ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

PHẠM LAN ANH

PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN CÁC LOÀI THUỘC GIỐNG ẾCH CÂY Gracixalus (AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

PHẠM LAN ANH

PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN CÁC LOÀI THUỘC GIỐNG ẾCH CÂY Gracixalus (AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE) Ở VIỆT NAM

Ngành: Sinh thái học

Mã số: 8.42.01.20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS NGUYỄN THIÊN TẠO 2. PGS.TS HOÀNG VĂN NGỌC

THÁI NGUYÊN - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi

dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Thiên Tạo (Bảo tàng Thiên

nhiên Việt Nam) và PGS. TS. Hoàng Văn Ngọc (Trường Đại học Sư phạm, Đại

học Thái Nguyên). Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là hoàn

toàn trung thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào

đã được công bố trước đó.

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2020

Tác giả luận văn

Phạm Thị Lan Anh

i

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm n chân thành và tri ân sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn

Thiên Tạo (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và công

nghệ Việt Nam) và PGS.TS Hoàng Văn Ngọc (Trường Đại học sư phạm, Đại

học Thái Nguyên) đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt và tạo mọi điều kiện thuận lợi

nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận

văn này.

Em xin chân thành cảm n thầy cô trong khoa Sinh học, Phòng Đào tạo

Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho em học tập, nghiên

cứu và hoàn thành khóa học. Đặc biệt, em xin cảm n Phòng Bảo t n Thiên

nhiên (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) đã gi p đ , cung cấp tài liệu và các

trang thiết bị trong thời gian nghiên cứu tại đây.

Tôi xin cảm n Ban Lãnh đạo, các cán b ki m lâm của khu bảo t n

thiên nhiên Na Hang, Tuyên Quang đã cung cấp thông tin và tạo điều kiện

thuận lợi cho tôi trong quá trình khảo sát thực địa.

Xin được t lòng biết n sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã

đ ng viên và ủng h tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu này.

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát tri n khoa học và công nghệ

Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.05-2019.334

Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020

Học viên

Phạm Lan Anh

ii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii

MỤC LỤC .......................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................... v

DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vi

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... vii

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

1. Lí do chọn đề tài .............................................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài ......................................................... 2

4. N i dung nghiên cứu ....................................................................................... 2

Chƣơng 1: TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ................................. 4

1.1. Tổng quan về nghiên cứu lư ng cư ở Việt Nam ......................................... 4

1.1.1. Lược sử nghiên cứu lư ng cư ở Việt Nam ................................................ 4

1.1.2. Lược sử nghiên cứu các loài lư ng cư thu c giống Gracixalus ............... 5

Chƣơng 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN,

THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 9

2.1. Mục đích nghiên cứu .................................................................................... 9

2.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 9

2.3. Phư ng pháp nghiên cứu .............................................................................. 9

2.3.1. Khảo sát thực địa ....................................................................................... 9

2.3.2. Trong phòng thí nghiệm .......................................................................... 11

Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................... 15

3.1. Phân loại các loài thu c giống Gracixalus ở Việt Nam ............................. 15

3.1.1. Đặc đi m hình thái các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam ........... 16

3.2. Phân tích mối quan hệ di truy n các loài trong giống Gracixalus.............. 30

iii

3.2.1. Sự sai khác di truyền giữa các loài trong giống Gracixalus ở Việt

Nam dựa trên đoạn gen 16S-rARN ................................................................... 30

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ................................................................. 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 37

iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

16S-rRNA : 16S ribosomal RNA

12S-rRNA : 12S ribosomal RNA

: C ng sự cs

: Axit đê ôxi ribônuclêic DNA

: Đa dạng sinh học ĐDSH

: Và tác giả khác et al.

: Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật IEBR

: Tổ chức Bảo t n Thiên nhiên Quốc tế IUCN

KBTTN : Khu Bảo t n thiên nhiên

: Lư ng cư LC

: Lư ng cư và Bò sát LCBS

: Phản ứng chuỗi polymerase PCR

: Phụ lục PL

: Tiến sĩ TS

: Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam VNMN

: Vườn quốc gia VQG

: Con đực ♂

: Con cái ♀

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các m i sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của

giống Gracixalus ..................................................................... 14

Bảng 3.1. Thông tin các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu ....................... 30

Bảng 3.2. Khoảng cách di truyền 16S-rARN giữa các loài trong giống

Gracixalus ở Việt Nam .................................................................... 35

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. S đ đo mẫu ếch nhái không đuôi ................................................... 12

Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại BI phân tích từ trình tự gen ti th 16S

rRNA với đ dài 542 nucleotid các loài thu c giống Gracixalus

và các loài ngoài nhóm. Các số nhánh trên và nhánh dưới lần

lượt là xác suất sau Bayes (BPP) và ML bootstrap (chỉ các giá

trị trên 70% được hi n thị). .............................................................. 34

vii

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Số lượng loài lư ng cư (LC) ghi nhận phân bố ở Việt Nam tăng nhanh

trong các thập kỷ qua từ 82 loài vào năm 1996 [9] lên đến 186 loài vào năm

2009 và cho tới nay có khoảng 290 loài được ghi nhận. Kết hợp phư ng pháp so

sánh hình thái, phân tích âm sinh học và dữ liệu sinh học phân tử đã phát hiện

nhiều loài mới cho khoa học, đặc biệt là các nhóm loài có đặc đi m hình thái

tư ng đ ng và nhóm các loài phức hợp ẩn còn chưa được nghiên cứu nhiều. Chỉ

riêng họ Ếch cây (Rhacophoridae), trong khoảng 10 năm trở lại đây đã có h n

30 loài mới được phát hiện và ghi nhận phân bố mới ở Việt Nam.

Giống Gracixalus trước đây được coi là m t phân giống của giống

Aquixalus (Delorme và c ng sự, 2005). Tuy nhiên, Li và c ng sự, 2008 và 2009

dựa trên các bằng chứng về di truyền phân tử đã khẳng định Gracixalus là m t

giống riêng biệt. Hiện nay, có 17 loài được ghi nhận phân bố ở My-an-ma, Lào,

Thái Lan, Trung Quốc và Việt Nam, trong đó ở Việt nam đã ghi nhận 11 loài.

Đáng ch ý, có 10 loài mới được phát hiện từ năm 2010 cho đến nay (Rowley và

c ng sự, 2011, 2014; 2020 Mo và c ng sự, 2013; Nguyễn và c ng sự, 2013;

Matsui và c ng sự, 2015, 2017; Zeng và c ng sự, 2017; Chen và c ng sự, 2018;

Wang và c ng sự, 2018; Yu và c ng sự, 2019). Điều này cho thấy mức đ đa

dạng cao về thành phần các loài thu c giống Gracixalus ở Việt Nam. Thêm

vào đó, các kết quả phân tích về mối quan hệ di truyền và phát sinh loài

thu c nhóm G. jinxiuensis cho thấy vấn đề phân loại học vẫn chưa được giải

quyết và cần thiết có những nghiên cứu cụ th h n (Matsui và c ng sự, 2017,

Chen và c ng sự, 2018).

Mặt khác, các loài thu c giống Ếch cây Gracixalus đa số có kích thước

nh , màu sắc trầm tối phù hợp với lối sống gần mặt đất của ch ng, lưng màu

nâu, xám hay xám nâu có m t vệt hình chữ X màu nâu nhạt ở lưng; có m t sọc

đen chạy từ mũi đến mắt và từ sau ổ mắt qua màng nhĩ về phía vai, bụng

1

thường có màu trắng đục và xuất hiện nhiều hạt, tay không có màng b i và đặc

biệt trong giống ếch này có loài phát ra âm thanh như tiếng chim hót. Do vậy,

ch ng được các nhà nghiên cứu quan tâm và tìm hi u. Ứng dụng phư ng pháp

nghiên cứu sinh học phân tử là m t công cụ hữu hiệu hỗ trợ công việc phân loại

và phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài, các nhóm loài có sự tư ng

đ ng về hình thái, các loài mới được phát hiện và mô tả gần đây dựa trên dữ

liệu hình thái và phân tử.

Vì những lý do nêu trên, học viên tiến hành thực hiện đề tài: “ Phân loại và

quan hệ di truyền các loài thuộc giống Ếch cây Gracixalus (Amphibia: Rhacophoridae) ở Việt Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm cập nhật thông tin về thành phần loài, phân loại,

phân bố, m t số đặc đi m sinh học sinh thái và quan hệ di truyền của các loài

thu c giống Ếch cây Gracixalus ở Việt Nam.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa

học cập nhật về phân loại học dựa trên các dữ liệu hình thái học và sinh học

phân tử của các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam, đ ng thời các đặc

đi m sinh học sinh thái từ các dẫn liệu ghi chép, quan sát ngoài thực địa. Mô tả

hình thái, biện luận mối quan hệ di truyền và cung cấp m t số đặc đi m sinh

học sinh thái về sinh cảnh sống, phân bố của các loài.

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài bổ sung số liệu góp

phần xây dựng c sở khoa học cho công tác quản lý, xây dựng kế hoạch bảo

t n các loài đ ng vật đặc hữu và có phân bố hẹp. Đ ng thời bổ sung tư liệu và

mẫu vật cho Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam.

4. Nội dung nghiên cứu

Đ thực hiện được các mục tiêu trên, đề tài dự kiến tri n khai các n i

dung nghiên cứu cụ th như sau:

2

- N i dung 1: Nghiên cứu đặc đi m hình thái các loài trong giống

Gracixalus ở Việt Nam.

+ Cập nhật danh sách các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam.

+ Mô tả, phân tích đặc đi m hình thái các loài trong giống Gracixalus ở

Việt Nam và cập nhật thông tin về phân bố của loài.

- N i dung 2: Nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các loài trong giống

Gracixalus ở Việt Nam.

+ So sánh sai khác di truyền giữa các loài trong giống Gracixalus dựa

vào kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S-rARN thu c hệ gen ty th .

+ Xây dựng cây quan hệ di truyền giữa các loài dựa trên giải trình tự

mẫu vật Gracixalus thu thập ở Việt Nam và các trình tự đã công bố trên Ngân

hàng gen.

3

Chƣơng 1

TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

1.1. Tổng quan về nghiên cứu lƣỡng cƣ ở Việt Nam

1.1.1. Lược sử nghiên cứu lưỡng cư ở Việt Nam

Theo Nguyen et al. (2009) [30], nghiên cứu về LC ở Việt Nam có lịch sử

khá lâu đời nhưng bắt đầu phát tri n mạnh vào các giai đoạn cuối thế kỷ XIX,

giữa và cuối thế kỷ XX và đặc biệt là những năm đầu thế kỷ XXI.

Trước năm 1945, các nghiên cứu về LC ở Việt Nam chủ yếu do các nhà

khoa học nước ngoài thực hiện như: Tirant (1885), Boulenger (1903), Smith

(1921, 1924, 1932)... [2] và hàng loạt công trình phát hiện loài mới được công

bố vào nửa đầu thế kỷ XX nhưng đáng ch ý là các công trình của Anderson

L.G (1942), Bourret (1937, 1942) mang tựa đề Les Batraciens de l’Indochine

(1942) [10]. Cuốn sách đã mô tả 171 loài và phân loài LC ở vùng Đông Dư ng

(Việt Nam, Lào, Campuchia), trong đó có 78 loài ghi nhận ở Việt Nam. Bên

cạnh đó cuốn sách đã công bố danh sách các địa đi m nghiên cứu trên toàn

vùng Đông Dư ng, tổng quan lịch sử nghiên cứu LC ở vùng này; công trình

còn đưa ra các đặc đi m hình thái dùng trong phân loại LC, các ghi ch đặc

đi m sinh học, phân bố theo các vùng địa lý, phân bố theo đ cao, định loại và

mô tả các loài. Mẫu vật và tư liệu mà tác giả phân tích được mang về từ vùng

Viễn Đông, bán đảo Đông Dư ng, vịnh Bengal, Đông Ấn, Java và được lưu trữ

tại Bảo tàng Tự nhiên Paris. Đây có th coi là tài liệu đầy đủ nhất về LC trong

khu vực vào những năm giữa thế kỷ XX. Tuy nhiên, thời gian này công tác

nghiên cứu LC mới chỉ dừng ở mức thu thập mẫu vật, thống kê, phân loại và

lập danh sách loài.

Từ năm 1945 đến năm 1954, Việt Nam tiến hành cu c kháng chiến

chống thực dân Pháp, nên việc nghiên cứu LC bị gián đoạn. Trong giai đoạn

này hầu như không có công trình nghiên cứu LC nào ở Việt Nam.

4

Sau hòa bình lặp lại ở miền Bắc Việt Nam (1954-1975) các nghiên cứu

về thành phần loài LC mới được tăng cường bởi các tác giả Việt Nam. Có th

k tên m t số nhà nghiên cứu tiêu bi u: Đào Văn Tiến, Trần Kiên, Nguyễn Văn

Sáng, H Thu Cúc (1956-1976), Đào Văn Tiến và Lê Vũ Khôi (1956),... và các

nghiên cứu r ng khắp từ cả hai miền Bắc và Nam. Trong báo cáo của Ủy ban

Khoa học và kỹ thuật Nhà nước, 1981 về LCBS miền Bắc Việt Nam (1956-

1976) đã ghi nhận 69 loài LC dựa trên mẫu vật thu tại 11 địa đi m nghiên cứu

thu c miền Bắc [8].

Từ năm 1975 đến nay, nổi bật là các nghiên cứu m t số các tác giả có th

k đến như: Năm 1977, Đào Văn Tiến đã tổng hợp và công bố khóa định loại

87 loài LC trong bài báo về “Định loại LC Việt Nam” [7]. Năm 1981, Trần

Kiên và cs. đã thống kê thành phần loài đ ng vật toàn miền Bắc từ năm 1956

đến năm 1976 in trong “Kết quả điều tra c bản đ ng vật miền Bắc Việt Nam”,

trong đó có 69 loài LC [1]. Tiếp đó, Inger et al. (1999) đã tiến hành điều tra,

đánh giá và ghi nhận 100 loài LC phân bố ở Việt Nam, tăng h n 20% so với

nghiên cứu của Bourret (1942). Năm 1996, Nguyễn Văn Sáng và H Thu Cúc

xuất bản chuyên khảo Danh lục Bò sát và LC Việt Nam ghi nhận 82 loài LC

[4]. Đến năm 2005 số lượng loài tăng lên gấp đôi (162) được Nguyễn Văn Sáng

và cs. thống kê trong cuốn Danh lục ếch nhái và Bò sát Việt Nam [5]. Cuốn

Danh lục gần đây nhất của Nguyen et al. (2009) ghi nhận tổng số 177 loài LC ở

Việt Nam [30]. Năm 2014 có 222 loài LC được ghi nhận phân bố, tăng thêm

20,27% so với năm 2009.

1.1.2. Lược sử nghiên cứu các loài lưỡng cư thuộc giống Gracixalus

Họ ếch cây Rhacophoridae được đánh giá là m t trong những họ có số

lượng và thành phần loài đa dạng trong lớp LC. Hiện nay trên thế giới họ

Rhacophoridae có khoảng h n 430 loài, thu c 17 giống. Chúng phân bố chủ

yếu ở Châu Phi, Trung Quốc, Ấn Đ , các nước Đông Nam Á, Nhật Bản và Đài

Loan [30].

5

Năm 2014, Nguyễn và c ng sự đã ghi nhận ở Việt Nam có sự phân bố của

khoảng 70 loài trong họ ếch cây, đến nay là 82 loài thu c 12 giống Chirixalus,

Feihyla, Gracixalus, Kurixalus, Liuixalus, Nyctixalus, Philautus, Polypedates,

Raorchestes, Rhacophorus, Theloderma, và Zhangixalus trong đó giống

Gracixalus ghi nhận được 11 loài, chiếm khoảng 13,4% tổng số loài.

Theo Delorme, Dubois, Grosjean và Ohler, 2005 Gracixalus thu c phân

giống Aquixalus của họ Ếch cây Rhacophoridae. Mặt khác, bằng cách sử dụng

phân loại cổ xưa Pyron và Wiens, 2011 đã đặt Gracixalus thu c Philautus

(Sensuricto) và xác nhận m t cách đ n thuần.

Giống Ếch cây - Gracixalux Delorme, M., A. Dubois, S. Grosjean, and A.

Ohler, 2005 hiện ghi nhận tổng số 17 loài trên thế giới và ở Việt Nam đã ghi

nhận 11 loài (Frost 2019), g m Gracixalus ananjevae (Matsui và Orlov, 2004);

G. gracilipes (Bourret, 1937); G. jinxiuensis (Hu, 1978); G. lumarius (Rowley,

Lê, Đậu, Hoàng và Cao, 2014); G. nonggangensis (Mo, Zhang, Luo, Zhou và

Chen, 2013); G. quangi (Rowley, Dau, Nguyễn, Cao và Nguyễn, 2011); G.

quyeti (Nguyễn, Hendrix, Böhme, Vũ và Ziegler, 2008; G. sapaensis (Matsui,

Ohler, Eto và Nguyễn, 2017); G. supercornutus (Orlov, Ho và Nguyễn, 2004);

Gracixalus trieng Rowley, Le, Hoang, Cao, and Dau, 2020; và G. yunnanensis

(Yu, Li, Wang, Rao, Wu và Yang, 2019)

Kurixalus ananjevae (Matsui & Orlov, 2004) lần đầu được Matsui và

Orlov mô tả với tên khoa học là Chirixalus ananjevae dựa trên hai mẫu chuẩn

thu tại tỉnh Hà Tĩnh, Việt Nam vào năm 2004 [26]. Theo Nguyễn Văn Sáng và

cs. (2005), C. ananjevae có tên phổ thông là Nhái cây ananjeva và là loài ghi

nhận mới cho khoa học [5]. Đây là loài có đặc đi m hình thái rất giống với loài

C. eiffingeri và C. idiootocus (bây giờ thu c giống Kurixalus) và cho tới nay loài

mới chỉ được ghi nhận tại tỉnh Hà Tĩnh, Việt Nam [26]. Năm 2014, Rowley et al.

sử dụng kết quả phân tích sinh học phân tử đã chuy n loài sang giống

Gracilxalus với tên gọi G. ananjevae [36].

6

Ứng dụng kỹ thuật của sinh học phân tử đã gi p các nghiên cứu hệ thống

và tu chỉnh vị trí phân loại của các họ, các giống hoặc chia tách các loài phức

tạp m t cách chính xác h n. Frost et al. (2006) đã xây dựng cây quan hệ di

truyền của hầu hết các họ ếch nhái trên toàn thế giới, công trình này đã tu chỉnh

vị trí phân loại của rất nhiều họ và giống lư ng cư, trong đó có m t số giống

phân bố ở Việt Nam như các loài thu c giống Paa chuy n sang giống

Nanorana, các loài thu c giống Chirixalus chuy n sang giống Chiromantis, các

loài thu c giống Rana chuy n sang giống Huia, Hylarana và Sylvirana,...[16].

Về quan hệ di truyền, các nghiên cứu về các loài thu c giống Gracixalux

còn khá hạn chế với m t số quan đi m khác nhau. M t số công trình công bố

có liên quan như:

Năm 2008, Dubois và c ng sự đã cung cấp bằng chứng phân tử cho sự

liên kết của Gracixalus với Aquixalus mặc dù sau đó Li, Che, Bain, Zhao, và

Zhang, 2008 trên c sở b dữ liệu phân tử lớn h n, đã cung cấp bằng chứng

phân tử rằng Aquixalus (Sensuricto) nên được đặt trong Kurixalus và

Gracixalus nằm cách xa Kurixalus, Gracixalus được xác định là 1 chi.

Năm 2013, Li et al đã phân tích mối quan hệ di truyền của m t số loài của

giống Gracixalux ở Trung Quốc và m t số tỉnh thu c Việt Nam, xác nhận mối

quan hệ họ hàng của Gracixalus và Philautus.

Cũng năm 2011 nhóm Rowley, Nguyen, Dau, Nguyen, và Cao đã đề xuất

trên c sở bằng chứng phân tử rằng hai nhánh chính có th được phân định: (1)

nhánh này có Gracixalus jinxiuensis và m t số loài chưa được đặt tên trước

đây, (2) m t nhánh khác bao g m ít nhất Gracixalus quyeti, Gracixalus

gracilipes, Gracixalus supercornutus và Gracixalus quangi. Năm 2014,

Rowley cùng c ng sự đã cung cấp bằng chứng phân tử s b cho các mối quan

hệ trong chi.

7

Matsui et al. (2017), đã phân tích về mối quan hệ của quần th loài

Gracixalux ở miền Bắc Việt Nam dựa trên phân tích gen ty th và phát hiện và

mô tả m t loài mới Gracixalus sapaensis.

Ngoài ra, gần đây m t số nhà nghiên cứu dựa trên sự khác biệt về di

truyền phân tử và hình thái đã phát hiện và mô tả các loài mới cho khoa học

thu c giống Gracixalus g m: Chen et al năm 2018 phát hiện, mô tả loài G.

tianlineneis; Zeng et al., 2018 phát hiện, mô tả loài G. guangdongensis; Yu et al

năm 2019 phát hiện, mô tả loài G. yunnanensis; và G. triengi được Rowley et al

phát hiện và mô tả năm 2020.

Năm 2015, 65 Rowley cùng c ng sự nghiên cứu đặc đi m sinh học, sinh

thái, sinh sản, trứng, phôi, ấu trùng và tiếng kêu của ba loài ếch Gracixalus

gracilipes, G. quangi, G. supercornutus. Kết quả nghiên cứu cung cấp các thông

tin về sinh học, sinh thái, sinh sản, trứng, phôi, ấu trùng và tiếng kêu như chim

hót của ba loài này.

Chen, Bei, Liao, Zhou và Mo, 2018 đã cung cấp m t cây ML phân tử của

loài Gracixalus và cung cấp m t bản đ sinh thái của loài Gracixalus .

Năm 2020, Nguyễn, Dư ng, Lưu và Poyarkov cung cấp m t bảng các

đặc đi m hình thái cho loài này.

8

Chƣơng 2

MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, THIẾT BỊ VÀ

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm cập nhật thông tin về thành phần loài, phân loại,

phân bố, m t số đặc đi m sinh học sinh thái và quan hệ di truyền của các loài

thu c giống Ếch cây Graxcixalus ở Việt Nam.

2.2. Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các loài lư ng cư thu c giống Ếch cây

Graxcixalus ở Việt Nam.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Khảo sát thực địa

* Chuẩn bị dụng cụ đi thực địa: Bản đ , GPS, túi nilong, c n, xi lanh,

khay, bút kim, giấy can, b đ mổ, lọ đựng mẫu vật, sổ ghi nhật ký, máy ảnh,

đèn pin (c lớn, c nh ).

* Địa điểm thu mẫu:.

- Sử dụng mẫu được thu thập tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam.

- Ngoài ra, chúng tôi tiến hành khảo sát thực địa trong khoảng thời gian 20

ngày từ tháng 5 đến tháng 7 năm 2019, vào thời gian này các loài Lư ng cư ra

hoạt đ ng, kiếm ăn và sinh sản. Nghiên cứu đã thực hiện các đợt khảo sát m t

số địa đi m thu c khu vực miền núi phía Bắc.

 Đợt 1 từ ngày 15 đến ngày 21 tháng 6 năm 2019 tại Khu bảo t n thiên

nhiên Na Hang, Tuyên Quang.

 Đợt 2 từ ngày 22 tháng 6 đến ngày 25 tháng 6 năm 2019 tại Yên Bái.

* Thời gian thu mẫu: Đ thu thập mẫu và các số liệu hình thái có liên

quan, ch ng tôi tiến hành khảo sát thực địa cả ban ngày và ban đêm. Thường

tập trung ven các suối nh , vũng nước, ao nh , vùng đầm lầy, hang hốc, n i phủ

nhiều lá mục ven các đường mòn trong rừng.

9

 Ban ngày: Từ 8h00 đến 11h00, khảo sát các tuyến đường và chụp ảnh

sinh cảnh, quan sát các nhân tố tác đ ng tới sinh cảnh và loài.

 Ban đêm: Các loài Lư ng cư thường hoạt đ ng và kiếm ăn nên ch ng tôi

tiến hành khảo sát từ 19h00 đến 1h00 ngày hôm sau đ thu thập mẫu vật

và đo đếm các chỉ số hình thái và sinh thái liên quan.

* Thu thập số liệu về đặc điểm sinh thái: Thông tin về sinh cảnh sống, n i

thu thập mẫu và điều kiện môi trường (nhiệt đ , đ ẩm) cũng sẽ được ghi nhận

tại địa đi m thu mẫu đ phục vụ việc phân tích đặc đi m phân bố của từng loài.

* Phương pháp thu mẫu: Chủ yếu thu thập bằng tay.

* Xử lý mẫu vật: Mẫu LC được thu đ trong túi nilong, sau khi chụp ảnh

m t số mẫu được trả về tự nhiên, mẫu vật đại diện cho các loài ở các địa đi m

khảo sát được giữ lại làm tiêu bản nghiên cứu.

* Làm tiêu bản:

Xử lý và bảo quản mẫu vật theo tiêu chuẩn của các bảo tàng trong nước

và trên thế giới qua tham khảo tài liệu của Simmon (2002) [39] và Ngô Đắc

Chứng & Nguyễn Quảng Trường (2015).

- Gây mê: Mẫu vật được gây mê bằng miếng bông thấm etyl acetate. Thu

bổ sung mẫu c hay mẫu gan đ phân tích DNA và lưu trữ trong c n 95% và

bảo quản trong tủ lạnh.

- Cố định mẫu: Việc cố định mẫu cần đảm bảo mẫu có hình dạng dễ phân

tích hoặc dễ quan sát sau này. Sắp xếp mẫu vật theo hình dạng mong muốn, sau

đó phủ nilong m ng lên toàn khay cố định mẫu, ngâm trong c n 80-90% trong

vòng 4-10 giờ. Đối với LC c lớn cần tiêm c n 100% vào bụng và c của con vật

đ tránh thối h ng mẫu.

- Ký hiệu mẫu: Cần đeo nhãn kí hiệu vào cho mẫu vật. Nhãn và chỉ bu c

không thấm nước, chữ viết trên nhãn không bị tan trong c n. Khi đeo nhãn cần

bu c chỉ quanh khớp giữa xư ng đùi và ống chân tránh bị tu t.

10

- Bảo quản mẫu vật: Đ bảo quản mẫu vật lâu cần chuy n sang ngâm c n

70%. Các bình đựng mẫu phải có nắp kín đ tránh bay h i c n và làm khô mẫu.

Mẫu vật phải được bảo quản trong phòng đủ điều kiện (nhiệt đ và đ ẩm thấp,

tránh ánh sáng trực tiếp của mặt trời, có khay và giá đựng).

2.3.2. Trong phòng thí nghiệm

a) Phân tích đặc điểm hình thái:

Mẫu trưởng thành: Các chỉ tiêu về kích thước theo tài liệu của Orlov et

al. 2012, được đo bằng thước kẹp điện tử Alpha-Tool với đ n vị đo nh nhất là

0,01 mm. Ngoài giá trị nh nhất (min) và giá trị lớn nhất (max), giá trị trung

bình và đ lệch chuẩn (TB ± SD) với số cá th tối thi u n > 2 cũng được thống

kê trong bảng các chỉ tiêu hình thái. Tổng số 26 chỉ tiêu hình thái được đo đếm

và phân tích, bao g m:

1 SVL = Chiều dài mút mõm-lỗ 14 AG = Khoảng cách từ nách đến

huyệt bẹn

2 HW = Chiều r ng đầu (đo ở 15 FLL = Dài chi trước (từ mút

đi m r ng nhất của đầu) ngón tay III đến nách)

3 HL = Dài đầu (đo từ mút mõm 16 FFL = Chiều dài ngón tay I

đến gờ sau của xư ng hàm)

4 HD = Chiều cao đầu (đo ở đi m 17 TFL = Chiều dài ngón tay III

cao nhất của đầu, thường ở phía

trước ổ mắt)

5 UEW = R ng mí mắt (phần r ng 18 FTD = Đường kính lớn nhất của

nhất của mí mắt trên) đĩa bám ngón tay III

6 ED = Đường kính ổ mắt (theo 19 HLL = Dài chi sau (từ mút ngón

chiều ngang) chân IV đến bẹn)

7 TD = Đường kính lớn nhất của 20 FL = Chiều dài đùi (từ hậu môn

màng nhĩ đến đầu gối)

11

8 IFE = Khoảng cách giữa góc trước 21 TL = Chiều dài ống chân (từ đầu

gối đến cổ chân) hai ổ mắt

9 IBE = Khoảng cách giữa góc sau 22 FOL = Chiều dài bàn chân (từ

cổ chân đến mút ngón chân IV) hai ổ mắt

10 ESL = Dài mũi (khoảng cách từ 23 FTL = Chiều dài ngón chân I

mút mõm tới góc trước ổ mắt)

11 TED = Khoảng cách từ rìa trước 24 FFTL = Chiều dài ngón chân IV

màng nhĩ đến góc sau ổ mắt

12 IND = Khoảng cách giữa hai lỗ 25 HTD = Đường kính lớn nhất

mũi của đĩa bám ngón chân IV.

13 END = Khoảng cách từ góc 26 MTT= chiều dài của khớp

trước ổ mắt tới lỗ mũi

Công thức màng b i được xác định dựa theo tài liệu của Ohler &

Delorme (2006)Error! Reference source not found. Bắt đầu từ m t ngón

hân (ngay ở gốc đĩa bám) thì là 0 (hoàn toàn); ½ thì là nửa của đốt; đốt 1 là đốt

sát gốc cổ chân (tính từ trong ra ngoài).

Hình 2.1. Sơ đồ đo mẫu ếch nhái không đuôi

12

(theo Hoàng Xuân Quang và cs. 2012, có bổ sung)

Định loại mẫu vật: So sánh hình thái của mẫu vật thu được với các mẫu đã

được định tên đang lưu giữ ở Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (VNMN) và

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR). Định loại tên loài theo các tài

liệu của Bourret (1942) , Inger et al. (1999) , Taylor (1962), Orlov et al. (2012)

và m t số tài liệu khác có liên quan. Tên khoa học và phổ thông của loài theo

Nguyen et al. (2009) [30] và m t số tài liệu mới công bố gần đây.

b) Phân tích sinh học phân tử: Tiến hành phân tích trình tự DNA m t

số đoạn gen thu c hệ gen ty th do các gen này di truyền theo dòng mẹ, có tốc

đ đ t biến cao h n nhiều lần so với gen trong nhân. Vì vậy, việc sử dụng các

gen này thích hợp đ giải quyết các n i dung nghiên cứu của đề tài. Đoạn gen

thu c hệ gen ty th là 16S rRNA được lựa chọn đ giải mã. Nhiều công trình

nghiên cứu trước đây cũng đã sử dụng gen này do có tỉ lệ tiến hóa thích hợp

cho nghiên cứu ở bậc giống, loài và quần th . Mẫu c hoặc gan của các loài ếch nhái được thu thập và bảo quản trong c n 70% ở 4oC. Các mẫu mô sẽ được

chiết tách dựa trên quy trình được trình bày trong Kuraishi et al. (2013) và có

điều chỉnh theo Nguyen et al. (2015), sử dụng b kít chiết tách của Qiagen.

DNA sau khi chiết tách sẽ được sử dụng đ nhân đoạn bằng phư ng pháp phản

ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction-PCR). Tổng th tích mỗi

phản ứng PCR là 20µl, bao g m 10µl mastermix, 7µl nước, 0,5µl mỗi chiều

m i, 2-5µl DNA khuôn, tùy thu c vào n ng đ DNA. Điều kiện phản ứng PCR: 950C ở 5’ với DreamTaq mastermix; 35 chu kỳ phản ứng ở 95oC trong 30s, 560C trong 30-45s, 72oC trong 30s; bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 7

ph t. Các sản phẩm PCR sẽ được điện di bằng gel agarose 1,5%. Sản phẩm đã

được nhân đoạn thành công sẽ được tinh sạch đ loại b tạp chất sinh ra từ phản ứng PCR sử dụng b kít GeneJETTM PCR Purification (Thermo Fisher

Scientific) và gửi giải trình tự hai chiều ở FirstBase (Ma-lai-xi-a). Sản phẩm

tinh sạch sau đó được gửi tới công ty Macrogen đ giải trình tự. Cuối cùng, kết

13

quả giải trình tự được xác thực bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng gen. Tất

cả các công đoạn phòng thí nghiệm sẽ được thực hiện tại phòng thí nghiệm của

Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, n i có đầy đủ các thiết bị nghiên cứu hiện đại

phục vụ các nghiên cứu về hệ thống phân loại học và di truyền quần th .

Bảng 2.1. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền

của giống Kurixalus

Tên mồi

Trình tự mồi

Tài liệu tham khảo

L2204

5'-AAA CTG GGA TTA GAT ACC CCA CTA T-3'

Nguyen et al. (2014)

tVal-L

5’- CGTACCTTTTGCATCATGGTC -3’

Nguyen et al. (2014)

H3056

5’-CTCCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGG -3’

Nguyen et al. (2014)

Chúng tôi sẽ xác định các mức đ của các đ n vị di truyền bằng cách: (1)

ước tính sự sai khác về mặt di truyền của các trình tự thu được giữa các đ n

vị/quần th được coi là có sai khác; (2) xây dựng cây phát sinh chủng loại.

Khoảng cách di truyền giữa các đ n vị phân loại được tính toán bằng cách so

sánh các số lượng khác biệt cố định và các đ t biến chung, số lượng nucleotid

thay thế trung bình cũng như số lượng nucleotid thay thế thực tại từng vị trí.

Cây phát sinh chủng loại sẽ được xây dựng các phân tích hợp lý tối đa

(Maximum Likelihood) có trong phần mềm Kakusan 4. Mô hình tiến hóa của

các trình tự sẽ được lựa chọn dựa trên tiêu chí thông tin Akaike (AIC) bằng

cách so sánh các mô hình phân tích Kakusan. Phân tích mô ph ng phi thông số

sẽ được sử dụng đ cung cấp đ tin cậy về thống kê cho các nhánh trong cây

phát sinh chủng loại sử dụng phư ng pháp hợp lý tối đa . Các giả thuyết về cây

phát sinh loài cũng được tính toán sử dụng phư ng pháp Bayes có trong phần

mềm MrBayes v3.2.

c) Phân tích thống kê:

Sử dụng phần mềm PAST Statistics đ phân tích thống kê và so sánh

m t số chỉ số tư ng đ ng và sai khác về đăc đi m hình thái giữa các quần th

và các loài trong cùng giống Gracixalus.

14

Chƣơng 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Phân loại các loài thuộc giống Gracixalus ở Việt Nam

- Qua phân tích hình thái của 102 mẫu vật từ b mẫu vật được thu thập

được qua các đợt thực địa đang lưu giữ ở Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,

thống kê được 10 loài loài lư ng cư thu c giống Gracixalus g m:

1. Gracixalus ananjevae (Matsui and Orlov, 2004)

2. Gracixalus gracilipes (Bourret, 1937)

3. Gracixalus jinxiuensis (Hu, 1978)

4. Gracixalus lumarius Rowley, Le, Dau, Hoang, and Cao, 2014

5. Gracixalus nonggangensis Mo, Zhang, Luo, Zhou, and Chen, 2013

6. Gracixalus quangi Rowley, Dau, Nguyen, Cao, and Nguyen, 2011

7. Gracixalus quyeti (Nguyen, Hendrix, Böhme, Vu, and Ziegler, 2008)

8. Gracixalus sapaensis Matsui, Ohler, Eto, and Nguyen, 2017

9. Gracixalus supercornutus (Orlov, Ho, and Nguyen, 2004)

10. Gracixalus trieng Rowley, Le, Hoang, Cao, and Dau, 2020

11. Gracixalus yunnanensis Yu, Li, Wang, Rao, Wu, and Yang, 2019

- Đặc đi m chung: Loài nhái cây nh cho đến trung bình, dài thân từ 10-

32 mm. Màng nhĩ rõ. Thiếu răng trên khẩu cái. Mũi có dạng chuỳ đôi khi dẹt.

Thường không có răng lá mía. Con đực thường có túi kêu. Ngón chân và ngón

tay đều có đĩa khá lớn, đĩa chân nh h n đĩa tay. Ngón tay tự do hoặc chỉ có

màng b i ở gốc ngón, ngón chân có màng b i phát tri n. Chân sau dài h n thân

nhiều. Chai sinh dục có hoặc không. Da thân và các chi nhám nổi mụn hoặc

không, bụng có mụn phẳng. C t sống ngắn. Đốt ngón ngoài cùng đ n hoặc chẻ

nhánh. Trên lưng thường có hoạ tiết sẫm hình chữ X. Các loài của giống này

thường gặp trên các bụi cây c thấp trong rừng ẩm nhiệt đới, trên núi nhiều khi

rất xa nước. Ch ng thường đẻ trứng trực tiếp trên lá cây, trứng phát tri n thẳng

15

trong lớp v nhầy trong. Trứng thường lớn, không sắc tố, số lượng trứng trong

m t ổ không nhiều, chỉ từ 6-20 quả.

3.1.1. Đặc điểm hình thái các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam

1. Nhái cây Gracixalus ananjevae (Matsui and Orlov, 2004)

Mô tả: - Đầu: Đầu dài gần bằng r ng, mõm nhọn, vùng má gần như

thẳng đứng, lõm. Màng nhĩ rõ và rất gần mắt. Không có răng lá mía. Mặt lưng

có những nốt sần nh màu trắng.

- Chi: Ngón tay hoàn toàn tự do. Ngón I ngắn h n ngón II, không có

màng giữa ngón I và II, giữa ngón II và III có màng ở gốc, đốt ngoài cùng của

ngón III tự do, ở cạnh ngoài của ngón IV màng kéo riềm đến đốt ngoài cùng

còn cạnh trong thì riềm kéo đến hai đốt ngoài. Các đầu ngón tay và ngón chân

có đĩa bám. Đĩa ngón chân nh h n đĩa ngón tay. Chân mảnh, khớp cổ bàn h i

vượt mắt.

- Mầu sắc: Toàn thân xanh xám. Vùng thái dư ng phía dưới nếp trên

màng nhĩ mầu nâu sẫm với vết trắng từ dưới mắt đến vai. Gờ mõm nâu kéo dài

đến đầu mõm bởi m t đường mảnh nâu sẫm. Nhiều nốt nâu trắng nh không cố

định trên lưng. Có những chấm trắng ở hông cũng như những hạt nổi ở vùng

hậu môn. Phần ngoài của màng chân đen. Dưới bụng trắng. Con ngư i nâu. Da

nhẵn với m t vài hạt nh trên đầu và lưng. Có nếp da từ mắt đến vai. Họng

nhẵn. Ngực, bụng và mặt dưới đùi nổi hạt.

- Kích thước: Dài thân con cái 43 mm; con đực 32 (Matsui và Orlov

2004) [26].

Giá trị sử dụng: Khoa học, ngu n gen hiếm

2. Nhái cây chân mảnh Gracixalus gracilipes (Bourret, 1937)

Mô tả:

Đầu: Đầu dài bằng r ng. Mõm nhọn có hình tam giác h i vượt quá hàm.

Gờ mõm rõ, vùng má gần như thẳng đứng, lõm. Mũi gần đầu mõm h n mắt.

Gian mũi bằng 2/3 gian mắt. Gian mắt gấp đôi mí mắt trên. Màng nhĩ rõ, gần

16

bằng 1/2 đường kính mắt và rất gần mắt. Không có răng lá mía, lỗ Choan nh

thuôn dài

Chi: Ngón tay hoàn toàn tự do. Ngón I h i ngắn h n ngón II. Đĩa ngón

III r ng bằng màng nhĩ. Ngón chân gần 2/3 có màng, màng chạm đĩa ngón

ngoài cùng, không có màng giữa ngón I và II, giữa ngón II và III có màng ở

gốc, đốt ngoài cùng của ngón III tự do, ở cạnh ngoài của ngón IV màng kéo

riềm đến đốt ngoài cùng còn cạnh trong thì riềm kéo đến hai đốt ngoài. Đĩa

ngón chân nh h n đĩa ngón tay. Củ bàn trong nh nhưng rõ, củ bàn ngoài

không rõ. Chân mảnh, khớp cổ bàn h i vượt mắt. Cẳng chân 4,5 lần dài h n

r ng, dài bằng bàn chân

Mầu sắc: Toàn thân xanh lá cây. Mí mắt mầu nâu sẫm. Có m t đường

nâu mảnh chạy ngang gian mắt. Vùng thái dư ng phía dưới nếp trên màng nhĩ

mầu nâu sẫm với vết trắng từ dưới mắt đến vai. Gờ mõm nâu kéo dài đến đầu

mõm bởi m t đường mảnh nâu sẫm. Vết nâu ở vùng thái dư ng kéo về phía sau

và nở ra ở vùng lưng, rất sẫm và biến mất ở phần cuối thân. M t hoạ tiết hình

chữ H trên lưng nối liền mí mắt. M t vết nâu nh hình tam giác ở hậu môn.

Nhiều nốt nâu nh không cố định trên lưng. Có những chấm trắng ở hông cũng

như những hạt nổi ở vùng hậu môn. Trên các chi có những vệt nâu ngang,

ngắn. Phần ngoài của màng chân đen. Dưới bụng xanh. Con ngư i nâu đ . Da

nhẵn với m t vài hạt nh trên đầu và lưng. Mí trên và vùng hậu môn có những

hạt hình chóp. Có nếp da từ mắt đến vai. Họng nhẵn. Ngực, bụng và mặt dưới

đùi nổi hạt.

Kích thước: Dài thân con cái 27,75 mm; con đực 22,76 (Bain and

Nguyen, 2004)

Sinh học, sinh thái: Nhiều con đực đang kêu, các con cái đang mang

trứng và nhiều ổ trứng đã được tìm thấy ở đ cao 1700 m (Bain and Nguyen,

2004). Nhiều ổ trứng được đẻ trên những cành lá treo l lửng trên mặt các vũng

nước trong rừng. Các ổ trứng thường ở đ cao cách đất đến 4 m. Kích thước ổ

17

trứng từ 2-8 mm. Bu ng trứng bên phải của 1 con cái đếm được 20 quả. Mỗi

quả trứng có đường kính 2,5-2,8 mm được bọc trong m t lớp v nhầy trong

suốt làm ch ng dính vào nhau và cả ổ trứng dính chặt vào lá. Trong trứng nòng

nọc phát tri n ở các giai đoạn từ 1-24, sau đó ch ng r i vào nước và tiếp tục

phát tri n ở các giai đoạn sau

Phân bố:

Việt Nam: Hà Giang (Tây Côn Lĩnh), Cao Bằng (Nguyên Bình), Lai

Châu, Lào Cai (dãy Hoàng Liên S n), Yên Bái

Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam)

Giá trị sử dụng: Khoa học, ngu n gen hiếm.

Ảnh: Nguyễn Thiên Tạo

3. Nhái cây jinxiu - Gracixalus jinxiuensis Hu and Tian, 1981

Mô tả: Đầu : Màng nhĩ sát với góc sau của mắt, gần như chạm nhau.

Chi: Ngón chân có màng nh ở gốc ngón

18

Mầu sắc: Da lưng sần sùi. M t vết thẫm ở giữa hai mắt như hình cái dĩa

kéo sâu về phía sau thành hai vệt r ng xiên xuống hai bên sườn.

Kích thước: SVL con cái: 30,2-36,9 mm (Phong Thổ); SVL con cái: 29-

30 mm, con đực: 23,5 mm (Quảng Tây)

Vật mẫu nghiên cứu: IEBR 2351-2360, IEBR 2323 (Lai Châu, Phong Thổ)

Phân bố:

Việt Nam: Lai Châu (Phong Thổ), Lào Cai (Sa Pa), Lạng S n

Thế giới: Trung Quốc (H Nam, Quảng Tây)

Giá trị sử dụng: Khoa học, ngu n gen hiếm

Ảnh: Nguyễn Thiên Tạo

4. Gracixalus lumarius Rowley, Le, Dau, Hoang, and Cao, 2014

Mô tả: (1) kích thước c th trung bình), (2) dorsum nâu diurnally và

vàng về đêm, (3) màng nhĩ màu h ng và supratympanic nếp gấp không rõ ràng

(5) iris vàng đậm với m t mạng lưới màu đen dày đặc, phân bố tư ng đối đ ng

đều, (6) dorsum với củ hình nón màu trắng đặc biệt ở con đực và (7) trứng

được đặt trên tường của m t phyptotelm.

19

Đầu : Màng nhĩ sát với góc sau của mắt, gần như chạm nhau.

Chi: Ngón chân có màng nh ở gốc ngón

Mầu sắc: Da lưng sần sùi. M t vết thẫm ở giữa hai mắt như hình cái dĩa

kéo sâu về phía sau thành hai vệt r ng xiên xuống hai bên sườn

Kích thước: SVL con cái: 36,3 mm, con đực trưởng thành 38,9 - 41,6

mm; con cái trưởng thành 36,3 mm

Phân bố: là loài đặc hữu của Việt Nam

Việt Nam: Ngọc Linh, Kon Tum

Giá trị sử dụng: Khoa học, ngu n gen hiếm

Ảnh: Jodi Rowley

5. Gracixalus nonggangensis Mo, Zhang, Luo, Zhou, and Chen, 2013

Mô tả:

Đầu : Màng nhĩ sát với góc sau của mắt, gần như chạm nhau.

Chi: Ngón chân có màng nh ở gốc ngón

Mầu sắc: Da lưng sần sùi. M t vết thẫm ở giữa hai mắt như hình cái đĩa

kéo sâu về phía sau thành hai vệt r ng xiên xuống hai bên sườn.

20

Kích thước: SVL con cái: 30,2-36,9 mm (Phong Thổ); SVL con cái: 29-

30 mm, con đực: 23,5 mm (Quảng Tây).

Vật mẫu nghiên cứu: IEBR 2351-2360, IEBR 2323 (Lai Châu, Phong Thổ)

Sinh học, sinh thái:

Phân bố:

Việt Nam: Lai Châu (Phong Thổ), Lào Cai (Sa Pa), Lạng S n

Thế giới: Trung Quốc (H Nam, Quảng Tây)

Giá trị sử dụng: Khoa học, ngu n gen hiếm

Ảnh: Nguyễn Quảng Trƣờng

6. Loài Gracixalus waza

Mô tả:

Nhái cây Waza, tên khoa học: Gracixalus waza, là m t loài ếch thu c họ

Rhacophoridae đặc hữu của Việt Nam. Loài nhái cây này được đặt theo được

đặt theo tên của Hiệp h i Các vườn th thế giới (WAZA) đ ghi nhận những

đóng góp của tổ chức này đối với công tác bảo t n các loài đ ng vật hoang dã

nói chung và ếch nhái nói riêng.

21

Mẫu vật của loài này đã được thu thập ở vùng n i đá vôi ở phía đông

tỉnh Cao Bằng ở đ cao 400-650m so với mực nước bi n. Loài nhái cây này

sinh sống ở các Thung lũng đá vôi hoặc cửa hang đ ng, khá xa ngu n nước.

Đặc đi m nhận dạng: (1) kích thước nh (chiều dài ống thông h i của

con đực 27.1 - 32,9 mm, của con cái 37,6 mm); (2) đầu r ng bằng hoặc r ng

h n dài; (3) không có răng v nanh; (4) mõm tròn và dài (16-18% chiều dài từ

mõm đến lỗ mũi); (5) gai trên mí mắt trên; (6) không có xư ng chày; (7) Da

lưng mịn màng; (8) rìa da ở cẳng tay và tarsus vắng mặt; (9) mặt lưng của đầu

và thân màu xanh xám đến xanh rêu với hoa văn màu nâu sẫm tạo thành m t

dấu Y ngược; và (10) cổ họng và ngực có vân màu tối

7. Nhái cây quang Gracixalus quangi

Mô tả: Kích thước nh (con đực <25 mm); màu da xanh; bề mặt trước

của đùi và sau cánh tay có màu vàng đục; vùng bẹn và phía trước đùi có những

đốm đen; mõm nhọn hình tam giác; có m t vệt hình chữ X màu nâu nhạt ở lưng

và sự hiện diện của m t hình chiếu xư ng chày. Gracixalus quangi được mô tả

tiếng kêu như chim hót và tiếng kêu gọi bạn tình đa dạng chứ không lặp đi lặp

lại như các con đực của các loài ếch thường thấy (tần số chiếm ưu thế 4,1- 4,7

kHz) (Rowley et al. 2011).

- Mẫu vật nghiên cứu:

Loài Nhái cây xanh Gracixalus quangi (Rowley, Dau, Nguyen, Cao, và

Nguyen, 2011) được tìm thấy lần đầu tiên tại khu rừng rậm, thường xanh, cách

dòng suối lớn khoảng 10 m trong Khu bảo t n thiên nhiên đề xuất Pu Hoat,

huyện Quế Phong, tỉnh Nghệ An, Việt Nam . Sau đó loài này được tìm thấy tại

các khu bảo t n thiên tỉnh S n La, Thanh Hóa, Hòa Bình hay miền bắc Việt

Nam, phía tây sông H ng và phần liền kề với Lào. Đây là m t loài ếch thu c

họ Rhacophoridae đặc hữu của Việt Nam.

- Một số đặc điểm sinh học, sinh thái: mẫu vật duy nhất của loài Nhái

cây quang được thu vào khoảng 19:00 ở trên lá cây, cách mặt đất khoảng 1,5 m

22

ở gần suối nh (cách suối khoảng 2 m). Sinh cảnh chính ven bờ suối là cây gỗ

vừa và nh xen cây bụi và dư ng xỉ. Trứng trong các cụm lá nhô ra vũng nước

nông hoặc vũng nước. Trong sáu ly hợp được đếm, số trứng dao đ ng từ 7 đến

18 (trung bình 11). Trứng có màu kem và được bọc trong m t viên nang

gelatin( Rowley et al. 2011).

Phân bố: Loài mới phát hiện năm 2011 ở Khu Bảo t n Thiên nhiên Pù

Hoạt (Nghệ An) và Khu Bảo t n Thiên nhiên Xuân Liên (Thanh Hóa).

Giá trị sử dụng: Khoa học, ngu n gen hiếm

Hình ảnh

Ảnh: Nguyễn Thiên Tạo

8. Gracixalus quyeti (Nguyen, Hendrix, Böhme, Vu, and Ziegler, 2008)

Mẫu vật nghiên cứu:

Loài ếch cây có kích thước nh (SVL 34 mm), không có răng v nanh. Đầu dài

h n r ng. Mõm tròn, dài h n đường kính ngang của mắt. Khoảng cách giữa hai

mắt dài h n chiều r ng của mí mắt trên. Lỗ mũi tròn, gần mõm h n mắt. Đ ng

tử hình bầu dục, nằm ngang. Màng nhĩ khác biệt, tròn, r ng h n đĩa của ngón

23

III. Supratympanic gấp không rõ ràng. Rìa da dọc theo mặt ngoài của cẳng tay,

xư ng chày, tarsus và ngón chân IV vắng mặt. Da không sần hoặc quay tròn;

mặt lưng của đầu, lưng và phần trên của sườn được bao phủ bởi những củ nh

sắc nhọn. Hoa văn màu nâu sẫm tạo thành hình chữ Y ngược, đáng ch ý là

m t đi m hình tam giác giữa hai mắt chia thành hai dải tiếp tục ở phía sau trên

lưng. Cổ họng và rìa họng và ngực màu trắng vàng với vân nâu.

Phân bố:

Hiện tại được biết đến từ Vườn quốc gia Phong Nha- Kẻ Bàng, dãy

Trường S n, miền trung Việt Nam, phía tây miền trung Lào.

Ảnh: Lê Khắc Quyết

9. Gracixalus sapaensis Matsui, Ohler, Eto, and Nguyen, 2017

Mẫu vật nghiên cứu:

Mẫu vật đực có chiều dài c th 30-36,9 mm, chiều dài đầu ngắn h n chiều

r ng. Mõm tròn, mắt lớn, lưng màu nâu vàng có các nốt sần màu vàng nhạt

(1) kích thước từ nh đến trung bình (con đực 21-37 mm, con cái 27-40

mm SVL), (2) mõm tròn, (3) da lưng gần như nhẵn, (4) mí mắt trên và lưng

24

thiếu gai, (5) không có hình chiếu xung quanh, (6) Khớp chày cổ chân đến mắt

khi chân áp sát vào c th , (7) màng b i kém phát tri n với các đốt ngón tay không có màng b i r ng ở ngón chân thứ tư thường là 3 ở mặt trong và 23/4 ở

mặt ngoài, (8) mặt lưng h i xám đến nâu đ , với các mảng màu nâu đậm h n

trên mí mắt trên và ngang ra sau, tạo thành chữ X , (9) sườn và bụng sáng màu

Phân bố: Loài này hiện chỉ tìm thấy tại vùng n i cao 1800-2500 mét tại

dãy n i Hoàng Liên S n thu c Việt Nam.

Ảnh: Nguyễn Thiên Tạo

10. Gracixalus supercornutus (Orlov, Ho, and Nguyen, 2004)

Mô tả:

Đầu : Đầu r ng, mõm nhọn. Mắt to (đường kính 3,8 mm). Phía trên mắt

có 6 gai nhọn kích thước khác nhau xếp làm hai hàng, 4 gai nh h n ở vùng

gian mắt. Dọc phía trên lưng còn có m t số gai nh khác, da h i sần sùi. Mũi

hình oval, cắt thẳng đứng về hai bên trong m t củ l i lớn. Các nốt sần rất phát

tri n ở trên màng nhĩ, gót chân và trên hậu môn. Màng nhĩ r ng (đường kính

2,3 mm), chiếm khoảng 60,5% đường kính mắt và cách mắt m t khoảng bằng

25

1/2 đường kính màng nhĩ. Gờ trên màng nhĩ yếu. Không có răng lá mía, lỗ

Choan tròn

Chi: Đ dài các ngón tay: I

r ng. Củ dưới khớp lớn. Củ bàn trong to, rõ. Chân dài gấp 2,5 lần tay. Cẳng

chân bằng 57,4% dài thân. Đ dài các ngón chân: I

dài, với đĩa tròn. Riềm da dọc theo gờ ngoài của chi trước và gờ trong cổ chân.

Củ dưới khớp tròn: 1, 1, 2, 3, 2. Có gờ trong bàn chân. Củ bàn trong tròn. Màng

giữa các ngón phát tri n. Đĩa ngón chân nh h n đĩa ngón tay

Mầu sắc: Lưng xanh với những vết nâu không cố định dọc thân tạo thành

hình như dạng chữ tượng hình. Bụng sáng với các vết trắng ở phần trước bụng

cũng như họng. Mặt bụng sần sùi nhất là phần cuối thân. Phía bên thân, dưới

mắt và màng nhĩ có đốm sáng trắng kéo đến tận đầu cánh tay. Trên tay và chân có

những vệt ngang nâu nhạt. Vệt nâu nhạt phía trên màng nhĩ. Vùng gian mắt và

trên đầu có vết nâu hình chữ Y. Khi ngâm c n mầu xanh của mẫu trở nên h i

vàng, những đốm trắng biến mất. Các mầu khác vẫn giữ giống như mẫu sống

Kích thước: Dài thân con cái 28,6-32,1 mm; con đực 22-24,1 mm

Vật mẫu nghiên cứu: Holotyp ZISP 7248 (Fn 03910); Paratyp ZISP

7249 (Fn 03963), ZISP 7250 (Fn 03964), IEBR 332, IEBR 333

Sinh học, sinh thái: Chỉ có m t ít số liệu liên quan đến các mẫu chuẩn:

Mẫu tìm thấy trên các lá, bụi cây ven suối đá chảy từ trên n i cao len l i giữa

rừng ẩm, dưới tán cây. Các ổ trứng với nòng nọc (từ 2-10 trứng m t ổ) ở nhiều

giai đoạn phát tri n khác nhau, nằm trong lớp v bằng chất keo trong suốt tìm

thấy ngày 22/10/2003 ven bờ đất sét dốc của m t con suối nh ở KBTTN Bà

Nà, Đà Nẵng. M t ổ có m t con đực ng i trên m t cái lá bên cạnh đang canh

gác. Các ổ trứng đều bám ở đầu dưới của lá, đám keo trong suốt của m t ổ đã

chẩy dài xuống chuẩn bị cho nòng nọc r i xuống nước.

Phân bố: Việt Nam: Thừa Thiên-Huế (Bạch Mã), Đà Nẵng (Bà Nà),

Kon Tum (Kon Plông)

26

Thế giới: Chưa tìm thấy

Giá trị sử dụng: Loài đặc hữu của Việt Nam

Ảnh: Nguyễn Thiên Tạo

11. Gracixalus trieng Rowley, Le, Hoang, Cao, and Dau, 2020

Đặc đi m chung: C th c trung bình (37,2 mm), chiều dài đầu bằng

91% chiều r ng đầu, mõm tròn r ng khi nhìn từ trên xuống, tròn ở mặt, Mắt

tròn, vượt kh i mõm; vùng má h i xiên, vùng mắt l i, lỗ mũi tròn, h i nhô cao,

gần mõm h n mắt; lỗ mắt hình bầu dục, ngang, màng nhĩ rõ, xấp xỉ m t phần

ba đường kính mắt, không có răng hàm trên, lỗ mũi trong nh , tròn, cách nhau

khoảng gấp sáu lần đường kính lỗ mũi; Gốc lư i gắn vào thềm miệng, đầu lư i

xẻ đôi sâu. Nếp gấp phía trên rõ ràng, kéo dài từ mắt đến nách. Có t i kêu,

được nối với khoang hai bên bằng cặp lỗ hở hình bầu dục, rõ ở hàm dưới.

Chi trước kh e, ngón tay hẹp; tỉ lệ giữa các ngón I

ngón tay nở r ng thành đĩa bám, có rãnh chia đôi; đĩa tư ng đối r ng so với

chiều r ng ngón tay (đĩa ngón thứ ba 239% chiều r ng của ngón tay thứ ba),

chiều r ng đĩa ngón thứ ba lớn h n (131%) so với đường kính màng nhĩ; Có ít

màng b i ở ngón tay, có ở ngón tay II – IV. Các nốt sần dưới da nổi rõ, tròn,

công thức 1, 1, 2, 2. Có các nốt sần ở lòng bàn tay; không lớn; Có nốt sần nh ở

lòng bàn tay, không đều, phẳng; củ bàn trong thuôn dài, hình bầu dục; riêng

biệt, miếng da có mặt ở bên trong bề mặt của ngón tay trước và mặt lưng và

mặt trong của ngón I và II.

27

Tỉ lệ của các ngón chân I

Mặt lưng nhẵn, h i có nốt sần nhẵn, không đều. Bề mặt bụng của đùi và bụng nốt sần nh , họng có nhiều nốt sần nh . Không có viền da trên các chi, không có các tuyến trên ngực riêng biệt.

Màu sắc: Bề mặt lưng màu nâu (màu nâu) hoặc màu vàng nâu (về đêm) với m t thanh ngang xen kẽ tối h n và đánh dấu hình chữ Y ngược ở phía sau bắt đầu giữa mắt và che hầu hết đầu; các chi có vạch màu nâu sẫm. Ngón tay màu nâu hoặc vàng nâu, có màng màu nâu h ng. Cánh có đốm màu nâu và h ng đậm (ban ngày) hoặc vàng và h ng (về đêm). Cổ họng và ngực chủ yếu là màu nâu vàng, với đốm nâu h ng đậm (ban ngày) hoặc vàng với đốm h ng (về đêm); bề mặt bụng và bụng của tay chân bao g m bàn tay và bàn chân màu nâu h ng (ban ngày) hoặc h ng (về đêm). Đ ng tử màu vàng nhạt với m t mạng lưới thưa thớt vàng mịn tinh tế vàng đậm h n t a ra từ các cạnh trước và sau của đ ng tử; mống mắt ngoại vi màu đen; mắt ngoại vi màu xanh nhạt sau

Phân bố: Kon Tum, Việt Nam N i sống: Sống trong rừng thường xanh, trên hốc cây

Ảnh: Nguyễn Thiên Tạo

28

12. Gracixalus yunnanensis Yu, Li, Wang, Rao, Wu, and Yang, 2019

Mô tả. Chiều r ng đầu lớn h n so với chiều dài; mõm tròn, h i nhô ra

ngoài rìa hàm dưới; vùng má xiên, h i lõm; lỗ mũi hình bầu dục, nhô ra, gần

mõm h n mắt; mắt lớn, đường kính ngang bằng chiều dài mõm; lỗ mắt hình

bầu dục, ngang; màng nhĩ khác biệt, đường kính nh h n m t nửa đường kính

mắt; nếp gấp rõ, kéo dài từ góc sau mắt đến phía trên cánh tay; không có răng

lá mía; đầu lư i xẻ đôi; m t cặp t i kêu trên miệng của cả hai góc; m t t i âm

thanh bên ngoài.

Tay trước tư ng đối kh e; chiều dài cẳng tay và bàn tay chiếm khoảng

47% chiều dài thân; tỉ lệ chiều dài giữa các ngón I

tri n với các rãnh xung quanh; đĩa ngón thứ ba lớn, h i r ng h n màng nhĩ;

màng giữa các ngón m ng; củ hình trụ nổi bật, tròn, đ n, công thức 1, 1, 2, 2;

m t củ bàn trong xư ng bàn tay, hình bầu dục; m t củ bàn ngoài xư ng bàn

tay, tròn.

Gót chân ch ng lên nhau khi chân vuông góc với c th ; chiều dài tư ng

đối của ngón chân I

vòng tròn; đĩa ngón chân nh h n đĩa ngón tay; ngón chân có màng, công thức

tạo màng I1.5–2II1.5–2.7III.5–3IV2.5–1.5V; củ l i hình trụ khác biệt và tròn,

công thức 1, 1, 2, 3, 2.

Mặt lưng rải rác với nhiều gai hình nón nh trên đầu, mí mắt trên và lưng;

sườn của c th và mặt lưng của chân tay mịn màng, m t vài gai hình nón nh

trên chân sau và cẳng tay; cổ họng, ngực, bụng và mặt bụng của đùi; m t vài gai

nh hình nón nằm rải rác trên mặt bụng của đùi, xư ng chày và cẳng tay.

Màu sắc của mẫu vật: Mẫu sống: con ngư i màu đ ng; mặt lưng màu

nâu vàng với m t dấu hình chữ Y màu nâu sẫm ngang qua lưng, bao phủ vùng

giao thoa và mí mắt sau, chia thành hai nhánh trên vai và đến phía sau lưng;

chân tay màu nâu với các thanh màu nâu sẫm; hai bên đầu màu nâu nhạt; sườn

vàng nâu, lốm đốm với màu h ng nhạt ở phần dưới; các đốm đen nh rải rác

29

dày đặc ở phần dưới của sườn, vùng thái dư ng và hàm trên; bề mặt bụng da

trong suốt, cằm có đốm vàng; miếng đệm và đĩa đệm màu vàng nhạt.

Phân bố. Ở Việt Nam, loài này được biết đến từ Lào Cai và Nghệ An.

3.2. Phân tích môi quan hệ di truyển các loài trong giống Gracixalus

3.2.1. Sự sai khác di truyền giữa các loài trong giống Gracixalus ở Việt

Nam dựa trên đoạn gen 16S-rARN

Trong nghiên cứu này, ch ng tôi sử dụng 32 trình tự của đoạn gen 16S

rARN được giải mã có chiều dài trung bình 550 nucleotide của các loài thu c

giống Gracixalus thu ở các địa đi m khác nhau ở Việt Nam và các trình tự so

sánh được tham khảo từ ngân hàng gen dựa theo tài liệu của Nguyen et al.

2008, Rowley et al. 2011, 2013, 2015, 2020, Matsui et al. 2015, Frost et al.

2006, Mo et al. 2013, Wang et al. 2018, Chen et al. 2018, Li et al. 2009, Zeng

et al. 2017 (địa đi m thu mẫu xem bảng 3.1). Trình tự của loài Rhacophorus

reinwardtii được sử dụng làm nhánh ngoài.

Bảng 3.1. Thông tin các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu

TT

Tên khoa học

Số hiệu mẫu

Nơi thu mẫu

Mã ngân hàng gen

Gracixalus

Nghe An,

Nguồn tham khảo Rowley et

1.

VNMN 03012

JN862546

ananjevae

Vietnam

al. 2011

Ha Giang,

Frost et al.

2.

G. gracilipes

AMNH A163897

DQ283051

Vietnam

2006

Rowley et

3.

G. gracilipes

AMS R 177672

Lao Cai, Vietnam KT374014

al. 2015

Guangdong,

Wang et al.

4.

G. guangdongensis

SYS a005750

MG520197

China

2018

Guangdong,

Wang et al.

5.

G. guangdongensis

SYS a004902

MG520193

China

2018

Li et al.

6.

G. jinxiuensis

KIZ 061210YP

Guangxi, China

EU215525

2008

Zeng et al.

7.

G. jinxiuensis

SYS a002183

Guangxi, China

KY624585

2017

30

TT

Tên khoa học

Số hiệu mẫu

Nơi thu mẫu

Mã ngân hàng gen

Nguồn tham khảo Zeng et al.

8.

G. jinggangensis

SYS a003186

Jiangxi, China

KY624587

2017

Kon Tum,

Rowley et

9.

G. lumarius

AMS R176202

KF918412

Vietnam

al. 2013

Kon Tum,

Rowley et

10.

G. lumarius

AMS R173838

MT328247

Vietnam

al. 2020

Mo et al.

11.

G. nonggangensis NHMG 200910010 Guangxi, China

JX841318

2013

Lai Chau,

12.

G. quangi

VNMN05723

This study

Vietnam

Nghe An,

Rowley et

13.

G. quangi

AMS R173417

JN862539

Vietnam

al. 2011

Quang Binh,

Nguyen et

14.

G. quyeti

VNUH 160706

EU871428

Vietnam

al. 2008

Quang Binh,

Nguyen et

15.

G. quyeti

ZFMK 82999

EU871429

Vietnam

al. 2008

Li et al.

16.

G. sapaensis

CIB XM-439

Lao Cai, Vietnam GQ285670

2009

Matsui et al.

17.

G. sapaensis

KUHE 46402

Lao Cai, Vietnam

LC011939

2015

Kanchanaburi,

Matsui et al.

18.

G. seesom

KUHE 35084

LC011932

Thailand

2015

Kon Tum,

Rowley et

19.

G. supercornutus

AMS R173887

JN862545

Vietnam

al. 2011

Kon Tum,

20.

G. supercornutus

VNMN08028

This study

Vietnam

Rowley et

21.

G. supercornutus

AMS R176287

Gia Lai, Vietnam KT374016

al. 2015

Chen et al.

22.

G. tianlinensis

NHMG 1705015 Guangxi, China MH117960

2018

Chen et al.

23.

G. tianlinensis

NHMG 1705016 Guangxi, China MH117961

2018

31

TT

Tên khoa học

Số hiệu mẫu

Nơi thu mẫu

Mã ngân hàng gen

Kon Tum,

Nguồn tham khảo Rowley et

24.

G. trieng

AMS R176206

MT328246

Vietnam

al. 2020

UNS 00342/AMS

Kon Tum,

Rowley et

25.

G. trieng

MT328245

R176205

Vietnam

al. 2020

Cao Bang,

Nguyen et

26.

G. waza

IEBR A.2012.2

JX896681

Vietnam

al. 2013

Cao Bang,

Nguyen et

27.

G. waza

VNMN A.2012.2

JX896684

Vietnam

al. 2013

Matsui et al.

28.

G. yunnanensis

VNMN 4357

Lao Cai, Vietnam

LC140986

2017

Yu et al.

29.

G. yunnanensis

KIZ 20160223

Yunnan, China MK234879

2019

30.

Gracixalus sp

MCC.2018.15

Yen Bai, Vietnam

This study

31.

Gracixalus sp

MCC.2018.35

Yen Bai, Vietnam

This study

Li et al.

32.

Gracixalus sp

03320Rao

Yunnan, China

GQ285669

2009

Malaysia,

Haas et al.

33.

R. reinwardtii

NMBE 1056516

JN377364

Sarawak

2011

Malaysia,

Haas et al.

34.

R. reinwardtii

CAS 219931

JN377365

Sarawak

2011

Thành phần phần trăm các nucleotide trong trình tự sử dụng đ xây dựng

cây phát sinh chủng loại: T: 22,1; C: 24,4; A: 32,5; G: 21. Sự sai khác các Nu

giữa các loài trong nhóm: S: 13/542; V: 165/542.

Phân tích mối quan hệ di truyền của các loài trong giống Gracixalus theo

hai phư ng pháp ML (Maximum likelihood) và BI (Bayesian Inference) đã cho

kết quả tư ng tự nhau. Kết quả phân tích theo phư ng pháp BI được trình bày ở

hình 3.1 chỉ ra mối quan hệ của các loài Gracixalus ở Việt Nam. Trong đó giá

trị xác xuất hậu nghiệm ở gốc nhánh (bootstrap) lớn h n hoặc bằng 70 đối với

ML và 95 đối với BI được cho là đáng tin cậy (Hình 3.1).

32

Ba nhánh tiến hóa được tách biệt rõ ràng: nhánh A g m các loài

Gracixalus trieng, Gracixalus sp; G. sapaensis, G. tianlinensis; G. ananjevae;

G. yunnanensis; G. jinxiuensis; G. guangdongensis và G. nonggangensis;

nhánh B g m các loài G. seesom; G. quyeti; G. gracilipes; G. supercornutus và

G. quangi và nhánh C duy nhất m t loài G. lumarius tách biệt.

Nhóm A: Loài Gracixalus trieng tách biệt với các loài còn lại, trong khi

đó các loài Gracixalus sp; G. sapaensis, G. tianlinensis có mối quan hệ gần gũi

với giá trị xác suất hậu nghiệm cao 100% ở dạng cây BI và 89% ở dạng cây

ML, tạo thành m t nhóm có sự sai khác di truyền trong khoảng 2.43 -2.86%, và

quần th loài Gracixalus sp mới mẫu vật thu được ở Yên Bái có th là loài mới

cho khoa học. Các loài G. ananjevae; G. yunnanensis; G. jinxiuensis; G.

guangdongensis cũng tạo thành nhóm có mối quan hệ gần gũi mặc dù giá trị

xác suất hậu nghiệm ở gốc nhánh không cao 77 ở dạng cây BI và 72 ở dạng cây

ML và khoảng cách di truyền 4.13 – 6.84% (Bảng 3.2). Loài G. waza được cho

là tên đ ng danh của loài G. nonggangensis với khoảng cách di truyền giữa các

quần th trong khoảng 1.2-1.7% (Bảng 3.2) với giá trị xác suất hậu nghiệm

tuyêt đối 100% ở cả hai dạng cây BI và ML.

Nhóm B: Các loài G. seesom; G. quyeti; G. gracilipes; G. supercornutus

và G. quangi có quan hệ gần gũi với giá trị xác suất hậu nghiệm cao 100% ở

dạng cây BI và 91% ở dạng cây ML, khoảng cách di truyền trong nhóm giao

đ ng từ 3,44 – 6,08% (Bảng 2)

Nhóm C: g m duy nhất loài G. lumarius tách biệt và khoảng cách di

truyền với các loài còn lại từ 16,41 – 18, 46% (Bảng 3.2)

33

Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại BI phân tích từ trình tự gen ti thể 16S

rRNA với độ dài 542 nucleotid các loài thuộc giống Gracixalus và các loài

ngoài nhóm. Các số nhánh trên và nhánh dƣới lần lƣợt là xác suất sau

Bayes (BPP) và ML bootstrap (chỉ các giá trị trên 70% đƣợc hiển thị).

34

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

1. Gracixalus sp

5.49 2.33

2. Gracixalus ananjevae

3. G. gracilipes

11.45 12.47 12.07

4. G. guangdongensis

4.41 5.24 4.35 11.08

5. G. jinggangensis

5.88 8.25 7.80 12.08 5.69

6.26 7.98 7.90 12.11 5.45 7.28

6. G. jinxiuensis

16.90 16.75 16.76 17.85 16.41 17.00 18.46

7. G. lumarius

8. G. nonggangensis

7.32 9.26 8.63 14.66 6.70 7.65 9.70 19.36

10.29 10.95 10.98 5.13 9.17 8.46 11.24 16.69 12.62

9. G. quangi

10.78 12.15 12.63 7.66 11.06 11.51 10.78 15.32 12.94 5.55

10. G. quyeti

2.86 6.89 6.59 11.79 5.48 6.65 7.14 18.26 8.60 10.05 10.28

11. G. sapaensis

8.95 10.92 11.76 6.56 9.29 10.59 10.40 18.77 11.15 6.08 7.59 9.32

12. G. seesom

13. G. supercornutus

11.72 12.01 12.26 6.97 10.47 9.98 12.28 17.83 13.76 2.66 6.04 11.50 7.52

14. G. tianlinensis

2.43 6.88 6.59 11.57 4.55 6.84 6.09 17.43 7.48 10.48 10.04 3.46 8.25 11.96

3.74 5.33 5.56 11.28 3.44 5.23 5.78 16.16 7.05 8.68 9.10 4.74 8.18 10.04 4.11

15. G. trieng

7.21 10.19 9.52 15.13 7.17 8.10 8.71 19.32 2.72 13.37 13.20 8.26 11.26 14.51 6.75 7.07

16. G. waza

17. G. yunnanensis

4.09 5.24 4.13 11.53 2.13 5.23 6.06 16.23 7.07 9.13 10.68 5.24 9.52 9.87 4.43 4.12 6.95

Bảng 3.2. Khoảng cách di truyền 16S-rARN giữa các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam

35

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ

1. Kết luận

Nghiên cứu này cung cấp những thông tin cập nhật về phân loại và mối

quan hệ di truyền các loài thu c giống Gracixalus ở Việt Nam, với những đóng

góp cụ th sau:

- Ghi nhận ở Việt Nam có tổng số 10 loài thu c giống Gracixalus ở

Việt Nam.

- Về quan hệ di truyền, các loài ếch nhái thu c giống Gracixalus ở Việt

Nam tập hợp thành 3 nhóm. M t số quần th có sự khác biệt về hình thái và

khoảng cách di truyền có th là loài mới cho khoa học.

2. Kiến nghị

2.1. Nghiên cứu tiếp theo

Tiến hành nghiên cứu bổ sung và chuyên sâu về phân loại học về các

loài ếch cây nh giống Gracixalus.

Mô tả các quần th có sự tách biệt rõ rệt về di truyền thu c Gracixalus

ở Việt Nam là các loài mới.

2.2. Đề xuất kiến nghị đối với bảo tồn

Thực hiện các giải pháp bảo t n với các loài đặc hữu có phân bố ở

Việt Nam.

Các dữ liệu về sinh học sinh thái đặc biệt các nhóm loài có hình thái

phức tạp như âm sinh học, sự phát tri n của nòng nọc… là rất cần thiết bổ sung

cho việc phân loại học cũng như công tác bảo t n loài ngoài tự nhiên.

36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A – Tài liệu tiếng Việt

1. Trần Kiên, Nguyễn Văn Sáng, H Thu Cúc (1981), Kết quả điều tra cơ

bản bò sát - ếch nhái miền Bắc Việt Nam (1956-1976), Kết quả điều tra cơ

bản động vật miền Bắc Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà N i.

2. Vũ Tự Lập (2009), Địa lí tự nhiên Việt Nam (Tái bản lần thứ 6), Nxb Đại

học Sư phạm Hà N i.

3. Hoàng Xuân Quang, Hoàng Ngọc Thảo, Ngô Đắc Chứng (2012), Ếch

nhái, bò sát ở vườn quốc gia Bạch Mã, Nxb Nông Nghiệp.

4. Nguyễn Văn Sáng, H Thu Cúc (1996), Danh lục bò sát và ếch nhái Việt

Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà N i

5. Nguyễn Văn Sáng, H Thu Cúc, Nguyễn Quảng Trường (2005), Danh lục

ếch nhái và bò sát Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà N i.

6. Lê Bá Thảo (2001), Thiên nhiên Việt Nam, Nxb Giáo dục Hà N i.

7. Đào Văn Tiến (1977), “Về khóa định loại ếch nhái Việt Nam”, Tạp chí

Sinh vật - Địa học, Hà N i, XV (2). tr. 33-40.

8. Uỷ ban Khoa học và kỹ thuật Nhà nước (1981), Kết quả điều tra cơ bản

động vật miền Bắc Việt Nam (phần bò sát, ếch nhái, Nxb Khoa học và Kỹ

thuật, Hà N i.

B – Tài liệu tiếng nƣớc ngoài

9. Boulenger GA (1893) Concluding report on the reptiles and batrachians

obtained in Burma by Signor L. Fea dealing with the collection made in

Pegu and the Karin Hills in 1887−88. Annali del Museo Civico di Storia

Naturale di Genov 13: 304–347.

10. Bourret R (1937) Notes herpétologiques sur l’Indochine française. XIV.

Les batraciens de la collection du Laboratoire des Sciences Naturelles de

l’Université. Descriptions de quinze espèces ou variétés nouvelles.

Annexe au Bulletin Général de l’Instruction Publique 1937: 5–56.

37

11. Chen W, Bei Y, Liao X, Zhou S, Mo Y (2018) A new species of

Gracixalus (Anura: Rhacophoridae) from West Guangxi, China. Asian

Herpetological Research 9: 74–84.

https://doi.org/10.11646/zootaxa.3616.1.5

12. Delorme M, Dubois A, Grosjean S, Ohler A (2005) Une nouvelle classi

cation générique et sub- générique de la tribu des Philautini (Amphibia,

Anura, Rhacophorinae). Bulletin Mensuel de la Société Linnéenne de

Lyon 74: 165–171. https://doi.org/10.3406/linly.2005.13595

13. Egert J, Luu VQ, Nguyen TQ, Le MD, Bonkowski M, Ziegler T (2017)

First record of Gracixalus quyeti (Amphibia: Anura: Rhacophoridae) from

Laos: molecular consistency versus morphological divergence between

populations on western and eastern side of the Annamite Range. Revue

suisse de zoologie 124(1): 47–51. https://doi.org/10.5281/zenodo.322663.

14. Fei L, Hu S, Ye C, Huang Y (2009) Fauna Sinica. Amphibia. Vol. 2

Anura. Science Press, Beijing, 957 pp.

15. Fei L, Ye CY, Huang YZ, Liu MY (1999) Atlas of amphibians of China.

Henan Science and Technology Press, 432 pp.

16. Frost DR, Grant T, Faivovich J, Bain HJ, Haas A, Haddad FBC, Rafael

ODS, Channing A, Wilkinson M, Donnellan CS, Christopher JR,

Jonathan AC, Boris LB, Paul M, Drewes RC, Nussbaum AR, Lynch DJ,

Green MG, Wheeler CW (2006) The amphibian tree of life. Bulletin of the

American Museum of natural History 297: 1–291.

17. Frost D.R. 2020. Amphibian Species of the World: and Online Reference.

Version 6.0. American Museum of Natural History, New York, USA.

http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/index.html/ [Accessed 27

August 2020].

18. Glaw F, Vences M (2007) A field guide to the Amphibians and Reptiles of

Madagascar. Third Edition, Frosch Verlag, Cologne.

38

19. Haas A, Hertwig ST, Krings W, Braskamp E, Dehling JM, Min PY,

Jankowski A, Schweizer M, Das I (2012) Description of three

Rhacophorus tadpoles (Lissamphibia: Anura: Rhacophoridae) from

Sarawak, Malaysia (Borneo). Zootaxa 3328(1): 1–19.

https://doi.org/10.5281/zenodo.208711.

20. Hu S, Fei L, Ye C (1978) Three new amphibian species in China.

Materials for Herpetological Research 4: 1–20.

21. Huelsenbeck JP, Hillis DM (1993) Success of phylogenetic methods in the

four taxon case. Systematic Biology 42: 247–264.

22. Katoh K, Standley DM (2013) MAFFT multiple sequence alignment

software version 7: improvements in performance and usability. Molecular

Biology and Evolution 30: 772–780.

https://doi.org/10.1093/molbev/mst010.

23. Leaché AD, Reeder TW (2002) Molecular systematics of the eastern fence

lizard (Sceloporus undulatus): a comparison of parsimony, likelihood, and

Bayesian approaches. Systematic Biology 51: 44–68.

24. Li JT, Che J, Bain RH, Zhao EM, Zhang YP (2008) Molecular phylogeny

of Rhacophoridae (Anura): A framework of taxonomic reassignment of

species within the genera Aquixalus, Chiromantis, Rhacophorus, and

Philautus. Molecular Phylogenetics and Evolution 48(1): 302–312.

https://doi.org/10.1016/j.ympev.2008.03.023.

25. Li JT, Che J, Murphy RW, Zhao H, Zhao EM, Rao DQ, Zhang YP (2009)

New insights to the molecular phylogenetics and generic assessment in the

Rhacophoridae (Amphibia: Anura) based on five nuclear and three

mitochondrial genes, with comments on the evolution of reproduction.

Molecular phylogenetics and evolution 53(2): 509–522.

https://doi.org/10.1016/j.ympev.2009.06.023.

39

26. Matsui M, Orlov N (2004) A new species of Chirixalus from Vietnam

(Anura: Rhacophoridae). Zoological Science 21: 671–676.

https://doi.org/10.2108/zsj.21.671.

27. Matsui M, Khonosue W, Panha S, Eto K (2015) A new tree frog of the

genus Gracixalus from Thailand (Amphibia: Rhacophoridae). Zoological

Science 32: 204–210. https://doi.org/10.2108/zs140238.

28. Matsui M, Ohler A, Eto K, Nguyen TT (2017) Distinction of Gracixalus

carinensis from Vietnam and Myanmar, with description of a new species.

Alytes 33: 25–37.

29. Mo Y, Zhang W, Luo Y, Zhou S, Chen W (2013) A new species of the

genus Gracixalus (Amphibia: Anura: Rhacophoridae) from Southern

Guangxi, China. Zootaxa 3616: 61–72.

https://doi.org/10.11646/zootaxa.3616.1.5.

30. Nguyen SV, Ho CT, Nguyen QT (2009) Herpetofauna of Vietnam,

Edition Chimaira, Frankfurt am Main, 768 pp.

31. Nguyen TQ, Hendrix R, Böhme W, Vu TN, Ziegler T (2008) A new

species of the genus Philautus (Amphibia: Anura: Rhacophoridae) from

the Truong Son Range, Quang Binh Province, central Vietnam. Zootaxa

1925: 1–13. https://doi.org/10.5281/zenodo.184786.

32. Nguyen TQ, Le MD, Pham CT, Nguyen TT, Bonkowski M, Ziegler T

(2013) A new species of Gracixalus (Amphibia: Anura: Rhacophoridae)

from northern Vietnam. Organisms Diversity & Evolution 13: 203–214.

https://doi.org/10.1007/s13127-012-0116-0.

33. Orlov NL, Ho TC, Nguyen QT (2004) A new species of the genus

Philautus from central Vietnam (Anura: Rhacophoridae). Russian Journal

of Herpetology 11: 51–64.

34. Rambaut A, Suchard MA, Xie D & Drummond AJ (2014) Tracer v1.6,

Available from http://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer.

40

35. Rowley J, Dau QV, Nguyen TT, Cao TT, Nguyen SN (2011) A new

species of Gracixalus (Anura: Rhacophoridae) with a hyperextended vocal

repertoire from Vietnam. Zootaxa 3125: 22–38.

https://doi.org/10.11646/zootaxa.3125.1.2.

36. Rowley J, Le DTT, Dau VQ, Hoang HD, Cao TT (2014) A striking new

species of phytotelm breeding tree frog (Anura: Rhacophoridae) from

central Vietnam. Zootaxa 3785: 25–37.

https://doi.org/10.11646/zootaxa.3785.1.2.

37. Rowley J, Dau VQ, Hoang HD, Nguyen TT, Le DTT, Altig R (2015) The

breeding biologies of three species of treefrogs with hyperextended vocal

repertoires (Gracixalus; Anura: Rhacophoridae). Amphibia-Reptilia 36(3):

277–285. https://doi.org/10.1163/15685381-00003007.

38. Rowley J, Le DTT, Hoang HD, Cao TT, Dau VQ (2020) A new species of

phytotelm breeding frog (Anura: Rhacophoridae) from the Central

Highlands of Vietnam. Zootaxa 4779: 341–354.

https://doi.org/10.11646/zootaxa.4779.3.3.

39. Simmons JE (2002) Herpetological collecting and collections

management. Revised edition. Society for the Study of Amphibians and

Reptiles, Herpetological Circular 31: 1–153.

40. Tanabe AS (2011) Kakusan 4 and Aminosan: two programs for comparing

nonpartitioned, proportional and separate models for combined molecular

phylogenetic analyses of multilocus sequence data. Molecular Ecology

Resources 11: 914–921. https://doi.org/10.1111/j.1755-0998.2011.03021.

41. Tavaré S (1986) Some probabilistic and statistical problems in the analysis of

DNA sequences. Lectures on Mathematics in the Life Sciences 17: 57–86.

42. Van Ende CN (2001) Repeated-measures analysis: growth and other time-

dependent measures. In: Scheiner S, Gurevitch J (Eds) Design and analysis of

ecological experiments. Chapman and Hall, New York, 134–157.

41

43. Wang J, Zeng Z, Lyu Z, Liu Z, Wang Y (2018) Description of a new

species of Gracixalus (Amphibia: Anura: Rhacophoridae) from

Guangdong Province, southeastern China. Zootaxa 4420: 251–269.

https://doi.org/10.11646/zootaxa.4420.2.7.

44. Ye C, Hu S (1984) A new species of Philautus (Anura: Rhacophoridae)

from Xizang Autonomous Region. Acta Herpetologica Sinica 3: 67–69.

45. Yu G, Li HH, Wang J, Rao D, Wu Z, Yang J (2019) A new species of

Gracixalus (Anura, Rhacophoridae) from Yunnan, China. ZooKeys 851:

91–111. https://doi.org/10.3897/zookeys.851.32157.

46. Zeng Z, Zhao J, Chen C, Chen G, Zhang Z, Wang Y (2017) A new species

of the genus Gracixalus (Amphibia: Anura: Rhacophoridae) from Mount

Jinggang, southeastern China. Zootaxa 4250: 171–185.

https://doi.org/10.11646/zootaxa.4250.2.3.

42