Các thuốc nhuộm hữu cơ nói chung được xếp loại từ ít độc đến không độc đối

với con người được đặc trưng bằng chỉ số LD50. Các kiểm tra về tính kích thích da, mắt

cho thấy đa số thuốc nhuộm không gây kích thích với vật thử nghiệm (thỏ) ngoại trừ

một số cho kích thích nhẹ.

26

Các thuốc nhuộm azo được sử dụng nhiều nhất trong ngành dệt, tuy nhiên chỉ có

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

một số màu azo, chủ yếu là thuốc nhuộm benzidin, có tác hại gây ung thư. Các nhà sản

xuất châu Âu đã ngừng sản xuất loại này, nhưng trên thực tế chúng vẫn được tìm thấy

trên thị trường do giá thành rẻ và hiệu quả nhuộm màu cao.

Thử nghiệm trên cá của hơn 3000 thuốc nhuộm được sử dụng thông thường cho

thấy thuốc nhuộm nằm trong tất cả các nhóm từ không độc, độc vừa, độc, rất độc đến

cực độc. Trong đó có khoảng 37% thuốc nhuộm gây độc vừa đến độc cho cá và thủy

sinh, chỉ 2% thuốc nhuộm ở mức độ rất độc và cực độc cho cá và sinh vật thủy sinh.

Khi đi vào nguồn nước nhận như sông, hồ, v.v. với một nồng độ rất nhỏ thuốc

nhuộm đã cho cảm nhận về màu sắc. Thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng càng nhiều thì

màu nước thải càng đậm. Màu đậm của nước thải cản trở sự hấp thụ oxy và ánh sáng

mặt trời, gây bất lợi cho sự hô hấp, sinh trưởng của các loài thủy sinh vật. Nó tác động

xấu đến khả năng phân giải của vi sinh đối với các chất hữu cơ trong nước thải. Các

nghiên cứu cho thấy khả năng phân giải trực tiếp thuốc nhuộm hoạt tính bằng vi sinh

rất thấp. Ở Việt Nam, qua số liệu điều tra tại các công ty dệt may lớn đều cho thấy màu

nước thải dệt nhuộm chủ yếu do thuốc nhuộm hoạt tính và một phần do các loại thuốc

27

nhuộm không tan hết khác gây ra.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu và phƣơng pháp

2.1.1. Vật liệu

Sáu mươi mẫu nấmtừ gỗ mục, gỗ tươiđã được thu thập từ rừng Quốc gia

Bidoup- Núi Bà tỉnh Lâm Đồng để phân lập sàng lọc các chủng nấm có khả năng sinh

enzyme ngoại bào vàdựa vào màu chỉ thị xuất hiện ở môi trường phân lập để chọn các

chủng sinh laccase.

2.1.2. Hóa chất

Hóa chất sử dụng để nghiên cứu là các hóa chất các hóa chất tinh khiết, đảm bảo

chất lượng như ABTS, guaiacol, catechol, veratryl alcohol, VIO, các hóa chất sinh học

phân tử v.v của các hãng Sigma, Merk, Aldrich và các hóa chất thông thường có xuất

xứ từ Trung Quốc, Việt Nam.

ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’

Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR:

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị chính bao gồm: cân kỹ thuật Navigator (Ohaus), máy đo pH Hanna

(Mỹ), tủ cấy vô trùng Laminar (Pháp), tủ sấy Lenton Themal (Anh), nồi khử trùng

ACP (Nhật Bản),máy chu trình nhiệt, máy xác định trình tự gen tự động ABI PRISM

3100 Avant Genetic Analyzer, máy điện di DNA (Bio-Rad), máy nuôi lắc ở các nhiệt độ 30oC, 37oC, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf (Đức), tủ lạnh các loại 4oC, - 20o, máy đo quang phổ Novaspec II (Đức), lò vi sóng, pipet của hãng Eppendorf, bình

tam giác, đầu côn, ống ly tâm v.v.

2.1.4. Các môi trường nuôi cấy

Các môi trường khác nhau gồm TSH1, PDA, PBD, Czapek, MEG, GYMP, Vis,

Mechi sử dụng trong nghiên cứu được khử trùng ở 115ºC trong 30 phút trước khi sử

28

dụng để nuôi cấy. Thành phần các môi trường được trình bày ở phụ lục 1.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào

Sáu mươi mẫu nấm đã được thu thập từ vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà thuộc

tỉnh Lâm Đồng. Các mẫu này được bảo quản trong các dụng cụ vô trùng và phân tích

ngay sau khi thu mẫu từ 3h đến 120h. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào đã được

tiến hành cùng lúc với phân lập nấm trên các môi trường thạch có chất chỉ thị. PDA là

môi trường được sử dụng để phân lập các mẫu nấm tươi này. Những năm gần đây,

guaiacol và syringaldazine bổ sung vào môi trường như các chất chỉ thị để quan sát sự

xuất hiện màu xung quanh sự phát triển của vi sinh vật. Trong thí nghiệm này, guaiacol

0,01% được bổ sung vào môi trường PDA rắn, enzyme ngoại bào được tiết ra và phản

ứng với guaiacol tạo thành màu nâu đỏ trên đĩa thạch.

Mẫu nấm đảm được cắt nhỏ với kích thước khoảng 0,5 x 0,5 cm sau đó đặt lên

đĩa thạch có chứa sẵn môi trường PDA bổ sung guaicol để làm chất chỉ thị và các đĩa thạch này được nuôi ở 30 0C trong thời gian 2 – 4 ngày. Chọn các chủng nấm tạo thành

màu nâu đỏ trên đĩa thạch tiến hành tách riêng và làm sạch.

2.2.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào

Từ các chủng nấm đã được làm sạch, ta sẽ tiến hành sàng lọc khả năng sinh các

enzyme ngoại bào khác nhau. Môi trường sử dụng trong thí nghiệm (TSH1): dịch chiết khoai tây: 200 g/l, glucose: 10 g/l, cám: 0,1%, bột đậu tương 0,5% và Cu2+: 0,1 mM trong bình tam giác 250 ml ở 300C và 200 rpm. Hoạt tính laccase của các chủng nấm

được xác định sau từng ngày nuôi cấy [6].

2.2.3. Phương pháp thu dịch laccase trên môi trường lên men lỏng để xác định hoạt

tính

Laccase trong các bình nuôi cấy được thu trong tủ cấy vô trùng Laminar (Pháp),

thao tác thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn. Với các thiết bị sử dụng để thu dịch là pipet

1000µl, các đầu tuýp 1ml và Eppendoft (Đức) 1,5-2ml. Dùng pipet đã gắn đầu tuýp hút

29

dịch enzyme trong các bình môi trường chứa chủng nấm vào các eppendoft, sau đó

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

đem ly tâm ở 12000v/p tại 4ºC trong 10 phút, dịch nổi thu được sử dụng để xác định

hoạt tính laccase.

2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase

Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hóa ABTS của laccase tạo thành hợp chất hấp thụ

ở bước sóng 420 nm, ở điều kiện thí nghiệm.

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng laccase cần thiết để tạo thành

1µM sản phẩm từ ABTS trong thời gian 1 phút, ở điều kiện thí nghiệm.

Thành phần phản ứng:

Thành phần phản ứng Mẫu đối chứng (µl) Mẫu thí nghiệm (µl)

Đệm natri axetat 20mM (pH 3) 800 600

Dịch laccase 0 200

ABTS 1 mM 200 200

Công thức tính:

U=

Trong đó: U: Hoạt độ laccase (U/l)

: hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm ở bước sóng 420nm

(420= 36 000 M-1cm-1)

,kkVpư: Tổng thể tích phản ứng (1 ml)

VE: Thể tích laccase (0,2 ml) ODτ: Giá trị OD đo được tại thời điểm

OD: Giá trị OD đo được tại thời điểm =0

Df: Độ pha loãng

2.2.5. Phân loại chủng nấm

2.2.5.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống

30

Chủng FBD154 được phân loại theo phương pháp truyền thống dựa vào hình

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

thái của khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy và làm tiêu bản để quan sát cuống sinh bào

tử trên kính hiển vi quang học.

Tách DNA tổng số từ nấm

Chủng nấm FBD154 được nuôi cấy trên môi trường PDA đến khi đủ

lượng sinh khối để tách DNA. Quá trình tách và thu nhân DNA tổng số được

thực hiện theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001). Các bước thực

hiện được trình bày ở phụ lục 3.

Khuếch vùng trình tự ITS

2.2.5.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS

Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự ITS là

ITS1-ITS4. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở phụ lục 4 và 5.

Cặp mồi ITS1 và ITS4 được sử dụng để nhân vùng trình tự ITS1 - 5,8 S -

ITS2 từ DNA tổng số của chủng FBD154. Sản phẩm DNA sau khi đã được

khuếch đại bằng kỹ thuật PCR được làm sạch bằng kit QIAGen. Sản phẩm PCR

sau khi tinh sạch được xác định trình tự trực tiếp bằng máy đọc trình tự tự động

ABI PRISM 3100 Avant Data Collection V1.0 và Sequencing Analysts.

Trình tự các đoạn gen được xử lý bằng phần mềm FinchTV và so sánh với

các trình tự đã được công bố trên GenBank (NCBI database). Cây phát sinh

chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6.06.

2.2.5.3. Phương pháp xác định trình tự vùng ITS

2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng

hợp laccase

Môi trường có khả năng sinh laccase cao nhất được chọn lọc theo các yếu tố

sau:

31

(Mỗi yếu tố thí nghiệm được lặp lại ít nhất 2 lần).

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

2.2.6.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Các môi trường nuôi cấy nấm khác nhau gồm: PDB, GYMP, Czapek, Mechi,

TSH1, VIS được sử dụng trong nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả

năng sinh laccase của chủng FBD154.

2.2.6.2. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng

Các hợp chất gồm: tyrosine, vanilin, veratryl alcohol, galic acid, CuSO4, FeSO4 ,

NiCl2với nồng độ 1 mM đã được sử dụng như là các chất cảm ứng để đánh giá sự ảnh

hưởng đến sinh tổng hợp laccase của FBD154.

2.2.6.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Dải pH 2-11 đã được sử dụng để đánh giá khả năng sinh trưởng và sinh laccase

trên môi trường TSH1 của chủng nấm FBD154. Đánh giá sự thay đổi hoạt tính enzyme

theo thời gian từ sau một ngày nuôi cấy cho đến khi hoạt tính enzyme giảm đã được

tiến hành.

2.2.6.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon là glucose trong môi trường TSH1 được thay thế bởi xylose,

saccharose, rỉ đường, mannose, lactose với nồng độ 10 g/l được sử dụng để nghiên cứu

ảnh hưởng của chúng lên khả năng sinh laccase của chủng nấm FBD154. Ngoài ra còn

có 1 thí nghiệm không sử dụng nguồn cacbon cũng được tiến hành để khảo sát. Thí nghiệm thực hiện trong bình tam giác 250 ml và được nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30oC.

Nguồn cacbon được lựa chọn sẽ được khảo sát theo dãy nồng độ để tìm ra nồng

độ thích hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.6.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ

Nguồn nitơ vô cơ là NaNO3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4NO3, NH4Cl với nồng độ ban đầu là 2 g/l được bổ sung vào môi trường để khảo sát ảnh hưởng của chúng lên

khả năng sinh tổng hợp laccase bởi chủng nấm FBD154.

2.2.6.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ

Nguồn nitơ hữu cơ trong môi trường được thay thế bởi cao malt, cao nấm men,

32

cao thịt, peptone, tripton và casein với nồng độ ban đầu là 1g/l để đánh giá hoạt tính

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

laccase sinh ra bởi chủng nấm FBD154.

2.2.7. Đánh giá hiệu quả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase thô từ

chủng nấm FBD154

Dịch enzyme có nồng độ cuối 1000 U/l được sử dụng để đánh giá khả năng loại

màu với sự tham gia của chất gắn kết. Chất gắn kết sử dụng là VIO (violuric acid),

HBT (Hydroxybenzotriazole), Si (Sinapic acid) , Ace (Acetoncysing)), Syr

(Syringaldehyde). Các thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để đánh giá hiệu quả loại màu

bằng laccase thô gồm các màu thuộc nhóm Anthraquinone (RBBR, NY5)và nhóm azo

(NY1, NY7) với bước sóng hấp thụ cực đại tương ứng 595, 595 và 520, 499 nm. Màu

thương mại (LF-2B, CLS)có bước sóng hấp thụ cực đại tương ứng là 550, 600

nm.Tổng thể tích phản ứng loại màu là 5 ml gồm: đệm natri axetat 20 mM pH 4, thuốc

nhuộm (nồng độ 100 mg/l), dịch enzyme thô (nồng độ cuối 1000 U/l) và chất gắn kết

(nồng độ cuối 200 µM). Nồng độ gốc của các thuốc nhuộm là 3g/l và nồng độ trong

phản ứng loại màu là 100 ppm. Mẫu đối chứng có màu và đệm natri axetat pH 4.

Thành phần và thể tích phản ứng enzyme thể hiện ở phụ lục 2.

Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm được đánh giá trong 24 giờ. Dịch phản ứng

chứa lần lượt các màu được đo tại các bước sóng phù hợp. Khả năng loại màu được

xác định bằng phần trăm hấp phụ của chất khử bằng công thức:

Trong đó D: phần trăm loại màu thuốc nhuộm (%)

Ai: Độ hấp thụ ban đầu

33

At: Độ hấp thụ tại thời gian t

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào

Từ 60 mẫu nấm thu thập từ vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà thuộc tỉnh Lâm

Đồng đã phân lập được 38 mẫu.

Hầu hết các nấm thu được này chỉ đo được laccase, LiP và MnP đo được ở rất ít

mẫu, đa phần là không phát hiện được. Trong 60 mẫu nấm, thì nấm mềm và dai có hoạt

tính laccase cao hơn so với các loại nấm cứng bởi vì nấm mềm và dai dễ nghiền nát

hơn các nấm cứng nên các enzyme ngoại bào dễ dàng xác định hơn. Hoạt tính enzyme

tự nhiên của nấm còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng khác nhau của nấm. Tuy

nhiên số liệu thu được cũng giúp các nhà nghiên cứu định hướng cho các nghiên cứu

Hình 3.1. Hoạt tính tự nhiên của các mẫu nấm từ Bidoup

sâu hơn đối với từng chủng.

Trong 60 mẫu nấm thu thập từ vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà chỉ có 38/60 mẫu

nấm thu được có thể nghiền để xác định hoạt tính vì có một số loại nấm quá rắn không

thể nghiền được. Trong số 38 mẫu xác định hoạt tính laccase, LiP và MnP thì 17/38 đo

được laccase tự nhiên với hoạt tính dao động từ 5 – 496 U/l. Không giống như laccase,

34

đã không xác định được enzyme MnP và LiP trong 17 mẫu nấm nêu trên. Số liệu thu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

được từ xác định enzyme ngoại bào tự nhiên góp phần cung cấp cho ta thông tin quan

trọng về sự hiện diện của cả 3 enzyme laccase MnP và LiP và hơn hết là để tập trung

vào một số chủng có tiềm năng sinh enzyme ngoại bào có hoạt tính cao.

3.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào

Tỷ lệ làm sạch nấm ở mức chấp nhận được, cụ thể là 38/60 mẫu nấm đảm đã

được làm sạch. Để tránh bỏ sót các mẫu nấm sinh enzyme nhưng không đo được trong

mẫu tự nhiên việc phân lập trên môi trường chất chỉ thị đã giúp khắc phục nhược điểm

này. Trên môi trường thạch sàng lọc chứa chất chỉ thị guaiacol, enzyme ngoại bào oxy

hóa chất này tạo nên vùng nâu đỏ sau từ 1-5 ngày nuôi cấy. Chỉ thị này chứng tỏ các

chủng nấm này có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase

Bảng 3.1. Các chủng nấm sinh enzym ngoại bào

(LiP và MnP) hoặc laccase (Bảng 3.1.).

Tên nấm Tên nấm Tên nấm

Tạo vùng nâu đỏ - - - + + + + - + + + - + FBD100 FBD101 FBD105 FBD106 FBD107 FBD108 FBD109 FBD110 FBD111 FBD113 FBD114 FBD116 FBD117 FBD118 FBD121 FBD122 FBD125 FBD126 FBD127 FBD130 FBD131 FBD132 FBD133 FBD135 FBD137 Tạo vùng nâu đỏ - + + + + - - - + + - + FBD138 FBD140 FBD141 FBD143 FBD145 FBD146 FBD148 FBD150 FBD152 FBD154 FBD157 FBD158 FBD161 Tạo vùng nâu đỏ - + + + + + - + + + - + -

Chú thích: (+): Tạo vùng nâu đỏ trên PDA chứa guaiacol, (-) Không tạo vùng

nâu đỏ trên PDA chứa guaiacol

35

Trong các mẫu nấm đã được làm sạch này thì chỉ có 24/38 chủng sinh enzyme

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

ngoại bào. Có tới 12 mẫu tạo vòng nâu đỏ nhưng không xác định được hoạt tính

enzyme tự nhiên. Kết quả này một lần nữa chỉ ra rằng việc nghiền mẫu ban đầu để xác

định hoạt tính tự nhiên rất quan trọng và môi trường phân lập định hướng cũng giúp

chúng ta phần nào cải thiện được hiệu suất phân lập nấm đảm sinh enzyme laccase,

MnP và LiP.

Bảy chủng nấm xuất hiện vùng nâu đỏ có đường kính to và đậm trên môi trường

PDA chứa guaiacol 0,01 % đã được chọn để thử hoạt tính trên môi trường TSH1. Kết

Bảng 3.2. Hoạt tính laccase và hình ảnh khuẩn lạc của 7 chủng nấm trên môi trường PDA

quả thu được trình bày ở bảng 3.2.

HOẠT

HOẠT TÍNH

TÊN

TÍNH TỰ

STT

SÀNG LỌC

MẶT TRƢỚC

MẶT SAU

CHỦNG

NHIÊN

(U/l)

(U/l)

1

FBD106

97

30,54

2

FBD107

6

83

3

FBD111

11

986,65

36

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

HOẠT

HOẠT TÍNH

TÊN

TÍNH TỰ

STT

SÀNG LỌC

MẶT TRƢỚC

MẶT SAU

CHỦNG

NHIÊN

(U/l)

(U/l)

4

FBD122

0

14,5

5

FBD145

0

48,92

6

FBD150

0

37,33

7

FBD154

0

4233

37

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Hình 3.2. Hoạt tính laccase của 7 chủng nấm phân lập từ Bidoup – Núi Bà

Hoạt tính laccase của 7 chủng phân lập được dao động rất lớn từ 14,5 đến

4233,1 U/l (Hình 3.2) và chủng FBD154 sinh laccase với hoạt tính cao nhất (4233,1

U/l). Nên chủng FBD154 được chọn để nghiên cứu tiếp theo.

3.3. Đặc điểm hình thái, phân loại và định danh chủng nấm FBD154

3.3.1. Đặc điểm hình thái

Chủng nấm FBD154 được nuôi cấy trên môi trường PDA bổ sung chất chỉ thị

guaiacol 0,01%. Sau 4 ngày nuôi cấy sợi nấm phát triển tốt, lan rộng trên bề mặt môi

trường, hệ sợi nấm bông xốp có màu trắng, không mịn và tạo vòng nâu đỏ trên môi

trường có chứa chất chỉ thị. Sau 6 đến 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA hệ sợi

nấm bắt đầu chuyển màu nâu đen và 10 ngày lên quả thể.

Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm FBD154

38

Ảnh tự nhiên Sau 4 ngày Sau 7 ngày Sau 12 ngày

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

3.3.2. Phân loại chủng FBD154

Chủng FBD154 đã được phân loại bằng sự kết hợp cả hai phương pháp hình thái

và xác định trình tự vùng ITS.

3.3.2.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống

Quả thể nấm dai khi còn tươi và rắn hoặc dễ vỡ khi bị khô. Phía trên bề mặt mũ

có màu trắng ngàở giữa chuyển sang nâu nhạt với các lỗ ở mặt dưới có màu kem. Các

lỗ sau códạng góc và các ống thường không đính kèm, chạy dọc theo chiều dài của

thân cây nấm.

Quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần, hệ sợi của chủng

FBD154 trong suốt không có vách ngăn, là hệ sợi khí sinh. Dựa vào khóa phân loại của

Hình 3.4. Hệ sợi nấm dưới kính hiển vi quang học

Samson RA (1984) chủng FBD154 được xếp vào ngành Basidiomycota, chi Polyporus

Tuy nhiên, để làm rõ các kết quả phân loại truyền thống, việc xác định và so

sánh vùng trình tự ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2) bởi cặp mồi ITS 1 và ITS 4 của chủng này

với các chủng đại diện tương đồng trên GenBank đã được tiến hành.

3.3.2.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8

S - ITS2)

Trong nhiều công bố, các gene mã hóa rRNA 18S và 28S thường được sử dụng

39

để xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại của nấm. Tuy nhiên, các đoạn trình tự

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

này chỉ phù hợp để xác định các bậc phân loại cao (chi, họ, bộ v.v.). Hiện nay, vùng

ITS (Internal Transcribed Space) bao gồm ITS1 (nằm giữa gene 18S và 5,8S) và ITS2

(nằm giữa gene 5,8S và 28S) đã được sử dụng để phân loại và đánh giá sự đa dạng của

nấm. Đặc biệt để định loại nấm đến loài người ta thường sử dụng đoạn trình tự ITS1 –

5,8S – ITS2. Hai vùng trình tự ITS1 và ITS2 được lựa chọn làm marker chuẩn cho mã

vạch DNA (DNA barcode) của nấm do chúng dễ dàng được khuếch đại từ những lượng

nhỏ DNA (vì số lượng bản copy cao) và có mức độ biến đổi cao giữa các loài có mối

quan hệ gần gũi.

Sản phẩm PCR nhân vùng ITS nêu trên bởi cặp mồi ITS1 và ITS4 từ DNA của

chủng FBD154 đã được giải trình tự với kích thước là 592 nucleotide. Cây phát sinh

Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loài của chủng FBD154

40

chủng loại của chủng nấm FBD154 được thể hiện ở hình 3.5.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Trình tự vùng ITS của chủng nấm FBD154 có mức độ tương đồng 99% với các

chủngPolyporus arcularius DSH92132 (mã số KP283489.1), Polyporus arcularius

JZB2115031 (JQ283966.1). Tương đồng 98% với chủng Polyporus arcularius MI51

(mã số KC581792.1) và tương đồng xa hơn (92%) so với chủng polyporus tricholoma

CulTENN9579 SBI (AF516554.1). Trong các chủng nấm đảm, chi Polyporus không

chỉ có tiềm năng sinh tổng hợp laccase mà các đại diện của chi này còn có khả năng

sinh các enzyme khác như: lignin peroxidase, manganese peroxidase, chitinase,

xylanase v.v. Đồng thời, nhiều loài trong chi Polyporus cũng có khả năng chuyển hóa

hay phân hủy nhiều hợp chất độc hại khác như thuốc nhuộm và các hợp chất PAH

(polycyclic aromatic hydrocarbon). Nấm Polyporus arcularius MI51 được phân lập từ

Tamil Nadu Ấn Độ có khả năng sinh tổng hợp laccase ở mức trung bình với hoạt tính

là 9.300 U/l sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường muối khoáng cơ bản [34]. Ngoài ra

Polyporus arcularius T438 có khả năng sinh tổng hợp laccase với hoạt tính 2.700 U/l

trên môi trường MVM - modified Vogel medium [6] sau 15 ngày nuôi cấy.

Kết quả phân loại dựa trên hình thái và xác định trình tự vùng ITS thì chủng này

thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, chi Polyporus và được đặt tên là Polyporus sp.

FBD154 và được đăng ký trên GenBank với mã số KR 920049.

3.4. Chọn lọc môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy

3.4.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase

của chủng Polyporus sp.FBD154

Môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố rất quan trọng trong quá trình

sinh tổng hợp laccase. Môi trường được sử dụng để đánh giá khả năng sinh enzyme của

chủng Polyporussp.FBD154bao gồm TSH1, PDB, Mechi, Vis, Czapek, Gymp. Sau 6

41

ngày nuôi cấy hoạt tính của chủng FBD154 được thể hiện ở hình 3.6.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh laccase ở chủng Polyporus sp. FBD154

Từ kết quả trình bày ở hình 3.6 cho thấy chủng Polyporus sp. FBD154 có khả

năng sinh trưởng tốt trên môi trường TSH1 và đạt hoạt tính cao nhất là 4.206 U/l sau 5

ngày nuôi cấy còn những môi trường còn lại thì cho kết quả rất thấp thậm chí là không

có hoạt tính. Do vậy, môi trường TSH1 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Theo một số công bố quốc tế thì chủng Polyporus brumalisi brc 05015có khả

năng sinh tổng hợp laccase đạt 7.720 U/L trên môi trường giàu dinh dưỡng MYPG

(0.25 % Bacto malt extract, 0.1 % Bacto yeast extract, 0.1 % tryptone pepton và 0.5 %

glucose) sau 24 ngày nuôi cấy [76]. Theo Michniewicz và cộng sự loài nấm Cerrena

unicolor có khả năng sinh laccase với hoạt tính 4.000 U/L trên môi trường Kirk với sự có mặt của Cu2+ [53]. Bên cạnh đó, Cerrena sp.WR1 cũng có khả năng sinh tổng hợp

laccase trên môi trường PDB [86]. Chủng nấm thuộc Pycnoporus sanguineus sinh

laccase với hoạt tính đạt 5300 U/l sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường GYP có bổ

sung 1 mM CuSO4 [83]. Như vậy với mỗi chủng nấm khác nhau có khả năng sinh

tổng hợp enzyme với hoạt tính khác nhau trên các môi trường thích hợp. Do đó việc

42

lựa chọn thành phần môi trường thích hợp là rất quan trọng cho các nghiên cứu tiếp

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

theo.

3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng

Polyporus sp.FBD154

pH môi trường là một trong các yếu tố quan trọng không những ảnh hưởng đến

sự phát triển mà còn ảnh huởng lớn đến khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh

vật. Trong nghiên cứu này, môi trường TSH1 được sử dụng ở dãy pH từ 2-12 để

nghiên cứu đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của

Hình 3.7. Ảnh hưởng pH môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus sp.FBD154

chủng FBD154.

Từ hình 3.7 ta thấy chủng Polyporus sp. FBD154 có khả năng sinh tổng hợp

laccase ở pH rất rộng từ pH 2- pH 9 và sinh trưởng tốt nhất ở môi trường acid đạt hoạt

tính cao nhất là 18.727 U/l ở pH 4. Ở pH 3 và pH 5 chủng nấm này cũng cho hoạt tính

khá cao lần lượt là 12.835 U/l và 8.344 U/l còn ở các pH 10, pH 11 và pH 12 hoạt tính

enzyme rất thấp nhất chỉ đạt từ 28-74 U/l và sinh khối cũng phát triển kém. Như vậy,

43

pH 4 phù hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp laccase cao nhất ở chủng FBD154.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

pH thích hợp cho khả năng sinh laccase của chủng FBD154 khác với chủng

Polyporus arcularius A08 sinh laccaza tối ưu trong môi trường chứa dịch thủy phân

cám gạo với pH thích hợp là 5,2-5,7. Tuy nhiên, hoạt tính laccaze của chủng này chỉ

đạt 1.480 U/L trên môi trường có pH thích hợp [99]. Theo nhiều tài liệu đã công bố

trong và ngoài nước thì nấm thường sinh trưởng tốt ở pH hơi axit. Loài nấm

Pycnoporus cinnabarinus sinh tổng hợp laccase đạt hoạt tính 24.000U/l trong môi

trường pH 4 với cơ chất là guaiacol (5mM) [23]. Chủng Pycnoporu coccineus

Thongkred 013 BCU sinh trưởng và sinh tổng hợp laccase tốt ở môi trường có pH 5

[57].Tuy nhiên, một số kết quả nghiên cứu khác cho thấy laccase vẫn được sinh ra ở

pH ban đầu kiềm như ở chủng Montospora sp. với pH ban đầu là 8,5 [98], chủng

Pycnoporu s coccineus MUCL38527 hoạt động ổn định ở pH 8. Đặc tính này phụ

thuộc rất nhiều vào nguồn gốc của chủng cho nên chủng FBD154 có thể tạo hoạt tính

laccase cao khác với các chủng đã được công bố.

3.4.3. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp laccase của

chủng Polyporus sp.FBD154

Các nghiên cứu tăng khả năng tổng hợp laccase của VSV bằng các chất cảm ứng

đã và đang trở thành một trong các biện pháp mang lại hiệu quả cao. Các nguồn này

bao gồm các amino acid, các hợp chất thơm, các chất chiết từ thực vật và các kim loại trong đó có Cu2+ [12]. Trong nghiên cứu này, các chất cảm ứng khác nhau đang được

sử dụng ở nhiều nghiên cứu gần đây bởi các nhà khoa học trên thế giới đã được chọn

để bổ sung vào môi trường. Ảnh hưởng của một số chất cảm ứng lên khả năng sinh

tổng hợp laccase bởi Polyporussp. FBD154 đã được khảo sát và kết quả được trình bày

44

ở hình 3.8.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Hình 3.8. Ảnh hưởng của chất cảm ứng lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus sp. FBD154

Các chất cảm ứng FeSO4, veratry alcohol, NiCl2 và axit galic không có tác dụng

cảm ứng khả năng sinh tổng hợp laccase bởi chủng FBD154 sau 120 giờ nuôi cấy hoạt

tính laccase chỉ dao động trong khoảng 8.900-10.000 U/l. Trên môi trường có chứa axit galic và veratry alcohol tương đương với mẫu đối chứng. Ion Fe2+ và Ni2+ dường như

có vai trò ức chế khả năng sinh tổng hợp laccase với hoạt tính chỉ đạt lần lượt 6.700 và

8.085 U/L ở chủng FBD154. Ngược lại, CuSO4, tyrosine và vaniline đều có vai trò cảm ứng sinh laccase. Hoạt tính laccase cao nhất trên môi trường chứa Cu2+ đạt 18.523 U/l

sau 120 giờ còn trên tyrosine và vanillin đạt lần lượt14.102 và 13.005 U/l sau 96 giờ

nuôi cấy (Hình 3.8). Do đó CuSO4 0,1 mM được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Với mỗi loại chất cảm ứng có tác động đến các chủng khác nhau là khác nhau.

Theo công bố của Hou và đtg [30], khi bổ sung guaiacol (1 mM) làm tăng khả năng

sinh laccase từ 2-232 lần ở các chủng nấm khác nhau như Phlebia spp., P. ostreatus.

Tuy nhiên, cũng có những minh chứng về sự ức chế hoạt tính laccase bởi guaiacol ở

chủng Pycnoporus cinnabarinus [23]. Chủng P. ostreatus ATCC MYA-2306 sinh ra

45

các isoenzyme của laccase khi có mặt của ferulic acid (2 mM) trong môi trường nuôi

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

cấy [58]. Rubia và đtg [76] đã chứng minh hiệu suất sinh tổng hợp laccase cao nhất đạt

2.699 U/l đối với loài nấm đảm Phanerochaete flavio-alba khi vanillin được sử dụng

làm chất cảm ứng.

3.4.4. Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng

Polyporus sp.FBD154

Do khi khảo sát các chất cảm ứng thì CuSO4 có vai trò quan trọng nhất đối với

chủng Polyporussp. FBD154 nên việc xác định nồng độ CuSO4 chính xác để tạo

Hình 3.9. Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus sp. FBD154

laccase cao đã được nghiên cứu.

Khi bổ sung CuSO4 ở nồng độ 0,05 - 0,4 mM, hoạt tính laccase đều tăng cao dao

động trong khoảng 16.000-24.000 U/L. Hoạt tính laccase cao nhất là 24.485 U/l ở nồng

độ CuSO4 0,3 mM sau 96 giờ nuôi cấy (Hình 3.9).

Lorenzo và đtg [48] đã nghiên cứu ảnh hưởng của Cu2+ lên khả năng sinh

laccase của Trametes versicolor (CBS100.29), hoạt tính cao nhất tăng 11 lần và đạt 8.000 U/L sau khi bổ sung 3,5 mM Cu2+ vào môi trường nuôi cấy. Hoạt tính laccase

46

được sinh ra bởi chủng Polyporus brumalis ibrc05015 có khả năng sinh tổng hợp

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

laccase cao nhất đạt 34.600 U/L khi bổ sung 0,25 mM CuSO4 vào môi trường sau 29

ngày nuôi cấy. Như vậy, mặc dù hoạt tính laccase của chủng FBD154 thấp hơn so với

chủng này nhưng thời gian để đạt hoạt tính cao nhất của chủng FDB154 ngắn hơn rất nhiều so với loài Polyporus brumalis ibrc05015 trên môi trường chứa nồng độ Cu2+

thích hợp.

3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng

Polyporus sp.FBD154

Để đánh giá ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp laccase

của chủng FBD154 thì nguồn cacbon có trong môi trường TSH1 là glucose được thay

thế bằng các nguồn cacbon khác như xylose, saccharose, lactose, rỉ đường, mannose

với nồng độ 10 g/l. Laccase với hoạt độ khác nhau sinh tổng hợp bởi chủng nấm

Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh laccase của chủng

Polyporus sp.FBD154 Trong các nguồn cacbon được sử dụng để khảo sát, cho thấy chủng FBD154 đạt

FBD154 sau 6 ngày nuôi cấy được thể hiện trong hình 3.10.

hoạt tính laccase cao nhất trong môi trường chứa mannose 29.183 U/l, tiếp theo là

47

lactose với hoạt tính đo được là 28.541 U/l rồi đến glucose đạt 23.386 U/l. Với môi

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

trường có nguồn cacbon là xylose, rỉ đường, saccharose và mẫu đối chứng thì hoạt tính

laccase thấp hơn so với các nguồn cacbon nêu trên đặc biệt là mẫu không bổ sung

đường thì có hoạt tính thấp hơn hẳn. Do đó các loại đường nêu trên đã làm tăng hoạt độ

laccase của chủng FBD154. Từ kết quả này cho thấy trên môi trường TSH1 có bổ sung

thêm nguồn cacbon là mannose, chủng FBD154 sinh tổng hợp laccase cao nhất, nên

đây là nguồn cacbon được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

Theo một số công bố trên thế giới, hoạt tính laccase của chủng Polyporus

arcularius A08 tăng lên 1.480 U/L khi bổ sung nguồn carbon hỗn hợp chứa cám gạo

và hemicelluloses trong môi trường với tỷ lệ C/N cao [99]. Chủng Monotospora sp.

sinh trưởng trên nguồn cacbon là maltose (2g/l) cho hoạt tính là 13.550 U/l (tăng 4 lần

so với môi trường cơ sở) [98].

Theo Strong [90] dùng nước thải có bổ sung 2% cao malt, 0,1% cao nấm men và

0,1% glucose làm tăng hoạt tính laccase của chủng Trametes pubescens MB89 lên 1,7

lần so với mẫu đối chứng. Trong khi đó, Revankar and Lele [75] khi nghiên cứu ảnh

hưởng của các nguồn carbon khác nhau (glucose, fructose, sucrose, lactose, tinh bột, và

glycerol) lên sinh tổng hợp laccase bởi Trametes versicolor MTCC138 nhận thấy rằng

hoạt tính laccase tăng 3 lần khi sử dụng glucose làm nguồn carbon. Một nghiên cứu

khác cũng đã chứng minh glucose có tác dụng làm tăng hoạt tính laccase của loài

Ganoderma lucidum lên 2.565 U/L ở nồng độ 20 g/L [19]. Kết quả nêu trên cho thấy

tầm quan trọng của sự lựa chọn nguồn cacbon trong sinh tổng hợp laccase của mỗi

chủng nấm đảm hay nấm sợi là khác nhau.

3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng

Polyporus sp.FBD154

3.4.6.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh laccase bởi chủng

Polyporussp. FBD154các nguồn nitơ vô cơ khác nhau đã được bổ sung vào môi trường

48

TSH1. Hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy của chủng FBD154 được xác định sau 72,

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus sp. FBD154

96, 120 và 144h (Hình 3.11).

Chủng FBD154 sinh trưởng và sinh laccase tốt trên cả 2 nguồn nitơ là NH4Cl và

(NH4)2SO4. Trong đó, trên môi trường có nguồn nitơ là NH4Cl, chủng FBD154sinh

hoạt tính laccase cao nhất đạt 65.895 U/l sau 120 h nuôi cấy. Từ hình 3.11ta thấy khi

môi trường bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ là NaNO3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4NO3

thì hoạt tính enzyme đều tăng cao hơn so với mẫu đối chứng và có hoạt tính lần lượt là

47.296 U/l, 56.666 U/l, 35.984 U/l và 40.565 U/l. Kết quả thu được chứng tỏ nguồn

nitơ vô cơ rất thích hợp để sinh tổng hợp laccase cao đối với chủng nấm đảm này.

Chủng Pleurotus dryinus IBB 903 sinh tổng hợp laccase và cho hoạt tính 6.025

U/l sau 10 ngày nuôi cấy khi sử dụng nguồn nitơ là (NH4)2SO4 với nồng độ là 10mM

[81]. Ở Việt Nam, (Đào Thị Ngọc Ánh, Đặng Thị Cẩm Hà, 2009) công bố chủng nấm

sợi Aspergillus sp. FNA1, phân lập từ đất nhiễm DDT-Nghệ An sinh tổng hợp laccase-

like trên 2 nguồn nitơ là NaNO3 và KNO3 với hoạt tính là 2608 U/l.Chủng nấm

tổng hợp laccase cao nhất khi bổ sung NaNO3và KNO3 (tỷ lệ 3:7) với nồng độ 3 g/l

49

Trichoderma sp. FCP3 phân lập từ gỗ mục ở rừng Quốc gia Cúc Phương cũng sinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

vào môi trường và có hoạt tính là 132 U/l [4].

3.4.6.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ

Ngoài bột đậu tương, một số nguồn nitơ hữu cơ được bổ sung thêm vào môi

trường nuôi cấy bao gồm cao malt, cao nấm men, cao thịt, peptone, tripton và casein

với nồng độ ban đầu là 1g/l. Hoạt tính laccase trong dịch nuôi cấy của chủng FBD154

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus sp. FBD154

được xác định sau 72, 96, 120 và 144 h.

Chủng nấm FBD154 sinh laccase cao nhất sau 96 h nuôi cấy với nguồn nitơ hữu

cơ là casein và hoạt tính enzyme cao nhất là 74.952 U/l tiếp đó là mẫu đối chứng và

cao malt với hoạt tính enzyme lần lượt là 61.489 U/l và 57.637 U/l sau 120 h nuôi cấy

(Hình 3.12). Như vậy caseinl à nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh tổng hợp laccase ở

chủng FBD154. Đặc tính này khá khác so với các nghiên cứu khác công bố quốc tế.

Sản xuất laccase bởi chủng Polyporus arcularius MI51 được tối ưu hóa khi sử dụng

các phương pháp mô hình hóa CDD (central composite design) và RSM (response

surface methodology) bằng cách nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố và môi trường

50

nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp laccase của chủng này. Các số liệu thu được đã chỉ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

ra rằng những thí nghiệm được thiết kế từ CCD làm tăng gần gấp 3 lần (28.300 U/l) so

với đối chứng sau 15 ngày nuôi cấy bằng cách tăng hàm lượng nitơ là cao nấm men lên

0,5 g/l và bổ sung 250 µM CuSO4 vào môi trường [34].

Nhận xét: Hoạt tính laccase ban đầu của chủng FBD154 là 4.233 U/l và sau khi chọn

lọc được các yếu tố môi trường và nguồn dinh dưỡng phù hợp thì hoạt tính laccase đã tăng

lên 74.925 U/l. Đây là chủng nấm đảm có khả năng sinh tổng hợp laccase có hoạt tính cao

so với các công bố quốc tế.

3.5. Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng enzyme thô sinh tổng hợp từ chủng

nấm Polyporussp.FBD154

Các nhóm màu hoạt tính là Azo (NY1, NY7), Anthraquinone (NY3, NY5,

RBBR), màu thương mại ( CLS, LF-2B) được sử dụng để đánh giá khả năng loại màu

bằng laccase thô của chủng Polyporussp.FBD154 với nồng độ màu ban đầu là 100

ppm.

Chất gắn kết là chất vận chuyển điện tử trung gian giữa lacacse với cơ chất, làm

tăng khả năng xúc tác của laccase. Vì vậy, hệ thống lacacse- chất gắn kết được nghiên

cứu rộng rãi trong những năm gần đây. Ngoài một số chất gắn kết tự nhiên như phenol,

aniline, 4-hydroxybenzoic acid, and 4-hydroxybenzyl alcohol, gần đây người ta sử

dụng một số chất gắn kết tổng hợp như ABTS, HBT, VIO, Ace, Syr và N-

hydroxyacetanilide (NHA) để làm tăng hiệu quả loại màu thuốc nhuộm. Trong nghiên

cứu này, chất gắn kết VIO, HBT, Ace, Sy, Si đã được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng

của nồng độ chất gắn kết đến khả năng loại màu thuốc nhuộm và nồng độ chất gắn kết

sử dụng trong mỗi thí nghiệm là 200 µM. Hoạt tính laccase ban đầu là 1000 U/l, tất cả

các thí nghiệm được theo dõi và đánh giá khả năng loại màu ở các thời điểm là 5 phút,

30 phút, 1, 2, 3 và 24 h.

Theo một số công bố trong nước và quốc tế thì laccase thô từ nhiều chủng nấm

51

có hiệu suất loại màu không cao khi không có mặt của CGK. Do đó để so sánh khả

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

năng loại màu của chủng FBD154 khi có và không có mặt của các chất gắn kết các thí

nghiệm đã được tiến hành.

3.5.1. Khả năng loại màu nhóm anthraquinone (RBBR, NY5) bởi laccase thô từ

chủng Polyporus sp. FBD154

Các màu RBBR, NY5 thuộc nhóm màu Anthraquinone được sử dụng trong

nghiên khả năng loại màu bằng laccase thô của chủng FBD154 và hiệu suất loại màu

được thể hiện trong hình 3.13.

(A) (B)

Hình 3.13. Khả năng loại màu thuốc nhuộm RBBR (A); NY5 (B) của dịch enzyme thô của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết

Hình 3.14. Sự thay đổi màu RBBR bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết

52

Hình 3.15. Sự thay đổi màu NY5 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Laccase thô thu được từ chủng nấm Polyporussp.FBD154 có khả năng loại màu

RBBR cao. Khi không sử dụng chất gắn kết sau 5 phút chỉ có thể loại được 15 %

nhưng sau 30 phút thì khả năng loại màu đã đạt tới 82,5 % . Trong khi đó với các thí

nghiệm bổ sung thêm chất gắn kết là Ace và Sy khả năng loại màu cho kết quả tương

đối cao lần lượt là 68 và 74 % sau 5 phút. Sau 30 phút hiệu suất loại màu ở tất cả các

thí nghiệm có mặt CGK đều xác định được 68-91 % (Hình 3.13A).

Với màu NY5 khả năng loại màu tương đối đồng đều. Ở thí nghiệm không bổ

sung CGK sau 5 phút chỉ có khả năng loại được 20 %. Nhưng sau 1 h hiệu suất loại

màu đã tăng lên rõ rệt đến 24 hđã đạt giá trị cực đại là 75 %. Bên cạnh đó với những thí

nghiệm có CGK thì khả năng loại màu lần lượt là VIO 80 %, HBT 80 %, Si 73 %, Sy

65 % và Ace 61 % sau 24h theo dõi. Như vậy, với màu NY5 khi bổ sung thêm CGK là

VIO và HBT đã làm tăng hiệu quả loại màu nhưng khi bổ sung các CGK còn lại thì

khả năng loại màu không tăng mà thậm chí còn giảm so với mẫu đối chứng (Hình

3.13B).

15 phút và 80% màu Malachite Green sau 24 h [20]. Theo Hou và đồng tác giả laccase thô

Chủng nấm P. pseudobetulinus có khả năng loại 65% màu Ambifix Blue H3R sau

nuôi cấy từ chủng Pleurotus ostreatus 32 (30.000 U/l) loại được 66% màu

Anthraquinone SN4R. Khi có mặt ATBS (0,16%) hiệu suất loại màu của dịch enzyme

tăng lên 90% [30]. Chủng nấm trắng Trametes sp. SQ01 phân hủy 97-99% thuốc

nhuộm azo và RBBR trong vòng 7 ngày nuôi cấy.Laccase tinh sạch từ chủng Trametes

sp. SQ01 (hoạt tính ban đầu 500 U/l) có khả năng loại bỏ tới 80% RBBR trong khoảng

nồng độ 50-400 ppm trong 30 phút ở pH 4,5; tại nồng độ 1000 ppm 30% RBBR bị loại

bỏ trong 30 phút [24]. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu khác lại cho thấy khả năng loại

màu tốt của dịch enzyme ngay cả trong trường hợp không có chất gắn kết. Laccase từ

loài Pycnoporus sanguineus loại màu thuốc nhuộm anthraquinone RBBR đạt 60% sau

24h ở 32ºC mà không sử dụng chất gắn kết [83]. Soares và cộng sự đã cho thấy hơn

53

90% màu RBBR bị loại trong 20 phút khi sử dụng 5,7 mM VIO [88].

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

3.5.2. Khả năng loại màu azo (NY1, NY7) bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.

FBD154

Các màu thuốc nhuộm hoạt tính NY1, NY7 thuộc nhóm màu Azo, có cấu trúc

bền nhất và được sử dụng nhiều trong các ngành công nghiệp nhuộm nhưng lại rất khó

bị phân hủy. Vì vậy thí nghiệm sử dụng laccase thô từ chủng FBB154 để loại màu azo

(A) (B)

Hình 3.16. Khả năng loại màu thuốc nhuộm NY1 (A); NY7 (B) của enzyme thô của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết

được khảo sát.

Hình 3.17. Sự thay đổi màu NY1 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết

Hình 3.18. Sự thay đổi màu NY7 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết

54

Với màu NY1 sau 5 phút với tất cả chất gắn kết thì hiệu suất đạt từ 62 đến 87%

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

(trừ CGK là Si đạt 19 %) riêng với thí nghiệm không bổ sung thêm CGK hiệu suất loại

màu đạt 57 %. Riêng với 2 CGK là Ace và Sy hiệu suất loại màu đã thu được cực đại

sau 5 phút với hiệu suất lần lượt là 87 và 85 %. Hiệu suất loại màu ở thí nghiệm không

có CGK và các thí nghiệm có chứa CGK là Si, ViO, HBT lần lượt đạt 72 %, 78 %, 89

%, 89 % sau 24h.

Khác với màu NY1 enzyme thô của chủng Polyporus sp. FBD154 có hiệu suất

loại màu NY7 khác hẳn. Cụ thể sau là 5 phút với các chất gắn kết khác nhau hiệu suất

loại màu là: 23 % VIO, 18 % HBT,92 % Ace, 92 % Sy. Sau 24 h hiệu suất loại màu thu

được từ 84 đến 92% khi có mặt tất cả các chất gắn kết. Riêng thí nghiệm không có chất

gắn kết hiệu suất loại màu thuốc nhuộm này thu được chỉ 46 % sau 24 h. Trong trường

hợp này CGK đã làm tăng khả năng xúc táccủa laccase lên rất nhiều.

Theo Martinez và đtg, laccase thô của chủng Pycnoporus sanguineus CS2 có

khả năng loại 70% màu MR (methyl red) mà không sử dụng chất gắn kết. Couto và

cộng sự [17] cũng đã công bố rằng laccase từ Trametes hirsute loại khoảng 90% màu

axit đỏ 97 chỉ trong 3 phút khi có mặt của 2 mM và 5 mM VIO.

3.5.3. Khả năng loại màu thương mại (CLS và LF-2B) bởi laccase thô của chủng

(A)

(B)

Hình 3.19. Khả năng loại màu thuốc nhuộm CLS (A); LF-2B (B) của dịch enzyme thô của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết

55

Polyporus sp.FBD154

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Hình 3.20. Sự thay đổi màu CLS bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết

Hình 3.21. Sự thay đổi màu LF-2B bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết

Khi không bổ sung CGK hiệu suất loại màu CLS tương đối cao 53% sau 3 h và

62% sau 24 h. Laccase thô từ chủng nấm FBD154 khi kết hợp với chất gắn kết có khả

năng loại được màu CLS với hiệu suất khá cao đạt từ 56 % đến 87 % sau 24 h. Cũng

giống như các màu khác khi có mặt của 2 CGK là Ace và Sy hiệu suất loại màu tăng

lên rõ rệt. Sau 5 phút với chất gắn kết là Ace và Sy đã loại được lần lượt là 72 % và 73

% các giờ tiếp theo kết quả này thay đổi không đáng kể.

Với màu LF-2B khi không có mặt của CGK thì hiệu suất loại màu chỉ đạt 18%

sau 3h nhưng sau 24 h hiệu suất loại màu thuốc nhuộm này đã là 73%. So với màu

CLS thì màu LF-2B có hiệu suất loại màu cao hơn khi sử dụng 2 CGK là Ace và Sy.

Sau 5 phút cả 2 CGK này đều loại được 90% màu thương mại LF-2B. Ở các thí

nghiệm khác hiệu suất loại không cao sau 5 phút nhưng sau 24 h thì hiệu quả loại màu

đã tăng lên rõ rệt và thu được từ 73 đến 94% (Hình 3.21).

Cui và cộng sự cũng đã thông báo laccase từ loài nấm Coriolopsis polyzona có khả

năng loại được 73,8% màu acid blue 62; 29,9% màu acid black 194; 55,3% màu

reactive black và 44,6% màu direct blue 71 với sự có mặt của 2,5 mM VIO (Cui et al.,

56

2009). Laccase từ Trametes versicolor có tốc độ loại màu thấp (5,67%) với màu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

reactive black 5 khi có mặt của HBT ở tỷ lệ màu/ chất gắn kết 1:5, trong khi chỉ một

mình laccase không thể loại được [10]. Husseiny (2008) cũng thông báo rằng hai loài

nấm sợi Aspergillus niger và Penicillium spp. có khả năng khử màu reactive dye (lần

lượt là 74,2% và 77,87%) và direct dye (78,3%; 67,42%) nhưng không đề cập tới khả

năng sinh enzyme [32]. Ngoài ra, Khelifi và cộng sự đã chứng minh được chủng

Aspergillus alliaceus 121C loại lần lượt 98,6 và 98% màu Indigo và Congo đỏ sau 9

ngày nuôi và hoạt tính laccase tạo ra 79 U/l [44].

57

Hiệu suất loại màu của chủng FBD154 tóm tắt ở bảng 3.3.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Bảng 3.3. Hiệu suất loại màu của thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase của FBD154 khi có mặt các chất gắn kết khác nhau

Màu

Thời gian

Enzyme và CGK

Hoạt tính laccase (U/l)

RBBR

NY5

NY1

NY7

CLS

LF-2B

E E + Ace E + Si E + VIO E + HBT E + Sy E E + Ace E + Si E + VIO E + HBT E + Sy E E + Ace E + Si E + VIO E + HBT E + Sy E E + Ace E + Si E + VIO E + HBT E + Sy E E + Ace E + Si E + VIO E + HBT E + Sy E E + Ace E + Si E + VIO E + HBT E + Sy

5 m 15 68 5 17 20 74 20 27 1 19 17.5 36 57 87 19 62 62 85 17 92 0 23 18 92 3 72 1 4 3 73 1 90 0 1 0 91

30 m 83 70 68 90 91 76 52 44 26 60 50 54 60 87 46 76 75 85 17 90 33 48 28 91 6 72 1 26 14 74 4 90 0 22 18 91

2 h 93 74 82 95 97 77 66 50 52 73 71 57 60 85 54 84 81 84 18 89 57 84 60 91 53 73 27 75 66 75 13 90 62 76 92 91

1 h 88 71 78 91 94 75 59 47 40 67 61 55 59 86 52 82 79 84 18 90 56 77 43 92 6 73 8 52 33 75 6 90 13 36 37 91

3 h 93 74 82 93 95 78 68 52 59 74 74 59 65 86 63 87 84 86 19 88 64 88 80 91 53 73 37 77 69 75 18 90 70 79 92 91

24 h 96 82 89 96 98 84 75 61 73 80 80 65 72 89 78 89 89 88 46 89 83 91 91 92 62 77 55 87 79 78 73 90 88 85 94 92

0 h 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

24 h 677 618 784 641 687 729 582 583 625 591 611 611 883 759 910 805 899 578 718 781 883 767 745 763 724 689 770 728 686 679 922 931 921 250 950 797

58

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Bảng 3.4. So sánh hiệu suất loại màu bởi laccase của chủng nấm FBD154 so với laccase thu được của các chủng nấm khác

Laccase

Hiệu suất loại màu

Polyporus pseudobetulinus

65% màu Ambifix Blue H3R sau 15 phút và 80% màu Malachite Green sau 24 h.

Nồng độ màu 200 ppm

Tài liệu tham khảo Songserm et al., 2012 [89]

100 ppm

Coriolopsis polyzona

Cui et al., 2009 [18]

73,8% màu acid blue 62; 29,9% màu acid black 194; 55,3% màu reactive black và 44,6% màu direct blue 71 khi sử dụng laccase có bổ sung 2,5 mM VIO

25 μM

40 ppm

Martínez et al., 2013[51] Uzan et al., 2010 [95]

Pycnoporus sanguineus CS2 Pycnoporus coccineus BRFM 938

100 ppm

Trametes versicolor

Li et al., 2014[47]

40 ppm

Lentinus Polychrous

Ratanapongleka, Phetsom, 2014 [71]

70% màu Methyl Red và 15% màu Reactive Black 5 sau 4 giờ ở 25ºC 26% Poly R-478, 93% RBBR, 100% Bromocresol purple, 92% Reactive black 5, 100% Acid yellow 17 sau 52 giờ khi bổ sung HBT 91,5% Reactive Blue KN-R ở 40oC sau 16 giờ; 68,9% Acid Red 35 ở 50oC sau 24 giờ; 59,7% DirectTurquoise Blue 5B và 68,2% Direct Orange 7 sau 28 giờ ở 40oC 85% Acid Blue 80; 30% Water Blue; 20% Indigo Carmine; ít hơn 10% đối với các màu thuộc nhóm azo (Reactive Black 5, Reactive Orange 16, Reactive Green 19) sau 120 phút.

Funalia trogii

100 ppm

100 ppm

Trichoderma sp. FCP3

74,96% Reactive Black 171; 78,14 Reactive Black 5 sau 5 phút ở 30oC 92% Acid bue 62; 86% Remazol brilliant bue R; 64% Acid blue 281; 60% Acid red 299; 6% Acid red 266 sau 3 giờ

30% Remazol brilliant bue R bị loại bỏ trong 30 phút

Trametes sp. SQ01

1000 ppm

Yeşİlada et al., 2014 [104. Hoang Thị Nhung et al., 2011[4] Xiao et al., 2013 [101]

Nghiên cứu này

100 ppm

Polyporus sp.FBD154

90% màu Remazol brilliant bue R với CGK là VIO sau 30 phút; 80% màu Acid blue 281 khi có mặt CGK là HBT sau 24 h; 87% màu Acid red 299 với CGK là Ace sau 5 phút; 92% màu Acid red 266, 91% màu Evezol Red và 73% màu Megafix black CLS với CGK là Sy sau 5 phút với nồng độ CGK là 200 µM

59

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1. Từ 60 chủng nấm đảm thu thập ở vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà thuộc tỉnh

Lâm Đồng đã phân lập được 38 chủng và lựa chọn được chủng FBD154 có khả

năng sinh tổng hợp laccase trên môi trường TSH1 có hoạt tính ban đầu cao nhất

là 4233 U/l;

2. Chủng FBD154 thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, chi Polyporusvà được đặt

tên là Polyporus sp. FBD154 với mã số đăng ký trên Genbank là KR 920049;

3. Polyporus sp. FBD154 có khả năng sinh tổng hợp laccase cao thời gian nuôi cấy

ngắn ở pH thấp với hoạt tính 74.925 U/l sau 4 ngàytrên môi trường chứa dịch

chiết khoai tây 200g/l, casein 1 g/l, cám gạo 1 g/l, bột đậu tương 5 g/l, mannose 10 g/l, CuSO4 0,3 mM, 3 g/l NH4Cl, pH 4 và tốc độ lắc 200 v/phút, ở 30oC; 4. Khi có mặt của 200 µM CGK dịch enzyme thô của chủng đã loại được 90%

màu RBBR ; 80% màu NY5; 87% màu NY1; 92% màu NY7, 91% màu LF-2B

và 73% màu CLS . Sau 30 phút hiệu suất loại màu của RBBR, NY1, NY5 lần

lượt là 83%, 60%, 52% khi không có mặt CGK;

5. Chủng nấm đảm được phân lập từvườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà thuộc tỉnh

Lâm Đồng với các đặc tính của laccase khác hẳn so với các công bố quốc tế có

mức tương đồng tới 99% với P. arcularius DSH92132, chủng nấm đảm này có

tiềm năng cao trong xử lý ô nhiễm môi trường và loại màu thuốc nhuộm. Với

các kết quả thu được chủng nấm đảm này đã được chấp nhận đơn đăng ký

quyền sở hữ trí tuệ.

Kiến nghị

1. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào khác của chủng

FBD154 như chitinase, protease, xylanse v.v.

2. Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy khác để tiếp tục nâng cao hoạt tính sinh

60

tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp. FBD154. Xác định cấu trúc của

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

laccase do FBD154 tạo ra sau khi đã được làm sạch và nghiên cứu các đặc tính

cơ bản của loại enzyme này.

3. Đánh giá khả năng phân hủy dioxin, PCB, PAH và phenol bởi chủng Polyporus

sp. FBD154.

4. Đánh giá khả năng kháng các VSV gây bệnh, sinh tổng hợp các chất kháng nấm

61

của chủng Polyporus sp. FBD154.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Đào Thị Ngọc Ánh, Đặng Thị Cẩm Hà (2009) Khả năng phân hủy DDT của chủng

nấm sợi FNA1 phân lập từ đất nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu tại Nghệ An. Tạp chí Khoa

học và Công nghệ Thái Nguyên 57(9): 46-51.

2. Đặng Thị Cẩm Hà (2012) Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme ngoại bào

Laccase, Manganese Peroxidase (MnP), Lignin Peroxidase (LiP) từ vi sinh vật phục vụ

xử lý các chất ô nhiễm đa vòng thơm. Đề tài độc lập cấp nhà nước176-178.

3. Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Lê Hồng Nga (2009) Nghiên cứu phân

lập, tuyển chọn nấm sợi sinh tổng hợp laccase từ rừng tự nhiên Việt Nam. Hội nghị

công nghệ sinh học toàn quốc 376-380.

4. Hoàng Thị Nhung, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2011) Sàng lọc chủng

nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase và phân hủy các hợp chất đa vòng thơm, loại

màu thuốc nhuộm. Tạp chí Công Nghệ Sinh học11 (2): 265-274

5. Nguyễn Nguyên Quang, Nguyễn Thị Lệ, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2010)

Phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm và thuốc nhuộm của chủng nấm sợi FBH11

phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại điểm nóng Biên Hòa. Hội nghị Khoa học

Kỷ niệm 35 năm thành lập Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hà Nội 2010: 392-

398.

Tiếng Anh

6. Aktas N., Cicek H., Unal A. T., Kibarer G., Kolankaya N., Tanyolac A (2001)

Reaction kinetics for lacasse-catalyzed polymerization of 1-naphthol. Bioresource

Technology80 91): 29-36.

7. Arora D.S., Sharma R.K. (2010) Ligninolytic fungal laccases and their

biotechnological applications. Appl. Biochem. Biotechnol 160(6): 1760–1788.

8. Arockiasamy S., Krishnan I.P.G., Anandakrishnan N., Seenivasan S., Sambath A.,

62

Venkatasubramani J.P (2008) Enhanced production of laccase from Coriolus

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

versicolor NCIM 996 by nutrient optimization using response surface methodology.

Appl Biochem Biotechnol 151(2-3): 371-379.

9. Bhatnagar A., Sillanpaa M (2010) Utilization of agro-industrial and municipal waste

materials as potential adsorbents for water treatment: areview.Chem Eng J157:277-

296.

10. Bibi I. and Bhatti, H.N (2012) Biodecolorization of Reactive Black 5 by laccase

mediator system.Afri. Jour Biotech 11(29): 7464-7471

11. Burton S (2003) Laccases and phenol oxidases in organic synthesis. Curr Org

Chem7: 1317-1331.

12. Cavallazzi JRP, Kasuya1 CM, Soares MA (2005) Screening of inducers for laccase

production by Lentinula edodes in liquid medium. Brazilian J Microb 36: 383-387.

13. Chacko J T., Subramaniam K (2011)Enzymatic degradation of azo dyesa review.

Int J Environ Sci 1:1250-60.

14. Charumathi D., Das N (2012)Packed bed column studies for the removal of

synthetic dyes from textile wastwater using immobilised dead C.

TropicalisDesalination 285:22-30.

15. Chang J., Kuo T., Chao Y., Ho J., Lin P (2000)Azo dye decolorization with a

mutant Escherichia coli strain. Biotechnol Lett2 (9): 807–812.

16. Chen S.C, Wu P.H, Su Y.C, Wen T.N, Wei Y.S, Wang N.C, Hsu C.A, Wang A.H,

Shyur L.F (2012) Biochemical characterization of a novel laccase from the

basidiomycete fungus Cerrena sp. WR1. Protein Eng Des. Sel 25(11): 761-9.

17. Couto S.R and Herrera J.L.T (2007) Laccase production at reactor scale by

filamentous fungi.Biotech. Adv 25: 558-569.

18. Cui T (2009) Enhanced large-scale production of laccases from Coriolopsis

polyzona forusein dye bioremediation. PhD thesis.The University of Westminster.

19. Cullen D (2002) Molecular genetics of lignin-degrading fungi and theirapplications

63

in organopollutant degradation. The Mycota XI Agricultural Application. Springer-

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Verlag Berlin Heidelberg.

dyes by immobilized laccase from Coriolopsis gallica into Ca-alginate beads.Int Biodeterior

Biodegrad90: 71-78

20. Daâssi D., Rodríguez-Couto S., Nasri M., Mechichi T (2014) Biodegradation of textile

21. Dhakar Kusum, Jain Rahul, Tamta Sushma ,Pandey Anita (2014) Prolonged

Laccase Production by a Cold and pH Tolerant Strain of Penicillium pinophilum (MCC

1049) Isolated from a Low Temperature EnvironmentEnzyme Researc 2004:6 pages.

22. Dhouib.A., Chakroun. H., Mechichi. T., Martinez. M.J, Sayadi. S(2010)Purification

and characterization of a novel laccase from the ascomycete Trichoderma

atrovirideApplication on bioremediation of phenolic compounds.Process Biochemistry

45(4): 507-513.

23. Eggert C., Temp U., Eriksson K.E.L(1996) The ligninolytic system of the white rot

fungus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and characterization of the laccase. Appl.

Environ. Microb62: 1151-1158.

24. Galai S., Limam F., Marzouki M.N (2009) A new Stenotrophomonas maltophilia

strain lroducing laccase use in decolorization of synthetics dyes.Appl Biochem

Biotechnol 416-431.

25. Glenn J.K., Morgan M.A., Mayfield M.B., Kuwahara M., Gold M.H. (1983). An

extracellular H2O2 requiring enzyme preparation involved in lignin biodegradation by

the white rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Biochem. Biophys. Res.

Commun114(3):1077-1083.

26. Givaudan A., Effosse A., Faure D., Potier P., Bouillant M.L., Bally R (1993)

Polyphenol oxidase in Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere: evidence

for laccase activity in nonmotile strains of Azospirillum lipoferum. FEMS Microbiol

Lett 108:205–210.

27. Hadibarata T., Yusoff A.R.M., Kristanti R.A (2012) Decolorization and meabolism

64

of Anthraquionone-type dye by laccase of white-rot fungi Polporus sp. S133. Water

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Air Solid Pollut233: 933-941.

28. Haki G.D., Rakshit S.K (2003) Developments in industrially important

thermostable enzymes: a review. Bioresour. Technol 89: 17-34.

29. Heinfling A., Bergbauer M., Szewzyk U (1997) Biodegradation of azo and

phthalocyanine dyes by Trametes versicolor and Bjerkandera adusta. Appl. Microbiol.

Biotechnol48(2): 261-266.

30. Hou H., Zhou J., Wang J., Du C., Yan B (2004) Enhancement of laccase

production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone

dye. Pro. Biochem39(11): 1415-1419.

31. Hu D.D., Zhang R.Y., Zhang G.Q., Wang H.X., Ng T.B (2011) A laccase with

antiproliferative activity against tumor cells from an edible mushroom, white common

Agrocybe cylindracea. Phytomedi 18: 374-379.

32. Husseiny Sh.M (2008) Biodegradation of the Reactive and Direct Dyes Using

Egyptian Isolates.J Appl Sci Res 4(6): 599- 606.

33. Jaouani A., Guillen F., Penninckx M.J., Martinez A., Martinez M.J (2005) Role of

Pycnoporus coccineus laccase in the degradation of aromatic compounds in olive oil

mill wastewater, Enzyme Microb Technol 36:478–486.

34. Jegatheesan M., Eyini M (2014)Response Surface Methodology Mediated

Modulation of LaccaseProduction byPolyporus arcularius. Arab J Sci Eng.

35. Jones C.L., Baker W.L., lonergan G.T (2001)Dimethylsulfoxide elevates

extracellular laccase (phenol oxidase) activity of Pycnoporus cinnabarinus grown on a

low nutritional newspaper medium.J Chem Technol Biotechnol 76:494–500.

36. Joshi M., Bansal R., Purwar R (2004) Color removal from textile effluents.Indian

J. Fiber Textile Res 29: 239-259.

37. Kalpana D., Velmurugan N., Shim J.H., Oh B.T., Senthil K., Lee Y.S (2012)

Biodecolorization and biodegradation of reactive Levafix Blue E-RA granulate dye by

65

the white rot fungus Irpex lacteus.J. Environ. Manage 111:142-149.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

38. Kalyani D., Dhiman S.S., Kim H., et al (2012) Characterization of a novel laccase

from the isolated Coltricia perennis and its application to detoxification of biomass.

Process Biochem.

39. Kapdan I. K., Kargi F (2002) Biological decolorization of textiledyestuff

containing wastewater by Coriolus versicolor in a rotating biological contactor.

Enzyme Microb. Technol30: 195-199.

40. Knapp J.S., Vantoch-Wood E.J., Zhang F (2001) Use of wood – rotting fungi for

the decolorization of dyes and industrial effluents. In: Fungi in Bioremediation. G. M.

Gadd(Ed.). Cambridge University Press, Cambridge 253-261.

41. Knapp J.S., Newby P.S., Reece, L.P (1995) Decolorization of dyes by wood rotting

Basidiomycete fungi.Enzyme Microbial. Biotechnol 17: 664–668.

42. Kiiskinen L.L., Ratto M., Kruus K (2004) Screening for novel laccase-producing

microbes. J. Appl. Microbiol97: 640-646.

43. Kunamneni A., Plou F.J., Ballesteros A., Alcalde M (2008) Laccases and their

applications: a patent review. Recent Pat. Biotechnol2(1): 10-24.

44. Khelifi E., Ayed L., Bouallagui H., Touhami Y., Hamdi M (2009) Effect of

nitrogen and carbon sources on Indigo and Congo red Decolourization by Aspergillus

alliaceus strain 121C. J Hazard Mater163: 1056-1062.

45. Khlifi R., Belbahri L., Woodward S., Ellouz M., Dhouib A., Sayadi S., Mechichi

T (2010) Decolourization and detoxification of textile industry wastewater by the

laccase -mediator system. J Hazar Mater 175: 802-808.

46. Levin L.A., Forchiassin V.A (2003) Degradation of organic pollutants by the white

rot basidiomycete Trametes trogii. Int. Biodet. Biodeg 52: 1-5.

47. Li Q., Ge L., Cai J., Pei J., Xie J., Zhao L (2014) Comparison of two laccases from

Trametes versicolor for application in the decolorization of dyes. J Microbiol

Biotech24(4): 545-555.

66

48. Lorenzo M., Moldes D., Sanromán M.A (2006) Effect of heavy metals on the

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

production of several laccase isoenzymes by Trametes versicolor and on their ability to

decolourise dyes. Chemosphere63(6):912-7.

49. Machczynski M.C., Vijgenboom E., Samyn B., Canters G.W (2004)

Characterization of SLAC: A small laccase from Streptomyces coelicolor with

unprecedented activity. Protein Sci 13(9): 2388–2397.

50. Mahmoud M.G., Rifaat H.M., El Sayed, O.H., El Beih, F.M.,Selim, M.S (2013)

Effect of inducers and process parameters on laccase production by locally isolated

marine Streptomyces lydicus from Red Sea, Egypt’’. International Journal of

ChemTech Research 5(1): 15-23.

C.E.H (2013) Purification and partial characterization of a thermostable laccase from

Pycnoporus sanguineus CS-2 with ability to oxidize high redox potential substrates and

recalcitrant dyes. Agricultural and Biological Sciences.

51. Martínez S.M.S., Gutiérrez-Soto G, Garza C.F.R., Galván T.J.V., Cordero J.F.C., Luna

52. Martins M.A.M., Cardoso M.H., Queiroz M.J., Ramalho M.T., Campos A.M.O

(1999) Biodegradation of azo dyes by the yeast Candida zeylanoides in batch aerated

cultures. Chemosphere 38: 2455–2460.

53. Michniewicz A., Ullrich R., Ledakowicz S., Hofrichter M (2005) The white-rot

fungus Cerrena unicolor strain 137 produces two laccase isoforms with different

physico-chemical and catalytic properties. Appl. Microb. Biotech 69(6):1-7.

54. Moldes D., Fernández-Fernández M., Sanromán M.A (2012) Role of laccase and

low molecular weight metabolites from Trametes versicolor in dye decolorization. Sci.

World J 2012: 9 pages.

55. Mohorčič M., Friedrich J., Pavko A (2004) Decoloration of the diazo dye reactive

black 5 by immobilised Bjerkandera adusta in a stirred tank bioreactor. Acta Chim.

Slov 51: 619-628.

56. Niladevi K.N, Sukumaran Rajeev K., Jacob Nicemol Anisha G.S., Prema P (2009)

67

Optimization of laccase production from a novel strainStreptomyces

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

psammoticususingresponse surface methodology. Microbiological Research164: 105-

113.

57. Otterbein L, Record E, Longhi S, Asther M, Moukha S (2000)Molecular cloning of

the cDNA encoding laccase from Pycnoporus cinnabarinus I-937 and expression in

Pichia pastoris.Eur J Biochem 267:1619–1625.

58. Palmieri G., Cennamo G., Faraco V., Amoresano A., Sannia G., Giardina P (2000)

A typical laccase isoenzymes from copper supplemented Pleurotus ostreatus cultures.

Enz. Microb. Technol 33: 220-230.

59. Parshetti G.K., Kalme S.D., Gomare S.S., Govindwar S.P (2007) Biodegradation of

Reactive Blue 25 by Aspergillus ochraceus NCIM–1146. Bioresour. Technol 98: 3638-

3642.

60. Patnaik P (1999) “A comprehensive guide to the properties of hazardous chemical

substances”, 2nd ed., John Wiley & Sons Publishers.

61. Paweena Thongkreda, Pongtharin Lotrakul, Sehanat Prasongsuka, Tsuyoshi Imai,

Hunsa Punnapayaka (2011)Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a

tropical isolate of Pycnoporus coccineus and its laccase.ScienceAsia 37: 225–233.

62. Peralta-Zamora P., De Moraes S. G., Esposito E., Antunes R., Reyes J., and Duran

N (1998) Decolorization of pulp mill effluents with immobilized lignin and manganese

peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Environ. Technol 19(5): 521–528.

63. Piontek, K., Antorini, M., Crystal, T.C (2002) Structure of a Laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.9 – A0 Resolution Containing a Full Complement of

Cooppers”.J Biology Chem277: 37663-37669.

64. Pilz R., Hammer E., Schauer F., Krag U (2003) Laccase-catalyzed synthesis of

coupling products of phenolic substrates in different reactors. Appl. Microbiol.

Biotechnol60: 708-712.

65. Pointing S.B (2001) Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Appl.

68

Microbiol. Biotechnol57: 20-33.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

66. Pointing S.B., Pelling A.L., Smith G.J., Hyde K.D., Reddy C.A (2005) Screening

of basidiomycetes and xylariaceous fungi for lignin peroxidase and laccase gene-

specific sequences. Mycol. Res 109(1): 115-124.

67. Pointing S.B., Jones E.B.G., Vrijmoed L.L.P (2000) Optimization oflaccase

production by Pycnoporus sanguineus in submergedliquid cultures.Mycologia 92:139–

144.

68. Prolonged Laccase Production by a Cold and pH Tolerant Strain ofPenicillium

pinophilum(MCC 1049) Isolated from a Low Temperature Environment.

69. Ramalho P.A., Cardoso M.H., Cavaco-Paulo A., Ramalho M.T (2004)

Characterization of azo reduction activity in a novel ascomycete yeast strain. Appl.

Microbiol. Biotechnol70: 2279–2288.

70. Rani C., Jana A.K., Bansal A (2011) Studies on the biodegradation of azo dyes by

white rot fungi Daedalea flavida in the absence of external carbon source. 2011 2nd

International Conference on Environmental Science and Technology 6: 147-150.

71. Ratanapongleka K., Phetsom J (2014) Decolorization of synthetic dyes by crude

laccase from Lentinus polychrous Lev. International Journal of Chemical Engineering

and Applications 5(1): 26-30.

72. Riva S (2006) Laccase: Blue enzyms for green chemistry.Trends in Biotechnology

24(5): 219–226.

73. Rodriguez C. S., Sanromán .M., Gübitz G. M (2005) Influence of redox mediators

and metalions on synthetic acid dye decolourization by crude laccase from

Trametes hirsute.Chemosphere 58: 417-422.

74. Record E, Punt PJ, Chamkha M, Labat M, van den Hondel CAMJJ, Asther M

(2002) Expression of the Pycnoporus cinnabarinus laccase gene in Aspergillus niger

and characterization of the recombinant enzyme. Eur J Biochem 269:602–609.

75. Reid I.D (1989) Solid state fermentation for biological delignification. Enz.

69

Microb. Technol 11: 786-803.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

76. Robles A., Lucas R., Cienfueges A.D., Galvez A (2000) Phenol oxidase activity in

strains of the hyphomycete Chalara paradoxa isolated from Olivemill wastewater

disposal ponds. Enzyme Microbial Technol 26: 484-490.

77. Riva S (2006) Laccase Blue enzyms for green chemistry.Trends in Biotechnology

24(5): 219–226.

78. Ruijssenaars H.J., Hartmans S (2004) A cloned Bacillus halodurans multicopper

oxidase exhibiting alkaline laccase activity. Appl. Microbiol. Biotechnol 65: 177-182.

79. Ryu W (1992) Decolorization of azo dyes by Aspergillus sojae B10. J. Microb.

Biotechnol 2: 215–219.

80. Sadhasivam S., Savitha S., Swaminathan, Feng-Huei Lin (2008) Production,

purification and characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated

Trichoderma harzianum WL1. Process Biochemistry 43: 736 – 742.

81. Sathishkumar P., Murugesan K., Palvannan T (2010)Production of laccase from

Pleurotus florida using agro-wastes and efficient decolorization of Reactive blue 198.

Journal of Basic Microbiology 50: 360-367.

82. Saratale, G.D., Kalme, S.D., Govindwar, S.P (2006) Decolorization of textile dyes

by Aspergillus ochraceus (NCIM-1146). Ind. J. Biotechnol5(3): 407–410.

83. Saratale R.G., Saratale G.D., Chang J.S., Govindwar SP (2011)Bacterial

decolorization and degradation of azo dyes: a review". J Taiwan Inst Chem Eng

42:138-57.

84. Schneider P., Michael B.C., Kristine M., Torben, Lars K.S., Peter R.O., Kiberly

M.B., Stephen HB, Feng X(1999)Characterization of a Coprinus cinereus laccase.

Enzyme microbial Technol 25: 502-508.

85. Selvam K., Shanmuga P.M (2012) Biological treatment of azo dyes and textile

industry effluent by newly isolated white rot fungi Schizophyllum commune and

Lenzites eximia. Int. Biodet. Biodeg 2(4): 1926-1935.

70

86. Shiroya A.J.Recent advances of laccase enzyme in industrial biotechnology.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Bhagwan Mahavir College Of Biotechnology, Surat.

87. Singh H (2006) Mycoremediation-Fungal Bioremediation. Wiley Interscience

Hoboken 421-471.

88. Soares, G.M., Amorim, M.T.P. and Costa-Ferreira, M (2001) Use of laccase

together with redox mediators to decolourize Remazol Brilliant Blue R. J.

Biotech89:123-129.

89. Songserm Pajareeya, Sangvanich Prakitsin Sihanonth Polkit, Karnchanatat

Aphichart (2012) Decolorization of textile dyes by Polyporus pseudobetulinus and

extracellular laccase. African Journal of Microbiology Research 6(4): 779-792.

90. Song Z., Zhou J., Wang J., Yan B., Du C(2003) Decolorization of azo dyes by

Rhodobacter sphaeroides. Biotechnol. Lett25: 1815–1818.

91. Sullivan G., Henry E.D (1971)Occurrence and distribution ofphenoxazinone

pigments in the genus Pycnoporus.J Pharmaceu-tical Sci 60:1097–1098.

92. Sulistyaningdyah W.T., Ogawa J., Tanaka H., Maeda C., Shimizu S (2003)

Characterization of alkaliphilic laccase activity in the culture supernatant of

Myrothecium verrucaria 24G-4 in comparison with bilirubin oxidase. FEMS Microbiol

Lett 230: 209-214.

93. Suzuki Takashi, Endo Kohki, Ito Masaaki, Tsujibo Hiroshi, Miyamoto Katsushiro,

Jnamori Yoshihiko (2003) A Thermostable laccase from Streptomyces

lavendulae REN-7: Purification, characterization, nucleotide sequence and expression.

Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 67: 2167-2175.

94. Téllez-JuradoA., Arana-Cuenca A., González Becerra A.E., G. Viniegra-González

G., Loera O (2006)Expression of a heterologous laccase by Aspergillus nigercultured

by solid-state and submerged fermentations”. Enzyme and Microbial

Technology38(50): 665-669.

95. Uzan E., Portet B., Lubrano C., Milesi S., Favel A., Lesage-Meessen L, Lomascolo

71

A (2011) Pycnoporus laccase-mediated bioconversion of rutin to oligomers suitable for

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

biotechnology applications. Appl Microbiol Biotechnol 90:97–105.

96. Viswanath, B., Chandra, M.S., Kumar, K.P. and Rajasekhar-Reddy, B (2008)

Production and purification of laccase from Stereum ostrea and its ability to decolorize

textile dyes. Dyn. Biochem. Pro. Biotech. Mol. Biol 2: 19-25.

97. Wang H.X., Ng T.B (2004) Purification of a novel low-molecular-mass laccase

with HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activity from the mushroom Tricholoma

giganteum. Biochem. Biophys. Res. Commun315(2): 450-454.

98. Wang, J.W., Wu, J.H., Huang, W.Y. and Tan R.X (2006) Laccase production by

Monotospora sp., and endophytic fungus in Cynodon dactylon”, Bioresource

Technology 97(5): 786-789.

99. Wang CL. , Zhao M., Lu L.,Wei XD, Li TL(2011) Characterization of spore

laccase from Bacillus subtilis WD23 and its use in dye decolorization.African Journal

of Biotechnology 10(11): 2186-2192.

100. Xu L., Wang H., Ng T (2012) A Laccase with HIV-1 Reverse Transcriptase

Inhibitory Activity from the Broth of Mycelial Culture of the Mushroom Lentinus

tigrinus. J. Biomed. Biotech2012: 1-7.

101. Xiao Y. Z., Chen Q., Hang J., Shi1 Y., Wu J., Hong Y. Z., Wang Y. P(2004)

Selective induction, purification and characterization of a laccase isozyme genes from

Trametes sp. AH28-2 and analyses of their differential expression. Applied

Microbiology and Biotechnology 71: 493-501.

102. Yadav J.S., Tripathi J.P (1991) Optimization of cultivation and nutrition

conditions and substrate pre-treatment for solid substrate fermentations of wheat straw

by Coriolus versicolor. Folia Microbiologica36: 249-301.

103. Yo Johannes C and Majcherczyk A (2000) Natural Mediators in the Oxidation of

PolycyclicAromatic Hydrocarbons by Laccase Mediator Systems. Appl Environ

Microbiol 66: 524–528

72

104. Yeşİlada Ö., Bİrhanli E., Ercan S., Özmen N., (2014) Reactive dye decolorization

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

activity of crude laccase enzyme from repeated-batch culture of Funalia trogii. Turk J

Biol 38: 103-110.

105. Zadrazil F., Brunnert H., (1981) Investigation of physical parameters important

for the solid state fermentation of straw by white rot fungi. Appl. Microbiol. Biotechnol

11: 183-188.

106. Zeng, G.M., Yu, H.Y., Huang, H.L., Huang, D.L., Chen, Y.N, Huang, G.H. and

Li, G.B (2006) Laccase activities of a soil fungus Penicillium simplicissimum in

relation to lignin degradation.W J Microb Biotech 22(4): 317-324.

107. Zhang G.Q., Wang Y.F., Zhang X.Q., Ng T.B., Wang H.X (2010) Purification and

characterization of a novel laccase from the edible mushroom Clitocybe maxima. Pro.

Biochem. 45(5): 627-633.

108. Zouari-Mechichi H., Mechichi T., Dhouib A., Sayadi S., Martίnez A., T.,

Martίnez M J (2006) Laccase purification and characterization from Trametes trogii

isolated in Tunisia decolorization of textile dyes by the purified enzyme.Enz Microb

73

Technol 39: 141-148.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy

Thành phần môi trƣờng Khối lƣợng Thành phần môi trƣờng Khối lƣợng

(g) (g)

PDA PDB

Khoai tây (lấy dịch chiết) 200 Khoai tây (lấy dịch chiết) 200

Glucose Glucose 10 10

Agar 18 1000 ml H2O

1000 ml pH 6,5 H2O

pH 6,5

GYMP MEG

0,5 1 MgSO4.7H2O KH2PO4

0,4 4 KH2PO4 Na2HPO4

NaCl 1 0,2 K2HPO4

Glucose 20 0,2 MgSO4

Peptone 2 0,5 CaCO3

Cao men Cao men 2 4

Cao malt 1 2 NH4Cl

Cao malt Glucose 2 4

1000 ml 1000 ml H2O H2O

pH 6 pH 6,5

Czapek TSH1

Saccharose 30 Khoai tây (lấy dịch chiết) 200

0,5 Glucose 10 MgSO4

1 Cám 1 KH2PO4

74

NaCl 1 Bột đậu tương 5

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

Thành phần môi trƣờng Khối lƣợng Thành phần môi trƣờng Khối lƣợng

(g) (g)

2 0.1 mM NaNO3 CuSO4

KCl 0,5 1000 ml H2O

0,01 pH 6,5 FeSO4

1000 ml H2O

pH 7

Vis

Mechichi

10

Cao malt 10 Glucose

Cao men 4 Peptone

3

Glucose 4 KH2PO4

0,6

1000 ml H2O K2HPO4

0,4

pH 5,5 ZnSO4

0,001

FeSO4

0,0005

MnSO4

0,5

MgSO4

1000 ml

H2O

pH 6

Phụ lục 2. Thành phần các chất trong phản ứng loại màu

Thuốc nhuộm

Nồng độ Thể tích Chất gắn kết Nồng Thể Laccase

(mg/L) (ml) độ tích thô (ml) Đệm natri acetate 20 mM, pH 6 (ml) (µM) (ml)

Đối chứng 4,833 100 0,167 0 0 0

Không có chất 4,583 100 0,167 0 0 0,25

gắn kết

75

Có chất gắn kết 4,383 100 0,167 200 0,2 0,25

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

 Bước 1: Nuôi cấy thu sinh khối nấm trong khoảng 3 đến 4 ngày

 Bước 2: Thu sinh khối bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút trong 10

phút ở 4oC

 Bước 3: Rửa 2 đến 3 lần sinh khối bằng môi trường nuôi cấy, ly tâm

6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

 Bước 4: Lấy sinh khối cho vào cối sứ đã khử trùng và nghiền trong

nitrogen lỏng cho đến khi thành bột mịn

 Bước 5: Dùng thìa xúc mẫu cho vào các ống eppendorf, bổ sung

600 μl đệm lyzozyme, lắc nhẹ

 Bước 6: Bổ sung tiếp 65 μl lyzozyme, ủ ở 37oC trong 30-45 phút  Bước 7: Cho 4 μl protease K ủ ở 56oC trong 2 giờ

 Bước 8: Bổ sung tiếp chloroform: isoamyl alcohol(tỷ lệ 24:1) với tỷ

lệ 1:1 về thể tích, trộn đều sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC

 Bước 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào ống eppendorf mới  Bước 10 : Bổ sung isopropanol với tỷ lệ 1:1 về thể tích, ủ ở 4oC qua

đêm

 Bước 11: Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút ở ở 4oC, thu tủa

 Bước 12: Hòa tan kết tủa trong 500 μl TE  Bước 13: Loại RNA bằng cách thêm RNAse, ủ ở 37oC qua đêm

 Bước 14: Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol(tỷ lệ 24:1) với tỷ lệ

1:1 về thể tích sau đó đảo nhẹ và ly tâm ở 12000 vòng/phút, 15 phút ở 4oC

 Bước 15: Thu phần dịch nổi phía trên

76

Phụ lục 3. Tách DNA tổng số từ nấm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền

 Bước 16: Bổ sung ethanol 100% (giữ lạnh) tỷ lệ 1:1 về thể tích  Bước 17: Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết

tủa sau đó rửa sạch bằng ethanol 80%. Làm khô DNA

 Bước 18: Hòa trong 100 μl TE và bảo quản ở 4oC

Phụ lục 4. Thành phần phản ứng

Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối

1X Đệm Taq 10X 2,5

0,2 mM dNTPs 2 mM 2,5

2 mM 2,5 MgSO4 20 mM

0,4 µM Mồi ITS1 10 µM 1

0,4 µM Mồi ITS4 10 µM 1

Taq Polymerase 5 U/ 0,2 1 U/25 µl

µl DNA khuôn 1

14,3 ddH2O

Tổng thể tích 25 µl

Phụ lục 5. Chu trình nhiệt

Nhiệt độ/thời gian Số chu kỳ Bước

1 Biến tính 94˚C/5 min

Biến tính 94˚C/30 s

30 Gắn mồi 54˚C/45 s

Kéo dài chuỗi 72˚C /60 s

Kéo dài chuỗi 72 ˚C /7 min 1

77

4 ˚C Giữ ổn định