Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Định lượng một số hợp chất polyphenol và sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp polyphenol ở chè

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– NGUYỄN THANH HUYỀN

ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT POLYPHENOL

VÀ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA TỔNG HỢP POLYPHENOL Ở CHÈ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– NGUYỄN THANH HUYỀN

ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT POLYPHENOL

VÀ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA TỔNG HỢP POLYPHENOL Ở CHÈ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Thị Thu Yến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2019

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là

trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả

thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích

dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Tác giả

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Thu Yến đã định

hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất

trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh

học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ

bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã

nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và

nghiên cứu khoa học.

Đề tài luận văn nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ mã số

B2016-TNA-24.

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2019

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thanh Huyền

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii

MỤC LỤC ................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................. v

DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................... vii

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4

1.1. Tổng quan về cây chè .............................................................................. 4

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ........................................................................ 4

1.1.2. Đặc điểm hình thái................................................................................ 5

1.1.3. Thành phần hóa học của chè ................................................................. 6

1.1.4. Tác dụng sinh học của cây chè ............................................................. 7

1.2. Polyphenol ở chè ................................................................................... 10

1.2.1. Thành phần polyphenol ở chè ............................................................. 10

1.2.2. Con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè ........................................ 15

1.2.3.Thành phần catechins ở chè …………………………………..……....16

1.2.4. Con đường sinh tổng hợp catechins ở chè ………………………...... 19

1.3. Tình hình nghiên cứu polyphenol ở chè………......................................21

1.3.1 Tình hình nghiên cứu polyphenol chè trên thế giới .............................. 22

1.3.2 Tình hình nghiên cứu polyphenol chè ở Việt Nam ............................... 24

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 26

2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................ 26

2.1.2. Hóa chất, thiết bị ................................................................................ 26

2.2. Địa điểm và thời gian ............................................................................ 28

2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 28

2.3.1. Phương pháp thu mẫu lá chè ............................................................... 28

2.3.2. Phương pháp định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằng

HPLC ................................................................................................. 28

2.3.3. Phương pháp sinh học phân tử ............................................................ 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 36

3.1. Định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằng HPLC ................... 36

3.2. Định lượng sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp

polyphenol ở chè ................................................................................ 38

3.3. Mối liên quan giữa hàm lượng catechins với sự biểu hiện của gen LAR

và ANR ở chè trung du xanh và chè trung du tím ................................ 45

KẾT LUẬN ................................................................................................. 48

KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ABTS: 2,2'-azinobis(3-ethylebenzothiaziline-6-sulfonate)

ANR: Anthocyanidin reductase

BHA: Beta Hydroxy Acid

Butylated Hydroxy Toluene BHT:

Catechin C:

complementary DNA cDNA:

Deoxyribonucleic acid DNA:

1,1-diphenyl 2-picryl hydrazyl DPPH:

Epicatechin EC:

epicatechin gallat ECG:

EGC: Epigallocatechin

epigallocatechin gallat EGCG:

Gallocatechin GC:

LAR: Leucoanthocyanidin reductase

RNA: Axit ribonucleic

PAL: phenylalanine ammonialyaza

Đtg: Đồng tác giả

HPLC:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại khoa học của cây chè ...................................................... 5

Bảng 1.2. Thành phần các hợp chất polyphenol trong lá chè xanh .................. 7

Bảng 2.1. Các mẫu chè nghiên cứu ............................................................... 26

Bảng 2.2. Các chất chuẩn và pic ion nhận dạng ............................................ 29

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ......................................... 33

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA .................... 33

Bảng 2.5. Danh sách và trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu

định lượng sự biểu hiện của gen ................................................. 34

Bảng 3.1. Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan của các chất

tham chiếu ................................................................................. 37

Bảng 3.2. Hàm lượng các chất tham chiếu (mg/g) ........................................ 38

Bảng 3.3. Giá trị chu kì ngưỡng Ct của các gen trên hai mẫu chè chạy lần 1 43

Bảng 3.4. Giá trị chu kì ngưỡng Ct của các gen trên hai mẫu chè chạy lần 2 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Bảng 3.5. Giá trị ΔCt của các gen ở hai mẫu chè. ......................................... 44

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol ........... 8

Hình 1.2: Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol ............................................ 9

Hình 1.3. Các con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè ............................ 16

Hình 1.4. Các dẫn xuất của catechins……………………………………….18

Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp catechin ở chè……………………………………21

Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC tại 280 nm (A) và phổ ESI-MS negative của 5

chất chuẩn C (1), GC (2), EGC (3), EGCG (4), ECG (5) (B-F). ... 36

Hình 3.2. Sắc ký đồ UV 280nm của 05 chất chuẩn (A) và 08 mẫu thí nghiệm . 37

Hình 3.3. Đồ thị khuếch đại của các gen trong phản ứng real-time. .............. 41

Hình 3.4. Biểu đồ đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại trong các ống

phản ứng ....................................................................................... 43

Hình 3.5. Biểu đồ so sánh sự biểu hiện của hai gen LAR, ANR trong hai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

mẫu chè tím và chè xanh. CT: chè tím, CX: chè xanh ................... 45

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cây chè (Camellia sinensis O. Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm,

có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, là cây trồng xuất hiện từ lâu

đời, có ảnh hưởng lớn đến cuộc sống nhân loại và có bề dày lịch sử phát triển.

Chè là loại nước uống phổ biến nhất mang tính toàn cầu. Việc uống chè

truyền thống đã giúp cho con người dần dần nhận biết những giá trị đích thực

của chè đối với sức khỏe, những cảm nhận ban đầu của người dùng chè lâu

năm đã từng bước kiểm chứng và khẳng định thông qua hàng trăm công trình

nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về các hợp chất thiên nhiên có

trong chè. Nước chè có tác dụng giải khát, khắc phục được sự mệt mỏi của cơ

bắp và hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh

mẫn sảng khoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về

trí óc và chân tay, ngăn chặn sự phát triển và tiến triển của bệnh Alzheimer

[30], làm giảm khả năng hình thành sỏi thận [44]. Nhiều nhà nghiên cứu cho

rằng, chè cũng là một loại thuốc, một cây cho kháng sinh tốt mà không độc

đối với cơ thể con người, chữa được một số bệnh đường ruột như kiết lị, tiêu

chảy, lợi tiểu [16]... Hơn nữa, uống chè còn kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo

phì [38]; chống viêm [35]; chống sâu răng, hôi miệng và ung thư vòm họng

[28]; phòng ngừa ung thư [18]; phòng ngừa bệnh tăng huyết áp [26]; tiểu

đường [25] và ngăn ngừa cholesteron tăng cao [29]. Ngoài ra, chè còn có khả

năng bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím [28]. Chè cũng được cho là ức chế

sự xâm nhiễm và sinh sản của HIV [31]. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức

khỏe được liệt kê ở trên đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol

có trong chè. Ở Việt Nam việc nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh dược

học của các polyphenol khai thác từ chè với mục đích phục vụ y - dược học là

một hướng nghiên cứu mới; mới dừng lại ở kinh nghiệm dân gian đơn giản;

chưa quan tâm khai thác nguồn nguyên liệu giàu các chất polyphenol thiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nhiên từ chè vào mục đích phòng và chữa bệnh cho con người.

Mặt khác, chất lượng của sản phẩm chè ngoài phụ thuộc vào công nghệ

chế biến còn chịu ảnh hưởng rất lớn bởi chất lượng nguyên liệu sử dụng. Có

khoảng 120 – 130 hoạt chất khác nhau trong cây chè và chúng sắp xếp thành

các nhóm sau: nhóm đường; nhóm pectin; nhóm tinh dầu; protein và axit

amin; các sắc tố; các chất vô cơ; vitamin; các enzyme; chất nhựa; các chất

hữu cơ; các hợp chất thứ cấp (polyphenol, tannin, cafein….). Trong đó hàm

lượng polyphenol, sẽ quyết định đến chất lượng của sản phẩm chè [6]. Có rất

nhiều các hợp chất polyphenol được tìm thấy ở chè, cả polyphenol đơn giản

và polyphenol phức tạp, trong đó flavonoid là thành phần polyphenol chủ yếu

được tổng hợp từ các polyphenol đơn giản [9]. Các thành phần hàm lượng

polyphenol này lại thay đổi rất lớn theo giống và chất lượng nguyên liệu. Vì

vậy việc nghiên cứu, điều tra tìm ra những vùng chè, giống chè có hàm lượng

và chất lượng polyphenol ưu việt để định hướng khai thác một cách có hiệu

quả nguồn nguyên liệu phong phú này vào mục đích phục vụ sức khỏe cộng

đồng là một hướng nghiên cứu mới, cần thiết và có nhiều triển vọng.

Việt Nam là một trong những quốc gia có diện tích trồng chè lớn, có

nhiều vùng chè với các đặc điểm sinh thái đặc trưng, trồng nhiều giống chè

khác nhau. Trong đó, giống chè Trung du từ lâu đã được coi là khởi thủy của

cây chè Việt Nam, có khả năng chịu bệnh, chịu hạn, sinh trưởng mạnh, giá trị

kinh tế cao, bảo vệ môi trường sinh thái. Tuy nhiên do đã được trồng nhiều

năm nên dần bị thoái hóa năng suất và chất lượng thấp [2][10] cần bảo tồn và

nghiên cứu để phục vụ các lợi ích của cây chè đặc biệt là khả năng chữa bệnh.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Định

lượng một số hợp chất polyphenol và sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme

tham gia tổng hợp polyphenol ở chè”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Định lượng một số hợp chất polyphenol ở các giống chè trồng tại Thái

Nguyên và nghiên cứu mối liên quan với sự biểu hiện của gen từ giống chè

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Trung du.

3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Chiết xuất và định lượng một số hợp chất polyphenol từ lá

của một số giống chè trồng ở Thái Nguyên.

Nội dung 2: Nghiên cứu định lượng sự biểu hiện ở mức độ phiên mã

của gen LAR và ANR tham gia tổng hợp một số hợp chất catechins ở chè

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Trung du.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây chè

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại

Theo Trịnh Xuân Ngọ (2009)[14] cây chè có nguồn gốc từ Đông Nam

Á. Đây là một loại cây công nghiệp lâu năm, cho hiệu quả kinh tế cao, được

trồng ở hơn 30 quốc gia. Những nước trồng chè phổ biến là: Trung Quốc, ấn

Độ, Srilanca, Nhật Bản, Nga, Đài Loan, Việt Nam….Việt Nam là một trong

những nước có tiềm năng và điều kiện thuận lợi để phát triển sản xuất chè:

diện tích đất theo qui hoạch để trồng chè rất lớn (trên 200.000 ha); điều kiện

khí hậu rất phù hợp cho cây chè phát triển: lắm nắng, mưa nhiều - lượng nước

mưa trung bình 1700 - 2000mm/ năm, độ ẩm không khí 80 -85%, - nhiệt độ

trung bình 21 - 22,60C; đất trồng chè gồm hai loại là phiến thạch sét và bazan

màu mỡ … Ngày nay, ở hầu hết các tỉnh có điều kiện thuận lợi đều trồng chè,

song ba vùng trồng nhiều nhất là:

- Vùng chè thượng du (Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái)

chiếm khoảng 25% sản lượng chè miền Bắc.

- Vùng trung du (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên). Đây là

vùng chè chủ yếu chiếm đến 75% sản lượng chè miền Bắc với nhiều nhà máy

sản xuất lớn.

- Vùng chè Tây Nguyên (Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đắc Lắc) chủ

yếu trồng giống chè Ấn Độ và chè shan, chè Ô long.

Trong đó vùng chè Thái Nguyên là vùng có sản lượng chè lớn thứ 2

trong cả nước và rất nổi tiếng với sản phẩm chè đặc sản Tân Cương. Thái

Nguyên hiện có 16746 ha chè, trồng chủ yếu là các giống Trung du

(TDLX, LDP1).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Về phân loại khoa học cây chè được thể hiện trong bảng 1.1:

Bảng 1.1. Phân loại khoa học của cây chè [14]

Phân loại khoa học

Giới Plantee

Ngành Magnoliopsida

Bộ Ericale

Họ Theaceae

Chi Camellia

Loài C.sinensis

1.1.2. Đặc điểm hình thái

Cây chè có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 30, thuộc loại thân gỗ hoặc

thân bụi và được trồng để thu lá làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và

mang một số đặc điểm sinh học sau đây:

- Hình thái:

Thân: thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và

chồi. Trên thân có mấu chia thành nhiều lóng.

Cành: do mầm dinh dưỡng biến đổi thành. Trên cành chia ra làm nhiều

đốt, chiều dài đốt cành biến đổi từ 1 – 10 cm tùy theo giống và điều kiện sinh

trưởng.

Chồi: mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh

dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả.

Lá: lá chè là loại lá hình đơn nguyên, có hệ gân lá rất rõ, rìa lá có răng

cưa, chiều dài từ 4 – 15 cm, rộng từ 2 – 5 cm.

Hoa: hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng,

có khi lại hơi phớt hồng.

Quả: quả chè là một loại quả nang có từ 1 - 4 hạt. Quả chè có dạng hình

tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt.

Hạt: hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nâu, cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng.

Hệ rễ: gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu

đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà [2].

- Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè: Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là 22 - 28oC, độ ẩm không khí tương đối

thích hợp là 80 - 85 %. Hàm lượng nước cần thiết cho cây chè biến động tùy

từng giống chè. Loại đất thích hợp cho trồng chè dày 60 - 100 cm; mực nước

ngầm dưới 100 cm; độ chua pH: 4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn 3 - 4 %[3].

- Sinh trưởng và phát triển của cây chè: Sự phát triển của cây chè chia làm

hai chu kỳ: chu kì phát triển lớn gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy

mầm đến khi cây chết và chu kì phát triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh

trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một năm[2][3].

1.1.3. Thành phần hóa học của chè

Thành phần chính của lá chè là nước chiếm 75-82%, có liên quan đến

quá trình biến đổi sinh hóa trong búp chè và đến sự hoạt động của các

enzyme, là chất quan trọng không thể thiếu được duy trì sự sống của cây [7].

Bên cạnh thành phần chính là nước thì thành phần và hàm lượng các

chất hòa tan trong chè là một trong mối quan tâm hàng đầu đối với các

nghiên cứu về chè xanh [6][3].Trong đó, nhóm chất tannin được xem như

thành phần chính, chiếm khoảng 27- 34% chất khô trong chè. Tanin gọi

chung là hợp chất phenol thực vật bao gồm các phonyphenol đơn giản và

các polyphenol đa phân tử, bên cạnh đó chúng còn kèm theo các hợp chất

phenol thực vật phi tannin có màu và vị rất đắng. Tỷ lệ các chất trong thành

phần hỗn hợp của tannin chè không giống nhau và tùy theo từng giống chè

mà thay đổi. Tuy nhiên, người ta đã xác định được trong chè tannin gồm 3

nhóm chủ yếu là catechins, flavonol và glycoside, anthocyanidin và

leucoanthocyanidin. Theo Chi - Tang Ho (2008) trong lá chè chứa hàm

lượng polyphenol tương đối cao, thành phần chính của polyphenol trong lá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chè được trình bày trong bảng 1.2 :

Bảng 1.2. Thành phần các hợp chất polyphenol trong lá chè xanh[21]

Thành phần Hàm lượng

Tổng số 18-36%

Flavan-3-ols (Catechin) 12-24%

Flavonol và glycosides 3-4%

Anthocyanins và Leucoanthocyanidin 2-3%

Phenolic ~ 5%

1.1.4. Tác dụng sinh học của cây chè

Nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước, cho thấy chè

xanh mang lại nhiều tác dụng nhờ thành phần hóa học đa dạng với các chất hỗ

trợ sức khỏe và phòng chống bệnh tật.

Theo Ts. Ngô Đức Phương, nguyên cán bộ Khoa Tài nguyên- Dược liệu,

viện Dược liệu đã đưa ra kết quả. Về dược lý học chè có vị đắng chát, tính

mát, có tác dụng thanh nhiệt giải khát, tiêu cơm, lợi tiểu, da thịt mát mẻ, bớt

mụn nhọt và cầm tả lị. Do có cafein và theophyllin, chè xanh được xem là

một chất kích thích não, làm tăng hô hấp, tăng cường và điều hoà nhịp đập

của tim[16].

Thành phần catechins có trong chè xanh đã được nghiên cứu chứng minh

có tác dụng giảm nguy cơ gây ung thư, giảm kích thước khối u, diệt khuẩn...

Ngoài ra, các nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy tác dụng chống phóng xạ

của chè xanh. Các flavonol và polyphenol làm cho chè có tính chất của

vitamin P[11].

Những chất polyphenol có trong chè xanh có vai trò quan trọng trong

việc phòng chống bệnh ung thư. So với chè đen thì chè xanh có hàm lượng

polyphenol cao hơn vì không bị biến đổi thành phần hóa học trong các phản

ứng sinh hóa[7]. Đặc biệt, EGCG là loại polyphenol chủ yếu tạo nên dược

tính của chè xanh, nó có công dụng ngăn ngừa các enzyme kích hoạt sự sao

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chép và quá trình phân bào[13].

TS. Ngô Đức Phương phân tích thêm, các thành phần vitamin trong

chè cũng có tác dụng tích cực đối với sức khỏe, ví dụ như vitamin C giúp

làm tăng sức đề kháng và chống bệnh cúm; vitamin nhóm B trợ giúp cho

quá trình trao đổi carbon hydrat; vitamin E tác dụng chống oxy hóa và hạn

chế lão hóa [16].

1.1.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa

Có nhiều nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính chống oxy hóa chính của

chè là do hoạt tính của các polyphenol. Nghiên cứu của Mai Tuyên, Vũ Bích

Lan và Ngô Đại Quang chỉ ra hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol tách

chiết từ lá chè xanh để bảo quản hạt dầu cải đã đưa ra kết luận polyphenol

chiết xuất từ lá chè xanh thứ phẩm có tác dụng kháng oxy hóa rất rõ rệt và

mạnh hơn nhiều so với ascorbic acid và tocopherol . Tác dụng sinh học của

các polyphenol chè hay của dịch chiết lá chè xanh được giải thích là do chúng

có tác dụng khử các gốc tự do, giống như tác dụng của các chất antioxidant.

Hình 1.1. Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol[11]

Cơ chế chống oxy hóa của chè thuộc cơ chế chống oxy hóa của các hợp

chất phenol. Tính chống oxy hóa của các ankylphenol thể hiện ở chỗ chúng có

khả năng vô hiệu hóa các gốc peroxyt, do đó nó có thể cắt mạch oxy hóa. Sản

phẩm đầu tiên xuất hiện là các gốc phenol tạo thành do nguyên tử hydro của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nhóm hydroxyl được nhường cho gốc peroxyt:

Hình 1.2: Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol[11]

Các gốc phenol rất ổn định, kém hoạt tính, nhờ vậy chúng không có khả

năng sinh mạch oxy hóa tiếp theo. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất

ankylphenol được tăng lên bằng cách hydroxyl hóa và phân tử phenol, vì các

hợp chất polyphenol có hoạt tính tốt hơn monophenol. Chúng có một số tính

chất sau:

Dạng khử của chúng có thể phản ứng với gốc tự do, chuyển thành dạng

oxy hóa:

Dạng oxy hóa của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc và như

vậy chúng có khả năng phản ứng với hai gốc tự do nữa:

Đặc biệt dạng oxy hóa và dạng khử của chúng có thể tương tác với nhau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thuận nghịch tạo gốc Semiquinon:

Ngoài ra các hợp chất catechin trong chè có khả năng tạo phức kim loại

chủ yếu Fe, Cu, đây là những chất xúc tác để tạo ra gốc tự do. Tỷ lệ EGC,

EGCG và EC tạo phức kim loại là 3:2, 2:1, 2:1, 3:1 [21].

1.1.4.2. Hoạt tính kháng khuẩn

Tháng 8/1996, Shimaura công tác tại trường Đại học y khoa Showa

(Nhật Bản) đã có công trình diễn thuyết “về tác động diệt khuẩn E.coli - 157”

tại hội thảo chuyên đề diệt khuẩn của chè xanh. Ông đã khẳng định rằng

catechin trong chè xanh có khả năng tiêu diệt các loại vi khuẩn làm hư hỏng

thực phẩm và loại bỏ các độc tố do chúng gây ra. Cơ chế hoạt động của các

catechin là phá hủy màng tế bào bên ngoài của vi khuẩn [25].

EGCG và EGC là catechin có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất.

Catechin là polyphenol có thể gây ra hiện tượng ngưng kết bằng cách tạo liên

kết trực tiếp với protein. Đây là tính chất đặc trưng của catechin chịu trách

nhiệm cho hoạt tính kháng khuẩn [36].

1.2. Polyphenol ở chè

1.2.1. Thành phần polyphenol ở chè

Hợp chất phenol là các nhóm chất khác nhau rất phổ biến trong thế giới

thực vật, chúng thường tồn tại dưới dạng glycozit dễ tan trong nước và

thường tập trung ở các không bào của tế bào thực vật [11].

Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vòng thơm (vòng benzen)

mang một hay hai, ba ...hoặc nhiều nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào

vòng benzen. Tuỳ thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm này mà

các tính chất lý hoá học hoặc hoạt tính sinh học thay đổi. Dựa theo số lượng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nhóm hydroxyl mà người ta phân biệt phenol thành các nhóm sau:

Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất được cấu tạo từ 1 vòng benzen và

1 hay nhiều nhóm OH, được phân thành các: mono phenol; di phenol

(pyrocatechin, rezoxyn...); tri phenol (pyrogalon, oxy hydroquinon...).

Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol): trong thành phần cấu tạo,

ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, được phân thành các nhóm:

monome và polymer .

- Monome (hay polyphenol đơn giản) được chia thành:

+ Nhóm C6 - C1 (axit phenol cacbonic): trong cấu trúc phân tử có thêm

nhóm cacbonyl, thường gặp ở hạt nảy mầm.

+ Nhóm C6 - C3 (axit cumaric, axit cafeic): có gốc cacbonyl được nối với

nhân benzen qua hai nguyên tử cacbon, thường gặp ở thực vật bậc cao.

+ Nhóm C6 - C3 - C6: gọi là các Flavonoid và được chia thành các nhóm

phụ như flavon, flavonol (sắc tố vàng), anthocyanidin (sắc tố xanh, đỏvà tím),

catechin (không màu)...

- Nhóm hợp chất polyphenol polymer: được chia thành các nhóm phụ

như Tanin, Lignin, Axit Humic….[15].

Các hợp chất polyphenol chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực

vật, chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hoá quan trọng; vào

các quá trình trao đổi chất dưới nhiều hình thức khác nhau như quá trình hô

hấp tế bào (vận chuyển H + trong quá trình phosphoryl hoá oxy hoá ...), quá

trình quang hợp, điều hòa sinh trưởng phát triển của thực vật…[4].

Thành phần polyphenol của lá chè rất đa dạng, nhưng bao gồm chủ yếu

là các flavonoid và tannin. Các polyphenol này chiếm 20 - 35 % trọng lượng

chè khô (ở lá búp non). Trong số các polyphenol thiên nhiên, các hợp chất

flavonoid có ý nghĩa thực tiễn lớn vì chúng phân bố rộng rãi trong thế giới

thực vật, ít độc đối với cơ thể và có nhiều hoạt tính sinh - dược học giá trị.

Các flavonoid không được tổng hợp ở người và động vật; chúng được tìm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thấy ở động vật là do động vật ăn thực vật mà có. Flavonoid được cấu tạo bởi

khung cacbon C6 - C3 - C6, gồm 2 vòng Benzen (vòng A và B) và một vòng

pyron (vòng C); trong đó vòng A kết hợp với vòng C tạo thành khung

Chroman [15]. Trong thực vật flavonoid tồn tại ở 2 dạng: Dạng tự do (gọi là

aglycon) và dạng liên kết với đường (glycozit). Các glycozit khi bị thủy

phân bằng axit hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycon. Tùy theo

mức độ oxy hóa của mạch 3 cacbon, sự có mặt hay không của nối đôi giữa

C2 = C3 và nhóm Cacbonyl ở C4 mà phân loại các Aglycon của Flavonoid

thành các nhóm phụ sau:

- Flavon, Flavonol, Flavanon, Flavanonol, Catechins,

Leucoanthocyanidin, Anthocyanidin, Chalcon, Auron.

- Catechins là hợp chất Flavonoid phổ biến trong thiên nhiên và có nhiều

trong quả và lá chè.

- Ngoài ra còn có các dẫn xuất:

+ IsoFlavonoid (vòng B nối với vòng C ở vị trí C3)

+ NeoFlavonoid (vòng B nối với vòng C ở vị trí C4)

+ BiFlavonoid (2 phân tử Flavonoid liên kết với nhau)[36].

Các công trình nghiên cứu đã cho biết thành phần Flavonoid trong lá chè

xanh chủ yếu là:

- Các dẫn xuất của catechins: catechin, epigallocatechin, gallocatechin,

epigallocatechin gallat, epicatechin, epicatechin gallat…

- Các chất flavonol: Quercetin, Kaempferol, Myricetin và các dẫn xuất

khác của flavonol

- Theaflavin và diosmin: Theaflavin sản phẩm của sự oxy hóa đồng thời

epigallocatechingalat và epigallocatechin[23].

Còn các Flavonoid trong chè đen chủ yếu là Theaflavin và Thearubigin.

Thearubigin là nhóm sản phẩm oxy hóa đã bị polymer hóa của catechins và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

các hợp chất gallat của nó [31].

Những năm gần đây, flavonoid là một trong những hợp chất được đặc

biệt quan tâm bởi các kết quả nghiên cứu cho thấy flavonoid có tác dụng to

lớn đối với sức khỏe của con người. Flavonoid là nhóm hợp chất có nhiều tác

dụng sinh học. Có thể chia các hoạt tính sinh học và cơ chế tác dụng đối với

cơ thể người của flavonoid thành các nhóm như sau:

- Tác dụng chống oxy hóa: Flavonoid được gọi là "Những tác nhân thu

dọn và hủy diệt" các gốc tự do độc hại. Tác dụng chống oxy hóa của

Flavonoid tăng dần khi tăng nồng độ của chúng và tuân theo trật tự: fustin <

catechin < quercetin < rutin = luteolin < kaempferol < morin[22][24].

- Tác dụng đối với các enzyme sinh học: Các Flavonoid có khả năng tác

động đến hoạt động của nhiều hệ enzym động vật trong các điều kiện in vitro

và in vivo. Do bản thân các chất Flavonoid khi ở trong cơ thể động vật tồn tại

ở dạng oxy hóa hoặc khử và chịu nhiều biến đổi phức tạp cho nên có thể

trong các điều kiện khác nhau nó sẽ thể hiện hoạt tính sinh học khác nhau:

kìm hãm hoặc kích thích hoạt động enzyme, hoặc kích thích có mức độ và có

điều kiện - theo những cơ chế phức tạp hơn trong những nghiên cứu in

vitro[17].

- Tác dụng đối với chuyển hóa và trên lâm sàng: Chè xanh cho thấy sự

hấp thụ các chất oxy hóa trong chè xanh diễn ra nhanh. Các chất chống oxy

hóa đi vào vòng tuần hoàn ngay sau khi uống vào làm cho lượng chất chống

oxy hóa trong huyết tương tăng lên đáng kể. Các Flavonoid có tác động sâu

sắc lên chức năng của các tế bào miễn dịch và tế bào viêm. Trong các nghiên

cứu trên động vật hai este methyl EGCG tách chiết từ Chè ôlong gây kìm hãm

đáng kể lên các phản ứng dị ứng trên chuột. Flavonoid baicalin trong các

nghiên cứu gần đây cho thấy có hoạt tính chống viêm và chống HIV -1 theo

cơ chế gây cản trở sự tương tác giữa các protein vỏ của HIV -1 với các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

receptor và ngăn chặn HIV -1 tấn công vào các tế bào đích [31].

- Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm: Tác dụng chống viêm nhiễm

và kháng khuẩn của Flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế

giới chứng minh. Một số tác giả nghiên cứu tác dụng của 24 anthoxyanin,

leucoanthoxyanin và axit phenolic lên Salmonella (vi khuẩn thương hàn) và

thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này đều có khả năng kìm

hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza. Tác dụng

kháng virut của Flavonoid cũng đã được khẳng định; Chang-Qi Hu và cộng

sự đã nghiên cứu khả năng ức chế virut HIV ở các tế bào H9 của 35

Flavonoid chiết xuất từ thực vật và tổng hợp - đã thấy rằng các hợp chất có

nối đôi ở vị trí C2 = C3 và có nhóm OH ở C6 và C4 thể hiện hoạt tính cao hơn

các Orthodiphenol[22][24].

- Tác dụng đối với ung thư: Tác dụng ngăn chặn và chữa trị bệnh ung

thư của chè và các hợp chất catechins được nghiên cứu mạnh mẽ nhất. Khi

tiến hành nghiên cứu in vivo, nhiều công trình công bố đã cho thấy chè và các

chất trích ly từ chè như EGCG, EGC, ECG… của chè có khả năng tương tác,

ngăn chặn và hạn chế quá trình khơi mào, hình thành và phát triển của tế bào

ung thư. Trong giai đoạn khơi mào, các hợp chất catechins trung hòa các tác

nhân bị kích hoạt bởi cytochrome P450 enzyme, tác nhân này có khả năng

tương tác làm thay đổi cấu trúc của DNA, ngăn chặn sự tạo thành

nitrosamine, một nhóm các hợp chất phát sinh từ khói thuốc lá, các amine dị

vòng trong thịt, cá nấu chín, các tác nhân được cho là có thể gây ung thư. Các

thử nghiệm in vivo cho thấy khả năng tương tác trực tiếp và tăng cường hiệu

quả của EGCG, EC vào hệ thống bảo vệ bằng enzyme của tế bào, hạn chế sự

hình thành của các tác nhân gây biến đổi trong tế bào. Trong giai đoạn bắt đầu

của tế bào ung thư, EGCG có khả năng ức chế AP-1, một chất dẫn truyền

khơi mào cho sự phát triển của tế bào ung thư da, thể hiện khả năng ngăn

chặn protein kinase. Enzyme kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của tế

bào ung thư, ức chế hoạt động của telomerase, làm giảm thời gian sống của tế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

bào ung thư. Trong quá trình ung thư diễn ra, EGCG có thể can thiệp, ức chế

hoạt đông của urokinase, enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát

triển và biến đổi của tế bào ung thư, phá hủy các dạng biến đổi đặc thù của tế

bào gây ra do adevirus, hay ngăn chặn quá trình tổng hợp DNA trong tế bào

ung thư hepatoma, leukemia, và ung thư phổi… [19][20].

1.2.2. Con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè

Vai trò của polyphenol là chất chống oxy hóa được biết đến và đang

được nghiên cứu như các tác nhân có thể làm giảm yếu tố nguy cơ liên quan

đến bệnh ung thư và bệnh tim [19].

Các chất polyphenol chống lại sự tạo thành enzyme Cox-2, tác nhân gây

viêm khớp, vậy chè có thể làm giảm đau viêm khớp. Ở chè xanh chứa cả

polyphenol đơn giản và phức tạp. Hàm lượng catechin (30%) và flavonol

(0,2-5%) là các hợp chất chủ yếu của polyphenol . Hàm lượng polyphenol

quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè và góp phần tạo hương vị của

chè. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe của chè đã được chứng minh là

do các hợp chất polyphenol [29].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Polyphenol được sinh tổng hợp thông qua con đường sau (Hình 1.3):

Hình 1.3. Các con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè [36]

Chú thích: ANR (anthocyanidin reductase); ANS (anthocyanin synthase);

4CL (4-coumarate : CoA ligase); C4H (cinnamate 4-hydroxylase); CHI

(chalcone isomerase); CHS (chalcone synthase); DFR (dihydroflavonol

reductase); F3H (flavanone 3β-hydroxylase); F3′H (flavonoid 3′-

hydroxylase); F3′5′H (flavonoid 3′5′-hydroxylase); FLS (flavonol synthase);

LAR (leuacoanthocyanidin reductase); PAL (phenylalanine ammonialyase);

UFGT (UDP-glucoseflavonoid 3-O-glucosyl transferase).

1.2.3. Thành phần catechins ở chè

Theo thống kê của Harbowy (1997), thành phần hóa học chính trong

chất rắn chiết xuất từ chè xanh là polyphenol, chiếm 30 - 40% trọng lượng

[22]; thành phần các chất hóa học trong chè đen giống với chè xanh [16].

Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè và góp

phần tạo hương vị của chè. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe con

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

người đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol có trong chè [22].

Các hoạt chất catechins và dẫn xuất của nó, còn được gọi là các flavan-3-ol

chiếm khoảng 70% polyphenol tổng số [39][42]. Các hợp chất catechins tồn

tại dưới trạng thái tự do và dạng ester phức tạp với acid gallic. Hàm lượng

catechins trong lá chè luôn thay đổi phụ thuộc vào giống chè, thời kì sinh

trưởng [8], vị trí các lá trên búp và nhiều yếu tố khác. Catechins là một hợp

chất không màu, tan trong nước, có vị đắng chát ở mức độ khác nhau và có

khả năng chống oxi hóa. Công thức cấu tạo catechins với nhiều nhóm

hydroxyl (5 nhóm ở các catechin, 6 ở các gallocatechin, 8 ở các catechin

gallate và 9 ở các gallocatechin gallate) đảm bảo khả năng kháng oxy hóa rất

mạnh của nhóm hợp chất catechin.

Các dẫn xuất của catechins: catechin (C), epigallocatechin (EGC),

gallocatechin (GC), epigallocatechin gallat (EGCG), epicatechin (EC),

Catechin (C)

Epicatechin (EC)

Epicatechin gallate (ECG)

Gallocatechin (GC)

Epigallocatechingallate (EGC)

Epigallocatechin (EGC)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

epicatechin gallat (ECG)…

Hình 1.4. Các dẫn xuất của catechins

Các " epi" có cấu trúc giống như các catechin, nhưng khác nhau về sự

định hướng trong không gian, dẫn đến tính chất hóa học sẽ khác nhau.

Khi thực hiện khảo sát trên các gốc tự do tổng hợp như DPPH,

ABTS,…, các catechins thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất kháng oxy

hóa đối chứng như vitamin C, vitamin E, trolox (các catechin thể hiện hoạt

tính mạnh hơn từ 3 đến 6 lần). Hoạt tính kháng oxy hóa của nhóm catechins

thể hiện một sự khác biệt về mối tương quan cấu trúc so với các hợp chất

khác họ flavonoid. Khi so sánh với hợp chất flavonoid có hoạt tính quét gốc

tự do mạnh nhất trong môi trường phân cực quercetin ( do đặc điểm cấu trúc

của quercetin có nhóm 4-oxo và nối đôi tại vị trí cacbon số 2 và 3 cho phép sự

hình thành liên hợp giữa vòng A và vòng B giúp giải tỏa điện tử tự do, 3

nhóm hydroxyl 3,5,7 và hai nhóm ortho-hydroxyl trên vòng B), các hợp chất

C và EC, do trong công thức thiếu sự liên hợp giữa vòng A và vòng B, có

hoạt tính quét gốc tự do kém hơn, nhưng các gallate catechin như EGCG và

ECG có hoạt tính trội hơn. Sự khác biệt về khả năng của EGCG và ECG được

giải thích dựa trên số lượng lớn các nhóm hydroxyl trong công thức, cho phép

tiếp nhận electron dễ dàng hơn. Hoạt tính kháng oxi hóa của các catechins

trong chè, tính theo tỉ lệ mol, trong thử nghiệm chống lại sự hình thành các

gốc tự do DPPH trong dung dịch nước được xếp theo trật tự giảm dần như

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

sau: epicatechin gallate ≈ epigallocatechin gallte > epigallocatechin > gallic

acid > epicatechin ≈ catechin. Kết quả tính toán cho thấy thành phần catechins

đóng góp 70-80% khảng năng kháng oxy hóa của chè [15].

Đối với khả năng ức chế quá trình oxy hóa lipid, các catechins của chè

được xếp theo trật tự sau: EGCG > ECG > EGC > EC; khả năng vô hoạt

gốc tự do sinh ra trong quá trình oxy hóa lipid thì ECG > EGCG > EC >

EGC; khả năng vô hoạt gốc tự do -OH giảm theo trật tự ECG > EC >

EGCG >> EGC.

Các kết quả khả quan trên đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu về tác dụng

cụ thể của hợp chất catechins lên các bệnh ở người và khả năng sử dụng

catechins trong quá trình ngăn ngừa và chữa trị bệnh. Ngoài ra nhóm chất này

còn được quan tâm sử dụng trong các lĩnh vực khác như mỹ phẩm, thực

phẩm; do xuất phát từ thiên nhiên, an toàn, chè và các chất từ chè đang được

sử dụng chủ yếu như một phụ gia chống oxy hóa nhằm thay thế các phụ gia

tổng hợp thường dùng khác như BHT, BHA…Uống nước chè tăng cường khả

năng phòng bệnh của cơ thể. Trong quá trình chế biến ra các sản phẩm chè,

các catechins bị biến đổi tạo thành các hợp chất tạo màu và mùi vị cho các sản

phẩm chè khác nhau[5].

Những công trình nghiên cứu của Đjemukhatze (1961 - 1976) về hợp

chất catechins có trong lá chè từ các nguồn gốc khác nhau - so sánh về thành

phần các chất catechins giữa các loại chè được trồng và chỉ mọc hoang dại đã

nêu lên luận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè và trên quan điểm để

xác minh nguồn gốc cây chè. Đjemukhatze kết luận rằng: những cây chè mọc

hoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu là (-)-epicatechin và (-)-epicatechin

gallat, ở chúng phát triển chậm khả năng tổng hợp (-)epigallo catechin và các

gallat của nó để tạo thành (+)-gallocatechin. Khi nghiên cứu về các cây chè

dại ở Việt Nam (rừng chè dại ở Suối Giàng, Tiên Thông và Thông Nguyên)

cho thấy chúng cũng tổng hợp chủ yếu là: (-)-epicatechin và (-)-epicatechin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

gallat (chiếm 70% tổng số các loại catechins). Khi di thực cây chè dại này lên

phía Bắc, với các điều kiện khắc nghiệt hơn về khí hậu, chúng sẽ thích ứng

dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có thành phần catechins phức tạp

hơn, cùng với sự tạo thành (-)-epigallocatechin và các gallat của chúng. Điều

này có nghĩa là sự trao đổi chất ở đây hướng về phía tăng cường quá trình

hydroxyl hóa (-)-epicatechin và gallic hóa [1].

Theo các kết quả nghiên cứu đó, thì cây chè cổ Việt Nam tổng hợp các

chất catechins đơn giản nhiều hơn cây chè Vân Nam Trung Quốc và sự tiến

hóa của cây chè thế giới là như sau: Camellia → chè Việt Nam→ chè Vân

Nam lá to→ chè Assam (Ấn độ).

1.2.4. Con đường sinh tổng hợp catechins ở chè

Catechins được tổng hợp thông qua con đường flavonoid (Hình 1.1).

+(amoni) đây là bước

Trong đó enzyme PAL (phenylalanine ammonialyaza) xúc tác sự khử amin

của L - phenyllalanine tạo thành axit cinamic và NH4

đầu tiên trong sinh tổng hợp phenylpropanoid mà cuối cùng là tạo catechins.

Thành phần của catechins bao gồm EC, ECG, EGC, EGCG, C và GC.

Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng cả thành phần và sự tích lũy catechins có

tương quan cao với mức độ biểu hiện của các gen liên quan [27], [34], [39],

[42]. Catechins của chè được tổng hợp theo 4 nhánh khác biệt của con đường

flavonoid dưới sự xúc tác trực tiếp của 2 loại enzyme là leucoanthocyanidin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

reductase (LAR) và anthocyanidinreductase (ANR) ( Hình 1.4).

Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp catechin ở chè[31]

Chú thích: ANR (anthocyanidin reductase); ANS (anthocyanin

synthase); 4CL (4-coumarate : CoA ligase); C4H (cinnamate 4-hydroxylase);

CHI (chalcone isomerase); CHS (chalcone synthase); DFR (dihydroflavonol

reductase); F3H (flavanone 3β-hydroxylase); F3′H (flavonoid 3′-

hydroxylase); F3′5′H (flavonoid 3′5′-hydroxylase); FLH (flavonol synthase);

LAR (leuacoanthocyanidin reductase); PAL (phenylalanine ammonialyase);

FGS(flavan-3-ol gallate synthase).

Hai enzyme ANR và LAR đóng vai trò chìa khóa xác định thành phần

catechins bao gồm: catechin được epimer hóa còn gọi là epicatechin (EGCG,

ECG, EGC và EC) và catechin không được epimer hóa (GC và C)

[33][34][42]. LAR xúc tác chuyển hóa leucocyanidin, leucoanthocyanin thành

C và GC. Trong khi ANR xúc tác tổng hợp EC và EGC từ anthocyanin. Sau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

đó, EC và EGC được ester hóa tạo thành ECG và ECCG [36][37][42].

Leucoanthocyanidin reductase (LAR) là hợp chất không màu, có tính

quang hoạt, khi đun với acid thì dễ chuyển thành anthocyanidin có màu đỏ.

Dễ dàng bị oxy hóa và ngưng tụ hình thành sắc tố trong quá trình lên men

chè. Leucoanthocyanidin reductase (LAR) là một emzyme đóng một vai trò

quan trọng trong sinh tổng hợp proanthocyanidins (PA) như catechin và

epicatechin ở cây chè. LAR xúc tác chuyển hóa leucocyanidin,

leucoanthocyanin thành C và GC. Reductase anthocyanidin (ANR) tham gia

vào quá trình sinh tổng hợp các flavonoid, ANR xúc tác tổng hợp EC và EGC từ anthocyanin [30][36][37][42]. 1.3 Tình hình nghiên cứu polyphenol ở chè

1.3.1 Tình hình nghiên cứu polyphenol chè trên thế giới

Đã có hàng nghìn công trình nghiên cứu của các tác giả ở nhiều nước

trên thế giới công bố tác dụng chữa bệnh của chè xanh. Trong cây chè người

ta quan tâm chủ yếu đến các hợp chất polyphenol (bao gồm Flavonoid

“catechins và các Flavonoid khác” và tanin) bởi chúng có nhiều tác dụng sinh

- dược học đáng quý như: tác dụng chống ung thư, chống đột biến tế bào,

chống phóng xạ, chống viêm ... Các polyphenol này chiếm 20 - 30 % trọng

lượng chè khô. Chè là nguồn cung cấp các hợp chất Flavonoid chính cho con

người bởi chè được sử dụng nhiều và chứa hàm lượng Flavonoid tương đối

cao. Các Flavonoid tìm thấy trong chè xanh chủ yếu là các flavan - 3- ols

(catechin), chiếm 90% trong các hợp chất phenol của lá chè. Các Flavonoid

trong chè đen chủ yếu là theaflavin và thearubigin - phức hợp các sản phẩm

oxy hóa của các hợp chất phenol chè xanh. Thearubigin là nhóm sản phẩm

oxy hóa đã bị polimer hóa của catechin và các hợp chất galat [20]. Các

Flavonoid được coi là các chất chống oxy hóa ở mức độ cao bởi chúng có khả

năng loại bỏ các gốc tự do và các gốc oxy hoạt động. Tuy nhiên, nhiều nghiên

cứu đã cho thấy rằng hoạt tính chống oxy hóa của các Flavonoid khác nhau là

khác nhau. Quercetin và 5,3’,4’ - trihydroxyl - 7- methoxyflavon thể hiện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hiệu ứng đồng vận khi chúng được thử ở dạng hỗn hợp. Byung Zun Ahn đã

chỉ ra rằng hoạt tính chống oxy hóa toàn phần và thứ tự hiệu quả của các

polyphenol chè xanh trong việc loại bỏ các gốc tự do hoạt động có hại là:

ECG > EGCG > EGC > axit Galic > EC = catechin. Sự oxy hóa các

lipoprotein phân tử thấp bị kìm hãm bởi catechin, EC, ECG và EGCG với

mức độ tương đương, nhưng không bằng khi có mặt EGC hoặc axit Gallic

[18]. Những năm gần đây, thường có nhiều công trình nghiên cứu tập trung

vào tác dụng ngăn ngừa ung thư của các chất chống oxy hóa tự nhiên có

trong thức ăn và rau quả. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng chè xanh

với thành phần chủ yếu là các polyphenol và đặc biệt là EGCG

(Epigallocatechingallat) có khả năng ức chế sự phát triển của một số dòng

tế bào ung thư ở người, bao gồm tế bào ung thư của phổi, phế quản, tuyến

tiền liệt, tuyến vú, gan và bạch cầu [23][24]. Một số nghiên cứu dịch tễ

học ở Nhật - một trong những quốc gia sử dụng chè nhiều nhất, đã chỉ ra

mối quan hệ tỷ lệ nghịch giữa thói quen uống chè xanh và tỷ lệ người chết

vì ung thư. Một số công trình nghiên cứu khác đã chứng minh tác dụng kìm

hãm của polyphenol chè lên sự hình thành, phát triển và di căn của khối u.

Tác dụng này chủ yếu là do hiệu quả chống oxy hóa cao và chống tăng sinh

khối u của các hợp chất polyphenol trong chè [5]. Chè xanh có thể bảo vệ

cơ thể khỏi ung thư bằng cách làm ngưng chu trình tế bào, kể cả chu trình

nguyên phân của tế bào ung thư. Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến 2 cơ chế

chính vì tác dụng ức chế sự phát triển tế bào u của EGCG: (1) tác dụng

ngăn cản chu kỳ phân chia tế bào, dừng chu kỳ phân chia tế bào ở các pha

G1, G2; (2) thúc đẩy quá trình apoptosis (sự chết tế bào theo chương trình).

Các nghiên cứu trên mô bệnh học cho thấy rằng cả chè xanh và chè đen

đều có thể kìm hãm sự tăng sinh của các tế bào u trong các mô hình động

vật. Mặc dù mối quan hệ giữa mức tiêu dùng chè và tỷ lệ người mắc bệnh

ung thư đã được nghiên cứu ở các quần thể dân cư khác nhau trên thế giới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nhưng vẫn chưa rút ra được kết luận rõ ràng. Những hạn chế đó có thể lý

giải do thành phần, hàm lượng cũng như hoạt tính sinh dược học của các

chất hóa học được sinh tổng hợp và tích lũy trong cây chè trồng ở các vùng

sinh thái khác nhau thì khác nhau, do đó tác dụng sinh dược học của chúng

cũng không đồng nhất [1]. Chính vì vậy các nghiên cứu về hàm lượng,

thành phần và tác dụng sinh dược học của các hợp chất tự nhiên trong cây

chè trồng ở các vùng khác nhau vẫn tiếp tục được tiến hành.

1.3.2 Tình hình nghiên cứu polyphenol chè ở Việt Nam

Ở nước ta, do vị trí quan trọng của cây chè trong nền kinh tế quốc dân

nên đã có nhiều nghiên cứu trên đối tượng này. Chỉ tính từ khoảng 10 năm

trở lại đây đã có khoảng vài chục công trình được công bố song những

nghiên cứu này tập trung chủ yếu vào việc nghiên cứu quy trình, điều kiện

trồng, chăm bón, chọn giống, chế biến, sinh trưởng phát triển và tăng năng

suất của chè…Các nghiên cứu theo hướng hóa sinh học cũng chỉ tập trung

vào các thành phần đóng vai trò chính trong việc nâng cao chất lượng chè

uống. Còn các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh dược học của các

chất polyphenol khai thác từ chè Việt Nam với mục đích phục vụ lĩnh vực

y dược còn rất ít; chỉ những năm gần đây mới xuất hiện một số công trình

của trường Đại học Y Hà Nội, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc

gia Hà Nội, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Trung tâm nghiên

cứu và phát triển công nghệ hóa sinh... Tuy nhiên, các nghiên cứu còn lẻ tẻ

chưa có hệ thống. Từ năm 2002, Đỗ Thị Gấm đã tiến hành khảo sát các hợp

chất polyphenol trong lá chè trồng ở vùng Tân Cương (Thái Nguyên) trên

sản phẩm chè Trung Du cho biết các hợp chất polyphenol có hoạt tính sinh

học cao trong lá chè chủ yếu là: Catechins và các dẫn xuất của catechins

(catechin, epigallocatechin, gallocatechin, epigallocatechingallat,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

epicatechin, epicatechingallat); các chất flavonol (quercitrin, kaemferol-3-

glycozit, kaemferol-3-rhamnozyl, quercetagemin); theaflavin và diosmin

[4]. Hàm lượng polyphenol trong lá chè Tân Cương biến động mạnh theo

mùa và theo tuổi lá. Các nghiên cứu của Trần Thị Thanh Hương và đtg cho

thấy: bột chiết polyphenol và EGCG chè xanh có tác dụng ức chế sự phát

triển tế bào của dòng tế bào ung thư phổi LU -1 và dòng tế bào ung thư gan

Hep - G2, tác dụng rõ nhất trên dòng LU - 1 với giá trị IC50 là 3, 84 µM

của EGCG chè xanh. Bước đầu phát hiện sự tăng hoạt độ của enzym

caspase - 3 trên dòng tế bào LU -1 được bổ sung EGCG chè xanh vào môi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

trường nuôi cấy [13].

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu

Mẫu búp chè mẫu búp chè 1 tôm và 2 đến 3 lá non được thu thập từ

một số giống chè trồng tại Thái Nguyên được Công ty chè Sông cầu, Huyện

Đồng Hỷ, Tỉnh Thái Nguyên và TS. Dương Trung Dũng - Khoa Nông học -

Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên chọn lọc và cung cấp (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Các mẫu chè nghiên cứu

Kí hiệu Tên giống Địa điểm lấy mẫu

Trung du xanh Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên B

Trung du tím Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên C

D Indo Công ty chè Sông Cầu

E Keo am tích Công ty chè Sông Cầu

F Bát tiên Công ty chè Sông Cầu

G LDP1 Công ty chè Sông Cầu

H pH1 Công ty chè Sông Cầu

I Phúc vân tiên Công ty chè Sông Cầu

Mẫu búp chè được hái bằng tay, đảm bảo đúng kĩ thuật thu hái chè của

vụ hè thu ( tháng 5 -10) nhằm làm tăng năng suất, chất lượng sản phẩm và tạo

cho cây chè sinh trưởng khỏe, bền vững: năng suất búp chè có quan hệ chặt

chẽ với số lá trên cây; với đặc điểm của cây chè mỗi một búp sinh ra từ 1

nách lá, do vậy nhiều lá mới có nhiều búp, năng suất cao; cho nên hái búp chè

Thái Nguyên và chừa lá( nguyên tắc hái chừa hợp lý) có tương quan chặt đến

năng suất chè[10].

2.1.2. Hóa chất, thiết bị

- Thiết bị và dụng cụ phân tích:

+ Máy LC/MS: Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Systems, CA, USA.

+ Hệ thống HPLC Agilent 1260 Series, detetor DAD kết nối với khối

phổ Agilent Single Quadrupole 6120 (Agilent, Santa Clara, USA).

+ Cột sắc ký: Cột Eclipse XDB C18 (250 x 4.6 mm, 5μm) và cột bảo vệ

XDB C18 của hãng Agilent; cân điện tử (Max 220g, d = 10-4g), model:

Practum 224-1S, Satorius, Germany.

+ Máy li tâm ống fancol, model: Centrifuge 5804R, Eppendorf,

Germany.

+ Máy siêu âm (SH-100, Elma Schmidbauer GmbH, Đức).

+ Micropipet loại 100, 200, 1000 µL, Eppendorf, Germany.

+ Bình định mức loại 50 mL.

+ Xylanh nhựa 5 mL.

+ Máy real-time PCR.

+ Máy điện di.

+ Màng lọc 0,45 µm cho kim bơm mẫu dùng để lọc mẫu trước khi bơm

vào hệ thống và các dụng cụ thí nghiệm khác.

+ Kit tách RNA thực vật (GeneJET Plant RNA Purification) của hãng

Thermo Scientific.

+ Gen đích (target gene = Tg) và gen tham chiếu (reference gene = Ref);

mồi Oligo(dT) và enzyme Reverse Transcriptase theo kit của hãng

Affymetrix (First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real - Time PCR).

+ Gel agarose và các hóa chất khác.

- Chất chuẩn: 05 chất tham chiếu (C), (GC), (EGC), (EGCG),

(ECG) trong 09 mẫu thử nghiệm

- Dung môi:

+ Acetonitril (ACN) đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC (Scharlau, Tây Ban

Nha).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

+ Methanol đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC (Scharlau, Tây Ban Nha).

+ Nước đạt tiêu chuẩn HPLC (MilliQ Ultra Purification \system, Merck-

Millipore, Đức).

2.2. Địa điểm và thời gian

Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại

học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; Viện nghiên cứu hệ gen và Trung tâm

tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa sinh biển Việt Nam - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 7/2017 đến tháng 12/2018.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp thu mẫu lá chè

Tám mẫu chè nghiên cứu ( Bảng 2.1) 1 tôm 2 đến ba lá đầu tiên được

thu thập vào tháng 9 năm 2017. Mẫu chè được chia thành hai phần, một phần

được sử dụng cho phân tích catechins được chiết trực tiếp với dung môi sau

khi thu thập. Phần còn lại của mẫu được đông lạnh ngay lập tức trong nitơ

lỏng để tách RNA nhằm mục đích định lượng sự biểu hiện của gen.

2.3.2. Phương pháp định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằng

HPLC

2.3.2.1 Điều kiện sắc ký

Chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp.

Pha động sử dụng hệ dung môi kênh A H2O (1% acetic) - kênh B ACN được

thiết lập gradient biến thiên từ tỉ lệ 95/5 đến tỉ lệ 5/95 trong 45 phút; Tốc độ

dòng: 0,5 mL/phút; Lượng bơm mẫu: 5 µL; Thời gian phân tích: 45 phút;

Nhiệt độ cột: 25 ; Bước sóng lựa chọn: 280 nm. Hệ thống LC/MS được kết

nối với phần mềm Agilent OpenLAB Control Panel. Khí nitơ được bơm với

tốc độ dòng 5,0 L/phút, áp suất đầu phun đạt 40 psi, nhiệt độ làm khô đạt

250oC. Chế độ bắn mảnh phổ khối lựa chọn ESI ở mode negative với pic ion

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

phân tử được lựa chọn như sau:

Bảng 2.2. Các chất chuẩn và pic ion nhận dạng

STT Chất tham chiếu Pic ion phân tử

C 1 325,0 [M+Cl]-

GC 2 341,0 [M+Cl]-

EGC 3 341,0 [M+Cl]-

EGCG 4 493,0 [M+Cl]-

ECG 5 477,0 [M+Cl]-

2.3.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Cân chính xác 4mg (±0,1mg) chất chuẩn (C, GC, EGCG, EGC và ECG)

vào bình định mức 5 mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng methanol thu

được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 µg/mL. Dãy dung dịch chuẩn được

khảo sát có nồng độ sau: 1, 5, 20, 50, 200, 500 µg/mL. Phân tích các chuẩn

nói trên theo điều kiện sắc ký đã xây dựng, lặp lại 3 lần và xác định phương

trình hồi quy tuyến tính dựa vào mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

peak. Phương trình đường chuẩn được xây dựng trên phần mềm

ChemStation, Agilent có dạng: y = ax + b với yêu cầu hệ số tương quan R2 >

0,99. Trong đó: y là diện tích peak thu được tương ứng với nồng độ chất

chuẩn x (µg/mL).

- Định lượng C (1):

+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của C được phát hiện một

cách ổn định tại thời gian lưu Rt 16,7 - 16,8 min đối với các mẫu chất tham

chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được

pic ion phân tử của C tại thời điểm 16,8 - 16,9 min với pic ion phân tử 325,0

[M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation

dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 16,7 - 16,8 min.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Định lượng GC (2):

+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của GC được phát hiện

một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 12,7 - 12,8 min đối với các mẫu chất

tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện

được pic ion phân tử của GC tại thời điểm 12,8 - 12,9 min với pic ion phân

tử 341,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm

Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 12,7 -

12,8 min.

- Định lượng EGC (3):

+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của EGC được phát

hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 15,1 - 15,2 min đối với các mẫu

chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát

hiện được pic ion phân tử của EGC tại thời điểm 15,2 - 15,3 min với pic ion

phân tử 341,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần

mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt

15,1 - 15,2 min.

- Định lượng EGCG (4):

+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của EGCG được phát

hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 18,8 - 18,9 min đối với các mẫu

chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát

hiện được pic ion phân tử của EGCG tại thời điểm 18,9 - 19,0 min với pic ion

phân tử 493,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần

mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt 18,8

- 18,9 min.

- Định lượng ECG (5):

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

+ Bước sóng lựa chọn: 280 nm

+ Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của ECG được phát

hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 24,9 - 25,0 min đối với các mẫu

chất tham chiếu dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát

hiện được pic ion phân tử của ECG tại thời điểm 25,0 - 25,1 min với pic ion

phân tử 477,0 [M+Cl]-. Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần

mềm Chemstation dựa trên diện tích pic UV 280 nm tại thời gian lưu Rt

24,9 - 25,0 min.

2.3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Phương pháp xác định dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích; N là nhiễu đường nền.

Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là

tính nhiễu lân cận hai bên của pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần

chiều rộng của pic tại nửa chiều cao. LOD và LOQ được chấp nhận tại

nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đường nền (đối với LOD)

và 10 lần (đối với LOQ).

2.3.2.4 Chuẩn bị mẫu

- Chuẩn bị chất tham chiếu: mẫu chất tham chiếu được pha trong dung

môi MeOH thành nồng độ 2 mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các nồng độ

khác nhau để thiết lập đường chuẩn định lượng.

- Chuẩn bị mẫu phân tích: Cắt nhỏ mẫu, trộn đều và cân lấy 3g mẫu.

Cho mẫu vào ống falcon 50ml sạch, khô, thêm 15mL MeOH, siêu âm 15

phút rồi ly tâm trong 5 phút, gạn lấy dịch chiết, lặp lại quy trình chiết 2 lần,

gom dịch chiết vào bình định mức 50mL, định mức đến vạch bằng MeOH

và lắc đều.

- Các dung dịch chất tham chiếu và mẫu phân tích đều được lọc qua

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào hệ thống HPLC.

2.3.2.5 Phân tích HPLC

Mẫu nghiên cứu được lọc qua màng lọc 0,45 µm và phân tích bằng hệ

thống LC Agilent Single Quadrupole 6120 (Agilent, Santa Clara, USA),

cột sắc ký Zorbax SB-C18 (4,6x150mm, 5µm), cột bảo vệ SB-C18 Agilent

1260 (CA, USA).

2.3.3. Phương pháp sinh học phân tử

2.3.3.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ lá chè

RNA tổng số từ mẫu chè nghiên cứu được tách chiết theo quy trình kit

tách RNA thực vật (GeneJET Plant RNA Purification) của hãng Thermo

Scientific như sau:

Nghiền 2g mẫu thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ

lỏng. Bổ sung ngay lập tức 500µl Plat RNA Lysis Solution, sau đó chuyển

sang ống eppendorf 1.5 ml. Ủ mẫu ở 56oC trong 5 phút, sau đó ly tâm 14.000

v/p trong 5 phút.

Sau khi ly tâm xong, hút dịch ở pha trên và chuyển sang ống eppendorfd

1.5 ml mới, sau đó bổ sung 250µl ethanol 96%. Chuyển hỗn hợp thu được

sang cột tinh sạch. Ly tâm cột ở 11.000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy

qua cột.

Bổ sung 700 µl Wash Buffer WB 1 vào cột tinh sạch. Ly tâm cột ở

11.000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500 µl Wash

Buffer 2 vào cột tinh sạch. Ly tâm trong 1 phút ở 11.000 v/p. Loại bỏ dịch

chảy qua cột. Lặp lại bước 7 thêm lần nữa. Ly tâm trong 1 phút ở 14.000 v/p,

loại bỏ dịch chảy qua cột và chuyển cột sang ống Eppendorf 1.5 ml mới. Bổ

sung 50µl nước không chứa Rnase vào giữa màng trong cột tinh sạch, ly tâm

11.000 v/p trong 1 phút.

Bỏ cột tinh sạch. Kiểm tra RNA tổng số bằng phương pháp điện di trên

gel agarose 1% và đo quang phổ ở bước sóng 260nm. RNA tổng số được bảo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

quản ở -80oC.

2.3.3.2 Phương pháp tổng hợp cDNA

Tổng hợp sợi cDNA đơn: Sợi cDNA được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu

mRNA bằng kit tổng hợp cDNA USB® First - strand cDNA synthesis kit for

Real-time PCR của hãng Affymetrix. Thành phần và chu trình nhiệt của phản

ứng ở bảng 2.3 và bảng 2.4. Các cDNA thu được được cất giữ ở tủ -20oC

trước khi thực hiện các thí nghiệm sau đó.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA

Thành phần

Thể tích (µl)

Primer oligodtT

2 Total RNA

Ðến 1 µg

10X RT Buffer

2 10mM dNTPs

1 RNase Inhibitor

1 M-MLV RT

1 Ðến 20µl

H2O

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA

Nhiệt độ

Thời gian (phút)

Bước 1

44oC

60 Bước 2

92oC

10

2.3.3.3 Phương pháp định lượng sự biểu hiện của một số gen mã hóa enzyme

tham gia tổng hợp polyphenol ở chè

Để so sánh mức độ biểu hiện của gen quan tâm trên các mẫu chè,

chúng tôi sử dụng phương pháp real-time PCR định lượng tương đối theo

phương pháp của Wang và đtg [39]. Các cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

PCR được trình bày ở bảng 2.5:

Bảng 2.5. Danh sách và trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu định

lượng sự biểu hiện của gen

Kích thước

Tên mồi

Trình tự

Gen đích

sản phẩm

TCAAGCAAGGACTGGAGAGG

qCsGAPDH F

glyceraldehyde

140bp

ACAGTGGGAACGCGGAAAG

qCsGAPDH R

-3-phosphate

TCCGAGGATCCAGAGAATGAC

qCsANR F

dehydrogenase

Anthocyanidin

175bp

TCCAGTGACTCTCATCCATGAC

qCsANR R

reductase

qCsLAR F ACTAGACCAACTCACCCTAGTCC

Leucocyanidin

169bp

CACCCCACACTCTTCTATCAATC

qCsLAR R

recductase

Thí nghiệm real-time PCR được thực hiện với gen đích (target gene =

Tg) và gen tham chiếu (reference gene = Ref) ở các mẫu chè khác nhau. Khi

đó, tương ứng với từng mẫu, sẽ có kết quả định lượng cho cả gen đích và gen

tham chiếu với giá trị Ct khác nhau. Dựa trên các giá trị này, chu kì ngưỡng

của gen đích trên các mẫu chè được tiêu chuẩn hóa bằng cách tính hiệu số

chênh lệch Ct của gen đích với gen tham chiếu trên các mẫu theo công thức

ΔCt = Ct(Tg) – Ct(Ref) (1)

Để so sánh tỷ lệ biểu hiện của một gen trên các mẫu thí nghiệm khác

nhau, cần chọn một mẫu làm mẫu định chuẩn (calibrator=C). Ở đây, chúng

tôi chọn mẫu chè Trung du xanh làm mẫu định chuẩn. Khi đó, mức độ biểu

hiện của gen đích trên mẫu chè Trung du tím so với chè Trung du xanh được

tính theo công thức:

R = 2-(ΔCt(chè Trung du tím) – ΔCt(chè Trung du xanh)) (2)

Dựa theo thiết kế thí nghiệm ở trên, chúng tôi sử dụng 5ng cDNA sợi

đơn được tổng hợp từ RNA tổng số của mỗi mẫu chè để làm khuôn cho phản

ứng real-time PCR. Phản ứng với mỗi gen ở từng mẫu chè được lặp lại ba

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

lần. Mỗi ống phản ứng chứa 5µl 2X Luna Universal qPCR Mastermix, 0.2µl

mồi mỗi loại, 0.2µl DMSO, 0.5µl cDNA 10ng/µl, và bổ sung nước đến thể

tích 10µl. Phản ứng real-time PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như

sau: 950C trong 10 phút, sau đó 45 chu kì gồm 2 bước: 950C trong 15 giây và

620C trong 30 giây, tiếp theo bước phân tích biến tính gồm: 950C trong 5

giây, 650C trong 1 phút và tăng dần nhiệt độ lên 970C.

Kết quả khuếch đại của mỗi chu kì được ghi lại bằng hệ thống máy

LightCycler 96 của hãng Roche. Kết quả được trích xuất và phân tích theo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

phần mềm tương ứng của máy.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằng HPLC

Để định lượng catechins từ mẫu chè nghiên cứu, chúng tôi tiến hành xây

dựng đường chuẩn định lượng của catechins gồm các chất chuẩn: C, GC,

EGCG, EGC và ECG. Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của các

chất chuẩn C, GC, EGC, EGCG, ECG được phát hiện lần lượt tại thời gian

lưu Rt 16,8 min, 12,8 min, 15,2 min, 18,9 min và 25,0 min; đồng thời hệ

thống MS phát hiện được pic ion phân tử tại m/z 325,0 [M+Cl]-, 341,0

[M+Cl]-, 341,0 [M+Cl]-, 493,0 [M+Cl]-, 477,0 [M+Cl]- tương ứng với các

thời gian lưu trên.

Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC tại 280 nm (A) và phổ ESI-MS negative của 5

chất chuẩn C (1), GC (2), EGC (3), EGCG (4), ECG (5) (B-F).

Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của chất chuẩn catechin

được phát hiện tại thời gian lưu ở phút 29 (Hình 3.1).

Kết quả phân tích trên HPLC của 8 mẫu chè cho thấy các tín hiệu của 5

hợp chất sử dụng để đánh giá có sự tách biệt rõ ràng các pic không bị chập và

sắc nét (Hình 3.1). Điều này chứng tỏ quá trình xử lý mẫu và các điều kiện

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

lựa chọn cho phân tích là phù hợp và tối ưu.

Hình 3.2. Sắc ký đồ UV 280nm của 05 chất chuẩn (A) và 08 mẫu thí nghiệm

(B): Chè Trung du tím, (C): Chè Indo, (D): Chè Keo am tích, (E): Chè Bát tiên, (F):

Chè LDP1, (G): Chè pH1, (H) Chè Phúc vân tiên và (I) Chè Trung du xanh.

Đường chuẩn được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa

trên diện tích pic tại bước sóng UV 280 nm có dạng Y = 39,05957x –

8,54829 và có hệ số tương quan R2 > 0,99987. Đồng thời, giá trị phát hiện

LOD = 0,02 và giới hạn định lượng LOQ = 0,07. Kết quả LOD và LOQ này

cho thấy phương pháp có độ nhạy cao.

Bảng 3.1. Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan của các chất

tham chiếu

Chất tham chiếu Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan

C Y = 4,59696x – 4,41487 0,99998

GC Y = 0,750176x – 1,71561 0,99993

EGC Y = 1,41194x – 2,03458 0,99995

EGCG Y = 11,74962x – 32,82216 0,99991

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ECG Y = 16,32119x – 16,68620 0,9992

Đánh giá hàm lượng các mẫu chè cho thấy mẫu chè Indo có hàm lượng

các thành phần rất cao, đặc biệt là các catechins thành phần cũng cho giá trị

rất cao gồm: 39,97 mg/g GC; 21,18 mg/g EGC; 23,87 mg/g EGCG và 1,76

mg/g C. Hàm lượng tổng các catechins đạt 90,64 mg/g, vượt trội so với các

mẫu chè khác. Hàm lượng tổng catechins các mẫu thử nghiệm khác gồm:

59,24 mg/g (chè Keo am tích), 57,91mg/g (chè Trung du xanh), 56,08 mg/g

(chè Phúc vân tiên), 40,44 mg/g (chè Trung du tím), 38,0 mg/g (Chè Bát

tiên), 37,03 mg/g (chè LDP1), 28,71 mg/g (chè pH1) (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Hàm lượng các chất tham chiếu (mg/g)

Hàm lượng chất tham chiếu (mg/g)

Tên mẫu C GC EGC EGCG ECG Tổng hàm lượng

57,91 0,82 20,56 6,81 20,15 9,57 Chè Trung du xanh

40,44 0,96 22,81 4,65 9,51 2,51 Chè Trung du tím

90,64 1,76 39,97 21,18 22,01 5,72 Chè Indo

59,24 0,61 17,83 11,79 23,87 5,14 Chè Keo am tích

56,08 0,37 6,46 6,23 19,16 5,78 Chè Bát tiên

37,03 0,95 7,08 8,18 15,52 5,30 Chè LDP1

28,71 0,58 11,23 4,09 10,10 2,71 Chè pH1

56,08 1,01 21,03 10,93 16,93 6,18 Chè Phúc vân tiên

3.2. Định lượng sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp

polyphenol ở chè

Phương pháp real-time PCR định lượng là một công cụ quan trọng để

định lượng sự biểu hiện sản phẩm phiên mã của gen nhanh chóng và tin cậy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nhờ vào tính đơn giản, đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng. Tuy nhiên, một

phân tích real-time PCR thành công phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm

tính toàn vẹn của RNA tổng số, hiệu suất của phản ứng phiên mã ngược, thiết

kế mồi, lựa chọn phương pháp hiển thị hóa học và phân tích số liệu. Bởi vì

các biến trong thí nghiệm là không thể tránh khỏi, điều này yêu cầu cần có

phương pháp chính xác để tiêu chuẩn hóa (normalization) trong phân tích

real-time PCR định lượng. Trong đó, tiêu chuẩn hóa với một gen tham chiếu

(reference gene) có biểu hiện ổn định là một phương pháp đơn giản và khá

thông dụng. Trong 8 giống chè được chúng tôi định lượng, giống chè Trung

du từ lâu đã được coi là khởi thủy của cây chè Việt Nam, có khả năng chịu

bệnh, chịu hạn, sinh trưởng mạnh, giá trị kinh tế cao, bảo vệ môi trường sinh

thái. Vì vậy chúng tôi chọn chè Trung du xanh và Trung du tím để định

lượng real- time PCR. Trong thí nghiệm định lượng sự biểu hiện của gen

LAR và ANR ở 2 mẫu chè nghiên cứu, chúng tôi sử dụng gen GADPH mã hóa

cho enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase làm gen tham chiếu.

Gen GADPH là gen quản gia (houseskeeping gene), đã được chứng minh là

có sự biểu hiện ổn định ở các mô khác nhau và ở các điều kiện khác nhau.

Trên thực tế, gen GADPH đã được sử dụng làm gen tham chiếu trong phân

tích real time PCR trong nghiên cứu của Wang và đtg (2012) [40].

Kết quả khuếch đại qua mỗi chu kì của các gen GADPH, LAR và ANR ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

mỗi mẫu chè được thể hiện ở hình 3.3 .

B

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.3. Đồ thị khuếch đại của các gen trong phản ứng real-time.

A: Đồ thị khuếch đại của gen GADPH, gen ANR trong một lần chạy 1

B: Đồ thị khuếch đại của gen GADPH và gen LAR trong một lần chạy 2.

Như được đề cập ở trên, lợi thế của real-time PCR so với phương pháp

PCR truyền thống là kết quả khuếch đại DNA ở mỗi chu kì được ghi lại thông

qua cường độ tín hiệu huỳnh quang thu được ở mỗi ống phản ứng. Sự thay

đổi cường độ tín hiệu này được ghi lại trên một đồ thị biểu diễn, gọi là đường

cong khuếch đại. Ở đó, trục hoành biểu diễn các chu kì, và trục tung thể hiện

cường độ huỳnh quang của các chu kì đó. Có thể nhận thấy, đồ thị khuếch đại

của các gen đều có hình dạng đặc trưng với lí thuyết. Ban đầu, khi lượng sản

phẩm khuếch đại trong ống phản ứng còn thấp, tín hiệu thu được là dạng

đường thẳng, có giá trị gần bằng 0. Đến một chu kì nhất định, tín hiệu huỳnh

quang bắt đầu tăng lên theo mức lũy thừa, đường biểu diễn đi lên theo đường

chéo. Sau đó, khi lượng sản phẩm PCR đạt đến mức độ bão hòa, đường biểu

diễn chuyển sang thành đường ngang. Đồng thời, chúng tôi thực hiện phân

tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR trong ống phản ứng. Đầu tiên,

nhiệt độ được đẩy lên cao, 950C trong 1 phút để biến tính hoàn toàn sản phẩm

có trong ống phản ứng. Tiếp theo, nhiệt độ hạ xuống 550C để các sản phẩm

khuếch đại có thể bắt cặp lại với nhau để hình thành mạch DNA đôi. Sau đó,

nhiệt độ được đưa lên từ từ với mỗi bước tăng là 0.20C trong 1 giây. Ở mỗi

bước này, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận và ghi lại. Bởi vì SYBR Green

chỉ bám vào DNA mạch đôi và phát ánh sáng, DNA mạch đơn không được

SYBR gắn vào, tín hiệu ghi nhận được sẽ giảm dần tương ứng với sự giảm

dần số lượng của phân tử DNA mạch đôi trong hỗn hợp. Khi đến bước tăng

nhiệt độ mà ở đó trùng khớp với Tm của sản phẩm khuếch đại trong ống phản

ứng, cường độ huỳnh quang sẽ giảm đột ngột vì có đến 50% sản phẩm khuếch

đại bị biến tính thành sợi đơn cùng một lúc. Nhờ đó, Tm của sản phẩm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

khuếch đại có trong ống được xác định. Do đó, thông qua phân tích nhiệt độ

nóng chảy của phản ứng PCR, có thể biết được sản phẩm khuếch đại có đặc hiệu hay có hiện tượng dư thừa dimer hay không (Hình 3.4).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.4. Biểu đồ đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại trong các ống

phản ứng

A: Biểu đồ đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại gen GADPH, gen

ANR trong một lần chạy 1

B: Biểu đồ đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại gen GADPH và

gen LAR trong một lần chạy 2

Ở đây, trục hoành là dải nhiệt độ, và trục tung là sự biến thiên của cường

độ tín hiệu huỳnh quang. Kết quả ở hình 3.4 cho thấy, sản phẩm khuếch đại

của các gen khá đặc hiệu, thể hiện là một đỉnh rõ ràng trên đồ thị. Tm của các

sản phẩm khuếch đại gen GADPH là 83,7; gen ANR là 81,5 và gen LAR là 84

Từ mỗi biểu đồ khuếch đại của gen, một đường tín hiệu ngưỡng cắt các

đường cong khuếch đại của gen tại các vị trí xác định. Giá trị hoành độ của

các điểm trên là giá trị chu kì ngưỡng Ct của ống phản ứng. Chúng tôi thu

được kết quả giá trị Ct của các gen quan tâm và gen tham chiếu trên hai mẫu

chè như bảng 3.3 (giá trị của 3 lần lặp lại được tính trung bình).

Bảng 3.3. Giá trị chu kì ngưỡng Ct của các gen trên hai mẫu chè chạy lần 1

(Thông số của các gen trong mỗi lần chạy được ghi riêng trong từng bảng nhỏ)

Giá trị Ct của Giá trị Ct của Mẫu gen GADPH gen ANR

17,34 ± 0,064 17,84 ± 0,017 Chè Trung du xanh

18,73 ± 0,04 20,16 ± 0,065 Chè Trung du tím

Bảng 3.4. Giá trị chu kì ngưỡng Ct của các gen trên hai mẫu chè chạy lần 2

(Thông số của các gen trong mỗi lần chạy được ghi riêng trong từng bảng nhỏ)

Gía trị Ct của

Mẫu

gen GADPH

gen LAR

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

17,22 ± 0,032

17,13 ± 0,020

Chè Trung du xanh

18,5 ± 0,049

19,72 ± 0,032

Chè Trung du tím

Sử dụng công thức (1), chúng tôi tiêu chuẩn hóa giá trị ΔCt của các

gen quan tâm dựa trên gen tham chiếu (gen GADPH). Kết quả được thể hiện

trên bảng 3.5 .

Bảng 3.5. Giá trị ΔCt của các gen ở hai mẫu chè.

Giá trị ΔCt của gen Giá trị ΔCt của gen Mẫu ANR LAR

Chè Trung 0.5 ± 0.081 -0.09 ± 0.052 du xanh

Chè Trung 1.43 ± 0.105 1.22 ± 0.081 du tím

R 0.525 0.403

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng chè Trung du xanh làm mẫu

định chuẩn. Khi đó, coi mức độ biểu hiện các gen quan tâm ở chè Trung du

xanh là 1, mức độ biểu hiện của các gen tương ứng trên chè Trung du tím

được tính toán theo công thức (2). Kết quả tính toán cho thấy các gen ANR,

LAR có mức độ biểu hiện ở cây chè Trung du tím bằng 0.525, 0.403 so với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

mức độ biểu hiện của các gen này ở cây chè Trung du xanh.

Hình 3.5. Biểu đồ so sánh sự biểu hiện của hai gen LAR, ANR trong hai mẫu chè Trung du tím và chè Trung du xanh. CT: chè Trung du tím, CX: chè Trung du xanh

Từ hình 3.5 là biểu đồ so sánh sự biểu hiện của hai gen quan tâm ở hai

mẫu chè. Có thể nhận thấy rõ rằng, cả hai gen đều biểu hiện cao hơn ở cây

chè Trung du xanh. Như vậy, mức độ phiên mã của cả hai gen ở Trung du

xanh đều cao hơn so với Trung du tím. Biểu hiện của LAR trong Trung du

xanh cao gấp 2,3 lần so với Trung du tím. Trong khi đó, so với Trung du

xanh, Trung du tím thể hiện mức độ biểu hiện ANR thấp hơn khoảng 2 lần.

3.3. Mối liên quan giữa hàm lượng catechins với sự biểu hiện của các gen

LAR và ANR ở chè Trung du xanh và chè Trung du tím

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã định lượng hàm lượng của catechins

trong hai giống chè địa phương của Việt Nam là Trung du xanh và Trung du

tím. Trung du xanh thuộc giống chè có lá màu xanh lá, trong khi chè tím

Trung du tím có nụ và lá màu tím. Mẫu ngay sau khi thu, catechins được

được chiết xuất với 100% methanol. Cấu trúc bình thường của catechins

được chứng minh là không ổn định ở nhiệt độ trên 80°C (Chen và đtg, 1995)

[21]. Vì vậy, phương pháp chiết xuất có kiểm soát nhiệt độ đã được áp dụng.

C, GC, EGC, EGCG và ECG là các hợp chất được phát hiện trong hai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

giống chè nghiên cứu. Hàm lượng riêng của từng catechins trong hai giống

chè được trình bày trong bảng 3.2. Các catechins được xác định định lượng

bằng phân tích HPLC. Trong các catechins được nghiên cứu, GC có nồng độ

cao nhất trong cả hai mẫu chiết xuất chè. Trong khi đó hàm lượng C cho thấy

mức thấp nhất trong cả hai giống. Hàm lượng của EGC, EGCG và ECG trong

Trung du xanh đều cao hơn so với Trung du tím.

Catechins có nguồn gốc từ nhiều nhánh của con đường chuyển hóa

flavonoid. Catechins được chuyển hóa từ leucocyanidin và

leucoanthocyanidin do xúc tác LAR và ANR. Sinh tổng hợp epicatechin và

epigallocatechin trước hết là nhờ anthocyanidin synthase- ANS để chuyển

leucoanthocyanidin thành anthocyanidin. Sau đó, anthocyanidin có thể được

chuyển đổi thành epicatechin bằng ANR hoặc dẫn xuất các dẫn xuất nhờ

enzyme UFGT (Liu và đtg, 2005) [32].

Hàm lượng catechins khác nhau tùy thuộc vào giống chè, thời gian thu

thập, giai đoạn phát triển, phương pháp chế biến. Tổng hàm lượng catechins

của giống Longjing43 là gần 150 mg/g trong búp chè khô với khoảng 5 mg/g

EGC, 13 mg/g C, 52 mg/g EGCG, 65 mg/g ECG (Zhang và đtg, 2016) [46].

So sánh, tỷ lệ giữa các hợp chất catechins trong chè Trung du tím và Trung

du xanh không phù hợp với Zhang. Những lý do có thể là sự khác biệt về

giống, thu thập thời gian, quy trình xử lý để phân tích HPLC. Kết quả nghiên

cứu của chúng tôi phù hợp với kết luận của Djemukhatze K.M. (1981) khi

nghiên cứu về các cây chè dại ở Việt Nam (rừng chè dại ở Suối Giàng, Tiên

Thông và Thông Nguyên) cho thấy chúng cũng tổng hợp chủ yếu là: (-)-

epicatechin và (-) - epicatechin gallat (chiếm 70% tổng số các loại catechins).

Khi di thực cây chè dại này lên phía Bắc, với các điều kiện khắc nghiệt hơn

về khí hậu, chúng sẽ thích ứng dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có

thành phần catechins phức tạp hơn, cùng với sự tạo thành (-) epigallocatechin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

và các gallat của chúng [1].

Giả thuyết này được hỗ trợ bởi phân tích PCR về các gen có liên quan

đến tổng hợp catechins. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu mức

độ biểu hiện của gen ANR và LAR trong hai giống chè, kết quả này hoàn toàn

phù hợp với mức độ biểu hiện tương đối của hai gen LAR, ANR trong hai mẫu

chè Trung du tím và chè Trung du xanh. Trung du xanh cho thấy các biểu

hiện cao hơn của gen LAR và ANR so với Trung du tím, điều này có thể giải

thích tại sao hàm lượng catechins trong Trung du xanh cao hơn so với Trung

du tím trong phân tích HPLC.

Như vậy, nghiên cứu này của chúng tôi đã chứng minh rằng giống

Trung du xanh chứa hàm lượng catechins cao hơn Trung du tím. Các kết quả

phân tích định lượng sự biểu hiện ở mức độ phiên mã bằng real time PCR

phù hợp với giả thuyết này vì cả gen LAR và ANR trong lá chè Trung du tím

thể hiện yếu hơn nhiều so với chè Trung du xanh. Catechins có rất nhiều lợi

ích cho sức khỏe. Do đó, những phát hiện của chúng tôi sẽ góp phần tăng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cường hoạt động bảo tồn và phát triển các giống chè địa phương.

KẾT LUẬN

1. Từ phương pháp HPLC, chúng tôi đã định lượng thành công năm

thành phần catechin chính trong tám mẫu chè khác nhau trồng tại Thái

Nguyên. Kết quả cho thấy mẫu chè Indo có hàm lượng catechin tổng và

catechin thành phần vượt trội, các mẫu chè Keo am tích, Phúc vân tiên, Bát

tiên và Trung du xanhcó hàm lượng tương đương nhau. Mẫu chè pH1 có hàm

lượng catechin tổng thấp nhất.

2. Sử dụng phương pháp real-time PCR định lượng sự biểu hiện của gen

LAR và ANR trong hai mẫu chè Trung du xanh và Trung du tím. Ở cả hai

giống chè đều có sự biểu hiện của hai gen LAR và ANR, tuy nhiên mức độ

biểu hiện của hai gen này ở chè Trung du xanh cao hơn chè Trung du tím.

3. Thiết lập được mối liên quan giữa hàm lượng catechins và sự biểu

hiện của gen LAR và ANR ở chè Trung du xanh và chè Trung du tím. Chè

Trung du xanh cho thấy gen LAR và ANR biểu hiện cao hơn so với chè Trung

du tím, điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả định lượng hàm lượng

catechins.

KIẾN NGHỊ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Tiếp tục nghiên cứu định lượng sự biểu hiện của các gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp catechins ở các giống chè địa phương khác và nghiên cứu vào các thời điểm khác nhau trong năm nhằm góp phần làm sáng tỏ quá trình sinh tổng hợp catechins và định hướng phát triển các sản phẩm chè.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

[1] Djemukhatze K.M. (1981),“Cây chè Miền Bắc Việt Nam”, NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

[2] Đỗ Ngọc Qũy & Lê Thất Khương (2000) “Giáo trình cây chè sản xuất chế

biến và tiêu thụ”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

[3] Đỗ Ngọc Quỹ (1991) “Sự thành lập và hoạt động của trạm nghiên cứu

nông nghiệp Phú Hộ 1918- 1945”, Viện nghiên cứu chè.

[4] Đỗ Thị Gấm (2002) “ Đánh giá sự biến động thành phần polyphenol trong

lá chè Tân cương (Thái nguyên) và hoạt tính chống oxy hóa của

chúng”, Hội nghị Hóa sinh y dược.

[5] Đỗ Tất Lợi (2000) “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB KH &

KT, Hà nội.

[6] Giang Trung Khoa, Nguyễn Thanh Hải, Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị

Bích Thủy, Phạm Đức Nghĩa, Nguyễn Thị Oanh, Phan Thu Hương,

P.Duez (2013) “Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đến thành phần hóa

học cơ bản của giống chè trung du”, Tạp chí khoa học và phát triển,

11(3), 373-279.

[7] Hoàng Thị Thu Yến, Nguyễn Văn Tuấn & Hoàng Thị Ngà (2012)

“Nghiên cứu đa dạng di truyền genome một số dòng chè (Camellia

sinensis) trồng tại xã Tân Cương – Thành phố Thái Nguyên bằng kỹ

thuật RAPD”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên, 96(8), tr.

139 -143.

[8] Hoàng Thị Thu Yến, Dương Thị Nhung, La Quang Thương & Hà Thị

Loan (2014) “Nghiên cứu chỉ thị SSR ở một số giống/dòng chè trồng

tại Thái Nguyên”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

120(6), tr. 13-19.

[9] Lê Tất Khương & Hoàng Văn Chung (1999) “Giáo trình cây chè”, NXB

Nông nghiệp, Hà Nội.

[10] Lương Văn Vượng, Phạm Huy Thông, Lê Văn Đức & Lê Hồng Vân (2013) “Kỹ thuật sản xuất và chế biến chè xanh”, NXB Nông nghiệp, 47, Hà Nội.

[11] Mai Tuyên, Vũ Bích Lan, Ngô Quang Đại (2008) Bài báo khoa học “Nghiên cứu chiết xuất và xác định tác dụng kháng oxy hóa của polyphenol từ lá chè xanh Việt nam”.

[12] Nguyễn Minh Hùng & Đinh Thị Phòng (2004) “Đánh giá tính đa hình RAPD genome một số giống chè”. Tạp chí công nghệ sinh học, 2(1), tr. 109-116.

[13] Trần Thị Thanh Hương, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn (2006) “Bước đầu nghiên cứu tác dụng của polyphenol chè xanh (Camellia sinensis) trên một số dòng tế bào ung thư nuôi cấy”, Tạp chí Nghiên cứu Y học - ĐHYHN, Vol.41, N02;

[14] Trịnh Xuân Ngọ( 2009) “Cây chè và kĩ thuật chế biến chè”, NXB Khoa

Học Kĩ Thuật Công Nghệ .

[15] Vũ Thi Thư, Đoàn Hùng Tiến và đtg (2001) “Các hợp chất hóa học có trong chè và một số phương pháp phân tích thông dụng trong sản xuất chè ở Việt Nam ”, Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

[16] Viện nghiên cứu Chè (1994) “Kết quả nghiên cứu khoa học và triển khai

công nghệ về Chè (1989 - 1993)”

Tài liệu tiếng nước ngoài

[17] Bandyopadhyay D., Chatterjee T.K., Dasgupta A., Lourduraja J., Dastidar S.G. (2005) “In vitro and in vivo antimicrobial action of tea: the commonest beverage of Asia”, Biol Pharm Bull 28 2125-2127.

[18] Bursill C., Roach P.D., Bottema C.D., Pal S. (2001) “Green tea

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

upregulates the low-density lipoprotein receptor through the sterol-

regulated element binding Protein in HepG2 liver cells”, J Agric Food

Chem 49 5639-5645.

[19] Byung Zun Ahn. (1995) “Proceeding of UNESCO regione seminar on

the chemistry, pharmacology and clinical use of Flavonoit compounds;

Polyoxyfenate Flavones, synthesis, cytotoxicities and Autitumor

activity against ICR Maice carrying S-180 cell”, Korea Oct. 11-85, pp

107 – 113.

[20] Chen, C. W and Ho, C. T. (1995) “Antioxidant properties of polyphenols

extracted from green tea and black tea”, J. Food Lip. 2, pp 35 – 46.

[21] Chi, Tang Ho, Tea and Tea Products (2008) “Chemistry and Health”,

Promoting Propertiess.

[22] Harbowy M. E. & Balentine D. A. (1997) “Tea chemistry”. Critical

Reviews ill Plant Sciences, 16(5), pp. 415-480.

[23] Harborn J. B (1964) “Biochermistry of phenolic compounds”, Academic

press, London and New york.

[24] Harborn J. B (1986) Nature, distribution and function of plant flavonoids,

in “Plant Flavonoids in Biology and Medicine: Biochemical,

Pharmacological, and Structure – Activity Relationships” (Cody V,

Middleton E Jr and Harborne J.B eds), Alan R. Liss, Inc., New York,

pp15 -24.

[25] Hosoda K., Wang M.F. , Liao M.L., Chuang C.K., Iha M., Clevidence

B., Yamamoto S. (2003), “Antihyperglycemic effect of oolong tea in

type 2 diabetes”, Diabetes Care 26, pp1714-1718.

[26] Itoh Y.,Yasui T.,Okada A.,Tozawa K., Hayashi Y., Kohri K., (2005)

“Preventive effects of green tea on renal stone formation and the role of

oxidative stress in nephrolithiasis”, J Urol 173, pp 271-275.

[27] Jiang X., Liu Y., Li W., Zhao L., Meng F., Wang Y., Tan H., Yang H.,

Wei C., Wan X., Gao L. & Xia T. (2013) “Tissue-specific,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

development-dependent phenolic compounds accumulation profile and

gene expression pattern in tea plant [Camellia sinensis]”. PLoS One,

8(4), pp. 62315.

[28] Katiyar S.K., Afaq F., Perez A., Mukhtar H. (2001) “Green tea

polyphenol (-)-epigallocatechin-3- gallate treatment of human skin

inhibits ultraviolet radiation-induced oxidative stress”, Carcinogenesis

22, pp 287-294.

[29] Lee M.J., Lambert J.D , Prabhu S., Meng X., Lu H., Maliakal P., Ho

C.T., Yang C.S. (2004) “ Delivery of tea polyphenols to the oral cavity

by green tea leaves and black tea extract”, Cancer Epidemiol

Biomarkers Prev 13, pp 132-137.

[30] Lee S.Y., Lee J.W., Lee H., Yoo H.S., Yun Y.P., Oh K.W., Ha T.Y.,

Hong J.T. (2005) “Inhibitory effect of green tea extract on beta-

amyloid-induced PC12 cell death by inhibition of the activation of

NFkappaB and ERK/p38 MAP kinase pathway through antioxidant

mechanisms”, Brain Res Mol Brain Res 140, pp 45-54.

[31] Liu S., Lu H., Zhao Q., He Y., Niu J., Debnath A.K., Wu S., Jiang S.

(2005) “Theaflavin derivatives in black tea and catechin derivatives in

green tea inhibit HIV-1 entry by targeting gp41”, Biochim Biophys Acta

1723, pp 270-281.

[32] Pang Y., Abeysinghe I. S., He J., He X., Huhman D., Mewan K. M.,

Sumner L. W., Yun J. & Dixon R. A. (2013) “Functional

characterization of proanthocyanidin pathway enzymes from tea and

their application for metabolic engineering”. Plant Physiol, 161(3), pp.

1103-1116.

[33] Punyasiri P. A., Abeysinghe S. B. & Kumar V. (2005) “Preformed and

induced chemical resistance of tea leaf against Exobasidium vexans

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

infection”. J Chem Ecol, 31(6), pp. 1315-1324.

[34] Rani A., Singh K., Ahuja P. S. & Kumar S. (2012) “Molecular regulation

of catechins biosynthesis in tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)”.

Gene, 495(2), pp. 205-210.

[35] Sang S., Lambert J.D., Tian S., Hong J., Hou Z., Ryu J.H., Stark R.E.,

Rosen R.T., Huang M.T., Yang C.S., Ho C.T. (2004) “Enzymatic

synthesis of tea theaflavin derivatives and their anti-inflammatory and

cytotoxic activities”, Bioorg Med Chem 12, pp 459-467.

[36] Singh K., Rani A., Kumar S., Sood P., Mahajan M., Yadav S. K., Singh

B. & Ahuja P. S. (2008) “An early gene of the flavonoid pathway,

flavanone 3-hydroxylase, exhibits a positive relationship with the

concentration of catechins in tea (Camellia sinensis)”. Tree Physiol,

28(9), pp. 1349-1356.

[37] Tanaka J. & Taniguchi F. (2006) “Estimation of the genome size of tea

(Camellia sinensis), camellia (C. japonica), and their interspecific

hybrids by flow cytometry”. Journal of the Remote Sensing Society of

Japan101), pp. 1-7.

[38] Tian W.X. ,Li L.C. ,Wu X.D. , Chen C.C. (2004) “Weight reduction by

Chinese medicinal herbs may be related to inhibition of fatty acid

synthase”, Life Sci 74 2389-2399.

[39] Wang Y. S., Gao L. P. & Shan Y. (2012) “Influence of shade on

flavonoid biosynthesis in tea (Camellia sinensis (L.) O.Kuntze)”. Sci

Hort, 141, pp. 7–16.

[40] Wei K., Wang L., Zhang C., Wu L., Li H., Zhang F. & Cheng H. (2015)

“Transcriptome Analysis Reveals Key Flavonoid 3'-Hydroxylase and

Flavonoid 3',5'-Hydroxylase Genes in Affecting the Ratio of

Dihydroxylated to Trihydroxylated Catechins in Camellia sinensis”.

PLoS One, 10(9), pp. 0137925.

[41] Wu Z. J., Li X. H., Liu Z. W., Xu Z. S. & Zhuang J. (2014) “De novo

assembly and transcriptome characterization: novel insights into catechins

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

biosynthesis in Camellia sinensis”. BMC Plant Biol, 14, pp. 277.

[42] Xie D. Y., Sharma S. B., Paiva N. L., Ferreira D. & Dixon R. A. (2003)

“Role of anthocyanidin reductase, encoded by BANYULS in plant

flavonoid biosynthesis”. Science, 299(5605), pp. 396-399.

[43] Xiong L., Li J., Li Y., Yuan L., Liu S., Huang J. & Liu Z. (2013)

“Dynamic changes in catechin levels and catechin biosynthesis-related

gene expression in albino tea plants (Camellia sinensis L.)”. Plant

Physiol Biochem, 71, pp. 132-143.

[44] Yang C.S., Chung J.Y., Yang G., Chhabra S.K, Lee M.J. (2000) “Tea

and tea polyphenols in cancer prevention”, J Nutr 130, pp 472S-478S.

[45] Zhang, Z., F. Werner, H.-M. Cho, G. Wind, S.E. Platnick, A.S.

Ackerman, L. Di Girolamo, A. Marshak, and K.G. Meyer (2016) “A

framework based on 2-D Taylor expansion for quantifying the impacts

of sub-pixel reflectance variance and covariance on cloud optical

thickness and effective radius retrievals based on the bispectral

method” J. Geophys. Res. Atmos., 121, no. 12,pp 7007-7025

[46] Zhen Y. S., Chen Z. M., Cheng S. J. & Chen M. L. (2002) “Tea

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

bioactivity and therapeutic potential”. London, Taylor & Francis.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Định lượng một số hợp chất polyphenol và sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp polyphenol ở chè

VÀ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA TỔNG HỢP POLYPHENOL Ở CHÈ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

VÀ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA TỔNG HỢP POLYPHENOL Ở CHÈ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

i

ii

+ Micropipet loại 100, 200, 1000 µL, Eppendorf, Germany.

Thành phần

Thể tích (µl)

Primer oligodtT

2

Total RNA

Ðến 1 µg

10X RT Buffer

2

10mM dNTPs

1

RNase Inhibitor

1

M-MLV RT

1

Ðến 20µl

H2O

Nhiệt độ

Thời gian (phút)

Bước 1

44oC

60

Bước 2

92oC

10

Kích thước

Tên mồi

Trình tự

Gen đích

sản phẩm

140bp

Anthocyanidin

175bp

reductase

Leucocyanidin

169bp

recductase

Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC tại 280 nm (A) và phổ ESI-MS negative của 5

(B): Chè Trung du tím, (C): Chè Indo, (D): Chè Keo am tích, (E): Chè Bát tiên, (F):

Chè LDP1, (G): Chè pH1, (H) Chè Phúc vân tiên và (I) Chè Trung du xanh.

B

Gía trị Ct của

Gía trị Ct của

Mẫu

gen GADPH

gen LAR

17,22 ± 0,032

17,13 ± 0,020

Chè Trung du xanh

18,5 ± 0,049

19,72 ± 0,032

Chè Trung du tím

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học, chiết xuất, bào chế và kiểm nghiệm một số hợp chất polyphenol trong nguyên liệu và thành phẩm từ lá Actisô Đà Lạt

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hành vi sử dụng dịch vụ ngân hàng điện tử tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Ngoại thương Việt Nam – Chi nhánh Thủ Đức

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố tác đồng đến nợ xấu tại Ngân hàng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Chi nhánh Tiền Giang

Luận văn Thạc sĩ: Yếu tố ảnh hưởng đến quyết định sử dụng dịch vụ thanh toán không dùng tiền mặt tại Ngân hàng TMCP Công thương Việt Nam (Vietinbank)

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về du lịch biển, thực tiễn tại tỉnh Bình Định