BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----------***----------
HOÀNG THỊ NHUNG
NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG HỢP EPS, KHÁNG VI SINH VẬT, TẠO LACCASE TỪ CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Hà Nội, 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----------***----------
HOÀNG THỊ NHUNG
NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG HỢP EPS, KHÁNG VI SINH VẬT, TẠO LACCASE TỪ CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU
Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Mã số: 60420103
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà
Hà Nội, 2015
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Đặng Thị
Cẩm Hà đã kiên trì chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm
quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các Thầy cô giáo đã tham gia giảng
dạy trong suốt khóa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đinh Thị Thu Hằng cùng tập thể cán bộ của
phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường và các nghiên cứu sinh đã tận tình giúp đỡ
tôi lấy mẫu và trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin cảm ơn đến PGS. TS Thành Thị Thu Thủy đã giúp đỡ tôi bổ trợ
thêm những kiến thức mới. Cảm ơn GS. Bram Brouwer và công ty BioDetection
Systems B.V- BDS, Hà Lan đã thực hiện các phân tích sử dụng công nghệ DR-CALUX
để có kết quả mới trong luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn tới chồng và con trai - là chỗ dựa tinh thần và
những người thân trong gia đình là chỗ dựa vững chắc, động viên, giúp đỡ trong suốt
thời gian qua.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó !
Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Học viên cao học
Hoàng Thị Nhung
Trang i
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận văn
Hoàng Thị Nhung
Trang ii
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................. ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................ iii
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. viii
DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................ 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMS) ................................................. 3 1.2. Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm .................................................................... 5 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới........................................................... 5 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ........................................................... 7 1.3. Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học tự nhiên .... 8 1.4. Tách chiết và xác định các đặc tính của polysaccharide từ nấm ......................... 9 1.5. Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm ................................... 11 1.6. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trong nghiên cứu cấu trúc của
polysaccharide ................................................................................................... 12 1.7. Tính chất vật lý của polysaccharide .................................................................. 15 1.7.1. Khối lượng phân tử của polysaccharide ................................................ 15 1.7.2. Độ hòa tan của polysaccharide từ nấm .................................................. 15 1.8. Vai trò của polysaccharide từ nấm đối với sức khỏe ........................................ 16 1.8.1. Tính kháng u, điều trị ung thư và miễn dịch của polysaccharide .......... 16 1.8.2. Hạ lipid máu và hạn chế đường huyết ................................................... 20 1.8.3. Tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm .................................... 21 1.8.4. Prebiotic từ nấm ..................................................................................... 22 1.8.5. Tính kháng virus của polysaccharide từ nấm ........................................ 23 1.8.6. Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide từ nấm ............................... 24 1.9. Laccase và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người .................................... 26
Trang iii
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
1.9.1. Tổng quan về laccase ............................................................................. 26 1.9.2. Ứng dụng của laccase trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe .......................... 27 1.10. Phương pháp phân tích sàng lọc DR-Calux ................................................... 28
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................................... 35
2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 35
2.1.1. Vi sinh vật .............................................................................................. 35
2.1.2. Hóa chât và thiết bị ................................................................................ 35
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 36
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng nấm ................................................... 36
2.2.2. Phương pháp phân loại nấm dựa vào trình tự xác định trình tự ITS ..... 36
2.2.3. Chuẩn bị giống ....................................................................................... 37
2.2.4. Phương pháp xác định sinh khối và hàm lượng exopolysaccharide ...... 37
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase................................... 37
2.2.6. Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase ................ 38
2.2.6.1. Đánh giá anh hưởng của pH ....................................................... 38
2.2.6.2. Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ............................... 38
2.2.6.3. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ ........................................... 39
2.2.6.4. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon ...................................... 39
2.2.7. Xác định hàm lượng protein, carbonhydrate tổng số của EPS thô ........ 39
2.2.8. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định .................................... 40
2.2.9. Xác định thành phần của polysaccharide ............................................. 41
2.2.10. Xác định hoạt tính của EPS và sinh khối nấm lên một số chức năng
của tế bào ............................................................................................. 41
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 44
3.1. Phân lập và phân loại các chủng nấm nghiên cứu ............................................. 44
3.2. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và hoạt tính laccase của các
chủng nấm…………… ..................................................................................... 48
3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy một số chủng nấm ... 54
Trang iv
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo sinh khối, sinh tổng hợp EPS
và laccase của 2 chủng nấm Earliella sp. FPT31 và Ganoderma sp. FMD12.. 56
3.4.1. Ảnh hưởng của pH môi trường .............................................................. 56
3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ......................................................... 59
3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ..................................................................... 61
3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon ................................................................ 63
3.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ glucose ............................................................ 65
3.4.6. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31 khi
kết hợp các yếu tố môi trường 67
3.5. Hàm lượng carbonhydrate và protein của EPS thô thu được từ FPT31 và
FMD12 ............................................................................................................ 70
............................................................................................................................
3.6. Thành phần và cấu trúc EPS của FMD12 và FPT31 ...................................... 72
3.7. Hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FMD12 và FPT31 ...................... 75
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 77
4.1. Kết luận ........................................................................................................... 77
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 79
Trang v
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) ABTS
Androgen Receptor AR
CALUX Chemical Activated Luciferase Gene Expression
COSY Corelated Spectrscopy
Cardiovascular Disease CVD
Deuterium oxide D2O
Dried crude exopolysaccharide dce
DMEM/F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
DMSO Dimethylsulfoxide
DNS 3,5-dinitrosalicylic acid
đtg Đồng tác giả
EPS Exopolysaccharide
ER Estrogen Receptor
FCS Fetal calf serum
GC Gas Chromatography
GR Glucocorticoid Receptor
HIV Human Immunodeficiency Virus
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
HPLC High- Performance Liquid Chromatography
IC50 Concentration Inhibiting 50% Of Groth
IFN Interferon
IL Interleukin
IPS Intracelular Polysaccharide
ITS Internal transcribed spacer
IZD Internal Zone Diameter
Trang vi
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
NEAA
Non-Essential Amino Acid
Microwave- Assisted Extraction MAE
Minimal Inhibitory Concentration MIC
Medicinal Mushrooms MMs
Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus MRSA
Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis MRSE
Mass Spectrometry MS
Molecular Weight MW
Natural killer NK
NMR Nuclear Magnetic Resonance
NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2 Nrf2
Phosphate Buffered Saline PBS
Potato Dextro Aga PDA
Potato Dextro Broth PDB
Potato Glucose Malt PGM
Pressurized Liquid Extraction PLE
Progesterone Receptor PR
Polysaccarit–K PSK
Polysaccharopeptide PSP
ROESY Rotating Frame Overhauser Enhancement Spectroscopy
Size-Exclusion Chromatography SEC
Supercritical Fluid Extraction SFE
Tumor Necrosis Factor TNF
Tryptone Soya Broth TSB
Ultrasonic- Assited Extraction UAE
Vancomycinresistant Enterococcus faecium VREF
Trang vii
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từ nấm 10
Bảng 1.2 Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của 14
dạng glucose và galactose
Bảng 1.3 Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư từ các nấm điển 19
hình
Bảng 1.4 Một số DR- Calux thông dụng 30
Bảng 2.1 Thành phần thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sự sinh trưởng của 36
vi sinh vật
Bảng 2.2 Sơ đồ hút mẫu cho phân tích sàng lọc CALUX 38
Bảng 3.1 Độ tương đồng giữa các nấm thuộc Ganoderma từ các vùng 40
Bảng 3.2 Hình thái các chủng nấm và khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp 44
polysaccharide và enzyme laccase của chúng
Bảng 3.3 Khả năng ức chế sự sinh trưởng 2 chủng vi khuẩn B. cereus và M. 50
luteus của dịch nuôi cấy chủng FMD12
Bảng 3.4 Sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp EPS theo thời gian của FPT31 55
và FMD12
Bảng 3.5 Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31 62
trên môi trường chứa đường và cao nấm men ở nồng độ khác nhau
Bảng 3.6 Điều kiện nuôi cấy của 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 với một số 64
nghiên cứu quốc tế
Bảng 3.7 Hàm lượng đường và protein trong EPS thô của FPT31 và FMD12 66
Bảng 3.8 Kết quả sàng lọc hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FPT31 71
và FMD12 bằng Calux
Trang viii
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Cơ chế tham gia miễn dịch của β- glucan từ nấm 18
Hình 1.2 Sơ lược về DR- Calux 29
Hình 3.1 41
Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm thuộc chi Ganoderma trong nghiên cứu
Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm trong nghiên cứu 42
Hình 3.3 49
Khả năng kháng Bacillus cereus và Micrococus luteus của dịch nuôi từ nấm FPT31 và FMD12
Hình 3.4 53
Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12
Hình 3.5 54
Hoạt tính enzyme laccase của chủng FPT31 theo thời gian nuôi cấy
Hình 3.6 57
Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12
Hình 3.7 59
Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12
Hình 3.8 61
Ảnh hưởng của nguồn nồng độ glucose đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12
Hình 3.9 Phổ HSQC của EPS sinh từ chủng FMD12 68
Hình 3.10 Phổ HSQC của EPS sinh từ chủng FPT31 69
Trang ix
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
MỞ ĐẦU
Giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài tuy nhiên chỉ có 14.000 loài trong đó là nấm
đảm Basidomycetes. Một vài trong số những chi này đã được trồng trên quy mô công
nghiệp trên toàn thế giới bao gồm Pleurotus (nấm sò), Lentinula (nấm hương),
Auricularia (mộc nhĩ), Agaricus (nấm Thiên Chúa), Flammulina (nấm kim châm),
Hypsizygus (nấm ngọc châm), Ganoderma (nấm Linh Chi), Inonotus obliquus (nấm đen),
Coprinus (nấm đùi gà), Agrocybe (nấm trân châu) và Volvariella (nấm rơm). Nấm được
sử dụng cho rất nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học đặc biệt là trong các ngành sản
xuất thực phẩm, enzyme, bổ sung cho chế độ ăn kiêng, các hợp chất có dược tính, thực
phẩm bổ sung [111] và nhiều ứng dụng khác.
Một thành phần quan trọng của nấm chiếm được sự quan tâm lớn của khoa học là
polysaccharide. Các polysaccharide từ nấm được thu nhận từ Ganoderma, Lentinus,
Oyster, Flammulina, Cordyceps, Coriolus và Pleurotus đều đã được chứng minh là có
nhiều hoạt tính sinh học bao gồm miễn dịch, kháng u, chống ung thư, kháng khuẩn,
kháng virus, chống oxy hóa, các đặc tính liên quan đến đường huyết và tim mạch. Ngoài
ra các enzyme laccase cũng đang được chứng minh vai trò quan trọng của nó trong lĩnh
vực bảo vệ sức khỏe con người.
Nấm được sử dụng chủ yếu thông qua ăn trực tiếp (nấm ăn) và sắc lấy nước uống
hoặc dùng hàng ngày cũng ở dạng sản phẩm uống (thực phẩm chức năng và thuốc) được
tách chiết từ các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm. Cho đến nay hầu hết các sản
phẩm từ nấm đều được thu nhận trực tiếp từ quả thể của nấm tự nhiên hay nấm trồng
thông qua quá trình tách chiết phức tạp và sử dụng nước nóng hay các dung môi hữu cơ
khác nhau. Lên men chìm là một giải pháp được đưa ra để khắc phục những nhược điểm
của một số phương pháp tách chiết truyền thống như thời gian thu nhận, hiệu suất tách
chiết, khả năng kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm trong suốt quá trình sản xuất và sự
phức tạp của quá trình thu nhận sản phẩm cuối cùng để tạo hàng hóa thương mại. Vì vậy,
Trang 1
việc lựa chọn môi trường thích hợp cho nấm sinh tổng hợp một lượng lớn các hợp chất
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
có hoạt tính sinh học mà quan trọng là polysaccharide có ý nghĩa lớn.
Các hoạt tính sinh học của polysaccharide bị ảnh hưởng bởi các đặc điểm về cấu
trúc của chúng như thành phần hóa học, khối lượng phân tử, các liên kết glycosidic và
dàng cấu hình. Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm về cấu trúc của polysaccharide có ý
nghĩa trong việc xác định các hoạt tính sinh học của chúng từ đó ứng dụng chúng vào
các mục đích thích hợp.
Công nghệ phân tích sàng lọc bằng CALUX đã trở thành một công cụ sinh học
mới bắt đầu được sử dụng trong việc phát hiện các chất hay các cụm chất có tác dụng ở
mức độ tế bào từ các mẫu sinh phẩm và môi trường dựa vào sự biểu hiện của gen đích
gắn với promoter chỉ thị là luciferase. Hiện nay, CALUX là phương pháp hữu hiệu để
không chỉ xác định nồng độ dioxin hay các chất đích đang được mong muốn tìm mà
công cụ này còn được ứng dụng trong các lĩnh vực như an toàn thực phẩm cho người.
Các lĩnh vực như nước uống, chất lượng môi trường, dược phẩm/ hóa chất, thức ăn chăn
nuôi, sản phẩm tiêu dùng, các phép thử ở bệnh viện, các sản phẩm sinh học tế bào, các
nguyên liệu đối chứng tham khảo và các sản phẩm khác v.v. là đối tượng mà công nghệ
CALUX có thể phân tích. Việc đánh giá các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ
nấm lên các chức năng của tế bào giúp định hướng một cách rõ ràng hơn về khả năng
ứng dụng của chúng để tạo thuốc, thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung cho người,
vật nuôi và cây trồng.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh
học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ
các vùng sinh thái khác nhau” đã được tiến hành. Nội dung chính của đề tài bao gồm:
- Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn nấm có khả năng sinh tổng hợp EPS và
enzyme laccase từ các mẫu nấm thu thập từ Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh
Phú Thọ; Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội; rừng keo tỉnh Bình
Trang 2
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Phước; rừng bị rải chất độc hóa học là A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế và Mã
Đà- tỉnh Đồng Nai;
- Phân loại 2 chủng nấm bằng phương pháp xác định trình tự vùng ITS;
- Lựa chọn môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và
laccase của 2 chủng nấm Ganoderma sp. FMD12 và Earliella sp. FPT31;
- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy 2 chủng
nấm Ganoderma sp. FMD12 và Earliella sp. FPT31;
- Xác định sơ bộ thành phần và tỷ lệ các đường tạo thành EPS của 2 chủng nấm
trên.
- Đánh giá một số hoạt tính sinh học của EPS bằng kỹ thuật CALUX để định
hướng ứng dụng.
Trang 3
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMs- Medicinal Mushrooms)
Nấm sợi và nấm mũ được phân bố rộng rãi và phong phú trên toàn thế giới. Các
ước tính gần đây về nấm cho thấy số lượng nấm vào khoảng 500 000 đến hơn 5 tỉ loài,
được công bố hơn 20 năm trước [46]. Cho đến nay, có khoảng 3 tỉ loài nấm được chấp
nhận sử dụng chung. Trong khi đó, hiện nay có 110 000 loài nấm đã được mô tả. Số
lượng các loài nấm trên trái đất hiện nay ước tính khoảng 150 00 – 160 000. Chưa hết,
có lẽ chỉ có 10% số loài có tên được khoa học biết đến [133]. Một phân tích về nguồn
gốc của các loài nấm mới cho khoa học đã được mô tả và công bố trong cuốn Biên lục
về Nấm xuất bản 10 năm trước cho thấy khoảng 60% các loài nấm mới được mô tả là từ
các vùng nhiệt đới.
Nấm được tiêu thụ trên toàn thế giới không chỉ do đặc tính cảm quan mà còn thu
hút được nhiều sự quan tâm do lợi ích của chúng đối với sức khỏe con người. Hiện nay
nấm được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng cũng như dược lý của chúng. Nấm có thể
được coi là một loại thực phẩm tốt cho sức khỏe vì chúng có hàm lượng protein và hàm
lượng chất xơ cao, với một lượng vitamin và khoáng chất đáng kể và lượng chất béo
thấp. Chúng là một nguồn dược phẩm lớn, mới nhưng chưa được khai thác. Hơn nữa,
nấm ngày càng thu hút sự quan tâm bởi chúng có thể được ứng dụng để tạo thực phẩm
chức năng và là nguyên liệu cho sự phát triển của các loại thuốc và các sản phẩm dinh
dưỡng do để bổ sung vào chứa một loạt các phân tử có hoạt tính sinh học như β- glucans,
polyphenol, phytosterol, tecpen. Quan trọng nhất đối với y học hiện đại là nấm dược liệu
(MMs) là nguồn polysaccharide vô hạn (đặc biệt là β- glucan) và các phức hợp
polysaccharide- protein có khả năng chống ung thư và tăng khả năng miễn dịch. Hầu hết
các Basidiomycetes bậc cao đều chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học với phân tử
lượng thấp hoặc cao (triterpenes, lactones, alkaloids và các hợp chất khác) trong quả thể
nấm, sợi nấm và dịch nuôi cấy [133], [128], [8], [27].
Trang 4
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
MMs được so sánh với thuốc thảo dược và được xác định có thể là các nấm lớn,
hầu hết thuộc nấm đảm và một vài thuộc nhóm nấm sợi. Chúng được sử dụng ở dạng
chiết xuất hoặc dạng bột để ngăn ngừa, giảm thiểu hay chữa trị bệnh, và/ hoặc bổ sung
cho người một chế độ ăn uống khỏe mạnh và cân bằng.
Nấm dược liệu và nấm ăn có khoảng 130 chức năng để có thể sử dụng làm thuốc
do có khả năng kháng ung thư, tăng khả năng miễn dịch, chống lão hóa, kháng các bệnh
tim mạch, chống tăng cholesterol, kháng vi rút, kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng, kháng
nấm, khử độc, bảo vệ gan, chống các ảnh hưởng của đái đường. Nấm được sử dụng vào
các liệu pháp tăng miễn dịch, và đã được chứng minh là có hiệu quả như chống viêm,
chống oxy hóa, kháng u, hoặc là kháng virus và là các nhân tố kháng khuẩn.
Rất nhiều, nếu không nói là tất cả, các nấm mũ bậc cao chứa các hợp chất có hoạt
tính sinh học không chỉ có trong quả thể nấm, trong sợi nấm qua nuôi cấy mà còn có
trong môi trường nuôi cấy. Các polysaccharide từ nấm đang được quan tâm đặc biệt bởi
các đặc tính hữu ích của chúng. Các dữ liệu khoa học về các polysaccharide từ nấm và
các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp lại khoảng 700 loài. Số lượng các
polysaccharide có hoạt tính sinh học hoặc các phức hợp polysaccharide- protein từ các
nấm thuốc có mặt để tăng cường các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và phản ứng miễn
dịch thu được và tạo ra hoạt tính kháng ung thư ở người và động vật. Cho đến nay các cơ
chế về hoạt động kháng ung thư của chúng vẫn còn chưa được hiểu một cách rõ ràng.
Polysaccharide và các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp có khối lượng phân tử thấp giữ vai
trò đặc biệt quan trọng do đặc tính kháng ung thư và tăng khả năng miễn dịch của chúng
[134].
1.2. Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Việc sử dụng các loài nấm trong các liệu pháp điều trị đã xuất hiện ít nhất từ thời
kì đồ đá mới. Trải qua hàng nghìn năm, các loài nấm được đánh giá là có giá trị cho con
người là nấm ăn và nấm dược liệu. Các nghiên cứu hiện đại xác nhận và ghi nhận nhiều
Trang 5
kiến thức cổ xưa về nấm dược liệu. Một lĩnh vực khoa học liên ngành tập trung vào
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
nghiên cứu nấm dược liệu đã được phát triển và ngày càng chứng tỏ tính ưu việt và độc
đáo của các hợp chất chiết xuất từ một loạt các loài nấm trong ba thập kỷ gần đây. Các
thử nghiệm lâm sàng hiện đại được tiến hành ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nga
và một số nước khác dựa trên các nấm đã biết nguồn gốc. Đông y học cổ đại đã nhấn
mạnh tầm quan trọng của một số loài nấm như nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), nấm
hương (Lentinus edode). Nấm cũng đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh ảnh
hưởng đến dân cư vùng nông thôn ở các nước châu Âu. Các loài quan trọng nhất là
Inonotus obliquus, Fomitopsis officinalis, Piptoporus betulinus, Fomes fomentarius.
Những loài này được sử dụng trong điều trị rối loạn tiêu hóa, các dạng ung thư khác
nhau, hen phế quản, đổ mồ hôi đêm …Từ lâu, nấm đã được sử dụng trong điều trị bệnh
ở Trung Mỹ (đặc biệt là chi Psilocybe), ở châu Phi, Algeria và Ai Cập. Vai trò đặc biệt
của nấm hương bay được tìm thấy trong Shaman giáo ở Siberia và Tây Tạng, trong Phật
giáo và huyền thoại Celtic [107], [129], [133], [18].
Ngày nay, nấm dược liệu được sử dụng trong các lĩnh vực như làm thực phẩm
ăn kiêng (sản lượng nấm thế giờ là 30 tấn vào năm 2012); sản phẩm bổ sung vào chế độ
ăn uống (sản phẩm của lĩnh vực này phát triển mộtt cách nhanh chóng và có giá trị hơn
18 tỷ USD/ năm); một loại thuốc mới được gọi là “dược phẩm nấm”; nhân tố kiểm soát
sinh học tự nhiên trong bảo vệ thực vật với các hoạt tính kháng côn trùng, diệt nấm, diệt
khuẩn, diệt cỏ, diệt tuyến trùng, kháng vi rút ở thực vật. Trong mỹ phẩm, các hợp chất
khác của MMs, bao gồm polysaccharide như β-glucans, glucuronoxylomannan (GXM ),
sacchachitin, tyrosinase và các enzyme khác được các công ty mỹ phẩm sử dụng do khả
năng tạo màng của chúng, kích hoạt các yếu tố tăng trưởng biểu bì, chống oxy hóa,
chống dị ứng, kháng khuẩn, va hoạt tính kháng viêm, kích thích hoạt động của collagen,
ức chế bạch biến tự miễn dịch và điều trị mụn trứng cá [133], [134], [54].
Trang 6
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Từ xưa, người Việt Nam đã sử dụng nấm Linh chi dùng làm dược liệu. Từ thời Lê
Quý Đôn (1726-1784), nấm Linh chi được đánh giá rất cao. Các chế phẩm từ Linh chi
(Ganoderma) được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như: gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư,
AIDS, suy nhược cơ thể, tiểu đường, giảm đau, giải độc trong cơ thể, đào thải chất
phóng xạ, giảm cholesterol trong máu, mất ngủ, loét dạ dày, làm tăng hệ thống miễn
nhiễm của cơ thể, tê thấp v.v. Tuy nhiên những nghiên cứu về nấm dược liệu và nấm ăn
cũng chủ yếu dừng lại ở thống kê, đánh giá và xác định sự đa dạng và giá trị tài nguyên
của loại nấm này ở các khu vực khác nhau như Thừa Thiên Huế [1], Vườn Quôc gia Bù
Gia Mập [6], vùng Thanh- Nghệ Tĩnh [5], tỉnh Tây Ninh [4].
Một nghiên cứu của Lê Xuân Thám và đtg (2011) đã xác định được thành phần
hóa học của mẫu nấm Linh Chi đen Amauroderma subresinosum Murr phân lập từ Vườn
Quốc Gia Cát Tiên bằng kỹ thuật sắc ký khí (GC). Nghiên cứu đã xác định được 14 axit
béo, trong đó axit béo chưa bão hòa 11-octadecaenomic có nồng độ cao nhất (khoảng
51,01% tổng lượng axit béo đã được xác định). Ngoài ra, các axit béo là lignoceric, 14-
methylpentadecaenoic, 8,11-octadecenoic cũng đã được xác định và làm sáng tỏ về cấu
trúc [104].
Trần Thị Hồng Hà và đtg (2012) đã tách chiết và xác định hàm lượng các
polysaccharide từ quả thể nấm hầu thủ Hericium erinaceus. Phân đoạn chiết bằng NaOH
4% cho tổng lượng polysaccharide chiếm 80% , bao gồm các dạng tan và không tan
trong nước. Một lượng ít polysaccharide được tổng hợp trong dịch nuôi cấy nấm.
Polysaccharide tan trong phân đoạn chiết NaOH 2% có hoạt tính ức chế sự hình thành
khối u tế bào ung thư gan (Hep-G2) thể hiện bằng việc giảm kích thước khối u xuống
24,4% và mật độ hình thành khối u 61,5% so với đối chứng âm [2].
Tuy nhiên, những nghiên cứu được tổng hợp ở trên mới chỉ tập trung vào chi
Ganoderma và ứng dụng của chúng trong y học. Trong khuôn khổ luận văn thạc sỹ này
học viên cao học không chỉ nghiên cứu, khảo sát về khả năng sinh tổng hợp
polysacchride của một số Ganoderma mà còn tập trung nghiên cứu khả năng sinh trưởng,
Trang 7
sinh tổng hợp expolysaccharide và enyme laccase của dịch lên men từ nấm phân lập mới
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
từ rừng ở các vùng khí hậu khác nhau. Đồng thời đánh giá khả năng kháng một số vi
sinh vật kiểm định; xác định thành phần và cấu trúc của polysaccharide trong dịch nuôi
cấy của 2 chủng nấm lựa chọn; đánh giá một số hoạt tính in vitro lên các chức năng của
tế bào. Từ đó, có hướng ứng dụng thích hợp cho mỗi chủng nấm, đặc biệt trong lĩnh vực
thực phẩm bố sung cho người và gia súc, gia cầm.
1.3. Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học tự nhiên
Trong số các hoạt chất sinh học có trong nấm, polysaccharides chiếm được sự
quan tâm hơn cả chủ yếu là do đặc tính tuyệt vời của trong miễn dịch, các chất chống
oxy hóa, chống viêm, hoặc kháng u. Polysaccharide là một polymer mà trong đó
monomer là các phân tử đường đơn. Một vài polysaccharide đã được phân lập từ các
nấm nguyên liệu. Khi tất cả các monosaccharide tạo thành carbohydrate cùng loại thì các
polymer này được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan. Tuy nhiên, nếu có
nhiều hơn một loại monosaccharide có mặt trong cấu trúc, chúng được gọi là
heteropolysaccharide hoặc heteroglycan. Như vậy, các heteropolysaccharide được hình
thành bởi các loại đường khác nhau [22], [120] và phức hợp polysaccharide-protein [11]
cũng có thể được tìm thấy trong một số nấm nhất định.
Các đặc điểm về cấu trúc như tính chất của monomer, các loại hình liên kết và
vị trí liên kết, cũng như số lượng và vị trí của các nhánh có trong chuỗi polymer sẽ ảnh
hưởng mạnh đến cấu trúc không gian 3 chiều cùng với kích thước phân tử từ đó sẽ xác
định các tính chất và hoạt tính của polysaccharide [16]. Tương tự, các tính chất vật lý
như khả năng hòa tan, độ nhớt, độ đông đặc, có thể ảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học
vì chúng có thể làm thay đổi tính sẵn sàng sinh học của polysaccharide [95]. Do đó, việc
xác định một cách rõ ràng các cấu trúc và tính chất vật lý phân tử của các
polysaccharides có trong nấm là vô cùng quan trọng để dự đoán các hoạt tính sinh học
của chúng.
Trang 8
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
1.4. Tách chiết và xác định các đặc tính của polysacchride từ nấm
Việc tách chiết polysaccharide liên quan đến việc phân tách các carbohydrate từ
nấm nguyên liệu. Các phương pháp tách chiết thông thường thường khuấy mẫu vào dung
môi [27]. Các dung dịch thường được sử dụng là nước ở nhiệt độ phòng, nước sôi, thậm
chí là dung dịch NaOH, KOH (2%). Phần còn lại được tách ra bằng cách ly tâm còn
polysaccharides được kết tủa với ethanol theo tỷ lệ 2: 1 ( v / v ) .
Trong một số trường hợp, nước hoặc dung môi cơ bản không đủ mạnh để tách
các polysaccharide không tan thì giải pháp có thể sử dụng các dung dịch có tính axit
mang tính khả thi cao. Một số axit, bao gồm acetic, formic, clohydric, axit phosphoric,
đã được thử nghiệm trong quá trình phân tách β- (1-3)-glucans không tan [94].
Các kỹ thuật tách chiết bằng dung môi thường sử dụng một lượng lớn các dung
môi hữu cơ độc hại, thường là mất nhiều thời gian, và có sản lượng thu nhận thấp và độ
chọn lọc cũng thấp. Thêm vào đó, với các phương pháp tách chiết này, các chất cần tách
chiết có thể tiếp xúc với nhiệt độ quá cao,cần ánh sáng và oxy, đòi hỏi phải có thời gian
tách chiết dài, dẫn đến sự hoạt động của các enzyme phân hủy glucan. Trong thời gian
tách chiết, một số hợp chất có hoạt tính sinh học có thể dễ dàng bị mất do sự ion hóa,
thủy phân và oxy hóa. Do đó, các kỹ thuật phức tạp hơn như tách chiết bằng áp suất chất
lỏng (PLE), tách chiết có siêu âm hỗ trợ hoặc dùng vi sóng có thể là một giải pháp tốt để
phân tách các polysaccharides. Bảng1.1 tổng hợp các kỹ thuật chính và các điều kiện cần
thiết cho việc chiết xuất các polysaccharide từ nấm.
Trang 9
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Bảng 1.1. Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từ nấm
Điều kiện tách chiết
Ưu, nhược điểm
Nấm
Tài liệu tham khảo
10.1 MPa; 28°C; 70 phút
[112]
Lentinus edodes
Kỹ thuật tách chiết Tách chiết bằng áp suất chất lỏng (PLE)
[37]
Chiết xuất dòng siêu tới hạn (SFE)
35 MPa; tốc độ dòng 10 kg/h CO2; 25°C ; 4 giờ
Ganoderma lucidum
[126], [58]
Agaricus bisporus
chiết bằng trợ
[121], [109]
- Thân thiện với môi trường; - Lượng dung môi sử dụng ít, thường là nước; - thời gian thực hiện ngắn; - Là phương pháp tự động và sử dụng oxy, ánh sáng từ môi trường. - Sử dụng CO2 như các dung môi chiết; - Thân thiện với môi trường; - Nhiệt độ tương đối thấp và các dung môi hữu cơ được loại bỏ trong quá trình chiết xuất sẽ tránh được sự phân hủy các thành phần có hoạt tính sinh học; - Hiệu suất tách chiết sẽ tốt. - Ưu điểm là nhanh, không tốn kém và hiệu quả tương tự với các kỹ thuật tách chiết thông thường; - Lượng dung môi sử dụng ít; - Quá trình chuẩn bị mẫu nhanh chóng.
Agaricus blazei
Tách siêu âm hỗ (UAE) Chiết xuất bằng vi sóng hỗ trợ (MAE)
-Giảm thời gian chiết nhưng làm tăng hiệu suất chiết và tiết kiệm năng lượng.
Ganoderma lucidum
[29], [21]
Chiết xuất kết hợp vi sóng và siêu âm (UMAE)
Cường độ siêu âm 230 W; 70°C; 62 phút; tỷ lệ nước: vật liệu 30 mL/g Cường độ vi sóng 400 W; 74,64°C; 29,37 phút; tỉ lệ nước: vật liệu 32,7:1 Cường độ siêu âm 50 W; Cường độ vi sóng 284 W; 701 giây; tỷ lệ nước: vật liệu 11,6:1
Trang 10
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Theo Lindequist và đtg (2005) thì 80- 85% các sản phẩm từ nấm dược liệu
được thu nhận từ quả thể và chỉ 15- 20% được thu nhận từ sợi nấm và dịch nuôi cấy
thông qua lên men chìm [121]. Tuy nhiên, lên men chìm đã được chứng minh là có
hiệu quả và khả năng kiểm soát tốt hơn cho quá trình sinh tổng tổng hợp các hợp chất
có dược tính từ Basidomysetes [33], [12], [8]. Bước đầu tiên để thành công trong lên
men chìm là chọn lọc môi trường thích hợp cho mỗi chủng nấm để sinh tổng hợp một
lượng lớn các chế phẩm sinh học. Ngoài ra, quá trình thu nhận exopolysaccharide từ
lên men lỏng cũng có nhiều ưu điểm hơn so với thu nhận từ quả thể. Thời gian lên
men chỉ khoảng 10-15 ngày so với nuôi cấy để thu quả thể có thể kéo dài đến 3 tháng
[66]. Dịch lên men chỉ qua bước kết tủa với ethanol ở 4oC trong khi một số
polysaccharide được thu nhận từ quả thể nấm tốn nhiều thời gian, qua nhiều bước
phức tạp để tách chiết và tách phân đoạn như tủa đường trong ethanol, lặp lại các
bước tách chiết bằng nước nóng và dung dịch ammonium oxalate của NaOH, sau đó
các polysaccharide đã được tách chiết lại trải qua nhiều bước làm sạch để sử dụng
cho các nghiên cứu tiếp theo. Hiệu suất tách chiết từ dịch lên men cũng cao hơn so
với các phương pháp tách chiết từ quả thể [56]. Với những ưu điểm này, lên men
chìm để thu một lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học đang lựa chọn và
nghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp khả thi nhất.
1.5. Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm
Các phân tích về cấu trúc của các polysaccharide giúp xác định các đặc điểm
phân tử như khối lượng phân tử, thành phần chuỗi, cấu hình và các dạng đồng phân,
trình tự các monosaccharide, sự có mặt và vị trí các nhánh, sự có mặt của các liên kết
interglycosidic. Ngày nay, có một loạt các kỹ thuật đặc trưng để có được các thông
tin chi tiết về cấu trúc của các polysaccharide.
Kích thước phân tử thường được xác định bằng phương pháp sắc ký loại trừ
kích thước (size-exclusion chromatography- SEC) bằng cách so sánh với các vật liệu
tiêu chuẩn.
Thành phần monosaccharide có thể được nghiên cứu bằng cách thủy phân
các polysaccharide trong axit và sau đó phân tích các loại đường tạo thành bằng
Trang 11
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high- performance liquid chromatography-
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
HPLC ) bằng sắc ký khí ( gas- chromatography- GC ) [14].
Sự có mặt và vị trí xuất hiện của các nhánh có thể được xác định thông qua
sự hình thành các dẫn xuất như methyl acetate alditol, trimetylsilyl, acetyl,
trifluoroacetyl, methaneboronate, acetal hoặc sự kết hợp của chúng và các phân tích
tiếp theo có thể làm sáng tỏ bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS) [13]. MS là một kỹ
thuật vô cùng hữu ích vì nó chỉ đòi hỏi một lượng mẫu tương đối thấp (picograms
hoặc ít hơn) và không cần polysaccharide quá tinh khiết. Mặc dù các phân tích về cấu
trúc của polysaccharide bằng MS có thể được thực hiện đối với nhiều
olygosaccharides không dẫn xuất và các phức glyco nhưng các polysaccharides được
O- methyl hóa vẫn được sử dụng để tăng tính ổn định của các ion và độ nhạy của MS.
GC/MS cung cấp thông tin về vị trí của liên kết glycosid, sự có mặt của các nhánh và
thành phần monosaccharide trong các carbohydrate phức tạp.
Polysaccharide có mặt trong tự nhiên ở cả 2 dạng cấu hình α và β; tuy nhiên
các tính chất vật lý về cơ bản khác nhau phụ thuộc vào loại liên kết. Do đó, việc làm
sáng rõ các cấu hình liên kết là một vấn đề quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc của
polysaccharide. Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một công cụ ưu việt để có được
các thông tin về thành phần các monosaccharide và cấu hình anomeric, các liên kết
trong chuỗi và xa hơn nữa là các kết quả phân tích sự methyl hóa [72].
1.6. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance- NMR)
trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide
Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân đã được sử dụng rộng rãi trong phân
tích cấu trúc và cấu hình không gian của các polysaccharide trong dung dịch. Giá trị
độ dịch chuyển hóa học và các hằng số tương tác thu được từ phổ NMR sẽ cung cấp
các thông tin về loại đường và cấu hình anomeric.
Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu
(không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid). Phổ cũng có
thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua
các tín hiệu trong khoảng 4,3 đến 5,8 ppm. Nếu các cấu hình là α thì sự thay đổi hóa
Trang 12
học là lớn hơn so với β. Khi tín hiệu xuất hiện ở vùng 5,0- 5,8 ppm, cấu hình anomer
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
là α và nếu xuất hiện ở vùng 4,3- 5,0 ppm, thì đó là anomer β. Như vậy dựa vào tỷ lệ
tích phân tương đối của các cộng hưởng anomer cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử
của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với
kết quả phân tích 1H-NMR. Nhìn chung, kết quả tính tích phân NMR là chính xác
hơn so với kết quả phân tích hoá học. Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự
có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ 1D 1H-NMR. Tiếp theo, số lượng chính
xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát
vùng anomer của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC.
Độ dịch chuyển hoá học của proton anomer (4,4 –5,8 ppm) được tách biệt một
cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các cộng hưởng 1H ở các vị trí khác (3,2– 4,5 ppm)
trong khi độ dịch chuyển 13C anomer (95 – 110 ppm) lại tách biệt rất rõ, không hề
trùng chập với các cộng hưởng 13C ở các vị trí còn lại (60 – 85 ppm).
Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình anomer được suy ra từ các
thông tin kết hợp có giá trị từ độ dịch chuyển hoá học 1H (H cộng hưởng giữa 5,0 và
5,8 ppm trong khi H cộng hưởng trong khoảng 4,4 và 5,2 ppm) với hằng số tương
tác vô hướng của C-1, H-1 (1JC-1, H-1 165-175 Hz đối với trong khi 1JC-1, H-1 158-165
Hz đối với ). Tương tác dị hạt nhân liên kết 1JC-1,H-1 có thể thu được từ phổ 1H – 13C
HSQC không khử tương tác.
Ở phổ 13C-NMR, các carbon trong vòng được tìm thấy trong khoảng 50- 85
ppm trong đó các carbon gắn với nitơ xuất hiện ở trong khoảng 65- 75 ppm. Các
carbon tham gia vào quá trình glycosyl hóa dịch chuyển xuống một khoảng 5-10 ppm.
Các nguyên tử C6 không thế được tìm thấy quanh vùng 60- 63 ppm và các carbon C6
liên kết với các đường dư khác xuất hiện quanh vùng 65- 70 ppm. Các tín hiệu carbon
của các nhóm methyl hóa được tìm thấy trong khoảng 15-30 ppm và các carbon
carbonyl hóa được tìm thấy ở 165- 185 ppm (Bảng 1.2) [72].
Trang 13
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Bảng 1.2. Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của
dạng glucose và galactose
H-2 C-2
H-3 C-3
H-4 C-4
H-5 C-5
H-6a C-6
H-6b Monosaccharide -D-Glcp H-1 5,11 0,30 C-1 97,5 4.5 3.520,06 72,51,0 3,760,10 73,80,4 3,410,05 70,70,6 3,740,10 72,90,5 3,640,16 61,40,4 3,780,08 -D-Glcp 4,840,46 102,92,4 3,310,05 74,11,1 3,550,07 76,31,4 3,510,13 70,41,0 3,550,09 76,01,3 3,770,05 61,51,0 3,940,05 -D-Galp 5,160,35 99,13,1 3,890,12 68,91,3 3,930,16 70,21,7 4,120,19 68,61,9 4,110,29 71,02,0 3,730,07 61,70,8 3,730,04 -D-Galp 4,680,26 103,52,4 3,530,17 71,72,1 3,800,16 73,51,7 4,080,18 67,92,0 3,740,20 75,51,1 3,740,05 61,80,7 3,740,05
Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương ứng
với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu
NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển
hoá học của 13 C so với độ dịch chuyển hoá học của các monomer không thế. Việc
phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hoá. Trật
tự các đơn phân trong mạch của polysaccaride được xác định chính là chuỗi các liên
kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ
HMBC và NOESY.
Kỹ thuật NMR hai chiều (2D) bao gồm phổ tương quan (COSY), phổ tăng
cường định kỳ Overhauser (ROESY), hiệu ứng quang phổ hạt nhân Overhauser
(NOESY) và sự kết hợp lượng tử đa dị nhân (HMQC) làm sáng tỏ cấu trúc của
polysaccharide gồm thành phần monosaccharide, liên kết glycosidic.
1.7. Tính chất vật lý của polysaccharide
Các tính chất vật lý như độ tan trong nước, độ nhớt, độ đặc là các yếu tố
quan trọng gần như quyết định khả năng sinh học và các hoạt động sinh lý khác. Hầu
Trang 14
hết các nghiên cứu về tính chất vật lý của các polysaccharide đã được thực hiện đối
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
với các β - glucans từ ngũ cốc, tuy nhiên ngày nay các polysaccharide phân lập từ
nấm đang chiếm được tầm quan trọng ngày càng lớn với số lượng các nghiên cứu
tăng đáng kể .
1.7.1. Khối lượng phân tử của polysaccharide
Khối lượng phân tử (MWS) của các polysaccharide khác nhau tùy thuộc vào
phương pháp xác định. Các β- glucan tan trong nước từ nấm có khối lượng phân tử
trong khoảng 105-106 Da. Phương pháp sắc ký kích thước loại trừ kết hợp với tán xạ
ánh sáng laser đa góc (SEC-LLS) thường được sử dụng để đo kích thước các phân tử.
Theo đó, khối lượng phân tử của polysaccharides từ Auricularia auricula-judae là
2,15- 106 Dal [143], các carbohydrate từ Ganoderma lucidum là 1,24- 105 Dal [132]
và từ Pleurotus tuber-regium là 3.14- 105 Dal [124]. Các kỹ thuật tương tự được kết
hợp với các kỹ thuật dò khác nhau, chẳng hạn như chỉ số khúc xạ (HPLC - RI , đã
chứng minh rằng các polysaccharides từ Calocybe indica có khối lượng phân tử là 2-
105 Dal [80] , từ bào tử của Ganoderma lucidum là 1,26- 105 Dal [9], và một
carbohydrate phân lập từ quả thể của Pleurotus Sajor - caju có khối lượng phân tử
9,75- 105 Dal [17].
1.7.2. Độ hòa tan của polysaccharide từ nấm
Độ tan trong nước của các polysaccharide phụ thuộc rất nhiều vào loại liên kết
xuất hiện trong chuỗi. Thông thường, cụm các liên kết liền kề cùng loại như β- (1 →
3) hoặc β- (1 → 4) có xu hướng tổng hợp các liên kết trong chuỗi thông qua các liên
kết hydro mạnh mẽ do đó có thể góp phần làm tăng độ cứng của các phân tử trong
dung dịch và độ hòa tan thấp hơn. Sự kết hợp của các liên kết tiếp giáp β- (1 → 4)
hay β- (1 → 3) tạo nên các liên kết dài giống như cellulose và kết quả là các
polysaccharide không tan. Curdlan và các liên kết β- (1 → 3) glucan khác thường
không tan trong nước, rượu, và hầu hết các dung môi hữu cơ nhưng tan trong các
dung dịch có tính kiềm như 0,25 M NaOH, Dimethylsulfoxide (DMSO), acid formic,
và một số thuốc thử dung môi không proton [87]. Các polysaccharide có cấu trúc lặp
của các liên kết đơn vị (1 → 3), (1 → 6) glucose - thường rất cứng, hình que, có hình
Trang 15
xoắn ba trong dung dịch nước. Ba sợi xoắn được giữ với nhau và ổn định bằng các
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
liên kết hydro mạnh. Một số điều kiện có thể phá vỡ các chuỗi xoắn ba, chẳng hạn
như nồng độ DMSO ≥ 87%, nhiệt độ ≥ 135°C, hoặc bổ sung natri hydroxide > 0,2
mol /L để xoắn ba phân ly gần như hoàn toàn thành các chuỗi đơn và làm tăng khả
năng tăng khả năng hòa tan.
Sự hiện diện của các mối liên kết khác nhau trong cấu trúc phá vỡ tính cân đối
của các trình tự và làm cho các phân tử hòa tan và linh hoạt hơn. Các khoảng cách bất
thường trong chuỗi β– glucan chịu trách nhiệm tạo nên hình dạng tổng thể cho
polysaccharide và do đó các chuỗi không thể sắp xếp chặt chẽ trên các vùng mở rộng,
tăng độ tan trong nước của các polysaccharide. Tuy nhiên, sự hiện diện của một mô
hình lặp đi lặp lại xen kẽ các mối liên kết như ba phần cellotriosyl liên tiếp có thể tạo
thành hình dạng ổn đinh. Phần đã được sắp này có thể áp đặt một số cấu hình không
đều đặn lên chuỗi β – glucan và do đó hình thành mức độ tổ chức cao hơn của các
polyme trong dung dịch dẫn đến khả năng hòa tan thấp [122].
Sự xuất hiện của các monosaccharide khác nhau trong chuỗi có thể điều chỉnh
độ hòa tan. Sự hiện diện của monosaccharide khác nhau như nhóm thế arabinosyl,
xuất hiện để ngăn chặn sự kết hợp này và làm cứng các phân tử lại bằng cách duy trì
khung xylan trong một cấu hình mở rộng hơn [95].
1.8. Vai trò của polysaccharide từ nấm đối với sức khỏe
1.8.1. Tính kháng u, điều trị ung thư và miễn dịch của polysaccharide
Polysaccharide từ nấm đã được sử dụng rộng rãi và có tác dụng trong điều trị
khối u bởi chúng làm tăng cường miễn dịch của cơ thể. Các polysaccharide với hoạt
tính kháng u mạnh có cấu trúc hóa học khá đa dạng từ homoglycan cho tới các
heteroglycan với các loại monomer như glucose, galactose, mannose, xylose,
arabinose, fucose, ribose, axit glucuronic. Ngoài các β-glucan mạch thẳng, một số β-
glucan mạch nhánh cũng có hoạt tính kháng u. Nhóm các polysaccharide có hoạt tính
kháng u thường là heteroglycan gồm các galactan, fucan, xylan, và mannan tùy thuộc
vào loại đường đơn trong chuỗi chính và các đường nhánh gồm arabinose, mannose,
fucose, galactose, xylose, axit glucuronic [118], [119].
Trang 16
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Nhiều polysaccharide có hoạt tính kháng u đã được tìm thấy trong quả thể,
trong khuẩn ty hoặc trong dịch lên men của một số nấm đảm Basidiomycetes. Những
chất này tuy khác nhau về thành phần hóa học, cấu trúc không gian và hoạt tính
kháng u nhưng phần lớn thuộc nhóm b-1,3/1,6-glucan. Hoạt tính kháng u ở nấm phần
lớn do các polysaccharide có đơn phân tử là glucose và được gọi chung là glucan.
Trong các phân tử glucan có tương đối nhiều kiểu liên kết, và phần nhiều trong số đó
là heteroglycan. Các phân tử glucan này tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm cùng
với một số polysaccharide khác như chitin, cellulose, galactomannan-protein,
glucuromannan-protein v.v.Tuy nhiên, chitin, chitosan hay cellulose không có hoạt
tính kháng u.
Các cơ chế hoạt động kháng u của các polysaccharide không hoàn toàn rõ ràng;
người ta tin rằng hoạt động gây nguyên phân của các polysaccharide từ nấm gồm
nhiều phản ứng miễn dịch thông qua việc kích hoạt các tế bào miễn dịch cụ thể để
tăng cường một loạt các chức năng của tế bào. Chúng bao gồm việc kích hoạt các đại
thực bào, tế bào lympho T và các tế bào diệt tự nhiên (NK)- là các tế bào có khả năng
tiết chất trung gian gây kích thích và các cytokine như các yếu tố hoại tử khối u α
(TNF - α), interferon γ (IFN - γ), hoặc 1β interleukin (IL - 1β). Các polysaccharide
cũng có thể ức chế các protein E - selectin và sự biểu hiện gen, ức chế tế bào ung thư
bám dính tế bào (tumoral cell-to-cell adhesion) [148]. Các cơ chế khác bao gồm các
hiệu ứng chống tăng sinh (antiproliferative), sự cảm ứng cơ chế gây chết tế bào theo
chương trình (apoptosis), và sự khác biệt của các tế bào ung thư [130].
Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các polysaccharide được phân lập từ các
chi nấm khác nhau đa số có khả năng cung cấp các hoạt tính kháng ung [51], [66],
[71] [130] [148]. Một số nghiên cứu lâm sàng đã làm rõ được tác dụng ức chế ung
thư của Lentinus edodes [149] [48], Grifola frondosa [15], Schizophyllum commune
[15] [48], Ganoderma lucidum [69] [78], Trametes versicolor [48], Inonotus obliquus
[91], Phellinus linteus [50], Flammulina velutipes [82], Hypsizygus marmoreus [83]
Ophicordyceps (Cordyceps), [49] Agaricus brasiliensis [136] và Tremella
mesenterica [71] [64]. Bảng 1.3 trình bày một số polysaccharide có hoạt tính kháng
ung thư từ nấm điển hình.
Trang 17
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Hình 1.1 Cơ chế tham gia miễn dịch của β- glucan từ nấm
Các hợp chất miễn dịch được tách từ hơn 30 loài nấm thuốc đã chứng minh
hoạt động kháng u trong điều trị ở động vật. Tuy nhiên, chỉ một số ít đã được thử
nghiệm tiềm năng chống ung thư ở người. Một vài nghiên cứu trong số đó đã được
tiến hành mà đối tượng là β-d-glucans hoặc phức hợp β-d-glucans liên kết với protein.
Hơn nữa, các thử nghiệm cũng cho thấy hoạt tính miễn dịch của phức hợp β-d-
glucan- protein cao hơn so với glucan tự do. Hình 1.1 minh họa cơ chế miễn dịch đơn
giản của β- glucan [8].
Các hoạt chất miễn dịch hoạt động chủ yếu bằng cách cải thiện hệ thống miễn
dịch của vật chủ. Như đã đề cập ở phần trên, quá trình này bao gồm kích hoạt các tế
bào đuôi gai, tế bào tiêu diệt tự nhiên (NK), tế bào T, đại thực bào, và sinh ra các
cytokine. Một số sản phẩm của nấm thuốc, chủ yếu là các polysaccharide (đặc biệt là
β-glucans), được phát triển cho mục đích lâm sàng và thương mại như Krestin (PSK)
và PSP (Polysaccharide peptide) từ T. versicolor; Lentinan được phân lập từ L.
edodes; Schizopyllan (Sonifilan, Sizofiran, hoặc SPG) từ S. commune; Befungin từ I.
Trang 18
obliquus; D-fraction, từ Gr. frondosa; GLPS polysaccharide phần từ Ga lucidum;.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
hexose hoạt động tương quan hợp chất (AHCC); và nhiều hoạt chất khác.
Bảng 1.3. Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư từ
Loài
Trị u hay ung thư
Cấu trúc hóa học
Tên gọi
Nguồn gốc phân lập
-1,3-glucan
C. versicolor
Sợi nấm
PSK và PSP
Ung thư hệ tiêu hóa, phổi và vú
Chuỗi β có nhánh β-1,4 và 1,6
L. edodes
Ung thư dạ dày
Quả thể
β1,3/1,6-glucan
Lentinan
S. commune
Ung thư cổ tử cung Dịch lên men β1,3/1,6-glucan
Schizophyllan
G. lucidum
Chữa ung thư
Quả thể, Sợi nấm
β-glucan, heteropolysaccarit glycoprotein
Ganoderans Protein LZ8 GLP
A. blazei
Chữa ung thư
β-1,6-glucan
Quả thể, Sợi nấm
G. frondosa
Chữa ung thư
Quả thể
Galactoxyloglucan- protein complex
β-1,3/1,6-glucan
Scleroglucan
Sclerotium rolfsii, S. glucanicum
các loài nấm điển hình
1.8.2. Hạ lipid máu và hạ đường huyết
Hầu hết các polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm có thể ví như là chất
xơ, vì vậy chúng không được tiêu hóa trong hệ tiêu hóa ở người [40]. Theo các
nghiên cứu trên một vài động vật và ở người, glucan từ các nấm L. endodes, G.
lucidum, S. commune, P. ostreatus, G. frondosa, A. blazei, C. sinensis và C. miltaris
có khả năng làm giảm lượng đường trong máu và cholesterol trong huyết thanh [ 65],
[70]. Tác dụng hạ đường huyết có được thông qua việc gắn các polysaccharide khó
tiêu hóa vào biểu mô ruột làm giảm tốc độ hấp thu glucose trong khi hiệu ứng
hypolipidemic là do sự gián đoạn tuần hoàn ruột gan của các axit mật [40], [65].
Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease- CVD) là một trong những nguyên
nhân chính gây tử vong ở các nước đang phát triển. Bệnh tim mạch do nhiều nguyên
nhân gây ra và bệnh sinh của các hình thức động mạch của bệnh tim mạch có liên
quan đến xơ vữa động mạch. Một số dấu hiệu sinh học có nguy cơ tiềm ẩn liên quan
Trang 19
đến bệnh tim mạch đã được xác định, như sự chuyển hóa lipid và lipoprotein (mật độ
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
lipoprotein thấp [LDL] và mật độ lipoprotein cao [HDL], hàm lượng cholesterol và
triacylglycerol), chức năng đông máu, tổn thương oxy hóa, chuyển hóa homocysteine,
huyết áp [89]. Polysaccharides từ nấm đã được chứng minh có khả năng bảo vệ và
chống lại bệnh tim mạch và các biến chứng của chúng. Ở đường ruột, β-glucans làm
giảm sự hấp thu cholesterol và các chuỗi axit béo dài [30]. Chuột đực được cho ăn 2%
cholesterol và 1% polysaccharide loại β-glucan ngoại bào tách chiết từ Volvariella
volvacea (nấm rơm) cho thấy cholesterol tổng số trong huyết thanh giảm đáng kể,
LDL-cholesterol trong gan và cholesterol toàn phần cũng giảm ở các mức độ khác
nhau. Trong khi đó không có thay đổi nhiều triacylglycerol trong huyết thanh; HDL-
cholesterol và lipid gan tổng số [23]. Tương tự như vậy, các polysaccharide từ
Agaricus auricula có hiệu quả đáng kể làm giảm cholesterol và HDL cholesterol tăng
trong chuột được nuôi với chế độ ăn giàu cholesterol [19]. Các phân đoạn
polysaccharide từ nấm Pleurotus nebrodensis đã được chứng minh có khả năng làm
giảm huyết áp tâm thu ở những chuột mắc chứng tăng huyết áp tự nhiên [90]. Ảnh
hưởng của dịch chiết từ Cordyceps sinensis trong nước nóng được đánh giá ở chuột
với chế độ ăn uống không chứa cholesterol và chuột với chế độ ăn giàu cholesterol.
Lượng cholesterol huyết thanh tổng của tất cả các nhóm chuột giảm sau khi có sự tác
động của polysaccharide. Trong số chuột được nuôi với chế độ ăn giàu cholesterol,
mức HDL cholesterol tăng nhưng giảm mật độ lipoprotein xuống rất thấp (VLDL) và
giảm mức cholesterol LDL [62].
Ngoài ra, các polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm cũng có tác dụng hạ
đường huyết thông qua sự điều tiết quá trình chuyển hóa carbonhydrat và tổng hợp
insulin. Các polysaccharide đường uống có vai trò rất quan trọng vì chúng có thể
được sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường.
1.8.3. Tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm
Các polysaccharide được chiết xuất từ các nấm G. lucidum, T. versicolor, L.
endodes, P. linteus và Agaricus có khả năng khử và đặc tính tạo phức và có thể ức
chế sự oxy hóa lipid hoặc stress oxy hóa- khử. Những tác dụng trên có liên quan đến
Trang 20
sự có mặt của β- glucan và một phenolic (chủ yếu là tyrosine và ferrulic acid) bán
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
liên kết với chuỗi chính β- glucan bằng các liên kết cộng hóa trị [40], [63], [147].
Mặc dù các hợp chất phenolic có trong quả thể và sợ nấm của G. lucidum là các hợp
chất có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất nhưng polysaccharide của G. lucidum cũng
thể hiện đặc tính khử các gốc tự do, thế khử và ức chế peroxy hóa lipid [47], [127].
Saltarelli và đtg (2009) đã nhận thấy trong số các polysaccharide khác nhau được
chiết từ sợi nấm của G. lucidum thì các polysaccharide khối lượng phân tử thấp có
hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, dựa vào hoạt tính tạo phức với Fe2+, xác định
lipoxygenase và gốc tự do1,1- diphenyl- dipicrylhydrazyl (DPPH) trong khi đó các
polysaccharide nội bào không có tác dụng chống oxy hóa [110]. Tương tự, các nghiên
cứu in vitro đã chỉ ra rằng peptidedoglucan từ G. lucidum có tác dụng bảo vệ ty thể,
lưới nội chất và các tiên mao của các đại thực bào khỏi các tác dụng tie cực từ hóa
chất và các biến cố [146]. Thêm nữa, dịch chiết trong methanol của các glucan và
proteoglucan từ G. lucidum và G. tsugae cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa bằng
cách thu các yếu tố của phản ứng oxy hóa [65].
Một cơ chế chống oxy hóa khác là khả năng của các polysaccharide trong việc
hạn chế quá trình sản xuất các gốc oxy tự do từ nấm và hoạt động của các tế bào đơn
nhân ngoại vi ở các đại thực bào có gai, điều này liên quan đến quá trình suy hô hấp
và lão hóa [142], [146], hoặc làm tăng hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa trong
huyết thanh [141]. Các dịch chiết trong methanol từ sợi nấm của các loài G. frondosa,
M. esculenta và Termitomyces albuminosus cũng thể hiện các hoạt tính chống oxy
hóa nhưng chủ yếu liên quan đến sự có mặt của các hợp chất phenolic trong dịch
chiết [84]. Các polysaccharide khác từ nấm bao gồm các polysaccharide được chiết
bằng nước từ quả thể của G. lucidum, Auricularia auricula và Cordyceps militaris
cho thấy có các đặc tính thu dọn, tạo phức và tính khử do đó làm tăng hiệu quả chống
oxy hóa tổng số [22], [75], [140], [92]. Không chỉ các dịch chiết từ quả thể, một số
nghiên cứu đã tìm thấy hoạt tính chống oxy hóa của dịch nuôi cấy và sinh khối nấm
thu được trong điều kiện lên men lỏng. Trong môi trường nuôi cấy Hericium
enrinaceum có bổ sung các nguồn selen (sodium selenite và selol), một
exopolysaccharide chứa selen được sinh tổng hợp. Exopolysaccharide này bộc lộ khả
Trang 21
năng chống oxy hóa tuyệt vời, dựa trên sự khử và ức chế quá trình peroxy hóa lipid
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
và thu dọn các gốc tự do DPPH [79]. Hai mươi lăm chủng nấm thuộc các chi
Agaricus, Lentinus, Schizophyllium, Pleurotus sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt
tính chống oxy hóa với hoạt tính thu được từ 753 đến 9.384 % quercetin/l/ngày theo
một công bố của Umeo và đtg [202].
1.8.4. Prebiotic từ nấm
Prebiotic là các chất tiền trợ sinh học tạo ra thức ăn và môi trường thuận lợi
cho vi khuẩn có lợi (probiotic) phát triển trong đường ruột. Các chất tiền trợ sinh học
này góp phần duy trì sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột, kích thích miễn dịch
đường tiêu hóa, giảm khả năng ung thư ruột kết, giảm cholesterol trong máu. Các tác
dụng prebiotic từ các polysaccharide từ nấm cũng đã được mô tả trong nhiều nghiên
cứu. Vì các enzyme tiêu hóa của người không thể thủy phân liên kết β-glucosid nên
nhiều polysaccharide nấm có thể hoạt động như là các nguồn prebiotic [8]. Synytsya
và đtg (2009) đã đánh giá hiệu quả prebiotic của các glucan được phân lập từ quả thể
của P. ostreatus và P. eryngii trên một vài chủng probiotic như Lactobaciluss,
Bifidibacterium và Enterococusii [123]. Cả 2 dạng glucan tan trong nước β-1,3/β-1,6-
glucan và gtan trong kiềm α-1,3-glucan của các loài nấm nói trên đều được đánh giá
là có khả năng kích thích sự tăng trưởng của các vi khuẩn probiotic, đặc biệt là các
glucan từ P. eryngii. Trong một nghiên cứu khác, các β- glucan từ màng cứng của P.
tuber-regium đã được đánh giá hiệu quả của chúng đối với Bifidobacterium infantis,
Bifidobacterium longum, và Bifidobacterium adolescentis trong môi trường dịch thể,
sử dụng inulin như là chất kiểm soát prebiotic [150]. Người ta nhận thấy rằng sau 24
giờ lên men, quần xã vi khuẩn có ích có bổ sung glucan từ nấm có mức tăng trưởng
gấp 3-4 lần tương tự như sự tăng trưởng khi bổ sung inulin [150]. Gần đây, Chou và
đtg (2013) đã chỉ ra rằng các polysaccharide từ các phần bỏ đi của nấm như cuống
của L.endodes, gốc của P.eryngii, và gốc của F.velutipes có thể làm tăng tỷ lệ sống
sót của Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei , và B. longum trong sữa chua
[25]. Các tác giả cũng quan sát thấy tác dụng hiệp đồng của các polysaccharide với
các peptide và amino acid có trong môi trường sữa chua để duy trì số lượng vi khuẩn
có lợi trên 107 CFU/ml ở điều kiện lạnh. Họ cũng phát hiện ra rằng các
Trang 22
polysaccharide từ nấm có tác dụng đáng kể trong bảo vệ (tăng tỷ lệ sống) cho các vi
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
khuẩn có lợi probiotic trong dịch dạ dày và mật mô phỏng.
1.8.5. Tính kháng virus của polysaccharide từ nấm
Một vài polysaccharide từ nấm dược liệu và nấm ăn đã được công bố có các
chất thể hiện hoạt tính kháng virus thông qua tăng sự giải phóng IFN- γ và tăng
cường sự phát triển của các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC- peripheral blood
mononuclear cell) [70], [81]. Các dịch chiết carbohydrate khác nhau từ nấm Lentinus
edodes đã được thử nghiệm và kết quả chỉ ra rằng dịch chiết này có hoạt tính kháng
virus gây bệnh sốt bại liệt loại 1 (PV - 1) và virus đậu bò loại 1 (BoHV - 1). Các minh
chứng thu được cho thấy các polysaccharide có tác dụng kháng virus và chúng hoạt
động ở giai đoạn đầu của quá trình sao chép ở cả hai chuỗi virus [108]. Đối với việc
điều trị vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV), chưa có một số lượng nghiên
cứu thực nghiệm đủ lớn liên quan đến các polysaccharide từ nấm. Đáng chú ý,
lentinan và một proteoglucan có tính acid từ G. lucidum đã được áp dụng thành công
như một liệu pháp điều trị bổ sung đối với HIV trong việc kết hợp với các thuốc
kháng HIV thông thường vì chúng có khả năng tăng cường sức đề kháng đối với
virus HIV và hạn chế độc tính của các thuốc chống HIV. Một nghiên cứu đã được
tiến hành đối với 88 bệnh nhân HIV dương tính với CD4 ở mức 200-500 tế bào/mm.
Các bệnh nhân được điều trị với sự kết hợp của lentinan polysaccharide từ L. edodes
và didanosine (ddI). Sự kết hợp này đã tạo nên sự tăng đáng kể CD4 kéo dài đến 38
tuần, trong khi nếu chỉ điều trị bằng ddI thì mức tăng CD4 là 5 % ở 14 tuần [42].
Hoạt tính kháng HIV tương tự cũng đã được phát hiện ở các glucan từ G. frondosa và
T. versicolor [70], [81].
1.8.6. Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide từ nấm
Sự phát triển của kháng sinh là một trong những thành tựu khoa học quan
trọng nhất trong 70 năm qua. Các hợp chất này hoạt động bằng nhiều cách như can
thiệp vào quá trình chuyển hóa hoặc trong các cấu trúc sinh vật [38]. Trong những
năm gần đây, việc ứng dụng các thuốc kháng sinh thương mại được tổng hợp hóa học
đã thu hút sự quan tâm của lớn do các tác động nguy hại của chúng đến sức khỏe.
Trang 23
Hiện tượng kháng các thuốc kháng sinh hiên nay đang là mối quan tâm lớn của các
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
bác sỹ, bệnh nhân, các nhà sản xuất dược và cộng đồng [86]. Ngoài ra, việc điều trị
các bệnh truyền nhiễm phổ biến ngày càng trở nên phức tạp do sự gia tăng tính kháng
nhiều loại thuốc của các vi sinh vật gây bệnh ở con người. Vì vậy, điều thiết yếu là
phải phát triển các tác nhân điều trị mới và hiệu quả chống lại được các mầm bệnh
kháng thuốc [10]. Mặc dù số lượng các hợp chất kháng khuẩn rất nhiều và đa dạng
nhưng thực tế sự kháng lại kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh đang có chiều
hướng gia tăng mạnh. Năm 2010, tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã khuyến cáo tất cả
các nước tiến hành việc kiểm soát sự lây truyền của các vi khuẩn kháng đa thuốc
cũng như nêu bật lên những rủi ro gặp phải khi thiếu các trị liệu luân phiên để chống
lại các vi sinh vật trên [138]. Hiện tượng kháng đa thuốc kháng sinh của các vi sinh
vật gây bệnh ở người đang ngày càng gia tăng do việc sử dụng các kháng sinh thương
mại một cách bừa bãi, các kháng sinh này được sử dụng chung trong điều trị nhiều
bệnh nhiễm trùng [113]. Các nhà nghiên cứu nhận ra rằng liều lượng kháng sinh thấp
không có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn nhưng có tác dụng ức chế chúng.
Các bệnh viêm nhiễm trước đây có thể dễ dàng chữa bằng kháng sinh thì ngày
nay lại trở nên nghiêm trọng do kháng lại kháng sinh [139], [101]. Mối liên hệ giữa
các vi sinh vật đa kháng khuẩn và các bệnh nhiễm trùng bệnh viện là vấn đề cấp bách
cần được giải quyết đối phó [102]. Vì vậy, việc nghiên cứu các chất kháng sinh mới
hay các chất kháng khuẩn không phải là kháng sinh có hiệu quả kháng lại các vi sinh
vật gây kháng thuốc hiện nay thực sự rất quan trọng. Các nhóm các sinh vật mới,
trong đó có nấm có thể là một nguồn thay thế có tính kháng vi sinh vật mới.
Các phương pháp khác nhau đã được sử dụng để xác định hoạt tính kháng
khuẩn của các hợp chất và dịch chiết từ nấm, bao gồm các phương pháp pha loãng,
phương pháp khuếch tán đĩa, phương pháp vết pha loãng trên aga dựa trên cơ sở
khuếch tán xuyên tâm và hơn nữa là xác định số lượng khuẩn lạc . Do đó, các kết quả
về hoạt tính kháng vi sinh vật được biểu diễn bằng các đơn vị khác nhau.
Tác động kháng khuẩn của các nấm từ khắp nơi trên thế giới và các hợp chất
tách chiết từ chúng đã được tổng hợp. Kết quả này rất hữu ích cho các nghiên cứu
Trang 24
khoa học trong tương lai. Cả các nấm ăn được và không ăn được đều thể hiện hoạt
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
tính kháng khuẩn kháng lại các vi sinh vật gây bệnh, trong đó có các vi khuẩn liên
quan đến nhiễm trùng bệnh viện như Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
maltophila, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,
Morganella morganii, Proteus mirabilis, Serratia marcescens và các vi khuẩn đa
kháng như MRSA, MRSE, VREF, PRSP, ERSP.
Các số liệu cho thấy các dịch chiết nấm và các hợp chất phân lập được thể hiện
hoạt tính kháng lại vi khuẩn Gram dương cao hơn so với Gram âm. Trong các nấm,
Lentinus edodes là loài đã được nghiên cứu là tốt nhất và gần như có hoạt động kháng
khuẩn kháng lại cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Các chủng nấm thuộc các chi
Boletus, Ganoderma và Lepista hứa hẹn nhiều tiềm năng cho các nghiên cứu trong
tương lai. Xét về số lượng các nghiên cứu đối với các hợp chất riêng biệt thì Plectasin
peptide- phân lập từ Pseudoplectania nigreella biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn cao
nhất kháng lại các vi khuẩn Gram dương.
Các nghiên cứu về nấm là rất rộng với hàng trăm loài đã được chứng minh là
có phổ ứng dụng trong công nghiệp y dược bao gồm cả các hoạt tính kháng khuẩn.
Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đánh giá các đặc tính kháng khuẩn của dịch
chiết từ quả thể nấm. Thực tế chưa có nhiều các nghiên cứu về xác định các đặc tính
kháng khuẩn cho các hợp chất riêng biệt, mới chỉ một số hợp chất có phân tử lượng
thấp và một vài peptide đã được mô tả. Sau khi cơ chế hoạt động của chúng được làm
sáng tỏ, các chất chuyển hóa từ nấm hoặc các hợp chất có liên quan khác có thể được
sử dụng để phát triển trong lĩnh vực dinh dưỡng hoặc như các loại thuốc có hiệu quả
chống lại các vi sinh vật gây bệnh đã kháng lại các phương pháp điều trị thông
thường [145].
1.9. Laccase và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người
1.9.1. Tổng quan về laccase
Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) là một
polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxydase. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử
đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử.
Trang 25
Laccase có phổ cơ chất khá đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin
và cả hợp chất vô cơ như iot. Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì
khác nhau về khối lượng phân tử, tính chất glycosyl hóa và các tính chất động học
[28]. Laccse được phân bố rộng rãi ở cả thực vật, nấm đảm, nấm sợi, xạ khuẩn và vi
khuẩn. Tuy nhiên cho đến nay, laccase chủ yếu được phát hiện ở nấm đảm
(Basidomycetes với hoạt tính cao), đặc biệt là ở các loài nấm có khả năng phân hủy
lignocellulose như Agaricus basidomyces, Botrytis cinerea, Chaetomium thmophilum,
Coprius, cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiatre, Pleurotus otreatus,
Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor .v.v.
Trong những năm gần đây, laccase được đặc biệt quan tâm bởi những ứng dụng
rộng rãi của nó trong xử lý môi trường và nhiều ngành công nghiệp khác nhau như
dệt nhuộm, tổng hợp hữu cơ, thực phẩm và tiềm năng trong lĩnh vực mỹ phẩm, dược
phẩm và bảo vệ sức khỏe con người.
1.9.2. Ứng dụng của lacacse trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe
Do tính đặc thù và bản chất sinh học của chúng nên laccase có tiềm năng ứng
dụng trong lĩnh vực y dược và đang được quan tâm nghiên cứu.
Chứng viêm da nhiễm độc do nhựa cây (kết quả của việc da tiếp xúc với các
chất độc từ cây thường xuân, cây yến mạch hay cây sơn mà chủ yếu là từ nhựa) chủ
yếu do urushiol- một chất độc là dẫn xuất của catechol gây nên. Khi urushiol bị oxy
hóa trở thành dẫn xuất ο- quinone thì lại trở thành một chất không độc. Lacase thể
hiện tính oxy hóa, polymer hóa và khử độc urushiol từ đó hạn chế được ảnh hưởng
của chứng viêm da do nhiễm độc nhựa cây.
Một ứng dụng tiềm năng khác của laccase trong lĩnh vực này là dựa vào sự
vận phát sinh iodine insitu. Laccase có thể oxy hóa iodide để tạo thành iodine- một
loại thuốc thử được sử dụng một cách rộng rãi như một loại thuốc tẩy. Việc ứng dụng
hệ thống sinh iodine bằng hệ thống laccase- muối iodide để khử trùng mang lại nhiều
tiến bộ hơn so với sử dụng trực tiếp iodine. Thứ nhất, muối iodide có tính ổn định và
an toàn hơn so với I2 trong việc bảo quản, vận chuyển và sử dụng. Thứ hai là việc giải
phóng iodine từ hệ laccase- iodide dễ dàng điều khiển (có thể điều chỉnh bằng hoạt độ
Trang 26
laccase). Hệ thống này có thể được sử dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp như
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
dược phẩm, nội thất, chăm sóc sức khỏe, khử trùng nước uống hay nước bể bơi cũng
như trong việc tẩy sạch các dây quấn vô cùng nhỏ.
Ngoài ra laccase còn được ứng dụng trong công nghệ khử mùi vì laccase có
khả năng oxy hóa nhiều hợp chất thiol và các hợp chất chứa sulphur. Thậm chí hệ
laccase còn có khả năng khử những mùi hôi thối thành mùi thơm nhờ khả năng tấn
công và biến đổi các phân tử hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây nên những mùi hôi
thối này. Laccase còn được sử dụng như là chất xúc tác trong quá trình sản xuất các
thuốc chống ung thư. Thậm chí laccase còn là thành phần của nhiều mỹ phẩm. Nhiều
cảm biến sinh học có chứa laccase đã được phát triển cho các xét nghiệm miễn dịch
và xác định glucose, các amin thơm và các hợp chất phenol (Kunamneu và đtg, 2008).
Laccase tạo liên kết đồng hóa trị với các phân tử liên kết sinh học như kháng thể,
kháng nguyên, DNA, RNA, biotin và streptavidin có thể được sử dụng như một
enzyme đánh dấu cho các xét nghiệm phát hiện trong hóa học mô, hóa học miễn dịch,
hóa học tế bào hay axit nucleic (Schmid và Urlacher, 2007).
Nấm dược liệu cũng chứa một số các enzyme như laccase, superoxide
dismutase, glucose oxidase, và peroxidase. Các enzyme này cũng đã được chứng
minh là đóng vai trò quan trọng trong các liệu pháp điều trị ung thư bằng cách ngăn
chặn sự oxy hóa và ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư. Nhiều sản phẩm
được tạo ra từ laccase như các nhân tố kháng khuẩn, giải độc hay chăm sóc sức khỏe
con người. Laccase có thể được sử dụng trong quá trình tổng hợp các hợp chất phức
tạp có dược tính như thuốc mê, thuốc kháng viêm, thuốc kháng sinh, an thần v.v., bao
gồm triazolo(benzo)cycloalkyl thiadiazines, vinblastine, mitomycin, penicillin X
dimer, cephalosporins và dimerized vindoline [98]. Ngoài ra, laccase đã được các nhà
nghiên cứu chứng minh về hoạt động ức chế một cách đáng kể quá trình phiên mã
ngược của HIV-1 [131]. Một laccase khác cũng đã được khẳng định về khả năng
chống lại aceruloplasminemia (một bệnh rối loạn di truyền do đột biến ở gen). Cách
đây vài năm, một phương pháp enzyme mới dựa trên laccase đã được phát triển để
phân biệt đồng thời morphine và codeine trong các mẫu thuốc được tiêm vào hệ
thống phát hiện.
Trang 27
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
1.10. Phương pháp phân tích sàng lọc CALUX
Dioxin và các chất ô nhiễm tương tự (các chất nồng độ thấp-Micropollutants)
thường được phát hiện ở các nồng độ rất thấp trong mẫu sinh phẩm và mô trường.
Các phương pháp phân tích cần có kỹ thuật, thiết bị đặc hiệu có độ nhạy cao như sắc
ký khí độ phân giải cao pha loãng đồng vị (high-resolution gas chromatography-
HRGC, sắc ký khí khối phổ độ phân giải- HRGC/HRMS, sắc ký khí lỏng khối phổ độ
phân giải cao -LC/MS/MS) v.v. Các phương pháp này có hạn chế là lượng mẫu lớn
để phân tích lớn (khoảng 15 ml), chi phí cao, thời gian dài.
Trong cơ thể con người nói riêng và sinh vật nói chung tồn tại các thụ thể. Mỗi
thụ thể tương ứng với một chất hay một nhóm chất có đặc tính giống nhau và có khả
năng liên kết đặc hiệu với các chất hay nhóm chất này. Khi các chất này đi vào cơ thể,
nó sẽ được gắn một cách đặc hiệu với các thụ thể tương ứng và một protein vận
chuyển tạo thành một phức hợp. Phức hợp này đi vào trong nhân tế bào (gọi là các
yếu tố phản ứng) tham gia vào quá trình dịch mã tạo ra các protein khác nhau, tùy
thuộc vào mức độ ô nhiễm của hợp chất ngoài môi trường. CALUX là một công cụ
dựa vào sự biểu hiện gen đã nghiên cứu và áp dụng để phát hiện và định lượng các
đơn chất hay hỗn hợp chất trong các mẫu sinh phẩm và môi trường. Nó gồm một
dòng tế bào cải biến di truyền với DNA được chèn thêm một gen (reporter) luciferase
để biểu hiện enzyme kết hợp với các yếu tố phản ứng gây ra sự phiên mã của các gen
chèn vào (Hình 1.2). Phụ thuộc vào liều lượng của các hợp chất hóa học xâm nhập
vào tế bào, tế bào sẽ sinh ra enzyme luciferase. Khi bổ sung cơ chất luciferin, enzyme
này sẽ chuyển hóa cơ chất thành hợp chất phát quang. Ánh sáng tạo thành sẽ được
định lượng bằng một máy đo luminometer. Mức độ phát quang trong tế bào CALUX
nhờ phần mềm chuyên dụng có thể tính được nồng độ các chất xác định. Các dòng tế
bào CALUX có thể được thiết kế lại để phát hiện một số nhóm chất quan tâm. Hầu
hết các ứng dụng của CALUX được định hướng và thành công nhất đầu tiên để phát
hiện các chất độc hại trong môi trường như dioxin hay các hoocmon.
CALUX là một công nghệ sàng lọc hiệu quả vì nó dựa trên phép đo tổng các
phối tử có hiệu quả trên một thụ thể. Không giống như các phân tích hóa học,
CALUX có thể đo tất cả các hoạt tính trên thụ thể quan tâm. Những năm gần đây, các
Trang 28
tác giả Hà Lan đã phát minh ra 28 dòng nữa (Bram Brouwer và đtg) để không những
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
định lượng được dioxin mà công cụ này còn đo được các chất như hoocmon, các chất
ô nhiễm ở nồng độ thấp và nhóm các chất liên quan đến các chức năng của tế bào.
Kết quả phân tích bằng Calux đã được cộng đồng chung châu Âu, Hoa Kỳ,
Nhật Bản.v.v. công nhận mang tính pháp lý như phân tích bằng HRGC/HRMS.
Phương pháp này được phổ biến nhanh và rộng bởi hiệu quả kinh tế, thời gian và chi
phí. Những ưu điểm trên đã giúp các nhà quản lý môi trường, y tế và hoạch định
chính sách có thể nhanh chóng đưa ra quyết định trong các vấn đề liên quan đến ô
nhiễm nói chung và dioxin nói riêng (http://www.biodetectionsystems.nl/).
Hình 1.2. Sơ lược về CALUX
Ngoài DR- CALUX là công nghệ rất phất triển cho đến ngày nay để xác định
nồng độ tổng số TEQ của một hỗn hợp phức hệ các chất trong huyết thanh người (<
0.1ppt) thì hiện nay CALUX cũng đang được phát triển để xác định sự có mặt và hoạt
tính của nhiều hợp chất khác trong cơ thể như các chất ô nhiễm nồng độ thấp hay các
hoormon. Các hợp chất này tuy có hàm lượng rất thấp nhưng lại gây ra tác động
nghiêm trọng đến sức khỏe con người, gây ra hậu quả tức thời và lâu dài như làm
hỏng hệ nội tiết, gây ung thư và rất nhiều bệnh tật khác. Nhóm chất hiện nay được
Trang 29
quan tâm nhiều nhất là các chất phá hỏng hệ nội tiết (Endocrine disrupting chemicals-
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
EDCs). Chúng gây rối loạn hệ nội tiết của cơ thể và làm bất lợi cho sự phát triển, sinh
sản, thần kinh, tim mạch và miễn dịch con người.
Danh mục tế bào CALUX của BDS bao gồm các phân tích sinh học liên quan
đến các lĩnh vực như an toàn thực phẩm, nước, môi trường, dược phẩm/ hóa chất, sản
phẩm tiêu dùng, các phép thử ở bệnh viện, các sản phẩm sinh học tế bào, các nguyên
liệu đối chứng tham khảo và các sản phẩm khác (Bảng 1.4).
Bảng 1.4. Một số CALUX thông dụng
Các thụ thể trong nhân
Các quá trình
Tên
Mục đích
Tên
Mục đích
DR CALUX
Dioxins
NfkB CALUX
Ìnlammation
PAH CALUX
PAHs
P21 CALUX
Phá hủy DNA
ERα CALUX
Estrogens
Nrf2 CALUX
Mất cân bằng oxy
ERβ CALUX
Estrogens
P53 CALUX
Phá hủy DNA
AR CALUX
Androgens
TCF CALUX
Carcinogenesis
PR CALUX
Progestins
AP1 CALUX
Stress
GR CALUX
Glucocorticoid
HIF1α CALUX
Hypoxia
TRβ CALUX
Thyroids
ESRE CALUX
Stress ER
RAR CALUX
Retinoids
Cytoxox CALUX
cytotoxicity
PPARγ CALUX Obesogens
PPARα CALUX Obesogens
PPARδ CALUX Obesogens
PXR CALUX
Xenobiotics
Trang 30
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vi sinh vật
Các chủng nấm đảm
Các mẫu nấm tự nhiên được thu thập từ các nguồn và thuộc các đề tài khác nhau
từ: Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh Phú Thọ, Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội,
A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế, Vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà, Rừng Mã Đà- tỉnh Đồng
Nai và rừng keo thuộc tỉnh Bình Phước được sử dụng để phân lập các chủng nấm có khả
năng sinh tổng hợp laccase và exopolysaccharide.
Vi sinh vật kiểm định
Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm Aspergillus niger và Penicillium italicum; 2
chủng vi khuẩn Bacillus cereus và Micrococus luteus từ Viện Hóa sinh biển.
Dòng tế bào được sử dụng trong các phân tích sàng lọc CALUX là các dòng tế
bào liên kết mô xương ở người được gắn reporter gen luciferaza với với thụ thể tương
ứng. Môi trường nuôi cấy dòng tế bào là DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium:
Nutrient Mixture F-12).
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất sử dụng để nghiên cứu là các hóa chất tinh khiết, đảm bảo chất lượng
được nhập ngoại từ các hãng Sigma, Merk, Aldrich và các hóa chất thông thường khác.
Cặp mồi sử dụng để phân loại các chủng nấm ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG và
ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATCC.
Nghiên cứu này được thực hiện với các máy móc, thiết bị với độ chính xác cao tại
phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học tái tạo môi trường và phòng Thí nghiệm trọng
điểm quốc gia về gene thuộc Viện Công nghệ sinh học. Các thiết bị chính bao gồm: Cân
kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô trùng Laminar của Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng,
Trang 31
máy nuôi lắc ở các nhiệt độ 280C, 30oC, 370C, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf,
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
tủ lạnh các loại 40C, -200, máy đo quang phổ Novaspec II, lò vi sóng, pipet man các loại
của hãng Eppendorf, bình nón, đầu côn, ống ly tâm v.v.
Ngoài ra nghiên cứu còn sử dụng thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker
AVANCE 500 của Trung tâm ứng dụng quang phổ- Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa
học và công nghệ Việt Nam.
Phần sử dụng công nghệ CALUX được phối hợp thực hiện và thuộc bản quyền
của BioDetection Systems (BDS, Amsterdam, Hà Lan), là 1/58 thành viên của BE- Basic
Foundation, Hà Lan. Tổ chức này đã ký hợp tác KHCN với Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng nấm
Các mẫu nấm tự nhiên được cắt nhỏ với kích thước khoảng 0,5- 1cm đặt lên đĩa
thạch có chứa sẵn môi trường PDA (dịch chiết khoai tây 200g/l; glucose 20g/l, aga 18g/l)
bổ sung guaicol làm chất chỉ thị và các đĩa thạch này được nuôi ở 300C trong thời gian 1
– 3 ngày sau đó được tách và làm sạch. Các chủng nấm phân lập được được giữ trong lọ
nhỏ với dung tích 10ml ở 4oC hoặc trong parafin oil để bảo quản lâu dài.
2.2.2. Phương pháp phân loại nấm dựa vào xác định trình tự ITS
Các chủng nấm được phân loại theo hình thái và xác định trình tự vùng ITS1-
5,8S-ITS2. Các chủng nấm được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường PDA, sau 5 ngày
nuôi cấy, sợi nấm được sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Cặp mồi ITS1 và ITS4 có
trình tự ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG và ITS4:
TCCTCCGCTTATTGATATCC [137] được sử dụng để khuếch đại trình tự ITS từ
DNA tổng số của chủng nấm nghiên cứu. Sản phẩm DNA sau khi được khuếch đại bằng
kỹ thuật PCR được làm sạch bằng kit QIAGen. Trình tự ITS của các chủng nấm được
xác định bằng máy xác định trình tự nucleotide tự động ABI 3730 và được so sánh với
Trang 32
các trình tự tương ứng được công bố trên GenBank. Sử dụng phần mềm Mega 6 để xây
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
dựng cây phát sinh chủng loại của chủng nấm nghiên cứu.
2.2.3. Chuẩn bị giống
Các chủng nấm được cấy trên môi trường PDA ở 30oC trong 4 ngày. Sau đó,
chúng được chuyển sang bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường PDB (200g/l dịch
chiết khoai tây; 20g/l glucose) nuôi lắc ở 150 vòng/phút, 30oC sau 7 ngày nuôi cấy được
đồng nhất và sử dụng làm giống cho các thí nghiệm.
2.2.4. Phương pháp xác định sinh khối và hàm lượng exopolysaccharide
Bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường PGM (200g/l dịch chiết khoai tây;
20 g/l glucose; 5g/l cao malt; 1g/l peptone; 1g/l KH2PO4, pH6) được bổ sung 5% giống,
nuôi lắc ở 150 vòng/phút, 30oC. Sau 10 ngày nuôi cấy, tách sinh khối khỏi dịch lên men
bằng cách ly tâm ở 8000 vòng/phút, 15 phút.
Exopolysaccharide thô trong dịch nuôi cấy được tách ra khỏi hỗn hợp lỏng bằng
phương pháp kết tủa sử dụng ethanol 96% tỉ lệ 1:4 thể tích, giữ ở 4oC qua đêm. Ly tâm
6000 vòng/phút trong 10 phút, phần lắng xuống là exopolysaccharide cần thu. Rửa
exopolysaccharide 3 lần bằng ethanol, sau đó sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi
để xác định lượng exopolysaccharide thu được.
Phần sinh khối nấm sau khi ly tâm được rửa sạch lại bằng nước cất, sau đó sấy
khô ở 50oC đến khối lượng không đổi để xác định lượng sinh khối thu được.
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính enyme laccase
Hoạt tính laccase được xác định dựa trên sự oxy hóa ABTS của enzyme laccase tạo
thành hợp chất hấp thụ ở bước sóng 420 nm. Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng
enzyme cần thiết để tạo thành 1µM sản phẩm từ ABTS (2,2'-azino-bis(3-
ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) trong thời gian 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [32].
Một phản ứng đo enzyme laccase bao gồm 600µl đệm axetat 20mM pH3, 200 µl ABTS
2,5mM, 200 µl mẫu thí nghiệm. Xác định giá trị OD ở thời điểm t=0 và thời điểm τ.
Trang 33
Công thức tính
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
U=
Trong đó: U: Hoạt độ enzyme (U/l)
: hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm ở bước sóng 420 nm
(420= 36 000 M-1cm-1)
Vpư: Tổng thể tích phản ứng (1 ml)
VE: Thể tích enzyme (0,2 ml)
ODτ : Giá trị OD đo được tại thời điểm
OD0: Giá trị OD đo được tại thời điểm =0
Df: Độ pha loãng
2.2.6. Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng,
sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase
2.2.6.1. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường
Hai chủng nấm FPT31 và FMD12 được nuôi cấy trên môi trường PGM tại các
các giá trị pH từ 3 đến 10. Hoạt tính enzyme laccase được xác định sau mỗi ngày nuôi
cấy, lượng sinh khối và exopolysaccharide thô được xác định sau 12 ngày nuôi cấy.
2.2.6.2. Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng, sinh
tổng hợp exopolysaccharide và enzyme laccase, 2 chủng FPT31 và FMD12 được nuôi
cấy trên môi trường PGM. Hoạt tính enzyme laccase được xác định sau mỗi ngày nuôi
cấy, lượng sinh khối và exopolysaccharide thô được xác định sau 6, 8, 10 và 12 ngày
nuôi cấy.
Trang 34
2.2.6.3. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Để đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp
exopolysaccharide và enzyme laccase, 2 chủng FPT31 và FMD12 được nuôi cấy trên
môi trường PGM có các nguồn nitơ khác nhau gồm các nguồn nitơ vô cơ (2g/l) KNO3,
NH4NO3, NH4Cl và nguồn nitơ hữu cơ (1g/l) peptone, cao nấm men, cao thịt. Hoạt tính
enzyme laccase được xác định sau mỗi ngày nuôi cấy, lượng sinh khối và
exopolysaccharide thô được xác định sau 12 ngày nuôi cấy.
2.2.6.4. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon
Hai chủng nấm FPT31 và FMD12 được nuôi cấy trên môi trường PGM tại trong
đó glucose được thay thế bởi các nguồn carbon khác bao gồm glucose, mannose, lactose,
xylose và saccharose. Hoạt tính enzyme laccase được xác định sau mỗi ngày nuôi cấy,
lượng sinh khối và exopolysaccharide thô được xác định sau 12 ngày nuôi cấy.
2.2.7. Xác định hàm lượng protein, carbonhydrat tổng số và đường khử của EPS thô
Hàm lượng carbonhydrat tổng số trong exopolysaccharide thô được xác định theo
Dubois và đtg (1956) [31]. Lấy 100µl dịch mẫu trộn đều với 200µ phenol 5%. Bổ sung
500µ dung dịch H2SO4 đặc vào mẫu và đun sôi trong 5 phút, để nguội về nhiệt độ phòng,
đo độ hấp thụ ở bước sóng 490nm. Mẫu đối chứng sử dụng 100µl nước cất thay cho mẫu
thí nghiệm. Từ hiệu số OD ở bước sóng 490nm giữa mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng,
xác định hàm lượng polysaccharide có trong exopolysaccharide thô dựa vào đường
chuẩn glucose.
Hàm lượng đường khử được xác định bằng bằng phương pháp sử dụng DNS. Mỗi
mẫu thí nghiệm chứa 200µl mẫu và 600µl DNS. Phản ứng được đun sôi có đậy nút trong
5 phút, làm lạnh về nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Sử dụng
200µl nước cất làm đối chứng. Xác định hàm lượng đường khử dựa vào đường chuẩn
glucose.
Trang 35
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Hàm lượng protein trong exopolysaccharide tổng số được xác định theo phương
pháp Bradford. Lấy 100µl mẫu nghiên cứu bổ sung 500µl dung dịch Bradford, ủ ở nhiệt
độ phòng sau 20 phút xác định độ hấp thụ ở bước sóng 595nm. Xác định hàm lượng
protein dựa vào đường chuẩn albumin.
2.2.8. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của một số chủng nấm thuốc
Các chủng vi sinh vật sử dụng để đánh giá khả năng kháng của một số chủng nấm
thuốc bao gồm 2 chủng nấm sợi kiểm định là Aspergillus niger và Penicillium italicum;
2 chủng vi khuẩn kiểm định là Bacillus cereus và Micrococus luteus. Các chủng này
được nuôi cấy trên môi trường Capeck (saccharose 30g/l; NaNO3 2g/l; KH2PO4 1g/l;
KCl 0,5g/l; MgSO4 0,5g/l; FeSO4 0,01g/l; NaCl 1g/l; aga 18g/l) cho nấm sợi và TSB
(Titan biotech, Ấn Độ) cho vi khuẩn.
Sử dụng phương pháp khuếch tán để đánh giá định tính khả năng kháng một số vi
sinh vật kiểm định của dịch lên men 7 chủng nấm nghiên cứu. Phương pháp khuếch tán
dịch nuôi được tiến hành bằng cách đục các giếng nhỏ có đường kính 5 mm trên các đĩa
thạch vừa được cấy vi sinh vật kiểm định. Nhỏ 40µl dịch nuôi cấy nấm đã ly tâm vào các
giếng và nuôi trong 2 ngày ở điều kiện thích hợp cho từng loại vi sinh vật kiểm định.
Hoạt tính kháng sinh được đánh giá thông qua các vòng ức chế được tạo thành quanh
thành giếng. Các thí nghiệm được lặp lại hai lần và dịch môi trường ban đầu được sử
dụng làm đối chứng âm.
Bảng 2.1. Thành phần mỗi thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sự sinh
trưởng của vi sinh vật
Mẫu Môi trường Dịch nuôi cấy nấm Vi sinh vật OD600
Thí nghiệm 1 2,5 ml 2,5 ml + ODtn1
Thí nghiệm 2 1,25 ml 3,75 ml + ODtn2
Đối chứng âm1 2,5 ml 2,5 ml - ODC1
Đối chứng âm 2 1,25 ml 3,75 ml - ODC2
Đối chứng dương 5 ml 0 ml + ODC
Trang 36
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Khả năng ức chế vi sinh vật của dịch nuôi nấm được xác định theo công thức
% ứ𝑐 𝑐ℎế = × 100 ODtni − ODci ODc
2.2.9. Xác định thành phần của polysaccharide từ 2 chủng nấm FPT31 và FMD12
Phổ 1D và 2D NMR ghi trên máy Bruker AVANCE 500. Nồng độ mẫu 3% trong
dung môi D2O + 1%TFA, sử dụng DSS là chất chuẩn nội, phổ được ghi ở 70ºC với kỹ
thuật đo khử tín hiệu của nước.
2.2.10. Xác định hoạt tính của EPS lên một số chức năng của tế bào
Hoạt tính của EPS thô thu được từ hai chủng nấm FPT31 và FMD12 lên một số
chức năng của tế bào được thực hiện bởi công ty BioDetection Systems B.V- BDS, Hà
Lan.
Nuôi tế bào trong đĩa 96 giếng
Tế bào được nuôi trong bình tế bào trong môi trường nuôi cấy DMEM có phenol
đỏ, bổ sung 7,5% FCS, NEAA. Hút hết dịch nuôi ra khỏi bình nuôi tế bào, rửa tế bào
bằng PBS và trysin và để trong tủ ấm 37oC trong 2-3 phút. Bổ sung môi trường xét
nghiệm (DMEM không có phenol đỏ, bổ sung 5% DCC-FCS và penicillin) và đảo trộn
kỹ, đếm và pha loãng tế bào đến nồng độ xét nghiệm. Hút 100µl vào mỗi giếng. Nuôi tế
bào trong 16 tiếng, 37oC trong 5% CO2.
Biểu hiện trên đĩa 96 giếng
- 1µl chất chuẩn được bổ sung vào 1 ml môi trường xét nghiệm, lắc 300
vòng/phút trong 10 phút;
- 20µl mẫu được cổ sung vào 1 ml môi trường xét nghiệm, lắc 300 vòng/ phút
trong 10 phút;
- Sau 16 tiếng nuôi, hút hết 100µl môi trường trong giếng và hút 200µl môi
trường có chứa chất chuẩn hoặc mẫu cần phân tích cho vào giếng theo sơ đồ ở bảng 2.2.
Trang 37
Tất cả các giếng xung quanh đều được bổ sung 200µl môi trường có chứa chất chuẩn để
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
tránh ảnh hưởng của không khí lên sự phát triển của tế bào;
PBS PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
PBS
PBS Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
PBS
PBS Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
Chất chuẩn
PBS Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu
PBS
PBS Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu
PBS
PBS Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu
PBS
PBS PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
Bảng 2.2 Sơ đồ hút mẫu cho phân tích sàng lọc CALUX
- Nuôi đĩa trong 24 giờ ở 37oC, 5% CO2;
- Hút hết 200µ môi trường ra khỏi giếng và bổ sung 30µl Lysimix, lắc 300
vòng/phút trong 10 phút.
- Đo cường độ phát sáng của luciferase protein bằng máy Luminometer
- Dữ liệu được xử lý bằng excel và Graph Prism.
Trang 38
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và phân loại các chủng nấm nghiên cứu
Các mẫu thu thập từ nhiều đợt lấy mẫu và được phân lập từ các khu vực rừng có
khí hậu và đặc điểm sinh thái khác nhau gồm Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh Phú Thọ,
Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội, A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế, Vườn Quốc
gia Bidoup- Núi Bà, Vườn Quốc gia Mã Đà- tỉnh Đồng Nai và tỉnh Bình Phước và thuộc
các dự án, đề tài khác nhau. A Lưới và Mã Đà là hai khu vực bị rải chất độc hóa học
nặng nề trong chiến tranh chống Mỹ. Các khu vực lấy mẫu này có khí hậu cũng như hệ
sinh vật khác nhau. Các mẫu nấm sử dụng để phân lập có hình thái quả thể nấm rất khác
nhau, hầu hết chúng thuộc nhóm nấm cứng. Mười hai chủng nấm đã được phân lập và
10/12 chủng đã được tiến hành định danh. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch của các
chủng nấm phân lập được cũng khác nhau (bảng 3.2). Dựa vào trình tự vùng ITS1-5,8S-
ITS2 và so sánh với các trình tự đã được công bố trên GenBank thì 10 chủng nấm đã
được xác định thuộc các chi Ganoderma, Trametes, Earliella và Inonotus và Panus
(bảng 3.2).
Trong số 10 chủng đã được phân loại có 6 chủng thuộc chi Ganoderma bao gồm
FMD12, FMD13, FMD16, FAL18, FPT47 và FBV334. Các chủng FMD12, FMD13 và
FMD16 có độ tương đồng 99% chủng Ganoderma sp. G31 (KR093030) và 97% với
chủng Ganoderma sp. FIRM138 (AJ698114). Ganoderma sp. G31 là nấm được phân lập
từ cây dầu cọ bị mục gốc ở vùng Miri, Malaysia và đã được xác định là thuộc loài G.
zonatum [168]. Ganoderma sp. FIRM138 là nấm được phân lập từ cây keo tai tượng bị
thối rễ ở Indonesia và được cho là gây nên bệnh thối đỏ rễ ở loài keo này và cũng được
xếp vào loài G. philippii [70]. Các chủng FAL18, FPT47 và FBV334 có độ tương đồng
99% với lần lượt với các chủng Ganoderma mastoporum voucher TNM-F0018835
(JX840351), Ganoderma gibbosum strain T160 (KJ654373) và Ganoderma lobatum
isolate JV 0409/13J (KF605675). Bảng 3.1 so sánh độ tương đồng giữa các Ganoderma
được phân lập được từ các vùng rừng khác nhau trong nghiên cứu này.
Trang 39
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Bảng 3.1. Độ tương đồng giữa các nấm thuộc Ganoderma từ các vùng
Cặp nấm so sánh Độ tương đồng (%) Cặp nấm so sánh Độ tương đồng (%)
FMD12 – FMD13 99 FMD13 – FAL18 95
FMD12 – FMD16 99 FMD13 – FPT47 93
FMD13 – FMD16 99 FMD13 – FBBV334 92
FMD12 – FAL18 95 FAL18 – FPT47 93
FMD12 – FPT47 93 FAL18 – FBV334 92
FMD12 – FBV334 92 FPT47 – FBV334 99
Kết quả nhận được khá thú vị. Các nấm được phân lập ở cùng một khu vực (Mã
Đà) hoặc ở hai khu vực gần nhau (Ba Vì và Xuân Sơn) thì có độ tương đồng với nhau
cao đến 99%. Các Ganoderma được phân lập ở các khu vực khá xa nhau thì có độ tương
đồng thấp. Độ tương đồng của các Ganoderma phân lập từ A Lưới và Mã Đà là 95%,
trong khi đó giá trị này của các Ganoderma từ Mã Đà với Xuân Sơn, Ba Vì hay A Lưới
với Xuân Sơn, Ba Vì chỉ khoảng 92-93%. Như vậy, các nấm Ganoderma ở 3 miền Bắc,
Trung, Nam là tương đối khác nhau, càng xa nhau về mặt địa lý và điều kiện tự nhiên thì
các nấm này càng thể hiện sự khác biệt về mặt di truyền.
Trang 40
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm thuộc chi Ganoderma
Trang 41
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm trong nghiên cứu
Trang 42
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Chủng nấm FPT31 có độ tương đồng 99% với các chủng Earliella scabrosa
voucher UOC DAMIA D37 (KR706167) phân lập từ Malaysia và Earliella scabrosa
isolate UTAR R8 (KJ867374) phân lập từ Sri Lanka. FAL11 tương đồng 99% với
Inonotus pachyphloeus CBS 193.37 (KM030575) và một số nấm thuộc loài I.
pachyphloeus. Chủng FBD167 tương đồng 94% với chủng nấm Panus conchatus isolate
X1234 (JN710579) và Panus conchatus voucher JMH44 (KM267730). Tương tự, FPT24
cũng tương đồng 99% với chủng Trametes elegan strain UMT170-T (KJ654414) và một
số nấm thuộc loài T. elegan. Như vậy, dựa trên các đặc điểm về hình thái quả thể, sợi
nấm và kết hợp với các số liệu về độ tương đồng của vùng trình tự ITS của các nấm
nghiên cứu với các trình tự trên GenBank, các chủng FPT31, FAL11, FBD167, và
FPT24 được đặt tên tương ứng là Earliella. sp FPT31, Inonotus sp. FAL11, Panus sp.
FBD167 và Trametes sp. FPT24.
3.2. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp exopolysaccharide và hoạt tính enzyme
laccase của các chủng nấm nghiên cứu
Hầu hết các khuẩn lạc đều tạo màu nâu đỏ trên môi trường thạch có bổ sung chất
chỉ thị guaiacol 0,2% chứng tỏ khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào thuộc
nhóm oxidoreductase (laccase) và peroxidase (mangan peroxidase, lignin peroxidase).
Bảng 3.2 thể hiện một số đặc điểm của các chủng nấm được phân lập và sàng lọc.
Trang 43
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Bảng 3.2. Hình thái các chủng nấm và khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase của chúng
Tên chủng Nguồn gốc Hình ảnh tự nhiên Hình ảnh khuẩn lạc Sinh khối (g/l) Polysaccharide (g/l) Hoạt tính laccase (U/l)
4,64 0,84 7.923 Earliella sp. FPT31 (KT965504) Rừng Quốc gia Xuân Sơn
4,37 3,24 944 Rừng Quốc gia Xuân Sơn Trametes sp. FPT24 (KT965503)
5,20 2,77 0 Rừng Quốc gia Xuân Sơn Ganoderma sp. FPT47 (KT965499)
Trang 44
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
6,38 0,36 2.573 Rừng Quốc gia Ba Vì Ganoderma sp. FBV334 (KT965498)
5,12 2,09 0 Rừng Quốc gia Mã Đà FMD11 (Chưa phân loại)
5,40 1,32 12 Rừng Quốc gia Mã Đà
Ganoderma sp. FMD12 (KT965500)
3,26 1,09 18 Rừng Quốc gia Mã Đà Ganoderma sp. FMD13 (KT965501)
Trang 45
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
5,29 1,03 0 Rừng Quốc gia Mã Đà Ganoderma sp. FMD16 (KT965502)
Inonotus sp. 6,26 0,39 1.000 Đồi Thịt Băm- A Lưới FAL11
5.15 1,11 12 Đồi Thịt Băm- A Lưới
Ganoderma sp. FAL18 (KT965495)
Bình Phước 5,56 0,15 0 D12 (Chưa phân loại)
8,79 1,21 2.439 Rừng Quốc gia BiDoup Panus sp. FBD167 (KT965505)
Trang 46
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Khả năng sinh trưởng của 12 chủng nấm trong nghiên cứu này trên môi trường
lên men không có sự sai khác quá lớn, sinh khối khô thu được có khối lượng từ 3,26 đến
6,28 g/l. Tám chủng trong số 12 chủng sau khi sàng lọc có khả năng sinh polysaccharide
trên môi trường nuôi cấy với khối lượng lớn hơn 1g/l. Cũng có 8/12 chủng có khả năng
sinh enzyme laccase với hoạt tính từ 12 đến 7.923 U/l. Tuy nhiên, các chủng sinh tổng
hợp laccase có hoạt tính cao lại không có khả năng sinh tổng hợp EPS cao. Kết quả này
có thể do điều kiện để sinh tổng hợp hai sản phẩm nêu trên khác nhau. Việc lựa chọn
môi trường để các chủng nấm này có thể sinh tổng hợp đồng thời 2 sản phẩm trên có ý
nghĩa vô cùng quan trọng để ứng dụng các sản phẩm thu được trong các lĩnh vực khác
nhau, đặc biệt trong lĩnh vực tạo nguyên liệu cho việc sản xuất các sản phẩm trong công
nghiệp dược liệu và nông nghiệp hữu cơ.
Các chủng nấm được phân lập từ các khu vực khác nhau cũng thể hiện những đặc
điểm khác nhau rõ rệt. Ba chủng nấm phân lập từ rừng Quốc gia Xuân Sơn tỉnh Phú Thọ
đều có khả năng sinh tổng hợp EPS khá tốt từ 0,84 đến 3,24 g/l, 2/3 chủng sinh enzyme
với hoạt tính cao, đặc biệt chủng FPT24 vừa sinh tổng hợp EPS tốt với giá trị EPS thu
được là 3,24g/l, vừa sinh tổng hợp enzyme laccase cao với hoạt tính thu được ở khảo sát
ban đầu là 944 U/l. Chủng nấm Ganoderma sp.FBV334 phân lập từ Vườn Quốc gia Ba
Vì có hoạt tính laccase đạt được 2.573 U/l nhưng EPS thu được chỉ là 0,36g/l. Chủng
nấm D12 phân lập từ Bình Phước không thể hiện hoạt tính laccase, đồng thời lượng EPS
sinh ra cũng rất thấp (0,15g/l). Được phân lập từ Vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà tỉnh
Lâm Đồng, chủng FBD167 vừa có khả năng sinh tổng hợp EPS tốt (1,21 g/l) đồng thời
sinh laccase có hoạt tính cao (2.439 U/l). Bốn chủng nấm phân lập được từ Vườn Quốc
gia Mã Đà tỉnh Đồng Nai đều thể hiện khả năng sinh EPS ở mức trung bình đến khá từ
1,02 đến 2,09g/l nhưng sinh laccase thu được có hoạt tính thấp. Hai chủng nấm phân lập
từ A Lưới tỉnh Thừa Thiên Huế đều có khả năng sinh trưởng tốt, chủng FAL11 sinh
laccase hoạt tính cao 1.000U/l nhưng sinh tổng hợp EPS thấp, trong khi đó chủng
FAL18 lại sinh EPS đạt 1,1g/l nhưng hoạt tính laccase lại chỉ đạt 12U/l. Mã Đà và A
Lưới là hai khu vực bị rải chất độc hóa học rất nặng nề trong chiến tranh, điều này ảnh
Trang 47
hưởng khá lớn đến hệ sinh thái ở các khu vực này. Để có những kết luận chính xác và
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
thuyết phục cần có nhiều nghiên cứu trên nhiều đối tượng nấm hơn nữa nhưng các kết
quả trong nghiên cứu này cũng đã phần nào phác họa, so sánh về đặc điểm của nấm ở
các khu vực khác nhau.
Cho đến nay đã có nhiều công bố về khả năng sinh tổng hợp polysaccharide, các
tính chất và ứng dụng của các nấm thuộc chi Ganoderma trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt
là trong lĩnh vực tăng cường và bảo vệ sức khỏe con người [20], [36], [143], [61], [135],
[56]. Các nấm thuộc chi Inonotus và Trametes và Panus cũng đã có một số nghiên cứu
công bố về khả năng sinh tổng hợp polysaccharide, enzyme laccase và một số hợp chất
thứ cấp có hoạt tính sinh học [19], [144], [44], [76], [77], [151]. Loài nấm Earliella
scabrosa đã được công bố về khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase và mangan
peroxidase khi lên men rắn trên môi trường bã mía với hoạt tính lần lượt là 44,3 và 3.692
U/g; đồng thời nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng enzyme thô thu từ chủng này có khả
năng loại màu thuốc nhuộm Navy FNB và Red FN-3G [43]. Một nghiên cứu khác của
Peng và đtg (2013) cũng đã công bố chủng nấm Earliella scabrosa phân lập từ rừng của
Malaysia có khả năng ức chế một số nấm mục gây bệnh cho cây cao su [100]. Thêm nữa,
theo nghiên cứu của Liew và đtg (2015) đã cho thấy dịch chiết trong ethanol của E.
scabrosa đặc tính chống oxy hóa với giá DPPH đạt 21,27 % đồng thời có khả năng ức
chế sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh Clostridium difficile,
Streptococus pyogenies, Pseudomonas aeruginos, Staphylococcus aureus và Escherichia
coli [68]. Tuy nhiên lại có rất ít các nghiên cứu đã công bố về khả năng sinh tổng hợp
polysaccharide của các loài nấm thuộc chi Earliella. Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên
cứu về nấm đảm vừa có khả năng sinh tổng hợp polysaccharide vừa sinh tổng hợp
enzyme laccase. Nhìn vào bảng 3.2 có thể thấy chủng nấm Earliella sp. FPT31 có khả
năng sinh tổng hợp đồng thời polysaccharide (0,84 g/l) và enzyme laccase (7.923 U/l)
trong khi đó chủng nấm FMD12 có khả năng sinh polysaccharide tương đối tốt (1.02 g/l)
nhưng không có khả năng sinh tổng hợp laccase. Dựa trên một số đặc điểm khác nhau về
nguồn gốc, hình thái v.v. thì 2 chủng nấm nghiên cứu đã được lựa chọn để khảo sát ảnh
Trang 48
hưởng của một số điều kiện nuôi cấy và khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây bệnh
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
kiểm định để hướng tới sử dụng chúng trong đấu tranh sinh học.
3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy một số chủng nấm
Dịch nuôi cấy của 7 chủng nấm là FPT31, FPT47, FBV334, FMD12, FMD13,
FMD16 và D12 được sử dụng để khảo sát và đánh giá khả năng kháng lại 4 chủng vi
sinh vật kiểm định gồm Aspergillus niger, Penicillium italicum, Bacillus cereus và
Micrococus luteus. Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp xác định đường kính
vòng ức chế (inhibit zone) trên môi trường thạch.
FMD12-Micrococus luteus FMD12- Bacillus cereus
FPT31- B. cereus FPT31- M.luteus
Hình 3.3. Khả năng kháng Bacillus cereus và Micrococus luteus của dịch nuôi từ nấm FPT31 và FMD12
Chỉ có dịch lên men của 2 chủng nấm Earliella sp. FPT31 và Ganoderma sp.
FMD12 có khả năng kháng lại cả 2 chủng vi khuẩn kiểm định này với đường kính các
Trang 49
vòng ức chế khác nhau (Hình 3.3). Dịch chiết của các chủng nấm còn lại không phát
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
hiện thấy khả năng kháng lại các vi sinh vật kiểm định.
Dịch nuôi cấy của chủng FMD12 có khả năng ức chế sự phát triển của 2 vi khuẩn
kiểm định là B. cereus và M. luteus với đường kính vòng ức chế lần lượt là 12 mm và 16
mm. Trong khi đó, dịch nuôi cấy của chủng FPT31 ức chế yếu hơn, đường kính vòng ức
chế là 2 mm đối với B. cereus và 4 mm đối với M. luteus.
Dịch nuôi cấy của chủng FMD12 tiếp tục được sử dụng để đánh giá khả năng ức
chế sự sinh trưởng và phát triển của hai chủng vi khuẩn kiểm định B. cereus và M.luteus
trong môi trường dịch thể. Thí nghiệm được tiến hành đối với 2 tỉ lệ môi trường: dịch
nuôi lần lượt là 1:1 (50% dịch nuôi nấm) và 1:2 (25% dịch nuôi nấm). Độ đục của các
mẫu thí nghiệm được xác định độ đục sau 12 giờ và 24 giờ. Kết quả được thể hiện ở
bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khả năng ức chế sự sinh trưởng 2 chủng vi khuẩn B. cereus và M.
luteus của dịch nuôi cấy chủng FMD12
Sau 12 giờ Sau 24 giờ Vi khuẩn kiểm định 25% 50% 25% 50%
B. cereus 55,26 81,58 35,42 75,00
M.luteus 49,02 68,62 61,62 80,81
Sau 12 giờ, 50% dịch nuôi cấy của chủng FMD12 trong môi trường có khả năng
ức chế đến 81,58% sự sinh trưởng của B. cereus và 68,62% của M.luteus so với mẫu đối
chứng không có dịch nuôi cấy nấm. Nếu trong môi trường có chứa 25% dịch nuôi nấm
thì các giá trị trên lần lượt là 55,26 và 49,02%. Sau 24 giờ nuôi cấy, khả năng ức chế của
dịch nuôi nấm đối với B. cereus giảm còn 75 và 35,42%, trong khi đó khả năng ức chế
sự sinh trưởng của M. luteus lại tăng lên 80,81 và 61,62% (bảng 3.).
Theo nghiên cứu của Peng và đtg (2013), dịch chiết từ sinh khối của nấm
Earliella scabrosa trong nước và methanol đều có khả năng kháng lại 7 chủng nấm gây
bệnh trên cây cao su Pycnoporus sanguineus, Schizophyllum commune, Lentinus sp., L.
Trang 50
sajor-caju, L. strigosus, Microporus affinis và M. xanthopus với các giá trị MIC (nồng
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
độ ức chế tối thiểu) từ 0,61 đến 5µg/µl [100].
Theo kết quả đã công bố của một số nghiên cứu quốc tế khác, dịch chiết từ quả
thể của nhiều nấm đảm có khả năng kháng lại B. cereus hoặc M.luetus hoặc kháng lại cả
hai. Dịch chiết trong methanol của Agaricus bisporus thể hiện khả năng kháng lại cả B.
cereus và M. luteus và một số vi khuẩn Gram dương khác nữa như Micrococcus flavus,
Staphylococcus aureus và Epidermidis Staphylococcus [11], [96], [97]. Dịch chiết trong
methanol của Agaricus silvicola cũng kháng lại vi khuẩn Gram dương Bacillus cereus
(MIC = 5μg / mL), Bacillus subtilis (MIC = 50μg / mL).
Chiết xuất thu được ở 2 loại dung môi methanol và ethyl acetate của Lepista nuda
đều có hoạt tính kháng khuẩn tốt với Bacillus cereus [55], [96].
Ganoderma lucidum là một trong những nấm dược liệu nổi tiếng nhất. Nhiều dịch
chiết khác nhau từ loài nấm linh chi này đã được đánh giá là có hiệu quả như nhau khi so
sánh với sulphate gentamycin, trong đó dịch chiết bởi acetone cho hiệu quả cao nhất.
Dịch chiết bởi các dung môi đã nghiên cứu từ nấm này đều ức chế được các vi khuẩn
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Escherichia coli,
Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi [39], [105], [115].
Tuy nhiên trong nghiên cứu đã được công bố bởi Sheena và đtg (2003) thì chiết xuất của
nó trong methanol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn lại rất thấp [115]. Các tác giả khác
cũng đã đánh giá dịch chiết từ nấm bởi nước ức chế được 15 loại vi khuẩn Gram dương
và Gram âm, và mức ức chế cao nhất là kháng lại Micrococcus luteus [39]. Mothana và
đtg (2000) cũng đã chứng minh khả năng kháng vi sinh vật của các hợp chất
Ganomycins A and B tách chiết từ Ganoderma pfeifferi kháng lại các vi khuẩn
Escherichia coli, Proteus mirabilis, Serratia marcescens [93].
Trang 51
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo sinh khối, sinh tổng hợp EPS và
laccase của 2 chủng nấm Earliella sp. FPT31 và Ganoderma sp. FMD12
3.4.1.Ảnh hưởng của pH môi trường
pH của môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng và ảnh hưởng lớn đến sự
sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung, nấm dược liệu nói riêng. Mỗi vi sinh
vật lại có một pH tối thích cho sự tạo thành sinh khối khác nhau. Ngoài ra, ở các pH
khác nhau, các sản phẩm của quá trình lên men cũng có thể khác nhau. Chưa có một quy
luật chung nào về ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp có
hoạt tính sinh học ở vi sinh vật. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng
hợp enzyme laccase và polysaccharide của hai chủng nấm FPT31 và FMD12 đã được
khảo sát với dải pH từ 3 đến 9. Kết quả được trình bày ở hình 3.4.
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp EPS của 2 chủng nấm nghiên cứu thể hiện hoàn toàn không giống nhau (Hình
3.4). Chủng FPT31 sinh trưởng tốt từ pH 6,5 đến 9 và tốt nhất ở pH 8 với lượng sinh
khối thu được là 11,96 g/l. Trong khi đó pH tối thích cho sinh tổng hợp EPS là 5,5 (1,27
g/l) và sinh tổng hợp laccase là 6 với hoạt tính là 31.334 U/l. Ở các pH thấp hơn, chủng
FPT31 vẫn có khả năng sinh tổng hợp EPS tương đối tốt, đạt 55,1-87,4% so với ở pH tối
thích nhưng khả năng sinh tổng hợp laccase lại giảm mạnh, chỉ bằng 4,2-18.1% so với
pH tối thích. Như vậy, đối với chủng FPT31, pH thích hợp cho sinh trưởng, sinh tổng
hợp EPS và enzyme laccase có giá trị khác nhau. Kết quả thu được có ý nghĩa định
hướng trong nghiên cứu cũng như ứng dụng, tùy vào sản phẩm hương đích cần thu nhận
mà chủng này được lên men trong môi trường có pH thích hợp. Nghiên cứu này trước
nhất tập trung vào đánh giá khả năng sinh tổng hợp EPS nên pH 5,5 được lựa chọn cho
các khảo sát tiếp theo.
Trái ngược với FPT31, FMD12 lại sinh trưởng tốt và sinh tổng hợp
polysaccharide cao ở các pH thấp và tối thích ở pH 3. Lượng sinh khối và EPS thu được
Trang 52
ở pH 3 này là 5,35 và 5,48 g/l tương ứng. pH càng cao thì lượng sinh khối thu được và
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
EPS tạo thành càng giảm.
g/l FPT31- Sinh khối
U/l FPT31- Hoạt tính
g/l
FPT31- EPS
35000
14
laccase
1.40
30000
12
1.20
25000
10
1.00
20000
8
0.80
15000
6
0.60
10000
4
0.40
5000
2
0.20
0
0.00
0
.
.
.
.
.
.
3 H p
4 H p
5 H p
6 H p
7 H p
8 H p
9 H p
6 H p
3 H p
4 H p
5 H p
6 H p
7 H p
8 H p
9 H p
3 H p
4 H p
5 H p
7 H p
8 H p
9 H p
5 5 H p
5 6 H p
5 5 H p
5 6 H p
5 5 H p
5 6 H p
g/l FMD12- sinh khối
g/l FMD12- EPS
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
3 H p
4 H p
5 H p
6 H p
7 H p
8 H p
9 H p
3 H p
4 H p
5 H p
6 H p
7 H p
8 H p
9 H p
Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp enzyme
laccase và EPS của FPT31 và FMD12
Theo công bố của Peng (2013), chủng nấm Earliella scabrosa được phân lập từ
rừng Malaysia sinh trưởng tốt nhất ở pH 6,5 với lượng sinh khối thu được là 20,74 g/l
[100]. Giá trị pH 9 là pH tối thích cho chủng nấm Phellinus gilvus [53] và các chủng
Trang 53
nấm dược liệu khác trong nghiên cứu của Lee (2004) và Lim (2004) sinh trưởng và sinh
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
tổng hợp EPS. Theo một công bố của Cho và đtg (2006), chủng nấm Tremella fucifomis
sinh EPS tốt nhất ở pH8 [24]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Ganoderma
lucidum sinh trưởng và tổng hợp EPS tốt ở các pH thấp. Chủng nấm Ganoderma
lucidum được phân lập từ rừng cây lá kim gần Rozaje, Serbia sinh khối thu được cao
nhất ở pH 5 (20,6 g/l) và lượng EPS thu được cao nhất ở pH 3 (5,2 g/l). pH 3 cũng là pH
tối thích cho Ganoderma lucidum phân lập từ gỗ Tipuana sinh trưởng và tổng hợp EPS
[99]. Tương tự, chủng Cordyceps militaris CCRC 32219 sinh trưởng tốt nhất ở pH4
(15,2 g/l sinh khối) và sinh EPS tốt nhất ở pH 4 và pH 5 với khối lượng thu được là
1,1g/l [116] trong khi loài Cordyceps gracilis lại tổng hợp EPS và IPS tốt nhất ở pH 6
[114].
3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Hai chủng nấm FPT31 và FMD12 được nuôi cấy trên môi trường thích hợp đối
với từng chủng sinh tổng hợp EPS. Hoạt tính enzzyme laccase được xác định sau mỗi
ngày nuôi cấy; sinh khối và EPS được xác định sau 4, 6, 8, 10 và 12 ngày nuôi cấy. Kết
quả được trình bày ở hình 3.5 và bảng 3.4.
FPT31- hoạt tính laccase
30000
25000
) l / U
20000
( e s a c c a
l
15000
10000
h n í t t ạ o H
5000
0
3 ngày
4 ngày
5 ngày
6 ngày
7 ngày
Hình 3.5. Hoạt tính enzyme laccase của chủng FPT31 theo thời gian nuôi cấy
Trang 54
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Chủng FPT31 sinh tổng hợp enyme laccase với hoạt tính cao nhất sau 5 ngày nuôi
cấy là 27.954U/l, tăng 30,4% so với ngày nuôi cấy thứ 4. Tuy nhiên, tốc độ tổng hợp
enzyme laccase lại nhanh nhất trong ngày nuôi cấy thứ 4, hoạt tính tăng 56,4% so với ở
ngày nuôi cấy thứ 3. Ở các ngày nuôi cấy thứ 6 trở đi, hoạt tính enzyme giảm dần, chỉ
còn 18.123 U/l sau 7 ngày nuôi cấy. Như vậy, nếu sản phẩm cần thu nhận sau lên men là
enzyme laccase thì thời gian lên men yêu cầu chỉ cần 5 ngày.
Bảng 3.4. Sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp EPS theo thời gian của FPT31
Chủng nấm
0 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày 12 ngày
và FMD12
Sinh khối (g/l) 0,13 3,92 6,22 7,42 7,94 8,34
Tốc độ sinh trưởng 0,95 1,15 0,6 0,26 0,2 (g/l.ngày) FPT31 EPS (g/l) 0 0,93 1,02 1,06 1,3 1,51
Tốc độ tổng hợp EPS 0,23 0,045 0,02 0,12 0,105 (g/l.ngày)
Sinh khối (g/l) 0,46 2,33 2,36 2,67 3,91 4,34
Tốc độ sinh trưởng 0,47 0,015 0,015 0,62 0,215 (g/l.ngày) FMD12 EPS (g/l) 0 1.43 1.52 1.65 1.71 1.8
Tốc độ tổng hợp EPS 0,36 0,045 0,065 0,03 0,045 (g/l.ngày)
Sau 12 ngày nuôi lắc, cả 2 chủng nấm nghiên cứu đều có lượng sinh khối và EPS
thu được cao nhất (Bảng 3.4) với các giá trị lần lượt là 8,34 và 1,51 g/l đối với FPT31,
4,34 và 1,80 g/l đối với FMD12. Tốc độ sinh trưởng theo thời gian của 2 chủng này
không giống nhau. Chủng FPT31 đạt tốc độ sinh trưởng nhanh nhất vào ngày nuôi cấy
thứ 6 với lượng tăng sinh khối là 1,15 g/l/ngày. Ở những ngày nuôi cấy tiếp theo, chủng
này sinh trưởng chậm dần và chỉ tăng 0,2 g/l/ngày vào ngày nuôi cấy thứ 12. Trong khi
đó, chủng FMD12 sinh trưởng nhanh nhất ở ngày thứ 10 với lượng tăng sinh khối là 0,62
g/l/ngày. Cả 2 chủng FPT31 và FMD12 đều có tốc độ sinh tổng hợp EPS tốt nhất ở giai
Trang 55
đoạn đầu (4 ngày) của quá trình nuôi cấy với các giá trí lần lượt là 0,23 và 0,36 g/l/ngày.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Ở các ngày nuôi cấy tiếp theo, tốc độ tổng hợp ở cả 2 chủng này chậm hơn nhưng không
theo một quy luật nhất định mà tăng giảm khác nhau ở mỗi giai đoạn nuôi cấy.
3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nguồn nitơ sử dụng trong môi trường nuôi cấy để đánh giá ảnh hưởng đến sinh
trưởng, tổng hợp EPS và laccase của 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 gồm các nguồn
nitơ vô cơ NH4Cl, NH4NO3, KNO3 với hàm lượng 2 g/l và các nguồn nitơ hữu cơ cao
nấm men, cao thịt, peptone với hàm lượng 1 g/l. Kết quả được trình bày ở hình 3.6.
Các muối và hợp chất nitơ hữu cơ không ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh
trưởng của chủng nấm FPT31với lượng sinh khối thu được dao động từ 7,71- 8,41 g/l
(Hình 3.6). Tuy nhiên nguồn nitơ lại có ảnh hưởng khá lớn đến sinh trưởng của chủng
FMD12. Trong môi trường chứa nguồn nitơ là peptone, lượng sinh khối thu được cao
nhất là 10,91 g/l còn với muối nitơ vô cơ là NH4Cl, lượng sinh khối thu được chỉ từ 2,3
đến 4,74 g/l.
Nguồn nitơ ảnh hưởng một cách rõ rệt lên khả năng sinh tổng hợp EPS của cả
FPT31 và FMD12. Lượng EPS thu được khi nuôi chủng FPT31 trên các nguồn nitơ hữu
cơ cao hơn hẳn so với các nguồn nitơ vô cơ. Trong khi đó, chủng FMD12 lại sinh tổng
hợp EPS tốt trên cả hai nguồn nitơ là NH4Cl và cao nấm men lần lượt là 3,96 và 3,80 g/l.
Khi nguồn nitơ là KNO3 chủng FMD12 chỉ sinh tổng hợp được1,28 g/l EPS.
Kết quả từ các công bố quốc tế của Cho và đtg (2006) về ảnh hưởng của nguồn
nitơ lên khả năng sinh trưởng và tổng hợp EPS của loài nấm Tramella fucifomis đã chỉ ra
rằng chủng này sinh trưởng và tổng hợp EPS tốt trên nguồn nitơ hữu cơ [24]. Trên môi
trường chứa tryptone, lượng sinh khối và EPS thu được lần lượt là 6,79g/l và 1,5g/l; với
nguồn nitơ là cao nấm men thì giá trị trên lần lượt là 5,77g/ và 1,21g/l; Trong khi đó,
trên môi trường chứa muối nitơ vô cơ NH4NO3, loài này sinh trưởng và tổng hợp EPS
kém và chỉ thu được 2,08g/l và 0,39g/l. Ở một nghiên cứu khác, cao nấm men cũng là
nguồn nitơ tối thích cho 2 loài nấm Morchella esculenta [88] và Ganoderma lucidum
Trang 56
[99]. Sự kết hợp của cao nấm men và peptone trong môi trường nuôi cấy làm tăng khả
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
năng sinh trưởng và lượng EPS tạo thành cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng nguồn đơn
như trong trường hợp của Ganoderma lucidum CCGMC 5.616 [35], Humphreya coffeata
[103], Agaricus sp.[85]. Trong nghiên cứu của Elisashivi và đtg (2009) đối với 8 chủng
nấm khi nuôi cấy trên môi trường chứa 3g/l cao nấm men và 2g/l (NH4)2SO4 thì lượng
sinh khối thu được từ 7,7 đến 12,7 g/l và EPS từ 1,0 đến 2,2 g/l [34].
FPT31- EPS
FPT31- Hoạt tính laccase
g/l
g/l
FPT31- Sinh khối
1.2
U/l 14000
12000
1
10000
0.8
8000
0.6
6000
0.4
4000
0.2
2000
0
0
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
FMD12- Sinh khối
FMD12- EPS
g/l
12
10
8
6
4
2
0
g/l 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12
Nếu nguồn nitơ hữu cơ là thích hợp cho chủng FPT31sinh trưởng và tổng hợp
EPS thì nguồn nitơ vô cơ lại thích hợp cho chủng này sinh tổng hợp enzyme laccase.
Trang 57
Hoạt tính laccase đạt cao nhất là 12.548 U/l trên nguồn nitơ là KNO3. KNO3 cũng là
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp của một số chủng nấm được phân lập và nghiên
cứu ở Việt Nam như chủng nấm Trichoderma sp. FCP3 [6],Myrothecium sp.FNBLa1 [3].
3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon
Cùng với nitơ, nguồn carbon là một yếu tố vô cùng quan trọng ảnh hưởng đến
sinh khối và các sản phẩm thứ cấp từ quá trình lên men của hầu hết vi sinh vật.
Polysaccharide là một polyme được tạo thành từ các monome là các đường đơn như
glucose, mannose, fructose, xylose, maltose, lactose v.v.Vì vậy, sự có mặt của các loại
đường này trong môi trường nuôi cấy có vai trò quan trọng đối với khả năng tổng hợp
EPS cũng như cấu trúc và các tính chất của EPS mà chúng tạo ra.
Để đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp EPS và laccase, các loại đường là glucose, mannose, lactose, xylose, saccharose đã
được sử dụng với hàm lượng 20g/l cho chủng FPT31 và 50g/l cho chủng FMD12. Kết
quả thu được trình bày ở hình 3.7.
Từ số liệu thể hiện ở hình 3.7 đã chỉ ra rằng có sự khác nhau khá lớn khi sử dụng
các nguồn carbon đối với sự sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và tạo laccase ở 2 chủng
FPT31 và FMD12. Đối với chủng FPT31, nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh trưởng
là 8,4g/l saccharose, cho tổng hợp EPS là 1,76g/l lactose. Trên môi trường có nguồn
carbon là glucose, chủng này sinh trưởng và tổng hợp EPS kém nhưng lại sinh tổng hợp
laccase với hoạt tính cao 17.037U/l. Lactose là nguồn carbon khá thích hợp đối với sự
sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của chủng FPT31 với các khối lượng thu
được lần lượt là 7,22g/l, 1,76g/l và 15.536U/l.
Khác với chủng FPT31, lactose là nguồn carbon thích hợp cho chủng FMD12
sinh trưởng với sinh khối đạt 5,08 g/l nhưng glucose lại là nguồn carbon thích hợp cho
chủng này tổng hợp EPS đạt được là 4,66 g/l. Trên nguồn carbon là xylose, chủng
FMD12 sinh trưởng và tổng hợp EPS kém hơn cả. Số liệu thu được có thế được giả thiết
Trang 58
là cấu trúc của polysaccharide được sinh ra từ 2 chủng nấm này là khác nhau không chỉ
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
về thành phần mà còn cả ở hàm lượng của các monome cấu thành nên chúng.
U/l
FPT31- Sinh khối
FPT31- Hoạt tính laccase
FPT31- EPS
g/l
g/l
18000
9
16000
8
14000
7
12000
6
10000
5
8000
4
6000
3
4000
2
1
2000
0
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
0
FMD12- Sinh khối
FMD12- EPS
g/l
g/l
5
6
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
glucose mannose lactose
xylose
glucose mannose lactose
xylose
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng
hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12
Theo kết quả của nhiều nghiên cứu quốc tế đã được công bố thì glucose là nguồn
carbon thích hợp cho sự sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và enzyme laccase của nhiều
nấm, đặc biệt là các đại diện nấm thuộc chi Ganoderma. Hai chủng nấm Ganoderma
lucidum CCGMC 5.6.16 [35] và Ganoderma lucidum CAU5501 [147] đều sinh trưởng
tốt trên nguồn carbon là 50g/l glucose và lượng sinh khối thu được lần lượt là 16,7 và
Trang 59
7,24 g/l; sinh tổng hợp EPS ở nồng độ glucose là 65 và 70g/l với lượng EPS thu được
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
lần lượt là 1,08 và 1,72 g/l. Ganoderma lucidum [99] lại thích hợp khi nuôi ở môi trường
chứa 40g/l glucose kết hợp với 20g/l cao malt và lượng sinh khối thu được là 4,70 g/l và
2,63 g/l EPS. Ngoài ra, glucose còn là nguồn carbon tối thích cho nhiều nấm khác như
Antrodia cinnamomea [131], Agaricus sp [85], Phellinus baumii [74], 8 chủng nấm
trong nghiên cứu của Elisashivi và đtg (2009) [34].v.v. Chủng nấm Morchella esculenta
SO-O2 sinh tổng hợp EPS cao nhất trên 2 nguồn carbon là glucose (2,3 g/l EPS) và
succrose (2,24 g/l EPS) còn trên nguồn lactose, EPS thu được chỉ là 0,58g/l.
Giống như chủng FPT31, 50g/l lactose là nguồn carbon thích hợp cho loài nấm
Humphreya coffeata sinh trưởng và tổng hợp EPS, với lượng sinh khối và EPS thu được
tới 15,5 g/l và 6,9g/l. Ngoài ra, maltose cũng là nguồn carbon thích hợp với các loài nấm
Pleurotus ostreatus và Lactiporus sulphureus var miniatus [53].
3.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ glucose
Glucose là nguồn carbon thích hợp cho chủng nấm FMD12 sinh trưởng và tổng
hợp EPS và là nguồn carbon tốt nhất cho chủng nấm FPT31 sinh tổng hợp enzyme
laccase. Do đó, việc khả sát chi tiết nồng độ glucose đã được tiến hành.
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sự sinh trưởng, tổng hợp EPS và
enzyme laccase đối với chủng nấm FPT31 và FMD12 đã được thực hiện. Hai chủng nấm
này được nuôi cấy trên môi trường có chứa glucose với các nồng độ khác nhau, từ 10
đến 60g/l. Kết quả được trình bày ở hình 3.8.
Cả 2 chủng nấm nghiên cứu đều sinh trưởng và sinh tổng hợp EPS trên môi
trường chứa glucose ở nồng độ từ 50-60 g/l. Ở nồng độ 60g/l glucose, lượng sinh khối
thu được ở 2 chủng FPT31 và FMD12 lần lượt là 25,8g/l và 11,29g/l, cao gấp 3 lần so
với ở nồng độ10g/l glucose trong môi trường. Tương tự, lượng EPS thu được cao nhất ở
chủng FPT31 là 1,47g/l ở nồng độ glucose là 50g/l còn đối với chủng FMD12 là 4,3 g/l
EPS ở 60g/l glucose.
Trang 60
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
U/l
g/l
g/l FPT31- Sinh khối
FPT31- EPS
60000
1.6
30
FPT31- Hoạt tính laccase
1.4
50000
25
1.2
40000
20
1
30000
0.8
15
0.6
20000
10
0.4
10000
5
0.2
0
0
0
g/l
g/l FMD12- Sinh khối
FMD12- EPS
12
5
10
4
8
3
6
2
4
1
2
0
0
10g/l20g/l30g/l40g/l50g/l60g/l
10g/l20g/l30g/l40g/l50g/l60g/l
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn nồng độ glucose đến khả năng sinh trưởng,
sinh tổng hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12
Nồng độ glucose cao thích hợp cho chủng nấm FPT31 sinh trưởng và tổng hợp
EPS nhưng chủng này lại sinh tổng hợp laccase tốt ở nồng độ glucose từ 10 đến 20g/l
với hoạt tính từ 50.454 đến 51.981 U/l. Đây là hoạt tính laccase rất cao so với các chủng
vừa có khả năng sinh EPS và laccase ngoại bào. Ở nồng độ glucose cao, hoạt tính
laccase giảm chỉ còn 50%.
Trang 61
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
3.4.6. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và enzyme laccase của chủng FPT31
khi kết hợp các yếu tố trong môi trường
Dựa theo các kết quả đã khảo sát về ảnh hưởng của một số yếu tố trong môi
trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của chủng
FPT31 đã được tiến hành. Trong thí nghiệm này chủng FPT31 được nuôi ở các môi
trường chứa thành phần các loại đường và cao men ở nồng độ khác nhau. Kết quả được
trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31 trên môi
STT
Nguồn carbon, nitơ (g/l)
Sản phẩm
Cao nấm
Laccase
Sinh khối
EPS
Glucose Lactose Mannose Xylose
men
(U/l)
(g/l)
(g/l)
1
50
0
0
0
9.282
1
1,35
trường chứa đường và cao nấm men ở nồng độ khác nhau
14,14
2
50
0
0
0
11,9
3
2.21
10.606
3
50
0
0
0
9.481
11,15
5
2,19
4
0
30
10
20
6.685
11,87
3
2,09
5
0
40
0
10
7.608
8,2
3
2,46
6
0
50
0
0
9.259
9,32
3
2,8
7
0
0
0
50
7.968
10,58
3
3,0
8
0
20
10
20
6.406
10,12
1
1,48
9
0
20
10
20
8.454
9,68
3
2,22
10
0
20
10
20
7.107
8,96
5
1,91
Chủng FPT31 vẫn sinh tổng hợp enzyme laccase cao nhất trên môi trường nguồn
carbon là glucose và hàm lượng cao nấm men sử dụng là 3g/l với hoạt tính laccase là
10.606U/l. Theo kết quả của thí nghiệm trước, ở nồng độ 20g/l, lactose là nguồn carbon
tốt hơn cả cho sự sinh tổng hợp EPS, sau đó là xylose và mannose, nhưng theo kết quả
của thí nghiệm này thì ở nồng độ 50g/l, trên môi trường có xylose lượng EPS thu được
từ chủng FPT31 là 3,0 g/l trong khi trên môi trường chứa lactose là 2,8g/l. Ở nồng độ
đường 50g/l, chủng FPT31 lại sinh trưởng tốt nhất khi có mặt glucose. Lượng sinh khối
Trang 62
thu được trên môi trường chứa glucose, lactose, xylose lần lượt là 14,14; 9,32 và
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
10,58g/l.
Nồng độ 3g/l cao nấm men thích hợp nhất cho sự tổng hợp EPS và enzyme
laccase của FPT31. Tuy nhiên, chủng này lại sinh trưởng tốt nhất ở nồng độ cao nấm
men là 1g/l.
Như vậy, sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp EPS
thì trên môi trường thích hợp chủng FMD12 tổng hợp được 4,3g/l EPS so với ban đầu là
1,02g/l, tăng gấp 4,2 lần còn chủng FPT31 tăng 3,6 lần so với ban đầu từ 0,84 lên 3,0g/l.
Bảng 3.6 tổng hợp so sánh điều kiện nuôi cấy của hai chủng FPT31 và FMD12 với một
số chủng nấm đã được công bố.
Trang 63
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Bảng 3.6. Điều kiện nuôi cấy của 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 với một số nghiên cứu quốc tế
Điều kiện nuôi cấy
Các sản phẩm lên men
Tên chủng nấm
pH
Tài liệu tham khảo
Nguồn carbon (g/l)
Nguồn nitơ (g/l)
Sinh khối (g/l)
EPS (g/l)
Sản phẩm khác
Nhiệt độ (oC)
Thời gian (ngày)
17 chủng nấm
Peptone 1
0,4 - 9,6
[60]
25
10-15
0,47- 1,52
Dịch chiết khoai tây 200; glucose 24; cao malt 10;
Lactose 50;
15,5
6,9
[103]
30
17
5;
Glucose 50;
2,6
0,5
[69]
28
14
Humphreya coffeata Antrodia cinnamomea Agaricus sp.
3,1
6,0
[85]
25
7 và 14 Glucose 39;
5;
5,2
28
4,91
2,36
[117]
Glucose 10; cao malt 3;
Agaricus brasiliensis 8 chủng nấm
Glucose 20;
7,7- 12,7 1,0- 2,2
[34]
25
8
Peptone 5; cao nấm men 10; Ca(NO3)2 nicotinic axit 1; Peptone 1; cao nấm men 2 Polypeptone cao nấm men 3; (NH4)2SO4 2; cao nấm men 3; Soy peptone 2;
var
Maltose 30;
8,1
3,9
[53]
25
Laetiporus sulphureus miniatus Armilaria mellea
Cao nấm men 4;
4
22
Glucose 40;
6,65
[73]
8
Tremella
28
7 và 14 Glucose 20;
Tryptone 2
6,35-
1,43-
[24]
EPS với đặc tính chống oxy hóa 233,2 mg/l
Trang 64
6,79
1,50
fuciformis Ganoderma lucidum
5,5
30
Glucose 50
Peptone 5; cao nấm men 5;
16,7
0,85
[35]
Cao nấm men 30;
Cordyceps militaris CCRC 32219
4
8
Glucose 40
1,1- 1,5
[116]
15,2- 22,3
Cao nấm men 5
IPS (g/l) 1,19; Ganoderic axit (mg/l) 212,3; Adenosine (mg/l) 50-100; Cordycepin (mg/l) 1024- 1041; IPS (g/l) 0,44
6
23
Glucose 30
6
0,65
[114]
3,5
15
[99]
Glucose 40; cao malt 60;
Peptone 10- 12;
4
[147]
Glucose 50- 70;
0,64- 1,12
0,82- 1,14
16
Maltose 10;
7,06
0,1
[123]
Cordyceps gracilis Ganoderma lucidum Ganoderma lucidum CAU550 Pleurotus ostreatus Phellinus baumii
6,5
28
7
Glucose 34;
2,37
[74]
Peptone 2; cao nấm men 2; Peptone 4; cao nấm men 5. Cao nấm men 1;
6,5
25
4
9,2
2,9
[88]
Morchella esculenta SO-02
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Cao nấm men 3;
5,5
30
12
10,57
3,0
FPT31
KNO3 2;
6,0
30
5
9,24
1,01
Trong nghiên cứu này
FMD12
Laccase (U/l) 7.968 Laccase (U/l) 51.981
3
30
12
NH4Cl 3;
11,29
4,58
Cám 200, glucose 30; Xylose 50, cao malt 5; Glucose 20, cao malt 5; Glucose 50; cao malt 3;
Trang 65
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
3.5. Hàm lượng carbonhydrate và protein của EPS thô thu được từ FPT31 và
FMD12
Trong luận văn này, EPS thô của 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 được tách chiết
từ dịch lên men trong môi trường dịch thể. Phương pháp này có ưu điểm là EPS được
thu nhận sau 10-15 ngày nuôi cấy, chỉ qua bước kết tủa với ethanol ở 4oC trong khi một
số polysaccharide được thu nhận từ quả thể nấm tốn nhiều thời gian, qua nhiều bước
phức tạp để tách chiết và phân đoạn như tủa đường trong ethanol, lặp lại các bước tách
chiết bằng nước nóng và dung dịch ammonium oxalate của NaOH, sau đó các
polysaccharide đã được tách chiết lại trải qua nhiều bước làm sạch để sử dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo. Lượng đường và protein trong EPS thô của 2 chủng FPT31 và
FMD12 được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3. 7. Hàm lượng đường và protein trong EPS thô của FPT31 và FMD12
Các thông số FPT31 FMD12
Hàm lượng EPS thô (mg/g) 2.856 4.581
Hàm lượng carbonhydrat tổng số (mg/g) 365,2 226,4
Hàm lượng đường khử (mg/g) 22,8 55,48
lượng polysaccharide tổng số 342,4 170,9
Hàm (mg/g)
Hàm lượng protein (mg/g) 36,5 20,7
Hàm lượng carbonhydrat tổng số có trong EPS thô (phần kết tủa thu được sau khi
ủ với ethanol) của 2 chủng FPT31 và FMD12 lần lượt là 365,2 và 226,4 mg/g dce- khối
lượng EPS thô đã sấy khô (chiếm 36,5 và 22,6%). Theo công bố của Jaroszuck và đtg
(2014) hàm lượng carbonhydrat tổng số trong exopolysaccharide thô thu được từ dịch
nuôi cấy của Ganoderma applanatum là 303mg/g dce (30,3%) [56]. Trong khi đó hàm
lượng carbonhydrat tổng số thu được trong polysaccharide thô của G. applanatum và G.
lucidum được chiết bằng nước nóng lần lượt là 20 và 30% [63]. Telles và đtg (2011)
cũng đã xác định 22,6% carbonhydrat tổng số trong polysaccharide ngoại bào tự nhiên từ
Trang 66
Pleurotus saijo-caju [125]. Tuy nhiên Cordyceps sinensis có hàm lượng đường tổng từ
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
46- 70% tùy thuộc vào ngày nuôi cấy theo một công bố của Leung và đtg (2009). Trần
Thị Hồng Hà và đtg (2012) đã tách chiết và xác định hàm lượng đường tổng số từ dịch
nuôi cấy và quả thể của nấm Hericium erinaceus (nấm Hầu thủ) ở các phân đoạn chiết
nước nóng, bã, dịch lọc và phần tủa với các giá trị lần lượt là 5,2; 35,8; 56,8 và 33,7% so
với lượng chất rắn chứa polysaccharide thu được [2].
Hàm lượng polysaccharide tổng số trong EPS thô từ FPT31 là 342,4 mg/g dce
chiếm 93,8% lượng carbonhydrat tổng số và từ FMD12 là 170,9 mg/g dce chiếm 75,5%
lượng đường tổng. Cũng theo công bố của Jaroszuck và đtg (2014), hàm lượng
polysaccharide tổng số trong EPS thô của Ganoderma applanatum là 241,8mg/g dce
chiếm 79,8% lượng carbonhydrat xác định được [56]. Kết quả thu được từ FPT31 và
FMD12 cao hơn so với hàm lượng polysaccharide tổng số có mặt trong
exopolysaccharide được chiết bằng nước nóng của G. lucidum (27,6 mg/g), Agaricus
bisporus (74,4mg/g) và Phellinus linteus (62,6mg/g) [63].
Hàm lượng protein chứa trong EPS thô từ 2 chủng FPT31 và FMD12 lần lượt là
36,5 và 20,7 mg/g dce (tương ứng 3,7 và 2,1%). Hàm lượng của các exopolysaccharide
thô thu từ G. applanatum là 22,6 mg/g dce (2,2%); các phân đoạn polysaccharide từ
chủng khác thuộc chi Ganoderma là G. lucidum cũng chứa các protein (khoảng 6,71% )
đặc trưng như các glycopeptide [57]. Các EPS thô được tách từ sợi nấm Cordyceps
sinensis chứa khoảng 65-75% đường và khoảng 25% protein, có thể là các phức hợp
polysaccharide- protein đặc trung của chúng [67]. Cui và Chisti (2003) cũng đã công bố
thêm về các phức chất polysaccharide- peptide từ Coriolus versicolor chứa các peptide
bao gồm chủ yếu là các axit aspartic và glutamic [26].
3.6. Thành phần và cấu trúc EPS của FMD12 và FPT31
Các phổ NMR nhận được đối với EPS của chủng FMD12 cho thấy EPS từ này có
cấu trúc khá đơn giản. Trên phổ 1H và 13C-NMR của mẫu FMD12 thu được (Hình 9a và
b), tại vùng anomeric của phổ 1H (từ 4,9- 5,2 ppm) và 13C (từ 96,5–98,7 ppm) đều xuất
Trang 67
hiện2 pic. Các pic tại 98,7 ppm và 5,3ppm được gán cho vị trí anomeric của α-D-
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
galactose;các píc tại 96,6 và 4,97ppm là của -D-glucose. Các tín hiệu từ 3.6-4.2 ppm
trên phổ 1H và 58 – 80 ppm trên phổ 13C là thuộc về proton và carbon vòng pyranoid.
Dựa vào giá trị tích phân các pic của proton anomeric trên phổ 1H, có thể tính được tỷ lệ
của các đường như sau glucose: galactose ≈ 3:1.
a b
Hình 3.9. Phổ HSQC của EPS sinh từ chủng FMD12
Không đơn giản như EPS của chủng FMD12, các phổ NMR nhận được đối với
EPS của chủng FPT31 cho thấy thành phần đường của EPS này tương đối phức tạp
(Hình 3.10a và b ). Vùng anomeric trên phổ 1H (4,9- 5,3 ppm) và 13C (92,4- 103,6 ppm)
xuất hiện rất nhiều pic. Điều này chứng tỏ EPS của chủng FPT31 được cấu thành từ
nhiều loại đường trong đó có thể dự đoán chiếm tỉ lệ lớn hơn cả là β-glucose (13C/1H
Trang 68
92,5 và 4,99 ppm), α-galactose (13C/1H 96,4 và 5,06 ppm) và α-glucose tại (13C/1H
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
13C là của các proton và carbon trong vòng pyranose. Tuy nhiên, để làm sáng rõ hơn về
103,5ppm và 5,2 ppm). Vùng pic từ 58 – 80 ppm trên phổ 1H và 3,2- 4,6 ppm trên phổ
các loại đường khác có mặt trong EPS của FPT31 thì EPS này cần được tinh chế thêm
hoặc kết hợp với các phương pháp phân tích khác.
a b
Hình 3. 10 Phổ HSQC của EPS sinh từ chủng FPT31
Nhiều polysaccharide từ các nấm khác cũng đã được công bố về thành phần các
đường và cấu trúc của chúng. Các phân tích bằng NMR cho thấy các phân đoạn
polysaccharide chiết từ quả thể của Flamulina velutipes có thành phần và tỉ lệ các đường
đơn khác nhau. Phân đoạn chiết trong KOH 2% PK2 chứa chủ yếu là glucan với thành
phần chính là glucose; phân đoạn chiết trong KOH 21% PK25 chứa 3 thành phần chính
Trang 69
là xylose, mannose và glucose với tỉ lệ % là 18: 32: 50. Phân đoạn chiết bằng DMSO
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
(Xylomannan- XM) gồm 2 loại đường chủ yếu với tỷ lệ mannose: xylose là 3:2. Hai
phân đoạn còn lại là SM1 và SM2 có tỉ lệ % mannose: xylose lần lượt là 9:91 và 3:97
[119]. Cũng dựa trên các kết quả phân tích bằng NMR, các β-glucan không tan từ
Ganoderma lucidum có thành phần chính là α- glucose (44,8%) và 23,8%), ngoài ra còn
có fructose (4,3%) và mannose (4,26%) trong khi chất đối chứng Laminarin (β- glucan
polysaccharide) có thành phần là 42,7% α- glucose và 47% β- glucose [45]. Một nghiên
cứu khác của Sharma và đtg (2015) đã công bố thành phần đường của polysaccharide
của chủng nấm Cordyceps gracilis Durieu & Mont thu từ dịch lên men và được phân
tích bằng HPLC. Kết quả cho thấy thành phần các đường đơn của polysaccharide gồm
glucose (62,15%), xylose (21,14%), rhamnose (36,81%), mannose (14,76%) [114].
3.7. Hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FMD12 và FPT31
Mười ba phân tích CALUX với các dòng tế bào hướng đích cho các chức năng ở
mức độ tế bào để xác định hoạt tính của EPS thô từ 2 chủng nấm FMD12 và FPT31 đã
được thực hiện. Kết quả phân tích sàng lọc được trình bày ở bảng 3.8 cho thấy EPS của
cả 2 chủng này đều có hoạt tính kháng progestagen và hoạt tính đối với Nrf2 (chống oxy
hóa). Mức độ của hoạt tính kháng progestagen của EPS từ 2 chủng FPT31 và FMD12
gần tương đương nhau lần lượt là 9,7 và 12 ng/g sản phẩm nhưng hoạt độ Nrf2 của EPS
từ chủng FMD12 là 350 µg/g sản phẩm, cao hơn gấp 1000 lần so với EPS từ chủng
FPT31 là 310 ng/g sản phẩm. Như vậy, EPS của cả 2 chủng nấm trên đều có tiềm năng
ứng dụng trong sinh sản, cụ thể là có tiềm năng để sản xuất thuốc tránh thai và sản xuất
các thực phẩm chức năng cần đến các chất chống oxy hóa, làm chậm quá trình lão hóa.
Trang 70
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Mẫu
Hoạt tính
Khả năng ứng dụng
Loại CALUX
Chỉ tiêu chức năng tế bào
Hoạt độ (ng hay µg/g sản phẩm)
Cyt- CALUX
Gây độc tế bào
ER- CALUX ag
Tính estrogen
ER- CALUX anta
Tính kháng estrogen
AR- CALUX ag
Tính androgen
AR- CALUX anta
Tính kháng androgen
GR- CALUX ag
Hoạt tính glucocorticoid
GR- CALUX anta
Hoạt tính kháng glucocorticoid
PR- CALUX ag
Hoạt tính progestin
Trong sinh sản
PR- CALUX anta
Hoạt tính kháng progestin
PPARalfa CALUX
Hoạt tính PPAR anpha
Nrf2- CALUX
Hoạt tính Nrf2
P53- CALUX-S9
Tiêu diệt khối u
P53- CALUX+S9
Tiêu diệt khối u sau trao đổi chất trong tế bào
FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12 FPT31 FMD12
Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có Có Có Không có Không có Có Có Không có Không có Không có Không có
9,7 ng/g 12 ng/g 310 ng/g 350 µg/g
Chống oxy hóa trong quá trình lão hóa
Bảng 3.8 Kết quả sàng lọc hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 bằng CALUX
Trang 71
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ các nghiên cứu được trình bày trong luận văn chúng tôi rút ra các kết luận sau
đây:
1. Đã sàng lọc 12 chủng nấm, trong đó có 12 chủng nấm sinh exopolysaccharide từ 0,15 g/l đến 3,24 g/l; 8 chủng tổng hợp enzyme laccase với hoạt tính từ 12 đến
2. Mười chủng nấm đảm đã được phân loại, 6 chủng thuộc chi Ganoderma, 4 chủng
7.923 U/l; 6 chủng vừa sinh EPS tốt vừa tổng hợp laccase;
còn lại thuộc các chi Trametes, Earliella, Inonotus, Panus. Trình tự vùng ITS1-
5,8S-ITS2 của các chủng nấm đã được đăng ký trên GenBank;
3. Dịch nuôi cấy của Earliella sp. FPT31 ức chế yếu sự sinh trưởng của 2 vi khuẩn
kiểm định là B. cereus và M. luteus;
4. Dịch nuôi cấy của Ganoderma sp. FPT31có khả năng ức chế sự sinh trưởng của 2 vi khuẩn kiểm định là Bacillus cereus và Micrococus luteus với đường kính vòng
ức chế lần lượt là 12 mm và 16 mm; Ở các độ pha loãng và thời gian thí nghiệm khác nhau, dịch nuôi của FMD12 ức chế từ 35,42% đến 81,58% sự sinh trưởng của
2 vi khuẩn kiểm định;
5. Chủng FPT31 sinh tổng hợp EPS tốt nhất ở pH 5,5; 50 g/l xylose, 5 g/l cao malt; 3 g/l cao nấm men sau 12 ngày nuôi cấy với sinh khối là 10,57 g/l, lượng EPS thu
được là 3,0 g/l và hoạt tính enzyme laccase là 7.968 U/l. Chủng FPT31 sinh laccase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện pH 6; 20 g/l glucose, 5 g/l cao malt; 2 g/l KNO3 sau 5 ngày nuôi cấy với sinh khối là 9,24 g/l, lượng EPS thu được là 1,01 g/l và
hoạt tính enzyme laccase là 51.981U/l;
6. Chủng FMD12 sinh tổng hợp EPS tốt nhất ở pH 3; 50 g/l glucose, 5 g/l cao malt; 3 g/l NH4Cl sau 12 ngày nuôi cấy với sinh khối là 11,29 g/l, lượng EPS thu được là
4,58 g/l;
7. EPS thô của chủng FPT31 có hàm lượng carbonhydrat tổng số là 365,2 mg/g; hàm lượng đường khử 22,8 mg/g và hàm lượng protein là 36,5 mg/g. EPS thô của chủng FMD12 có các giá trị trên lần lượt là 226,4 mg/g; 55,48 mg/g và 20,7 mg/g.
8. EPS của chủng FPT31 có cấu trúc tương đối phức tạp trong đó có 3 thành phần đường chính là β-glucose, α-galactose, α-glucose. EPS từ chủng FMD12 có cấu
Trang 72
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
trúc đơn giản hơn chỉ gồm 2 loại đường chính là α-D-galactose và β-D-glucose với
tỉ lệ glucose: galactose ≈ 3:1.
9. EPS của cả 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 đều có hoạt tính in vitro kháng progestagen với hoạt độ lần lượt là 9,7 và 12 ng/g sản phẩm.; hoạt tính Nrf2 với
hoạt độ là 310 ng/g sản phẩm và 350 µg/g sản phẩm.
4.2. Kiến nghị
1. Tiếp tục nghiên cứu các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp cả EPS và enzyme laccase như Trametes sp. FPT24 và Panus sp. FBD167.
2. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc của các polysaccharide như sự có mặt của các nhánh và các liên kết v.v.
3. Định hướng ứng dụng 2 chủng nấm FPT31 và FMD12.
Trang 73
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ngô Anh, Trần Đình Hùng, Nguyễn Thị Đoan Trang, Nguyễn Thị Bảo Trang, 2008. Nghiên cứu về sự đa dạng về giá trị tài nguyên của khu hệ nấm lớn ở Thừa Thiên Huế và
công nghệ nuôi trồng nấm dược liệu. Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 48.
2. Trần Thị Hồng Hà, Lê Hữu Cường, Trần Thị Như Hằng, Lưu Văn Chính, Lê Mai Hương, 2012. Phân lập các polisccarit từ nấm Hầu thủ lên men dịch thể và đánh giá hoạt tính
kháng u của chúng. Tạp chí Khoa học cà Công nghệ, 50(3):327-334.
3. Trần Thị Thu Hiền, Hoàng Thị Nhung, Nguyễn Hải Vân, Nguyễn Thị Lan Anh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà, 2013. Nghiên cứu phân lập và ảnh hưởng của một số điều
kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp laccase bởi chủng nấm thu thập từ rơm mục
Ninh Bình. Tạp chí Công nghệ sinh học, 11(2):265-274.
4. Nguyễn Thị Đức Huệ, 2000. Góp phần nghiên cứu nấm lớn ở một số địa điểm trong tỉnh
Tây Ninh. Luận văn Thạc sỹ khoa học, trường Đại học Khoa học Huế.
5. Trần Văn Mão, 1984. Góp phần nghiên cứu thành phần loài và đặc điểm sinh học của một số loài nấm lớn phá hoại gôc vùng Thanh- Nghệ- Tĩnh. Luận án tiến sỹ sinh học, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội.
6. Hoàng Thị Nhung, Nguyễn Quang Huy, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà, 2012. Sàng lọc chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase và phân hủy các hợp chất
hữu cơ đa vòng thơm, loại màu thuốc nhuộm. Tạp chí Công nghệ sinh học, (3).
7. Nguyễn Phương Thảo, Lưu Hồng Trường, Vương Đức Hòa, Võ Huy Sang, 2013. Ghi nhận ban đầu về thành phần loài nấm lớn tại Vườn Quốc gia Bù gia Mập, tỉnh Bình
Phước. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5.
8. Almeida S.M., Umeo S.H., Marcante R.C., Yokota M.E., et al., 2015. Iron bioaccumulation in mycelium of Pleurotus ostreatus. Braz. J. Microbiol. 46: 195-200. 9. Bao X.F., Fang J.N., Li X.Y, 2001. Structural characterization and immunomodulating activity of a complex glucan from spores of Ganoderma lucidum. Biosci Biotechnol Biochem, 65:2384–2391.
10. Baratta M.T., Dorman H.J.D., Deans S.G., Figueiredo A.C., Barroso J.G., Ruberto G., 1998. Antimicrobial and antioxidant properties of some commercial essential oils. Flav. Frag. J. 13: 235- 244.
11. Barros L., Cruz T., Baptista P., Estevinho L.M., Ferreira I.C.F.R., 2008. Wild and commercial mushrooms as source of nutrients and nutraceuticals. Food ChemToxicol, 46: 2742–2747.
Trang 74
12. Beattie K.D., Rouf R., Gander L., May T.W., Ratkowsky D., Donner C.D, Gill M., Grice I.D., Tiralongo E., 2010. Antibacterial metabolites from Australian macrofungi from the genus Cortinarius. Phytochemistry, 71: 948–955.
13. Bernardo, D. Mendoza C.G., Calonje M., Novaes-Ledieu M., 1999. Chemical analysis of
the lamella walls of Agaricus bisporus fruit bodies. Curr. Microbiol, 38, 364–367.
14. Blakeney A.B., Harris P.J., Henry R.J., Stone B.A.. 1983. A simple and rapid preparation
of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydr Res 113:291–299.
15. Boh B., Berivic M., 2007. Grifola frondosa (Diks.:Fr.) S.F. Gray (Maitake mushroom): Medicinal properties, active compounds, and biotechnological cultivation. Int J Med Mushrooms, 9:89‑108.
16. Bohn, J. A. and J. N. BeMiller. 1995. (1→3)-beta-d-glucans as biological response modifiers: A review of structure–functional activity relationships. Carbohydr Polym
28:3–14.
17. Carbonero E.R., Gracher A.H.P., Komura D.L., Marcon R., Freitas C.S., Baggio C.H., Lentinus edodes
Santos A.R.S., Torri G., Gorin P.A.J., Iacomini M., 2008.
heterogalactan: Antinociceptive and anti-inflammatory effects. Food Chem, 111:531–537. 18. Chang S.T, Wasser S.P., 2012. The role of culinary‑medicinal mushrooms on human
welfare with a pyramid model for human health. Int J Med Mushrooms ;1:95‑134.
19. Chen G., Luo Y.C., Ji B.P. et al., 2011. Hypocholesterolemic effects of Auricularia auricula ethanol extract in ICR mice fed a cholesterol-enriched diet. J Food Sci Technol,
48:692–698.
20. Chen M.L., Hsieh C.C., Chiang B.L., Lin B.L., 2015. Triterpenoids and Polysaccharide Fractions of Ganoderma tsugae Exert Different Effects on Antiallergic Activities. Evid
Complement
Alternat Med. Article
ID
754836,
10
pages
Based http://dx.doi.org/10.1155/2015/754836.
21. Chen Y., Gu X., Huang S.-Q., 2010. Optimization of ultrasonic/microwave assisted extraction (UMAE) of polysaccharides from Inonotus obliquus and evaluation of its anti-
tumor activities. Int J Biol Macromol, 46:429–435.
22. Chen Y., Xie M. Y., Nie S. P., Li C., Wang Y. X., 2008. Purification, composition analysis and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of Ganoderma atrum. Food Chem, 107:231–241.
23. Cheung P.C.K., 1996. The hypocholesterolemic effect of extracellular polysaccharide
from the submerged fermentation of mushroom. Nutr Res, 16:1953–1957.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 75
24. Cho E.J., Oh J.I., Chang H.Y., Yun J.W., 2006. Production of exopolysaccharides by fuciformis. Journal of
submerged mycelialculture of a mushroom Tremella Biotechnology 127: 129–140.
25. Chou W.T., Sheih I. C., and Fang T. J., 2013. Various mushroom wastes as prebiotics in
different systems. J Food Sci, 78:M1041–M1048.
26. Cui J and Y. Chisti, 2003. Polysaccharopeptides of Coriolus versicolor: physiological activity, uses, and production. Biotechnology Advances, vol. 21, no. 2, pp. 109–122. 27. De Silva D.D., Rapior S., Sudarman E., Stadler M., Xu J., Alias S.A.,2013. Bioactive metabolites from macrofungi: Ethnopharmacology, biological activities and chemistry. Fungal Divers, 62:1‑40
28. Desai S.S., Nityanand C., 2011. Microbial Laccase and their application. Asian Journal
of Biotechnology, 3 (2): 98-124
29. Dong J.Z., Wang Z.C., Wang Y., 2011. Rapid extraction of polysaccharides from fruits
of Lycium barbarum L. J Food Biochem, 35:1047–1057.
30. Drozdowski L. A., Reimer R. A., Temelli F. et al., 2010. Beta-glucan extracts inhibit the in vitro intestinal uptake of long-chain fatty acids and cholesterol and down-regulate genes involved in lipogenesis and lipid transport in rats. J Nutr Biochem, 21:695–701. 31. DuBois K. A., Gilles J. K., Hamilton., Rebers P. A., Smith F., 1956. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances, Anal. Chem. 28 (3): 350–
356.
32. Eggert C., Temp U., Ericksson K. E., 1996. The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase. Applied
Environment of Microbiology, 602: 1151-1158.
33. Elisashvili V., 2012. Submerged cultivation of medicinal mushrooms: bioprocesses and
products (review). Int. J. Med. Mushrooms 14: 211-239.
34. Elisashvili V., Kachlishvili E., Wasser S., 2009. Carbon and nitrogen source effects on Basidiomycetes exopolysaccharide production. Appl Biochem Microbiol, 45:531–35. 35. Fang Q.H., Zhong J.J., 2002. Submerged fermentation of higher fungus Ganoderma lucidumfor production of valuable bioactive metabolites—ganoderic acid and polysaccharide. Biochemical Engineering Journal 10: 61–65.
36. Ferreira I.C., Heleno S.A.,
Reis F.S., Stojkovic D., Queiroz M.J., Vasconcelos M.H., Sokovic M., 2015. Chemical features of Ganoderma polysaccharides with antioxidant, antitumor and antimicrobial activities. Phytochemistry Jun, 114:38-55
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 76
37. Fu Y.J., Liu W., Zu Y.G., 2009. Breaking the spores of the fungus Ganoderma lucidum
by supercritical CO2. Food Chem, 112:71–76.
38. Fuchs FD., 2004. Princípios Gerais do Uso de Antimicrobianos. In: Fuchs F, Wannamacher L, Ferreira M, editors. Farmacologia Clínica – Fundamentos da
terapêutica Racional. 3ª ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan; p. 342.
39. Gao Y., Tang W., Gao H., Chan E., Lan J., Li X., Zhou S., 2005. Antimicrobial activity
of the medicinal mushroom Ganoderma. Food Rev Int, 21: 211-229.
40. Giavasis I. and Biliaderis C., 2006. Microbial polysaccharides. In Functional Food Carbohydrates, ed. C. Biliaderis, and M. Izydorczyk, pp. 167–214. Boca Raton: CRC Press.
41. Glen M., Bougher N.L., Francis A.A., Nigg S.Q., Lee S.S., Irianto R., Barry K.M., Beadle C.L., Mohammed C.L., 2009. Ganoderma and Amauroderma species associated
with root-rot disease of Acacia mangium plantation trees in Indonesia and Malaysia. Australasian Plant Pathology, 38:345–356.
42. Gordon M., Guralnik M., Kaneko Y. et al., 1995. A phase II controlled study of a com- bination of the immune modulator, lentinan, with didanosine (DDI) in HIV patients with CD4 cells of 200–500/mm(3). J Med, 26:193–207.
43. Guaerra G., Dominguez O., Leal M.R., Manzano A.M., Sanchez M.I., Hernandez I., Palacios I., Arguelles J., 2008. Production of laccase and manganes peroxidase by white-
rot fungi from sugarcane bagasse in soild bed: use for dye decolourization. Sugar Tech, 10(3): 260-264.
44. Hama S.S., Kima S.H., Moon S.Y., Chung M.J., Cui C.B., Han E.K., Chung C.K., Cho M., 2009. Antimutagenic effects of subfractions of Chaga mushroom (Inonotus obliquus) extract. Mutation Research 672 (2009) 55–59.
45. Han M.D., Han Y.S., Hyun S.H., Shin H.W., 2008. Solubilization of water-insoluble b- glucan isolated from Ganoderma lucidum Journal of Environmental Biology, 29(2): 237- 242.
46. Hawksworth D.L., 2012. Global species number of fungi: Are tropical studies and molecular approaches contributing to a more robust estimate. Biodivers Conserv, 21:242- 33.
47. Heleno S. A., Barros L., Martins A., Queiroz M. J. R. P., Santos-Buelga C., and Ferreira I. C. F. R., 2012. Fruiting body, spores and in vitro produced mycelium of Ganoderma
lucidum from Northeast Portugal: A comparative study of the antioxidant potential of phenolic and polysaccharidic extracts. Food Res Int, 46:135–140.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 77
48. Hobbs C., 2004. Medicinal value of Turkey Tail fungus Trametes versicolor (L.:Fr.) Pilát
(Aphyllophoromycetideae). Int J Med Mushrooms, 6:195‑218.
49. Holliday H., Cleaver M., 2008. Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes). A review. Int J Med Mushrooms, 10:209‑18.
50. Hsieh P.W., Wu J.B., Wu Y.C., 2013. Chemistry and biology of Phellinus linteus.
BioMed, 3:106‑13.
51. Hu Q., Wang H., and Ng T. B., 2012. Isolation and purification of polysaccharides with anti-tumor activity from Pholiota adiposa (Batsch) P. Kumm. (higher basidiomycetes). Int J Med Mushrooms, 14:271–284.
52. Hur J.M., Yang C.H., Han S.H., Lee S.H., You Y.O., Park J.C., Kim K.J., 2004. Antibacterial effect of Phellinus linteus against methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. Fitoterapia, 75: 603– 605.
53. Hwang H.S., Lee S.H., Baek Y.M., Kim S.W., Jeong Y.K., Yun J.W., 2008. Production of extracellular polysaccharides by submerged mycelial culture of Laetiporus sulphureus
var. miniatus and their insulinotropic properties. Appl Microbiol Biotechnol, 78:419–29. 54. Hyde K.D., Bahkali A.H., Moslem M.A., 2010. Fungi‑ an unusual source for cosmetics.
Fungal Divers, 43:1‑9.
55. Ishikawa N.K., Fukushi Y., Yamaji K., Tahara S., Takahashi K., 2001. Antimicrobial Cuparene-type sesquiterpenes, Enokipodins C and D, from a mycelial culture of
Flammulina velutipes. J Nat Prod, 64: 932-934.
56. Jaroszuk M.S., Jaszek M, Dudka M.M., Blachowicz A., Rejczak T.P., Janusz G., Wydrych J., Polak J., Wilkolazka A.Z., Szerszen M.K., 2014. Exopolysaccharide from Ganoderma applanatum as a Promising Bioactive Compound with Cytostatic and
Antibacterial Properties. BioMed Research International, Article ID 743812, 10 pages. 57. Jia J., Zhang X., Hu Y. et al., 2009. Evaluation of in vivo antioxidant activities of Ganoderma lucidum polysaccharides in STZdiabetic rats. Food Chemistry, 115(1): 32–
36.
58. Jiangwei M., Zengyong Q., Xia X., 2011. Optimisation of extraction procedure for black fungus polysaccharides and effect of the polysaccharides on blood lipid and myocardium antioxidant enzymes activities. Carbohydr Polym, 84:1061–1068.
59. Kalyoncu F., Oskay M., Saǧlam H., Erdoǧan T.F., Tamer A.Ü, 2010. Antimicrobial and antioxidant activities of mycelia of 10 wild mushroom species. J Med Food, 13: 415-419.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 78
60. Kim S.W., Hwang H.J., Park J.P., Cho Y.J., Song C.H., Yun J.W., 2002. Mycelial growth and exo-biopolymer production by submerged culture of various edible mushrooms under different media. Lett Appl Microbiol, 34:56–61.
61. Klupp N.L., Chang D., Hawke F., Kiat H., Cao H., Grant S.J., Bensoussan A., 2015. Ganoderma lucidum mushroom for the treatment of cardiovascular risk factors (Review)
The Cochrane Collaboration and published in The Cochrane Library, Issue 2
62. Koh J.H., Kim J.M., Chang U.J., and Suh H.J., 2003. Hypocholesterolemic effect of hot-
water extract from mycelia of Cordyceps sinensis. Biol Pharm Bull, 26:84–87.
63. Kozarski M., Klaus A., Niksic M., Jakovljevic D., Helsper J. P. F. G., and van Griensven L. J. L. D., 2011. Antioxidative and immunomodulating activities of polysaccharide
extracts of the medicinal mushrooms Agaricus bisporus, Agaricus brasiliensis,
Ganoderma lucidum and Phellinus linteus. Food Chem, 129:1667–1675.
64. Lachter J., Yampolsky Y., Gafni‑Schieber R., Wasser S.P., 2012. Yellow Brain Culinary
‑ Medicinal Mushroom, Tremella mesenterica Ritz.:Fr. (Higher Basidiomycetes), is
subjectively but not objectively effective for eradication of Helicobacter pylori; a prospective controlled trial. Int J Med Mushrooms, 14:55‑63.
65. Lakhanpal T. N. and Rana M., 2005. Medicinal and nutraceutical genetic resources of
mushrooms. Plant Genet Resource, 3:288–303.
66. Lee K.H., Cho C.H., and Rhee K.H., 2011. Synergic anti-tumor activity of gamma- irradiated exo-polysaccharide from submerged culture of Grifola frondosa. J Med Plants
Res, 5:2378–2386.
67. Leung P. H., Zhao S., Ho K. P., and Wu J. Y., 2009. Chemical properties and antioxidant activity of exopolysaccharides from mycelial culture of Cordyceps sinensis fungus Cs-
HK1. Food Chemistry, 114( 4), 1251–1256.
68. Liew G.M, Khong H.Y, Kutoi C.J., 2015. Phytochemical Screening, Antimicrobial and Antioxidant Activities of Selected Fungi from Mount Singai, Sarawak, Malaysia. International Journal of Research Studies in Biosciences, 3(1):191-197.
69. Lin E.S., Sung S.C., 2006. Cultivating conditions
influence exopolysaccharide production by the edible basidiomycete Antrodia cinnamomea in submerged culture. Int J Food Microbiol, 108:182–87.
70. Lindequist U., Niedermeyer T. H., and Jülich W. D., 2005. The pharmacological poten-
tial of mushrooms. Evid Based Complement Altern Med, 2:285–299.
71. Lo T.C.T., Hsu F.M., Chang C.A., Cheng J.C.H., 2011. Branched alpha-(1,4) glucans from Lentinula edodes (L10) in combination with radiation enhance cytotoxic effect on
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 79
human lung adenocarcinoma through the toll-like receptor 4 mediated induction of THP-
1 differentiation/activation. J Agric Food Chem, 59:11997–12005.
72. Lundqvist L., 2015. Structural and Interaction Studies of Polysaccharides by NMR Spectroscopy. Doctoral Thesis, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala. 73. Lung M.Y., Hsieh C.W., 2011. Antioxidant property and production of exopolysaccharide from Armillaria mellea in submerged cultures: effect of culture aeration rate. Eng Life Sci, 11:482–90.
74. Luo J., Liu J., Ke C., Qiao D., Ye H., Sun Y., Zeng X., 2009. Optimization of medium composition for the production of exopolysaccharides from Phellinus baumii Pilát in immuno-stimulating activity of exopolysaccharides. submerged culture and
the
Carbohydrate Polymers, 78:409–415.
75. Luo Y., Chen G., Li B., Ji B., Guo Y., and Tian F., 2009. Evaluation of antioxidative and hypolipidemic properties of a novel functional diet formulation of Auricularia auricula and Hawthorn. Innov Food Sci Emerg Technol, 10:215–221.
76. Ma L., Chen H., Dong P., Lu P., 2013. Anti-inflammatory and anticancer activities of extracts and compounds from the mushroom Inonotus obliquus. Food Chemistry 139:503–508.
77. Ma L., Chen H., Zhu W., Wang Z., 2013. Effect of different drying methods on physicochemical properties and antioxidant activities of polysaccharides extracted from
mushroom Inonotus obliquus. Food Research International 50: 633–640
78. Mahajna J., Dotan N., Zaidman B.Z., Petrova R.D., Wasser S.P., 2010. Pharmacological values of medicinal mushrooms for prostate cancer therapy: The case of Ganoderma lucidum. Nutr Cancer, 61:16‑26.
79. Malinowska E., Krzyczkowski W., Herolda F. et al., 2009. Biosynthesis of selenium- containing polysaccharides with antioxidant activity in liquid culture of Hericium
erinaceum. Enzyme Microb Technol, 44:334–343.
80. Mandal S., Maity K.K., Bhunia S.K., Dey B., Patra S., Sikdar S.R., Islam S.S., 2010. Chemical analysis of new water-soluble (1→6)-, (1→4)-α, β-glucan and water-insoluble (1→3)-, (1→4)-β-glucan (calocyban) from alkaline extract of an edible mushroom, Calocybe indica (Dudh Chattu). Carbohydr. Res, 345:2657–2663.
81. Markova N., Kussovski V., Radoucheva T., Dilova K., and Georgieva N., 2002. Effects of intraperitoneal and intranasal application of Lentinan on cellular response in rats, Int Immunopharm, 2:1641–1645.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 80
82. Maruyama H., Ikekawa T., 2007. Immunomodulation and antitumor activity of a mushroom product, proflamin, isolated from Flammulina velutipes (W.Curt.:Fr.) Singer (Agaricomycetideae). Int J Med Mushrooms, 9:109‑22.
83. Matsuzawa T., 2006. Studies on antioxidant effects of culinary‑medicinal bunashimeji
mushroom Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigel. (Agaricomycetidae). Int J Med Mushrooms, 8:245‑50.
84. Mau J.L., Chang C. N., Huang S. J., and Chen C. C., 2004. Antioxidant properties of methanolic extracts from Grifola frondosa, Morchella esculenta and Termitomyces albuminosus mycelia. Food Chem, 87:111–118.
85. Maziero R., Cavazzoni V., Bononi V.L.R., 1999. Screening of basidiomycetes for the production of exopolysaccharide and biomass in submerged culture. Revista de
Microbiologia, 30:77–84.
86. McGowan J.E.J., 2001. Economic.Impact of antimicrobial resistance. Emerg. Infect.
Diseases, 7: 286-292.
87. McIntosh M., Stone B.A., Stanisich V.A., 2005. Curdlan and other bacterial (1 → 3)-
beta-d-glucans. Appl Microbiol Biotechnol, 68:163–173.
88. Meng F., Liu X., Jia L., Song Z., Deng P., Fan K., 2010. Optimization for the production of exopolysaccharides from Morchella esculenta SO-02 in submerged culture and its
antioxidant activities in vitro Carbohydrate Polymers 79 (2010) 700–704 by a fungal strain belonging to Ganoderma lucidum complex. Bioresource Technology. 101:1941–
1946.
89. Mensink, R. P., A. Aro, E. Den Hond et al. 2003. PASSCLAIM—Diet-related cardiovas-
cular disease. Eur J Nutr, 42:6–27
90. Miyazawa N., Okazaki M., and Ohga S., 2008. Antihypertensive effect of Pleurotus
nebrodensis on spontaneously hypertensive rats. J Oleo Sci, 57:675–681.
91. Mizuno T., Zhuang C., Abe K., Okamoto H., Kiho T., Ukai S., et al., 1999. Antitumor and hypoglycemic activities of polysaccharides from the sclerotia and mycelia of
Inonotus obliquus (Pers.:Fr.) Pil. (Aphyllophoromycetideae). Int J Med Mushrooms, 1:301‑16.
92. Mohan K., Padmanaban M., Uthayakumar V., 2015. Isolation, structural characterization and antioxidant activities of polysaccharide from Ganoderma lucidum. American Journal
of Biology and Life Sciences, 3(5): 168-175.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 81
93. Mothana R.A.A., Jansen R., Jülich W.D, Lindequist U., 2000. Ganomycins A and B, new antimicrobial Farnesyl hydroquinones from the Basidiomycete Ganoderma pfeifferi. J Nat Prod, 63: 416-418.
94. Muller A., Ensley H., Pretus H., 1997. The application of various protic acids in the extraction of (1 → 3)-beta-d-glucan from Saccharomyces cerevisiae. Carbohydr Res,
299:203–208.
95. Muralikrishna G, Rao M., 2007. Cereal non-cellulosic polysaccharides: Structure and
function relationship—An overview. Crit Rev Food Sci Nutr, 47:599–610.
96. Ozen T., Darcan C., Aktop O., Turkekul I., 2011. Screening of antioxidant, antimicrobial activities and chemical contents of edible mushrooms wildly grown in the Black Sea
region of Turkey. Comb Chem High Throughput Screen , 14: 72-84.
97. Öztürk M., Duru M.E., Kivrak S., Mercan-Doǧan N., Türkoglu A., Özler M.A., 2011. In vitro antioxidant, anticholinesterase and antimicrobial activity studies on three Agaricus species with fatty acid compositions and iron contents: A comparative study on the three
most edible mushrooms. Food Chem Toxicol, 49: 1353-1360.
98. Pannu J.S., Kapoor R.K., 2014. Microbial laccases: a mini-review on their production, purification and applications. International Journal of Pharmaceutical Archive, 3(12):
528-536.
99. Papinutti L., 2010. Effects of nutrients, pH and water potential on exopolysaccharides
production. Bioresource Technology, 101, 1941–1946.
100. Peng T.Y., don M.M., 2013. Antifungal Activity of In-vitro Grown Earliella Scabrosa, a Malaysian Fungus on Selected Wood-degrading Fungi of Rubberwood. Journal of
Physical Science, 24(2), 21–33.
101. Peres-Bota D., Rodriguez H., Dimopoulos G., DaRos A., Mélot C., Struelens M.J., Vincent J.L., 2003. Are infections due to resistant pathogens associated with a worse outcome in critically ill patients? J Infect , 47: 307-316.
102. Pittet D., 2005. Infection control and quality heath care in the new millennium. Am J
Infect Control, 33: 258-267.
103. Porras-Arboleda S.M., Valdez-Cruz N.A., Rojano B., Aguilar C., Rocha-Zavaleta L., Trujillo-Roldán M.A., 2009. Mycelial submerged culture of new medicinal mushroom, Humphreya coffeata (Berk.) Stey. (Aphyllophoromycetideae) for the production of valuable bioactive metabolites with cytotoxicity, genotoxicity, and antioxidant activity.
Int J Med Mushr, 11:335–50.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 82
104. Quang D.N., Nga T.T., Tham L.X., 2011. Chemical composition of Vietnamese Black Lingzhi Amauroderma subresinosum Murr. Research Journal of Phytochemistry, 5(4): 216-221.
105. Quereshi S., Pandey A.K., Sandhu S.S., 2010. Evaluation of antibacterial activity of
different Ganoderma lucidum extracts. J Sci Res, 3: 9-13.
106. Rakib M.R.M., Bong C.F.J., Khairulmazmi A.,, Idris A.S., 2014. Genetic and Morphological Diversity of Ganoderma Species Isolatedfrom Infected Oil Palms (Elaeis guineensis). Int. J. Agric. Biol., 16: 691_699.
107. Reshetnikov S.V., Wasser S.P., Tan K.K., 2001. Higher Basidiomycota as source of antitumor and immunostimulating polysaccharides. Int J Med Mushrooms, 3:361‑94.
108. Rincao V.P., Yamamoto K.A., Pontes Silva Ricardo N.M. et al., 2012. Polysaccharide and extracts from Lentinula edodes: Structural features and antiviral activity. Virol J, 9
(37):1–6.
109. Ru Q.M., Zhang L.R., Chen J.D., Pei Z.M., Zheng H.L., 2009. Microwave-assisted extraction and identification of polysaccharide from Lycoris aurea. Chem Nat Compd,
45:474–477.
110. Saltarelli R., Ceccaroli P., Iotti M. et al., 2009. Biochemical characterisation and antioxi- dant activity of mycelium of Ganoderma lucidum from Central Italy. Food Chem,
116:143–151.
111. Santos M.P, Marcante R.C, Santana T.T, Tanaka H.S, et al., 2015. Oyster culinary- medicinal mushroom, Pleurotus ostreatus (Higher Basidiomycetes), growth in grain-
based diet improves broiler chicken production. Int. J. Med. Mushrooms, 17: 169-178 112. Santoyo S., Plaza M., Jaime L., 2010. Pressurized liquid extraction as an alternative process to obtain antiviral agents from the edible microalga Chlorella vulgaris. J Agric
Food Chem, 58:8522–8527.
113. Sharma A., Patel V.K., Rawat S., Ranteke P., Verma R., 2010. Identification of the antibacterial components of some Indian medicinal plants against Klebsiellapneumoniae. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2(3): 123-127.
114. Sharma S.K., Gautam N., Atri N.S., 2015. Optimization, Composition, and Antioxidant Activities of Exo- and Intracellular Polysaccharides in Submerged Culture of Cordyceps gracilis (Grev.) Durieu & Mont. Evid Based Complement Alternat Med. Article ID 462864, 8 pages.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 83
115. Sheena N., Ajith T.A., Mathew A.T., Janardhanan K.K., 2003. Antibacterial activity of three macrofungi, Ganoderma lucidum, Navesporus floccosa and Phellinus rimosus occurring in South India. Pharm Biol, 41: 564–567.
116. Shih I.L., Tsai K.L., Hsieh C., 2007. Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris
Biochemical Engineering Journal, 33: 193–201.
117. Shu C.H., Xu C.J., 2007. Medium Optimization
for Producing Bioactive Exopolysaccharides by Agaricus brasiliensis S. Wasser et al. (=A. blazei Murrill ss.
Heinem) in Submerged Culture Food Technol. Biotechnol, 45 (3): 327–333.
118. Smania A., Monache F.D., Smânia E.F.A., Gil M.L., Benchetrit L.C., Cruz F.S., 1995. Antibacterial activity of a substance produced by the fungus Pycnoporus sanguineus (Fr.)
Murr. J Ethnopharmacol, 45: 177-181. 25.
119. Smiderle F.R., Carbonero E.R., Mellinger C.G., Sassaki G.L., Gorin P.A.J., Iacomini M., 2006. Structural characterization of a polysaccharide and a b-glucan isolated from the
edible mushroom Flammulina velutipe. Phytochemistry, 67: 2189–2196
120. Smiderle F.R., Carbonero E.R., Sassaki G.L., Gorin P.A.J., Iacomini M., 2008. Characterization of a heterogalactan: Some nutritional values of the edible mushroom
Flammulina velutipes. Food Chem, 108:329–333.
121. Song J.F., Li D.J., Liu C.Q., 2009. Response surface analysis of microwave-assisted extraction of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris. J Chem Technol Biotechno,l 84:1669–1673
122. Storsley J.M., Izydorczyk M.S., You S., Biliaderis C.G., Rossnagel B., 2003. Structure and physicochemical properties of beta-glucans and arabinoxylans isolated from hull-less barley. Food Hydrocolloids, 17:831–844
123. Synytsya A., Mickova K., Jablonsky I., Spevacek J., Erban V., Kovarikova, E., Copikova J., 2009. Glucans from fruit bodies of cultivated mushrooms Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii: Structure and potential prebiotic activity. Carbohydr. Polym, 76:548– 556.
124. Tao Y., Zhang L., 2006. Determination of molecular size and shape of hyperbranched
polysaccharide in solution. Biopolymers, 83:414–423.
125. Telles C. B. S., Sabry D. A., Almeida-Lima J., 2011. Sulfation of the extracellular polysaccharide produced by the edible mushroom Pleurotus sajor-caju alters its
antioxidant, anticoagulant and antiproliferative properties in vitro. Carbohydrate Polymers, 85(3):514–521.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 84
126. Tian Y., Zeng H., Xu Z., 2012. Ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of polysaccharides recovered from white button mushroom (Agaricus bisporus). Carbohydr Polym, 88:522–529.
127. Tseng Y.H., Yang J.H., and Mau J.L., 2008. Antioxidant properties of polysaccharides
from Ganoderma tsugae. Food Chem, 107:732–738.
128. Umeo S.H., Souza G.P.N., Rapachi P.M., Garcia D.M., Paccola-Meirelles L.D., Valle J.S., Colauto N.B. and Linde G.A., 2015. Screening of basidiomycetes in submerged cultivation based on antioxidant activity. Genetics and Molecular Research 14 (3): 9907-
9914.
129. Van Griensven L.J., 2009. Culinary‑medicinal mushrooms: Must action be taken. Int J
Med Mushrooms, 11:281‑6.
130. Wang G., Dong L., Zhang Y. et al., 2012. Polysaccharides from Phellinus linteus inhibit cell growth and invasion and induce apoptosis in HepG2 human hepatocellular
carcinoma cells. Biologia, 67:247–254.
131. Wang H.X., NG, T.B., 2004. A novel laccase with fair thermostability from the edible wild mushroom (Albatrella dispansus). Biochemical Biophysics Res Communication, 315: 450-454.
132. Wang J., Zhang L., Yu Y., Cheung P. C. K., 2009a. Enhancement of antitumor activities in sulfated and carboxymethylated polysaccharides of Ganoderma lucidum. J Agric Food Chem, 57:10565–10572.
133. Wasser S.P., 2010. Medicinal mushroom science: History, current status, future trends,
and unsolved problems. Int J Med Mushrooms, 12:1‑16.
134. Wasser S.P., 2014. Enhancement of exo-polysaccharide production and antioxidant activity in submerged cultures of Inonotus obliquus by lignocellulose decomposition. J Ind Microbiol Biotechnol., 38(2):291-298.
135. Wasser S.P., 2014. Medicinal Mushroom Science: Current Perspectives, Advances,
Evidences, and Challenges. Biomedical Journal, 37:345-356.
136. Wasser S.P., Didukh M.Y., Amazonas M.A., Nevo E., Stamets P., Eira A.F., 2002. Is widely cultivated culinary ‑ medicinal Royal Sun Agaricus (the Himematsutake
mushroom) indeed Agaricus blazei Murrill. Int J Med Mushrooms, 4:267‑90.
137. White T, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 85
138. World Health Organization report –Antimicrobial resistance (AMR), 2012. Available at http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2010/amr_20100820/en/index.html.Acces sed January 21.
139. World Health Organization
report on
infectious diseases 2000- Overcoming
antimicrobial resistance. Available at http://www.who.int/infectious-disease-report.
Accessed January 21, 2012.
140. Wu F., Yan H., Ma X. et al., 2011. Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris. Afr J Microbiol Res, 5:2743–
2751.
141. XiaoPing C., Yan C., ShuiBing L., YouGuo C., JianYun L., and LanPing L., 2009. Free radical scavenging of Ganoderma lucidum polysaccharides and its effect on antioxidant
enzymes and immunity activities in cervical carcinoma rats. Carbohydr Polym, 77:389-
393.
142. Xie J., Zhao J., Hu D. J., Duan J. A., Tang Y. P., and Li S. P., 2012. Comparison of poly-
saccharides from two species of Ganoderma. Molecules, 17:740–752.
143. Xu S., Xu X., Zhang L., 2012. Branching structure and chain conformation of water- soluble glucan extracted from Auricularia auricula-judae. J. Agric. Food Chem, 60:
3498–3506.
144. Xu X., Hu Y., Quan L., 2014. Production of bioactive polysaccharides by Inonotus obliquus under submerged fermentation supplemented with lignocellulosic biomass and their antioxidant activity. Bioprocess Biosyst Eng. 37(12):2483-92.
145. Yamac M., Bilgili F., 2006. Antimicrobial activities of fruit bodies and/or mycelial
cultures of some mushroom isolates. Pharm Biol, 44: 660–667.
146. You Y.H. and Lin Z.B., 2002. Protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of macrophages induced by reactive oxygen species. Acta Pharmacol Sinica, 23:789–791.
147. Yuan B., Chi X., Zhang R., 2012. Optimization of exopolysaccharides production from a novel strain of Ganoderma lucidum CAU5501 in submerged culture. Brazilian journal of microbiology , 490-497.
148. Yue L., Cui H., Li C. et al., 2012. A polysaccharide from Agaricus blazei attenuates tumor cell adhesion via inhibiting E-selectin expression. Carbohydr Polym, 88:1326– 1333.
149. Zhang Y.Y., Li S., Wang X.H., Zhang L.N., Cheung P.C.K., 2011. Advances in lentinan:
Isolation, structure, chain conformation and bioactivities. Food Hydrocoll, 25:196–206.
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 86
150. Zhao J. and Cheung P. C. K., 2011. Fermentation of β-glucans derived from different sources by bifidobacteria: Evaluation of their bifidogenic effect. J Agric Food Chem, 59:5986–5992.
151. Zhao X., Ma S., Liu N., Liu J., Wang W., 2015. Optimization, Composition, and Antioxidant Activities of Exo- and Intracellular Polysaccharides in Submerged Culture of
Cordyceps gracilis (Grev.) Durieu & Mont. Sapan Kumar Sharma,1 Nandini Gautam,
and Narender Singh Atri. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine
Article ID 462864, 8 pages
Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17
Trang 87
