Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của Vitamin C lên sự tăng trưởng, chu kỳ tế bào và apoptosis của tế bào ung thư dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

––––––––––––––––––––

ĐINH THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA VITAMIN C LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, CHU KỲ TẾ BÀO VÀ APOPTOSIS

CỦA TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

––––––––––––––––––––

ĐINH THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA VITAMIN C LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, CHU KỲ TẾ BÀO VÀ APOPTOSIS

CỦA TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trương Phúc Hưng

LỜI CẢM ƠN

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn tại khoa Công nghệ

Sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, em đã nhận THÁI NGUYÊN - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn tại khoa Công nghệ

Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, em đã nhận được

sự giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên và cán

bộ trong khoa và trường.

Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn TS. Trương Phúc Hưng đã hướng dẫn

em hoàn thành luận văn này.

Để có được kết quả học tập như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn sâu

sắc đến Thầy giáo - TS. Nguyễn Phú Hùng – Trưởng khoa Công nghệ sinh học,

Thầy luôn dành thời gian để hướng dẫn, chỉ bảo em trong quá trình thực hiện

luận văn này.

Xin trân trọng cảm ơn ThS. Ngô Thu Hà đã giúp đỡ em trong các nghiên

cứu thực nghiệm tại phòng Thí nghiệm của Khoa. Xin chân thành cảm ơn các

thầy cô bộ phận Sau đại học của Nhà trường đã tạo điều kiện thuận lợi trong

quá trình em học tập tại trường.

Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo và quý đồng nghiệp khoa Cận lâm sàng

– Trung tâm Y tế huyện Đầm Hà, tới người thân trong gia đình và những người

bạn đã luôn gắn bó với em, là nguồn động lực cho em tiếp tục phấn đấu trong

học tập, rất mong được nhận sự đóng góp quý báu của các thầy cô giáo, các nhà

khoa học cùng các bạn bè đồng nghiệp.

Thái Nguyên, ngày 22 tháng 11 năm 2019

Học viên

Đinh Thị Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ii

LỜI CAM ĐOAN

Mọi kết quả thu được trong luận văn không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ

các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tất

cả các số liệu trong luận văn này chưa được công bố trong bất kỳ công trình

nào khác. Nếu có điều gì sai trái tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Thái Nguyên, ngày 22 tháng 11 năm 2019

Người viết cam đoan

Đinh Thị Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

5-hmC : 5- hydroxymethycytosine

AA : Axit Ascoricic

CA : Carbohydrate antigen

CEA : Carcinoembryonic antigen

DHA : Dehydroascorbic acid

GLUT : Vận chuyển hexose

GSH : Glutathione

H. pylori : Helicobacter pylori

MNNG :N -methyl- N '-nitro- N –nitrosoguanidine

NADPH : Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

NOC : Hợp chất N-nitroso gây ung thư

RBC : Số lượng hồng cầu trong máu

ROS : Loại oxy phản ứng

SVCT : Vận chuyển natri – vitamin C

UTBM : Ung thư biểu mô

UTDD : Ung thư dạ dày

CSC : Tế bào gốc ung thư

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iii

MỤC LỤC ....................................................................................................... iv

DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vi

DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... vii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2 1.1. Dịch tễ học ung thư dạ dày ...................................................................... 3

1.1.1. Tình hình ung thư dạ dày trên thế giới và trong nước ........................ 3

1.1.2. Yếu tố nguy cơ của bệnh lý và nguyên nhân phát sinh ung thư dạ dày ........................................................................................................................... 4

1.1.3. Phân loại học của ung thư dạ dày ......................................................... 6 1.2. Vitamin C ................................................................................................ 10

1.2.1. Cấu trúc của vitamin C ........................................................................ 10

1.2.2. Hấp thu và chuyển hóa vitamin C ở đường ruột ................................ 11

1.2.3. Chức năng sinh lý của vitamin C trong cơ thể ................................... 13 1.2.4. Vitamin C trong điều trị ung thư ......................................................... 14

1.2.5. Các nghiên cứu về vai trò của vitamin C trong ung thư dạ dày ........ 16 1.3. Chu kỳ tế bào .......................................................................................... 18

1.3.1 Khái niệm chu kỳ tế bào ........................................................................ 18

1.3.2 Các giai đoạn trong chu kỳ tế bào ........................................................ 18

1.3.3 Vai trò của chu kỳ tế bào trong việc hình thành khối u ...................... 21 1.4 Apoptosis .................................................................................................. 22

1.4.1 Khái niệm apoptosis .............................................................................. 22

1.4.2 Vai trò của apoptosis trong ung thư ..................................................... 23 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU ............... 25

2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

v

2.2. Địa điểm và thời gian ............................................................................. 28

2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 28

2.3.1. Nuôi cấy tế bào ung thư 2D và xử lý với Vitamin C ........................... 28 2.3.3. Phân tích chu kỳ tế bào và apoptosis bằng Flow cytometry ............... 30

2.3.4. Phân tích khả năng di cư của tế bào ................................................... 30

2.3.5. Nuôi cấy tumorsphere .......................................................................... 30

2.3.6. Phương pháp xử lí số liệu .................................................................... 31 3.1. Tác động của vitamin C lên sự tăng sinh tế bào.................................. 32

3.2. Tác động của vitamin C lên kiểu hình tế bào ...................................... 34

3.3. Ảnh hưởng của vitamin C lên chu kỳ tế bào ....................................... 35

3.4. Ảnh hưởng của vitamin C lên apoptosis của tế bào ............................ 36

3.5. Ảnh hưởng của vitamin C lên sự di trú của tế bào ............................. 38

3.6. Ảnh hưởng của vitamin C lên sự hình thành tumorsphere của tế bào ......................................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Bảng phân loại các dạng Ung thư biểu mô .............................. 8

Bảng 1.2. Đặc điểm của ung thư tế bào biểu mô dạ dày ở các giai đoạn khác nhau. ........................................................................................ 10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Ung thư biểu mô tuyến biệt hóa trung bình và kém ở mô dạ dày [51] ................................................................................................ 7

Hình 1.2. Ung thư tế bào dạng nhẫn ở mô dạ dày ............................... 8

Hình 1.3. Acid L – ascorbic, acid ascorbate (C6H8O6 ) ...................... 11

Hình 1.4. Chuyển hoá vitamin C [13] .................................................. 12

Hình 1.5. Trao đổi chất của vitamin C [24] ........................................ 14

Hình 1.6. Tổng quan về chu kỳ tế bào ................................................. 19

Hình 1.7. Tế bào bình thường (trên) và tế bào đang chết rụng (dưới) ................................................................................................................. 23 Hình 2.1. Hệ thống kính hiển vi soi ngược .......................................... 26

Hình 2.2. Tủ ấm CO2 Memmert – Đức + hệ thống cấp CO2 ............. 26

Hình 2.3. Hệ thống phân tích dòng chảy tế bào ................................. 27

Hình 2.4. Buồng thao tác an toàn sinh học cấp II Thermo Fisher Scientific - Mỹ ........................................................................................ 27

Hình 3.1. Ảnh hưởng của vitamin C lên sự tăng sinh tế bào (n = 3, *p <0,05 so với đối chứng) ......................... Error! Bookmark not defined.

Hình 3.2 Ảnh hưởng của vitamin C lên hình thái tế bào ........... Error! Bookmark not defined.

Hình 3.3. Ảnh hưởng của vitamin C lên chu kỳ tế bào (n = 3,*p <0,05. A) sự thay đổi về chu kỳ tế bào (tỷ lệ %) khi xử lý tế bào với vitamin C ở nồng độ khác nhau. B) hình ảnh minh họa ảnh hưởng của vitamin C lên chu kỳ tế bào ........... Error! Bookmark not defined.

Hình 3.4. Ảnh hưởng của vitamin C lên apoptosis của tế bào [60] ................................................................. Error! Bookmark not defined.

Hình 3.5. Ảnh hưởng của vitamin C lên sự di trú của tế bào. Thang đo 50µm .................................................. Error! Bookmark not defined.

Hình 3.6 Ảnh hưởng của vitamin C lên sự hình thành tumorsphere của tế bào ung thư dạ dày MKN45 sau 48h nuôi cấy. Thang đo 50µm. ...................................................... Error! Bookmark not defined.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Ung thư dạ dày là một loại là dạng ung thư phổ biến thứ 5 và là nguyên

nhân gây tử vong thứ 3 trong nhóm ung thư. Theo Tổ chức Y tế Thế giới

(WHO), ung thư dạ dày gây ra 783.000 cái chết trên toàn thế giới vào năm

2018. Tỷ lệ mắc ung thư dạ dày ở nam giới thường gấp 1,5 -2 lần so với nữ

giới.

Việt Nam thuộc nhóm 20 quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất

thế giới, với tỷ lệ mắc mới khoảng 16,1 trường hợp trên 100 nghìn dân [15].

Khoảng trên 70% trường hợp ung thư dạ dày được phát hiện ở giai đoạn

muộn đã dẫn tới tỷ lệ tử vong cao. Bệnh thường không có những triệu chứng

rõ ràng ở giai đoạn đầu và khi xuất hiện những triệu chứng cụ thể thì thường

đã có dấu hiệu di căn đến các bộ phận khác của cơ thể.

Trong điều trị ung thư nói chung và ung thư dạ dày nói riêng thì 3

phương pháp phổ biến nhất đang được sử dụng gồm: Phẫu thuật, hóa trị liệu

và xạ trị liệu. Hóa trị liệu là sử dụng thuốc chống ung thư có độc tính cao,

nhắm vào các tế bào phân chia. Các thuốc được sử dụng trong hóa trị liệu

truyền thống hiện nay gây chết không chọn lọc cho các tế bào và do thường

có nhiều tác dụng phụ cho cơ thể, ảnh hưởng đến chức năng của hệ thống

miễn dịch, hệ thống tiêu hóa, gan, thận…làm suy giảm nhanh chóng sức

khỏe của người bệnh sau các chu kỳ điều trị. Mặt khác, điều trị bằng phương

pháp hóa trị phổ biến như hiện nay thường dẫn tới tỷ lệ tái phát khối u sau

điều trị là rất cao do một số tế bào có khả năng kháng thuốc.

Một trong những cách tiếp cận hiện đại trong nghiên cứu liệu pháp điều

trị ung thư là hướng tới các hợp chất, các thuốc có trong tự nhiên ít gây độc cho

cơ thể và có tác dụng điều trị chọn lọc, ít nguy cơ tạo ra kháng thuốc. Vitamin

là nhóm các phân tử hữu cơ rất cần thiết cho cơ thể sinh vật dù với lượng rất

nhỏ. Vitamin C tham gia vào nhiều phản ứng trong cơ thể, hoạt động như một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

2

chất chống oxy hóa trong tế bào làm tăng sự miễn dịch cho cơ thể chống lại

bệnh tật trong đó có ung thư. Trong một vài năm trở lại đây, vitamin C là đối

tượng được quan tâm đặc biệt trong các nghiên cứu về chống ung thư ở một số

dạng ung thư khác nhau như ung thư vú, ung thư gan, ung thư phổi. Công dụng

của vitamin C không phải ai cũng biết được một cách đầy đủ, vậy sử dụng

vitamin C thật sự có khả năng điều trị ung thư hay không ? Đây chính là lý do

để chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tác động của Vitamin

C lên sự tăng trưởng, chu kỳ tế bào và apoptosis của tế bào ung thư dạ dày”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá tác động của vitamin C lên kiểu hình, sự tăng trưởng, chu kỳ,

apoptosis, khả năng di trú và khả năng hình thành tumorsphere của tế bào ung

thư dạ dày.

3. Nội dung nghiên cứu

- Phân tích ảnh hưởng vitamin C lên sự sinh trưởng tế bào ung thư dạ

dày MKN45.

- Đánh giá tác động của vitamin C lên kiểu hình tế bào ung thư dạ dày

MKN45.

- Phân tích ảnh hưởng của vitamin C lên chu kỳ tế bào ung thư dạ dày

MKN45.

- Phân tích sự tác động vitamin C lên quá trình apoptosis của tế bào ung

thư dạ dày MKN45.

- Phân tích tác động của vitamin C lên khả năng di trú của tế bào ung thư

dạ dày MKN45.

- Phân tích ảnh hưởng của vitamin C lên sự hình thành các tumorsphere

của dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Dịch tễ học ung thư dạ dày

1.1.1. Tình hình ung thư dạ dày trên thế giới và trong nước

Ung thư dạ dày là các tế bào của dạ dày phát triển mất kiểm soát, tạo thành

các khối u tại dạ dày, có thể lan ra xung quanh và các cơ quan xa hơn (di căn

xa). Bệnh liên quan đến vi khuẩn Helicobacter pylori, chế độ ăn uống và một

số yếu tố địa lý, môi trường. Bệnh thường diễn biện âm thầm ở giai đoạn sớm

nên người bệnh thường được phát hiện khi đã ở giai đoạn muộn. Ung thư dạ

dày có thể phát triển ở bất cứ phần nào của dạ dày, có thể lan ra khắp dạ dày

và đến các cơ quan khác của cơ thể, đặc biệt là thực quản, phổi, hạch bạch huyết

và gan, nhưng hay gặp nhất là ở vị trí dạ dày là 1/3 dưới, tức ung thư vùng hang

môn vị. Tỷ lệ này ở Mỹ là 45% và ở Việt Nam theo nhiều thống kê có tới hơn

80% [1] [2] [3].

Các nước có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao thuộc vùng Đông Á (Nhật Bản,

Trung Quốc, Hàn Quốc). Liên Xô cũ, Nam Mỹ, vùng Caribe và Nam Âu. Các

nước có tỷ lệ mắc bệnh thấp thuộc vùng Nam Á ( Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan),

Bắc Mỹ, Úc và Châu Phi [38].

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) vừa công bố tình hình ung thư hiệu chỉnh

theo độ tuổi tại 185 quốc gia và vùng lãnh thổ. Theo đó, Việt Nam xếp vị trí

99/185 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỉ lệ mắc ung thư 151,4/100.000 dân, xếp

19 châu Á và thứ 5 tại khu vực Đông Nam Á. Theo thống kê của WHO, số ca

mắc mới ung thư tại Việt Nam không ngừng tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên

126.000 năm 2010. Năm 2018, số ca mắc mới tăng lên gần 165.000 ca/96,5

triệu dân, trong đó gần 70% trường hợp tử vong, tương đương 115.000 ca. Tính

chung cả 2 giới, 5 loại ung thư có tỉ lệ mắc nhiều nhất tại Việt Nam gồm: Ung

thư gan, hơn 25.000 ca (15,4%), kế đó là ung thư phổi (14,4%), ung thư dạ dày

(10,6%), ung thư vú, ung thư đại tràng [41]. Như vậy, mỗi năm ước tính có từ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

4

15.068-16.114 người mắc bệnh, trong số này có từ 11.327-12.098 người tử

vong do ung thư dạ dày [8].

Về phân bố ung thư dạ dày ở Việt Nam, Hà Nội chiếm 33,2%, các tỉnh

miền Trung 14% và ở Thành phố Hồ Chí Minh thấp hơn nhiều với 2,2% [9].

Trong khi đó ở Thừa Thiên Huế ung thư dạ dày chiếm 14,7% và đứng hàng thứ

2 trong tổng số các loại ung thư ở Huế [6]. Tỷ lệ ung thư dạ dày ở nam nhiều

hơn nữ, ở hầu hết các báo cáo đã được công bố. Bệnh ít thấy ở lứa tuổi dưới

40, tỷ lệ ung thư dạ dày tăng dần sau tuổi 40 và đạt đỉnh cao ở độ tuổi 70 [55].

Nhiều nghiên cứu về dịch tễ cho thấy tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao thường xảy

ra ở tầng lớp dân cư có điều kiện kinh tế xã hội thấp [4].

1.1.2. Yếu tố nguy cơ của bệnh lý và nguyên nhân phát sinh ung thư dạ dày

Nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori): nhiều tài liệu đã xác định

vi khuẩn H. pylori là nguyên nhân chính có thể gây viêm loét dạ dày, loạn sản,

dị sản, từ đó làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày. Trong nghiên cứu của Nguyễn

Xuân Vinh cho thấy, nguy cơ mắc ung thư dạ dày khi nhiễm H. pylori là 5 lần

và nếu nhiễm H. pylori với kiểu gen CagA (cytotoxin-associated gen A) thì

nguy cơ này còn cao hơn nữa, khoảng 10 lần. Năm 1994, Tổ chức Y tế Thế giới

đã thông báo H. pylori là yếu tố gây ung thư dạ dày nhóm I. Tuy vậy, tỷ lệ

nhiễm H. pylori ở những bệnh nhân viêm dạ dày mãn (30-50%) và ung thư dạ

dày (80-97,6%) nếu có CagA và VagA (Vacuolating cytotoxin) dương tính.

Một số tác giả cho rằng, con đường từ nhiễm H. pylori đến ung thư dạ dày như

sau: Nhiễm trùng lâu dài H. pylori gây ra viêm dạ dày mãn tính, tiến triển theo

hướng viêm dạ dày teo, chuyển sản ruột, loạn sản và cuối cùng là biến đổi ác

tính niêm mạc dạ dày [5]. Ngoài H. pylori là yếu tố nguy cơ chính còn có các

yếu tố nguy cơ khác làm tăng nguy cơ trở thành ung thư dạ dày.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

5

Cho đến nay, người ta đã xác định có nhiều nguyên nhân gây ra ung thư

dạ dày nhưng cơ chế chính xác còn chưa rõ. Có những giả thuyết về nguyên

nhân được nhiều người công nhận bao gồm:

Yếu tố môi trường và chế độ ăn uống: Quỹ Nghiên cứu Ung thư Thế

giới/Viện Nghiên cứu Ung thư Hoa Kỳ (WCRF/AICR) đã kết luận rằng: Muối

cũng như thực phẩm được bảo quản bằng muối, có lẽ là nguyên nhân của ung

thư dạ dày. Đây là yếu tố đóng vai trò quan trọng, một nghiên cứu thấy tỷ lệ

mắc bệnh của người Nhật di cư sang Mỹ thấp hơn so với người bản địa đã

chứng minh vai trò của môi trường sống và chế độ ăn uống. Nhiều nghiên cứu

đã chứng minh vai trò của chế độ ăn uống có liên quan đến sự xuất hiện của

ung thư dạ dày, họ kết luận rằng các thức ăn tươi, hoa quả tươi như cam, chanh

tăng chất xơ, thức ăn giàu vitaim A, C, các yếu tố vi lượng như kẽm, đồng, sắt,

magie làm giảm nguy cơ mắt ung thư dạ dày. Các yếu tố có thể làm tăng nguy

cơ mắc ung thư dạ dày gồm sử dụng hàm lượng muối cao trong thức ăn, thức

ăn có chứa hàm lượng nitrat cao, chế độ ăn ít vitamin A,C, ăn những thức ăn

khô và thức ăn hun khói hoặc muối dầm, rượu thuốc lá…[5] [30].

Bằng phương pháp chẩn đoán huyết thanh, tỷ lệ huyết thanh dương tính

với H. pylori trong ung thư dạ dày là 64-70%. H. pylori ước tính gây ra 65%

đến 80% của tất cả các trường hợp ung thư dạ dày, tương đương với 660.000

trường hợp mới hàng năm [21].

Virus Epstein- Barr: Genome của virus này đã được phát hiện thấy ở một

số bệnh nhân ung thư dạ dày. Nó ít liên quan hơn ở những bệnh nhân ung thư

dạ dày dưới 35 tuổi, ung thư tâm vị, ung thư mỏm cụt. Trong những năm gần

đây, nhiều tác giả thống kê ung thư mỏm cụt dạ dày sau cắt đoạn trong bệnh

loét dạ dày thời gian từ 15-20 năm tỉ lệ khoảng 0,5-17%. Cũng có ý kiến giải

thích là do phẫu thuật thúc đẩy sự phát triển của loại vi khuẩn sinh nitrit trong

dạ dày và dẫn đến hậu quả phát triển dị sản ruột, từ đó dễ hình thành ung thư

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

6

dạ dày. Tỷ lệ ung thư mỏm cụt dạ dày sau phẫu thuật cắt đoạn theo Billroth II

cao hơn BillrothI [7].

Yếu tố di truyền: Ước tính ung thư dạ dày có tính chất gia đình chiếm tỷ

lệ từ 1% đến 15% trong tổng số bệnh nhân mắc ung thư dạ dày, mặc dù ung thư

dạ dày có thể là một bệnh có tính chất gia đình nhưng hiện nay chưa chứng

minh được yếu tố di truyền có liên quan đến ung thư dạ dày hay không.

Shinmura đã nghiên cứu DNA của các bệnh nhân ung thư dạ dày mang tính

chất gia đình và kết luận sự sửa chữa DNA không phù hợp, sự đột biến gen p53

và gen E-cadhein không gây nên ung thư dạ dày.

Nhóm máu: Có mối liên quan giữa tỉ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày cao với

người có nhóm máu A so với các nhóm máu khác, theo Arid (1953) thì nhóm

máu A gấp 1,2 lần nhóm O, còn 16-20% với lý do không rõ [28].

1.1.3. Phân loại học của ung thư dạ dày

Đại thể của ung thư dạ dày:

Ung thư giai đoạn sớm: Mô ung thư khu trú ở lớp viêm mạc và dưới niêm

mạc, chưa xâm lấn qua lớp cơ, hiếm gặp di căn trong giai đoạn này.

Ung thư giai đoạn muộn: Ở giai đoạn này khối u thường có kích thước

lớn, phát triển xâm nhập vào cơ thành dạ dày, có thể tới thanh mạc, xâm lấn

vào các tạng lân cận và thường có di căn hạch quanh dạ dày hoặc di căn xa.

Tổn thương gặp là sùi, loét, xâm nhập. Các tổn thương này có thể xen lẫn nhau.

Tùy theo tổn thương nào chiếm ưu thế người ta chia thành các loại sau:

Vi thể của ung thư dạ dày:

Ung thư biểu mô tuyến ở dạ dày (adenocarcinoma) là u biểu mô ác tính,

bắt nguồn từ tế bào biểu mô tuyến ở niêm mạc dạ dày. Ung thư dạ dày đa số

là ung thư biểu mô tuyến (90%) [51]. Về mặt mô bệnh học, có hai loại ung thư

biểu mô tuyến dạ dày chính (theo phân loại Lauren) là: dạng ruột và dạng phân

tán. Ung thư biểu mô tuyến thường xâm lấn nhanh chóng vào thành dạ dày,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

7

xâm nhập sang cơ niêm mạc (muscularis mucosae), lớp dưới niêm mạc, và đến

lớp cơ trơn của thành ống tiêu hóa. Các tế bào ung thư biểu mô tuyến dạng

ruột có cấu trúc hình ống bất thường, phân bố thành nhiều lớp, có nhiều ống

tuyến, giảm cấu trúc đệm (stroma). Thông thường, chuyển sản ruột cũng hay

xảy ra ở các vùng niêm mạc xung quanh. Tùy vào cấu trúc tuyến, sự đa hình

thái và sự tiết dịch của tế bào mà ung thư biểu mô tuyến có thể có 3 cấp độ biệt

hóa: tốt, trung bình và kém. Trong ung thư biểu mô tuyến dạng phân tán (dạ

dày có dạng như cái chai/lọ bằng da, ung thư xơ cứng, chứa nhiều dịch nhày,

dịch keo), các tế bào ung thư thường không liên kết và tiết dịch thẳng vào

khoảng khe ngoại bào tạo ra những khoang lớn chứa chất nhày/chất keo. Tế

bào ung thư ở thể này ít có sự biệt hóa rõ ràng. Kiểu hình tế bào đặc trưng bởi

nhân tế bào nằm gần rìa của tế bào, tạo nên dạng "tế bào dạng nhẫn".

Khoảng 5% ung thư dạ dày là ung thư bạch huyết (lymphoma)

(MALTomas, hoặc MALT lymphoma), ngoài ra còn có u cấu trúc đệm [52].

Hình 1.1. Ung thư biểu mô tuyến biệt hóa trung bình và kém ở mô dạ dày [51]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

8

Hình 1.2. Ung thư tế bào dạng nhẫn ở mô dạ dày

Có nhiều hệ thống phân loại mô học ung thư biểu mô dạ dày khác nhau.

Năm 2000, Tổ chức Y tế Thế giới đã công bố một bảng phân loại mới. Phân

loại này đã gồm cả phân loại của Lauren (gồm hai typ: ruột và lan tỏa) vào bảng

phân loại của WHO các typ mô học được mã hóa, loại mô học ung thư biểu mô

tế bào nhỏ được bổ sung [12].

Bảng 1.1. Bảng phân loại các dạng Ung thư biểu mô Mã số bệnh Loại mô học

Tân sản nội biểu mô tuyến 8140/0

UTBM tuyến 8140/3

Kiểu giống tế bào biểu mô ruột 8140/3

Kiểu lan tỏa 8144/3

UTBM tuyến nhú 8260/3

UTBM dang tuyến ống nhỏ 8211/3

UTBM dạng tuyến nhày 8480/3

UTBM tế bào nhẫn 8490/3

UTBM dạng tuyến- vảy 8560/3

UTBM tế bào vảy 8070/3

UTBM tế bào nhỏ 8041/3

UTBM không biệt hóa 8020/3

8240/3

Các loại khác Carcinoid (u nội tiết biệt hóa cao)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

9

Hệ thống phân loại ung thư được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện

nay được gọi là TNM. Trong đó, T viết tắt cho Tumor – khối u nguyên phát.

N là Node – Hạch bạch huyết và M là Metastase – Di căn. Mỗi chữ cái được

gán với một số để giúp đánh giá các giai đoạn tổng thể của bệnh ung thư [5].

Phân loại TNM ung thư biểu mô dạ dày (WHO 2000):

T U nguyên phát (Tumor)

TX U nguyên phát không đánh giá được

T0 Không có bằng chứng của U nguyên phát

Tis Ung thư biểu mô tại chỗ; U nội biểu mô không có xâm nhập mô đệm.

T1 U xâm nhập mô đệm hoặc dưới niêm mạc.

T2 U xâm nhập lớp đệm, cơ hoặc dưới thanh mạc.

T3 U xâm nhập qua thanh mạc (phúc mạc tạng không có xâm nhập

vào các cấu trúc phụ cận).

T4 U xâm nhập vào các cấu trúc phụ cận.

N Hạch bạch huyết vùng (Lympho Node)

NX Hạch bạch huyết vùng không được đánh giá

N0 Không di căn hạch lymopho vùng

N1 Di căn 1 đến 6 hạch lympho vùng

N2 Di căn 7 đến 15 hạch lympho vùng

N3 Di căn trên 15 hạch lympho vùng

M Di căn (Metastasis)

MX Di căn xa không được đánh giá

M0 Không di căn xa

M1 Di căn xa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

10

Bảng 1.2. Đặc điểm của ung thư tế bào biểu mô dạ dày ở các giai đoạn khác nhau. N Giai đoạn M T

N0 Tis M0 0

N0 T1 M0 IA

N1 T1 M0 IB N0 T2 M0

N2 T1 M0

N1 T2 M0 II

N0 T3 M0

N2 T2 M0

N2 T3 M0 IIIA N1 T3 M0

N0 T4 M0

N2 T2 M0 IIIB

T4 IV N1, N2, N3 M0

M0 T1, T2, T3 N3

M1 T bất kỳ N bất kỳ

Giai đoạn bệnh ảnh hưởng nhiều nhất đến các kết quả điều trị [10].

Nếu các tế bào ung thư được tìm thấy trong mẫu sinh thiết, bước tiếp theo

cần làm là xác định giai đoạn ung thư, nghĩa là tìm ra mức độ trầm trọng của

bệnh. Có nhiều xét nghiệm để xác định xem ung thư đã lan rộng hay chưa, và

nếu có thì nó đã ảnh hưởng đến những phần nào của cơ thể. Bởi vì ung thư dạ

dày có thể lan sang gan, tụy, và các cơ quan gần dạ dày cũng như phổi, bác sĩ

có thể yêu cầu chụp cắt lớp CT, chụp cắt lớp PET, hoặc làm siêu âm nội soi,

hoặc các xét nghiệm khác để kiểm tra những vùng trên. Cũng có thể kiểm

tra dấu ấn ung thư trong máu

1.2. Vitamin C

1.2.1. Cấu trúc của vitamin C

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

11

Vitamin C hay còn gọi là ascoricic acid, là một carbohydrate phân tử thấp,

phổ biến và hòa tan trong nước [50]. Trong các chức năng sinh đã biết, vitamin

C hoạt động như một chất khử, nó cho một electron cho cơ chất trong khi bản

thân nó bị oxy hóa thành gốc ascorbyl - một gốc tự do tương đối ổn định. Hai

phân tử gốc tự do ascorbyl có thể phân hủy thành 1 phân tử ascorbate và 1 phân

tử acid dehydroascorbic, tương ứng với dạng khử và oxy hóa hoàn toàn vitamin

C.

Hình 1.3. Acid L – ascorbic, acid ascorbate (C6H8O6 )

Dưới dạng ascorbate - nó thực hiện nhiều chức năng sinh lý trong cơ thể

con người với vai trò như một chất nền enzyme và/hoặc đồng yếu tố (cofactor),

tham gia vào các quá trình tổng hợp collgen, carnitine, dẫn truyền thần kinh, sự

tổng hợp và dị hóa của tyrosine, và sự trao đổi chất của microsome. Trong quá

trình sinh tổng hợp, ascorbate đóng vai trò là chất khử, cho các electron và ngăn

chặn quá trình oxy hóa để giữ các nguyên tử sắt và đồng ở trạng thái khử.

Vitamin C được hấp thụ trong cơ thể bằng cách vận chuyển tích cực và

khuếch tán đơn giản. Vận chuyển phụ thuộc vào phức hệ vận chuyển Natri-

ascorbate Co-Transporters (SVCTs) và Hexose vận chuyển (GLUT). Mặc dù,

acid dehydroascorbic được hấp thụ ở tốc độ cao hơn ascorbate, lượng acid

dehydroascorbic tìm thấy trong huyết tương và mô dưới bình thường điều kiện

là thấp, vì các tế bào nhanh chóng giảm acid dehydroascorbic thành ascorbate.

1.2.2. Hấp thu và chuyển hóa vitamin C ở đường ruột

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

12

Vitamin C được hấp thụ từ ruột non ở người, đạt được nồng độ vitamin C

trong huyết tương tối đa khoảng 120-80 phút sau khi uống. Ngoài ra, vitamin

C có thể bị oxy hóa trong ruột. Sau khi hấp thụ, vì vitamin C tan trong nước,

nó được phân phối từ máu đi khắp không gian ngoại bào. Nồng độ vitamin C

trong mô phụ thuộc vào nồng độ vitamin C trong huyết tương và dịch ngoại

bào, do đó phụ thuộc vào chế độ ăn uống của vitamin C. Nồng độ vitamin C,

thường là mM, nếu vượt quá mức cần thiết nó có thể hoạt động như một

coenzyme.

Hình 1.4. Chuyển hoá vitamin C [13]

Ngược lại với các mô khác, hồng cầu tiếp nhận vitamin C thông qua con

đường dehydroascorbic acid. Các tế bào tiền thân erythroid có chất vận chuyển

SVCT2, nhưng chúng bị mất đi trong quá trình trưởng thành, do đó hồng cầu

lưu hành không có bất kỳ chất vận chuyển vitamin C nào. Hồng cầu lưu hành

có nồng độ vitamin C thấp hơn đáng kể so với huyết tương. Các hồng cầu có

thể làm giảm dehydroascobic acid (DHA) thông qua protein glutaredoxin. Các

hồng cầu không phải là nơi dự trữ vitamin C huyết tương dựa trên dòng chảy

trực tiếp từ hồng cầu, mặc dù giả thuyết này đã được xem xét [36]. Vì dòng

ascorbate từ hồng cầu lưu hành tương đối chậm [24]. Hồng cầu có số lượng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

13

nhiều hơn các tế bào máu khác, chúng chiếm phần lớn lượng vitamin C trong

các tế bào máu lưu thông [34].

1.2.3. Chức năng sinh lý của vitamin C trong cơ thể

Vitamin C là một vi chất thiết yếu cho người và động vật. Nó là một chất

chống oxy hóa mạnh và là đồng yếu tố cho một họ các enzyme điều hòa sinh

tổng hợp của các gen. Vitamin C góp phần bảo vệ hệ thống miễn dịch bằng

cách hỗ trợ các chức năng tế bào khác nhau của cả hệ thống miễn dịch bẩm sinh

và thích nghi. Vitamin C tăng cường chức năng của hàng rào biểu mô chống

lại các tác nhân gây bệnh và thúc đẩy hoạt động chống oxy hóa, do đó có khả

năng bảo vệ cơ thể, chống lại stress oxy hóa do môi trường gây ra. Vitamin C

tích lũy trong các tế bào thực bàonhư bạch cầu trung tính và có thể tăng cường

hóa trị liệu, thực bào, tạo ra các loại oxy phản ứng và cuối cùng là tiêu diệt vi

khuẩn. Vitamin C cũng cần thiết cho apoptosis và giải phóng bạch cầu trung

tính đã chi từ các vị trí bị nhiễm bởi đại thực bào, do đó làm giảm hoại

tử/NETosis và tổn thương mô tiềm ẩn.

Vitamin C là một chất chống oxy hóa hiệu quả cao, do đó bảo vệ các phân

tử sinh học quan trọng (protein, lipid, carbohydrate và acid nucleic) khỏi bị hư

hại bởi các chất oxy hóa được tạo ra trong quá trình chuyển hóa tế bào bình

thường và thông qua tiếp xúc với độc tố và chất ô nhiễm (ví dụ: khói thuốc lá)

[19]. Vitamin C cũng là một đồng yếu tố cho một họ các enzyme

monooxygenase và dioxygenase điều hòa sinh tổng hợp protein [32],

[35]. Vitamin C từ lâu đã được biết đến như là một đồng yếu tố cho các lysyl

hydroxylase và prolyl hydroxylase, cần thiết để ổn định cấu trúc bậc ba của

collagenvà là một đồng yếu tố cho hydroxylase liên quan đến sinh tổng hợp

Carnitine, một phân tử cần thiết để vận chuyển acid béo vào ty thể thực hiện

quá trình tổng hợp năng lượng trao đổi chất (hình 1.5) [24].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

14

Hình 1.5. Trao đổi chất của vitamin C [24]

Vitamin C được biết đến như là một đồng yếu tố cho các enzyme

hydroxylase, tham gia vào quá trình tổng hợp hormone. Ví dụ, norepinephrine

và các hormone được amid hóa, là trung tâm của phản ứng tim mạch đối với

nhiễm trùng nặng [20]. Hơn nữa, nghiên cứu trong hơn 15 năm qua đã phát

hiện ra vai trò mới của vitamin C trong việc điều hòa quá trình sao chép gen và

tín hiệu tế bào thông qua điều hòa hoạt động của yếu tố phiên mã (hình1.5) [32]

[63]. Ví dụ, hydroparase asparagyl và prolyl cần thiết cho quá trình điều hòa

giảm yếu tố phiên mã pleiotropic hypoxia-inducible Fact-1α (HIF-1α) sử dụng

vitamin C [32]. Nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra vai trò quan trọng của vitamin

C trong việc điều hòa quá trình methyl hóa DNA và histone bằng cách đóng

vai trò là chất đồng hoạt hóa cho các enzyme hydoxylate [63].

1.2.4. Vitamin C trong điều trị ung thư

Ngoài hoạt động chống oxy hóa, vitamin C đóng vai trò hiệu quả trong

phòng ngừa và điều trị ung thư. Vitamin C đảm nhiệm nhiều chức năng quan

trọng trong bảo vệ cơ thể chống ung thư, bao gồm hoạt động chống oxy hóa

và bảo vệ cấu trúc tế bào (gồm DNA), tránh các tổn thương cho tế bào.

Vitamin C cũng giúp cơ thể tăng cường chức năng miễn dịch, ức chế sự hình

thành các hợp chất sinh ung trong cơ thể. Các bằng chứng dịch tễ học về vai

trò bảo vệ cơ thể, chống lại ung thư của vitamin C là không thể phủ nhận

[37]. Ăn nhiều vitamin C thực sự làm giảm nguy cơ của tất cả các dạng ung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

15

thư, gồm ung thư phổi, đại tràng, ung thư vú, cổ tử cung, thực quản, khoang

miệng, và ung thư tụy. Điểm mấu chốt từ tất cả các nghiên cứu này là khẳng

định vai trò cần thiết của việc sử dụng nguồn thực phẩm giàu vitamin C hay

các chế phẩm bổ sung vitamin C để chống lại bệnh tật. Hầu hết các nghiên

cứu này tập trung vào khả năng ngăn ngừa ung thư của vitamin C, carotene

hay những chất tương tự trong thực phẩm mà ít chú ý đến các chế phẩm bổ

sung.

Vitamin C liều cao đã được nghiên cứu như một phương pháp điều trị ung

thư tiềm năng từ những năm 1970 và nó có thể được sử dụng như là một tác

nhân độc lập hoặc kết hợp với hóa trị liệu tiêu chuẩn. Kết quả từ các thử nghiệm

lâm sàng gần đây cho thấy vitamin C tiêm tĩnh mạch là an toàn ở bệnh nhân

ung thư, tạo ra tác dụng phụ tối thiểu [37] . Vitamin C đã được chứng minh là

làm giảm tác dụng của hóa trị liệu do đặc tính chống oxy hóa của nó khi áp

dụng ở nồng độ thấp/sinh lý [56]. Dữ liệu khác chỉ ra rằng kết hợp vitamin C

liều cao với liệu pháp chống ung thư khác sẽ ức chế sự phát triển khối u trong

các mô hình tuyến tụy, gan, tuyến tiền liệt, ung thư buồng trứng, sarcoma và u

trung biểu mô ác tính [40]. Hơn nữa, một số thử nghiệm sử dụng vitamin C

tiêm tĩnh mạch liều cao ở bệnh nhân ung thư đã dẫn đến tăng chất lượng cuộc

sống cũng như cải thiện các chức năng về thể chất, tinh thần và cảm xúc và

giảm bớt các tác dụng phụ bao gồm mệt mỏi, buồn nôn, nôn, đau, và mất cảm

giác ngon miệng.

Mức sinh lý của vitamin C có giá trị giải độc hiệu quả các gốc oxy hóa tự

do (ROS) và các loại nitơ phản ứng được hình thành trong quá trình trao đổi

chất bình thường nhưng thường xuyên bị sản xuất quá mức dưới nhiều dạng

căng thẳng. Như vậy, vitamin C bảo vệ chống lại tổn thương tế bào và tử vong

bởi các tác nhân gây oxy hóa pro-oxy hóa. Có khả năng giảm độc tính của một

số tác nhân hóa trị liệu trên mô bình thường khi phối hợp với AA có liên quan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

16

đến việc ngăn chặn thiệt hại oxy hóa thế chấp trong các tế bào không nhắm mục

tiêu [40].

1.2.5. Các nghiên cứu về vai trò của vitamin C trong ung thư dạ dày

Nhiễm trùng mãn tính bởi H.pylori có liên quan đến sự phát sinh của ung

thư biểu mô dạ dày [59]. Mặc dù một loạt các yếu tố có thể góp phần vào quá

trình gây ung thư, xong H.pylori là đối tượng được đặc biệt quan tâm [44].

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy vitamin C trong chế độ ăn uống làm

giảm nguy cơ ung thư dạ dày [22]. Người ta đã chứng minh rằng vitamin C làm

giảm sự hình thành các hợp chất N -nitroso (NOCs) trong dịch dạ dày và loại

bỏ các chất chuyển hóa oxy phản ứng (ROM) trong niêm mạc dạ dày [65]. Sự

giảm nồng độ vitamin C trong dịch dạ dày đã được báo cáo ở những bệnh nhân

nhiễm H.pylori và mức độ vitamin C trở lại bình thường sau khi diệt trừ sinh

vật [66]. Các nghiên cứu cho rằng giảm nồng độ vitamin C của dịch dạ dày dẫn

tới làm giảm tác dụng bảo vệ của nó và do đó làm tăng nguy cơ ung thư dạ

dày. Tuy nhiên, bằng chứng từ các nghiên cứu dịch tễ học và kiểm soát trường

hợp chủ yếu dựa trên nồng độ vitamin C trong huyết thanh hoặc huyết

tương nhưng không có dữ liệu trực tiếp liên quan đến nồng độ vitamin C của

dịch dạ dày thấp làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày. Hơn nữa, hầu hết các nghiên

cứu trước đây cho thấy rằng nhiễm H.pylori không ảnh hưởng đến nồng độ

vitamin C trong huyết thanh hoặc huyết tương [42].

Vitamin C là một phân tử có tính axit với hoạt tính khử mạnh và là thành

phần thiết yếu của hầu hết các mô sống. Nó có hai dạng chính là axit ascorbic

và axit dehydroascobic (DHA) đều có hoạt tính và có thể chuyển đổi qua phản

ứng oxi hóa khử [13]. Vitamin C đã chứng minh rằng cả axit ascobic và DHA

đều có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào bằng cách thay đổi sự tăng

sinh tế bào và/hoặc gây chết tế bào đối với các loại tế bào khác nhau [17]

[49]. Axit ascoribic gây ức chế tăng trưởng trong các tế bào u ác tính ở người

khác nhau [14], gây chết tế bào apoptosis trong tế bào ung thư bạch cầu ở người

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

17

[52] và trong các nguyên bào sợi [23] [41]. Ngoài ra, vitamin C có thể ức chế

các dạng apoptosis của các loại tế bào T khác nhau [18]. Bổ sung vitamin C

làm giảm đáng kể sự tăng sinh tế bào biểu mô đại tràng ở chuột [25]. Mặc dù,

vitamin C hiện diện ở các mức độ cao hơn đáng kể trong dịch dạ dày và các tế

bào niêm mạc dạ dày so với trong huyết tương hoặc huyết thanh [58] nhưng

ảnh hưởng của nó trên tế bào biểu mô dạ dày vẫn còn chưa rõ ràng.

Tác dụng của vitamin C đối với sự tăng trưởng của H.pylori và khả năng

gây bệnh của nó đã được báo cáo bởi một số nhóm nghiên cứu. Vitamin C liều

cao ức chế rõ rệt sự tăng trưởng H.pylori, hoặc thậm chí dẫn đến diệt trừ sinh

vật. Tuy nhiên, nồng độ vitamin C cần thiết trong các nghiên cứu này là rất cao

và thường gấp 10 lần hoặc lớn hơn mức sinh lý trong dạ dày [64] [27]. Là một

chất chống oxy hóa, vitamin C có cả hoạt động chống oxy hóa và tiền oxy hóa

và liều lượng lớn có thể thúc đẩy sỏi thận [26]. Vitamin C đặc biệt hiệu quả với

sự có mặt của các ion sắt, vì các inon sắt thúc đẩy hoạt động chống oxy hóa của

vitamin C.

Như vậy, vitamin C có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và làm

thay đổi các sự kiện chu kỳ tế bào do H.pylori gây ra ở nồng độ tương đương

với trong dịch dạ dày. Tuy nhiên, tác dụng ức chế tế bào ung thư dạ dày của

vitamin C đã bị mất đi ở bệnh nhân nhiễm H.pylori.

Vitamin C trong dịch dạ dày và in vitro đã được chứng minh là có tác dụng

ức chế sự phát triển của Helicobacter pylori. Mục đích của nghiên cứu này là

điều tra ảnh hưởng của việc bổ sung vitamin C vào chế độ diệt trừ đối với tỷ lệ

tiệt trừ H. pylori. Thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có kiểm soát này được thực

hiện trên 312 bệnh nhân nhiễm H. pylori đã chuyển đến Trung tâm nghiên cứu

Taleghani về Tiêu hóa và Bệnh gan. Phương pháp Bệnh nhân được chia ngẫu

nhiên thành hai nhóm. Bệnh nhân nhóm A (162 bệnh nhân) đã nhận được

amoxicillin 1g và metronidazole 500 mg thầu, bismuth 240 mg thầu và

omeprazole 40 mg qid trong hai lần chia. Bệnh nhân thuộc nhóm B (150 bệnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

18

nhân) nhận được chế độ tương tự cộng với 500 mg vitamin C mỗi ngày. Tất cả

bệnh nhân được điều trị trong 2 tuần. Bốn tuần sau, tất cả các bệnh nhân đã trải

qua thử nghiệm hơi thở urê và kết quả được so sánh. Kết quả Tổng cộng có 140

bệnh nhân thuộc nhóm A và 141 ở nhóm B đã hoàn thành nghiên cứu. Khi phân

tích ý định điều trị, 48,8% bệnh nhân trong nhóm A so với 78% ở nhóm B đã

đáp ứng với điều trị tiệt trừ và có xét nghiệm hơi thở urê âm tính (p <0,0001).

Như vậy Bổ sung vitamin C vào chế độ điều trị H. pylori của amoxicillin,

metronidazole và bismuth có thể làm tăng đáng kể tỷ lệ tiệt trừ H. pylori [69].

1.3. Chu kỳ tế bào

1.3.1 Khái niệm chu kỳ tế bào

Chu kỳ tế bào, hay chu kỳ phân bào, là một vòng tuần hoàn các sự kiện

xảy ra trong một tế bào từ lần phân bào này cho đến lần kế tiếp, trong đó bộ

máy di truyền và các thành phần của tế bào được nhân đôi và sau đó tế bào

phân chia làm hai tế bào con. Ở các sinh vật đơn bào (nấm men, vi khuẩn,...)

một cá thể sau khi trải qua chu kỳ phân bào tạo ra hai cá thể mới; còn ở các sinh

vật đa bào thì chu kỳ tế bào là một quá trình tối quan trọng để một hợp tử phát

triển thành một cơ thể hoàn chỉnh và để cơ thể bổ sung số lượng tế bào thay

cho số đã chết.

1.3.2 Các giai đoạn trong chu kỳ tế bào

Chu kỳ tế bào có thể được chia thành các pha sau: G1, S , G2 (các pha G1,

S, G2 được gộp lại thành kỳ trung gian) và pha nguyên phân, hay pha M. Bản

thân pha M bao gồm hai quá trình liên quan chặt chẽ với nhau: quá trình nguyên

phân trong đó nhiễm sắc thể của tế bào mẹ được chia tách ra làm hai phần bằng

nhau, và quá trình phân chia tế bào chất (cytokinesis) trong đó tế bào chất của

tế bào mẹ tách làm hai phần bằng nhau và hình thành hai tế bào con. Việc kích

hoạt mỗi pha phụ thuộc vào sự tiến triển đúng cách của pha trước. Tế bào nếu

có chu kỳ bị tạm thời ngưng trệ hay bị đảo ngược thì được xem như lâm vào

một trạng thái tĩnh lặng gọi là pha G0.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

19

Hình 1.6. Tổng quan về chu kỳ tế bào

Vòng tròn ngoài: I = kYPERLINK "ht, M = nguyên phân; inner ring:

M = nguyên phân, G1 = pha G1, G2 = pha G2, S = pha S; không n

"https://vi.wikiped0 = pha G0/pha nghp

Sau khi quá trình phân bào kết thúc, các tế bào con tiếp tục kỳ trung

gian của một chu kỳ tế bào mới cho riêng mình. Mặc dù thông thường các giai

đoạn của kỳ trung gian không được phân biệt rõ ràng bằng các đặc điểm hình

thái, mỗi kỳ hay pha của chu kỳ tế bào đều có những quá trình hóa sinh đặc

trưng để chuẩn bị cho sự phân chia của tế bào [51].

Pha G0 : Các tế bào không phân chia trong các sinh vật đa bào nhân

chuẩn thường chuyển từ trạng thái của pha G1 sang trạng thái tĩnh lặng của

pha G0 và có thể duy trì trạng thái tĩnh lặng này suốt một thời gian dài, thậm

chí là vĩnh viễn (ví dụ tế bào cơ, tế bào thần kinh hay tế bào của mô thủy

tinh thể). Đây là điều phổ biến xảy ra trong các tế bào đã hoàn toàn biệt hóa.

Trạng thái tĩnh lặng của tế bào xuất hiện khi DNA của chúng bị hư hỏng hay

thoái hóa, điều này khiến tế bào không sinh sản được, hoặc giả khi các điều

kiện ngoại bào tỏ ra không ủng hộ sự phân bào hay không có tín hiệu kích

thích sự tiếp tục của chu kỳ tế bào. Các tế bào ở trạng thái G 0 cũng có thể

phục hồi khả năng phân bào và quay trở về chu kỳ tế bào; quá trình này được

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

20

cơ thể điều thiết nhằm đảm bảo sự sinh sản của tế bào nằm trong tầm kiểm

soát.

Kỳ trung gian: Trước khi sự phân bào diễn ra, tế bào cần tích lũy các chất

dinh dưỡng để chuẩn bị cho sự phân bào. Tất cả việc này diễn ra trong kỳ trung

gian. Kỳ trung gian gồm có 3 pha: G1, S, và G2.

Pha G1 : Pha G1 - hay còn được gọi là pha sinh trưởng - là giai đoạn đầu

tiên của kỳ trung gian, nó bắt đầu khi sự phân bào kết thúc cho đến khi sự sinh

tổng hợp DNA bắt đầu xảy ra. Trong khi hoạt động sinh tổng hợp ở quá trình

phân bào diễn ra khá chậm, trong pha G1 chúng tăng tốc rất nhanh chóng. Trong

pha này nhiều enzyme đã được sản sinh nhằm phục vụ cho các hoạt động diễn

ra trong pha S kế tiếp - phần lớn chúng là enzyme xúc tác quá trình tự nhân đôi

DNA. Thời gian tiến hành pha G1 thay đổi nhiều tùy theo loài và tùy theo các

loại tế bào trong cùng loài [51]. Trong giai đoạn này, kích thước tế bào tăng lên

và tế bào tăng cường cung cấp protein cũng như tăng số lượng các bào quan

khác (ti thể, ribosome). Ở người, pha này kéo dài chừng 9 tiếng đồng hồ.

Pha S: Tiếp theo pha G1 là pha S, bắt đầu khi sự sinh tổng hợp DNA xảy

ra và kết thúc khi tất cả các nhiễm sắc thể đều được sao chép - lúc này mỗi

nhiễm sắc thể bao hàm hai nhiễm sắc tử chị em. Vì vậy trong pha này, hàm

lượng DNA trong tế bào được nhân đôi mặc dù số bội thể của tế bào không

thay đổi. Tốc độ phiên mã ARN và sinh tổng hợp protein phải nói là cực kì

chậm trong pha này. Tuy nhiên sự sinh tổng hợp histone thì vẫn mau lẹ - thực

chất quá trình sinh tổng hợp histone chủ yếu diễn ra trong pha này.

Pha G2 : Sau khi pha S kết thúc, tế bào sẽ chuyển sang pha G2 - pha này

kéo dài cho đến khi quá trình nguyên phân bắt đầu. Sự sinh tổng hợp lại diễn

ra mạnh ở pha này, trong đó chủ yếu là sự hình thành các sợi thoi hay vi

quản vốn cần thiết cho quá trình nguyên phân. Việc ức chế sinh tổng hợp

protein trong pha này sẽ khiến tế bào không thể nào bước vào quá trình nguyên

phân được.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

21

Pha nguyên phân: Pha nguyên phân, hay còn gọi là pha M, là một pha

ngắn bao hàm sự phân bào có tơ (karyokinesis). Pha nguyên phân có thể được

 Kỳ trước hay tiền kỳ

 Kỳ giữa hay trung kỳ

 Kỳ sau hay hậu kỳ

 Kỳ cuối hay mạt kỳ

 Kỳ phân chia tế bào chất (cytokinesis)

chia là nhiều kỳ, lần lượt xếp theo thứ tự thời gian như sau:

Nguyên phân là một quá trình mà trong đó tế bào nhân chuẩn chia

tách nhiễm sắc thể trong nhân của nó thành hai phần giống hệt nhau để từ đó

hình thành nên hai nhân cho hai tế bào con [42]. Ngay sau quá trình nguyên

phân là quá trình phân chia tế bào chất (cytokinesis), trong đó nhân tế bào, tế

bào chất, bào quan và màng tế bào được phân chia làm hai phần gần giống nhau

để hình thành nên hai tế bào con gần giống nhau. Cả hai quá trình này được

gộp lại thành pha nguyên phân hay pha M (mitotic phase) - trong đó sự phân

bào diễn ra để tế bào mẹ phân chia thành hai tế bào con gần như giống hệt nhau

và giống hệt tế bào mẹ. Quá trình này chiếm 10 phần trăm của chu kỳ tế bào;

đối với người như đã nói pha nguyên phân chỉ chiếm từ 30 phút đến 1 giờ so

với cả chu kỳ là 24 giờ [46].

1.3.3 Vai trò của chu kỳ tế bào trong việc hình thành khối u

Những bất thường trong việc điều hòa chu kỳ tế bào có thể dẫn tới việc

hình thành các khối u. Như đã nói, một số gen như các gien ức chế chu kỳ tế

bào (RB, p53...) khi bị đột biến có thể khiến tế bào sinh sản mất kiểm soát và

hình thành khối u. Mặc dù chu kỳ tế bào khối u bằng hay dài hơn tế bào bình

thường, trong các khối u tỉ lệ tế bào trong trạng thái sẵn sàng phân bào so với

các tế bào ở trạng thái pha G0 cao hơn nhiều so với các tế bào bình thường;

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

22

trong khi đó các tế bào bị chết hay già lão vẫn không thay đổi. Chính vì thế mà

tính tổng cộng thì số tế bào khối u sẽ từ từ tăng dần lên [47].

Những tế bào đang trải qua chu kỳ một cách tích cực là mục tiêu trong các

liệu pháp chữa bệnh ung thư vì các DNA của chúng bộc lộ tương đối rõ rệt

trong quá trình phân bào và vì vậy chúng dễ bị tổn thương bởi các

loại thuốc hay tia bức xạ. Việc này được tận dụng tối đa trong việc điều trị ung

thư bởi một phương pháp mang tên là debulking, lúc này một số lớn các tế bào

khối u bị loại bỏ và điều này khiến một số lớn tế bào khối u còn trong pha G0 bị

chuyển sang pha G1 (do dinh dưỡng, ôxi, nhân tố sinh trưởng,... dồi dào hơn vì

các tế bào giảm đi). Các tế bào này nhanh chóng bị tiêu diệt bởi tia bức xạ hay

thuốc ngay khi mới chớm thực thi chu kỳ tế bào [47]. Nhìn chung, các tế bào

dễ bị tổn thương nhất vào cuối pha M và vào pha G2, còn sức chống chịu đối

với bức xạ cao nhất ở cuối pha S. Đối với những tế bào có chu kỳ dài và pha

G1 dài, chúng cũng có sức kháng cự tốt ở cuối pha G1.

1.4 Apoptosis

1.4.1 Khái niệm apoptosis

Apoptosis là một dạng chết tế bào được lập trình xảy ra trong các sinh vật

đa bào [26]. Những thay đổi này bao gồm chảy máu, co rút tế bào, phân mảnh

hạt nhân, ngưng tụ nhiễm sắc thể, phân mảnh DNA nhiễm sắc thể, và

mRNA phân rã. Con người trưởng thành trung bình mất từ 50 đến 70 tỷ tế bào

mỗi ngày do quá trình tự hủy. Đối với một đứa trẻ trung bình ở độ tuổi từ 8 đến

14 tuổi, khoảng 20 đến 30 tỷ tế bào chết mỗi ngày [29].

Trái ngược với hoại tử, một dạng chết tế bào do chấn thương tế bào cấp

tính, apoptosis là một quá trình được kiểm soát và kiểm soát chặt chẽ, tạo ra lợi

thế trong vòng đời của sinh vật. Ví dụ, sự phân tách ngón tay và ngón chân

trong phôi người đang phát triển xảy ra do các tế bào giữa các chữ số trải qua

quá trình tự hủy [11] .

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

23

Quá trình apoptotic khiếm khuyết đã liên quan đến rất nhiều loại

bệnh. Apoptosis quá mức gây ra teo, trong khi một lượng không đủ dẫn đến

tăng sinh tế bào không kiểm soát, chẳng hạn như ung thư.

Hình 1.7. Tế bào bình thường (trên) và tế bào đang chết rụng (dưới)

1.4.2 Vai trò của apoptosis trong ung thư

Apoptosis được cho là đóng vai trò chính trong liệu pháp chống ung thư.

Tổn thương tế bào thường dẫn tới sự ngừng tăng trưởng và ức chế khối u bằng

cách gây ra apoptosis, hoại tử và lão hóa. Cơ chế chết tế bào phụ thuộc vào mức

độ tổn thương DNA sau khi tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của chất chống

ung thư. Các tế bào kháng apoptosis và các con đường dẫn truyền ức chế quá

trình apoptosis có thể ngăn cản tế bào chết theo chương trình apopotosis của tế

bào cũng như ngăn cản sự lão hóa. Đáp ứng chống lại sự phát sinh ung thư là

không đồng nhất tùy thuộc từng loại tế bào khác nhau, cũng như mức độ tổn

thương tế bào cũng như loại tác nhân gây ung thư tác động lên tế bào. Hầu hết

các thuốc chống ung thư thông thường hiện nay đều có độc tính gây chết tế bào

theo con đường apopoptosis, trong khi đó, môt số loại thuốc nhắm đích ung thư

mới thường hướng tới việc gây biệt hóa hoặc lão hóa tế bào nhưng ít gây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

24

apoptosis tế bào. Cách tiếp tận mới này giúp cho cơ thể giảm thiểu được các

tác động phụ do độc tính của thuốc gây ra [16].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

25

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 do phòng thí nghiệm Inserm U1053

- Viện Sức khỏe và nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp tại Bordeaux cung cấp.

Dòng tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng tại Phòng thí nghiệm Nuôi cấy tế

bào ung thư – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.

Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy

DMEMF12 và RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết thanh bò, trypsin,

kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp).

Các đĩa nuôi cấy tế bào, ống pipette và một số dụng cụ nhỏ khác do

Thermo Fisher cung cấp.

Hóa chất thí nghiệm vitamin C : Có nguồn gốc từ hãng Bio England.

Các thí nghiệm được triển khai trên các hệ thống trang thiết bị hiện

đại gồm:

- Buồng thao tác an toàn sinh học cấp II Thermo Fisher Scientific - Mỹ.

- Hệ thống kính hiển vi soi ngược Eclipse Ts2 NIKON -Nhật Bản.

- Hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Eclipse Ti2-U NIKON -Nhật Bản.

- Tủ ấm CO2 Memmert – Đức + hệ thống cấp CO2.

- Hệ thống phân tích dòng chảy tế bào BD Accuri C6 Plus TM Flow

Cytometer - Becton, Dickinson and Company, BD Biosciences– Mỹ.

- Các trang thiết bị phụ trợ hiện đại khác tại Phòng thí nghiệm Y sinh –

Trường Đại học Khoa học.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

26

Hình 2.1. Hệ thống kính hiển vi soi ngược

Hình 2.2. Tủ ấm CO2 Memmert – Đức + hệ thống cấp CO2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

27

Hình 2.3. Hệ thống phân tích dòng chảy tế bào

Hình 2.4. Buồng thao tác an toàn sinh học cấp II Thermo Fisher Scientific - Mỹ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

28

2.2. Địa điểm và thời gian

Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng Thí nghiệm Y Sinh – Trường

Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2019 đến tháng 08/2019.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nuôi cấy tế bào ung thư 2D và xử lý với Vitamin C

Môi trường nuôi cấy: Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động

vật trong điều kiện bám dính gồm có: Môi trường nuôi cấy RPMI 1640,

10% huyết thanh bò có chửa (FBS) và 1% kháng sinh

Penicillin/Streptomicin (P/S).

Nuôi cấy tế bào: Các tế bào được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng, tiếp

theo mỗi giếng được bổ sung 100 µl môi trường nuôi cấy đã được chuẩn bị ở

trên. Đĩa nuôi cấy được đưa vào trong tủ nuôi cấy CO2 và nuôi cấy ở nhiệt độ

370C, 5% CO2.

* Phương pháp xử lý tế bào với vitamin C

Tế bào ung thư dạ dày sau 24h nuôi cấy, đã bám dính trên bề mặt đĩa sẽ

được tiến hành xử lý vitamin C lần lượt ở các nồng độ khác nhau từ 0,5mM;

1mM; 2 mM; 5 mM; 10 mM thời gian xử lý trong 24h, 48h hoặc 120h tùy theo

từng thí nghiệm cụ thể.

+ Các giếng đối chứng: Không xử lý với vitamin C (0 mM).

+ Các giếng thí nghiệm: Lần lượt được xử lý với vitamin C ở các nồng

độ từ 0,5 – 10 mM.

Mỗi nồng độ khác nhau (kể cả đối chứng) được xử lý gồm 3 giếng và thí

nghiệm này được lặp lại 3 lần.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

29

Quan sát sự thay đổi hình dạng và phân tích số lượng tế bào bằng kính

hiển vi soi ngược NIKON Ts2 và kiểu nhân tế bào (nhuộm DAPI) kính hiển vi

huỳnh quang NIKON T2U sau 24h, 48h và 120h.

2.3.2. Phân tích sự tăng sinh tế bào bằng phương pháp MTT

MTT khảo nghiệm là một xét nghiệm đo màu để đánh giá hoạt động trao

đổi chất của tế bào. Enzyme oxyoreductase tế bào phụ thuộc H của NAD (P)

có thể, trong các điều kiện xác định, phản ánh số lượng tế bào khả thi hiện

diện. Những enzyme này có khả năng làm giảm thuốc nhuộm tetrazolium MTT

3- (4,5- di methyl thiazol -2-yl) -2,5-di phenyl tetrazolium bromide

thành formazan không hòa tan của nó, có màu tím. Các thuốc nhuộm

tetrazolium liên quan chặt chẽ khác bao gồm XTT, MTS và WST, được sử

dụng cùng với chất nhận điện tử trung gian, 1-methoxy phenazine

methosulfate (PMS). Với WST-1, không thấm được tế bào, sự khử xảy ra

bên ngoài tế bào thông qua sự vận chuyển điện tử màng plasma. Các xét

nghiệm nhuộm Tetrazolium cũng có thể được sử dụng để đo độc tính tế bào

(mất tế bào khả thi) hoặc hoạt động tế bào học (chuyển từ tăng sinh sang

hoạt động) của các tác nhân dược phẩm và vật liệu độc hại. Các xét nghiệm

MTT thường được thực hiện trong bóng tối vì thuốc thử MTT rất nhạy cảm

với ánh sáng [53].

Các dòng tế bào được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng (đáy bằng) ở mật độ

5x103 tế bào/giếng, thể tích nuôi cấy là 100 µl/giếng. Sau 48 giờ tế bào được

xử lý bằng môi trường mới chứa DCLK ở các nồng độ từ 10 - 500 µg/ml. Thời

gian xử lý là 48 giờ, sau đó, bổ sung 20 µl dung dịch MTT trong 4 giờ. Tiếp

theo, dung dịch nuôi cấy chứa hóa chất MTT được loại bỏ hoàn toàn và được

thay thế bởi 100 µl dung môi và 12 µl dung dịch đệm: 0,1 M NaCl; 0,1 M

glycine; pH = 10 và tiếp tục ủ 15 phút. Mật độ quang (optical density) của mỗi

giếng được đo bằng máy quang phổ nano (SPECTROstarNano) ở bước sóng 570

nm. Tỷ lệ phần trăm tế bào sống so với đối chứng được tính theo công thức:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

30

% Tế bào sống so với đối chứng = (Mật độ quang giếng xử lý/Mật độ

quang giếng đối chứng)*100

Trong đó, tỷ lệ tế bào sống ở giếng đối chứng được coi là 100%, mỗi nồng

độ được xử lý có số lần lặp lại n = 8 (8 giếng cho một nồng độ).

2.3.3. Phân tích chu kỳ tế bào và apoptosis bằng Flow cytometry

Theo phương pháp của Riccardi & Nicoletti (2006) [45] : 2x105 tế bào của

mỗi dòng được nuôi cấy trên đĩa loại 12 giếng. Sau 24 giờ, tế bào được xử lý

bằng môi trường nuôi cấy chứa DCLK ở nồng độ 100 µg/ml. Các giếng đối

chứng không bổ sung dịch chiết. Thời gian xử lý là 48 giờ trong điều kiện 370C,

5% CO2. Tiếp theo, các tế bào được tách khỏi bề mặt đĩa bằng cách xử lý với

trysin/EDTA và được thu lại bằng ly tâm 1300 vòng/phút trong 3 phút, sau đó

được nhuộm với dung dịch Fluorochrom (0,1% sodium citrate (wt/v); 0,1%

Triton X-100 (v/v), 50 mg l-1 PI trong nước khử ion vô trùng) trong thời gian 2

giờ ở 40C trước khi phân tích bằng hệ thống dòng tế bào BD-Canto II. Kết quả

dữ liệu được phân tích bằng phần mềm BD FACS Diva 6.1.1.

2.3.4. Phân tích khả năng di cư của tế bào

Các tế bào được nuôi cấy bám dính như đã trình bày trong mục 2.3.1. Khi

mật độ tế bào đạt đến 80 -90% trên bề mặt đĩa nuôi cấy, một đường danh giới

được thiết lập bằng cách sử đụng đầu côn vạch theo thước kẻ. Tiếp theo, các

giếng nuôi cấy được rửa lại bằng PBS để loại bỏ các tế bào không bám dính

trước khi tiến hành xử lý các giếng tế bào với vitamin C ở nồng độ khác nhau.

Sau 48h xử lý với thuốc, các giếng tế bào được chụp ảnh dưới kính hiển vi soi

người ở cùng một độ phóng đại 80X. Quan sát sự thu hẹp dải phân cách do quá

trình di trú của tế bào.

2.3.5. Nuôi cấy tumorsphere

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

31

Nuôi cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2.000 tế bào/giếng

nuôi cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt không bám dính để hình thành nên

tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu).

Sử dụng môi trường DMEMF12/Glutamax có bổ sung 1%

ampinicillin/streptomycin, yếu tố tăng trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố

tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml, 0,3% glucose, 5µg/ml insulin ở 370C, 5%

CO2. Mỗi 2 ngày của quá trình nuôi cấy, loại bỏ 1 ml môi trường nuôi cấy cũ,

đồng thời bổ sung 1 ml môi trường nuôi cấy mới. Các tế bào trước khi nuôi cấy

tumorsphere được xử lý với vitamin C ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 – 2mM.

Đối chứng không xử lý với vitamin C.

2.3.6. Phương pháp xử lí số liệu

Phân tích giá trị khác biệt về mặt thống kê giữa các nhóm đối chứng và

nhóm kiểm định theo Mann Whitney, sử dụng phần mềm GraphPad Prism

5.0.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

32

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tác động của vitamin C lên sự tăng sinh tế bào

Để đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên sự tăng sinh của tế bào ung thư

dạ dày MKN45, chúng tôi tiến hành xử lí các tế bào MKN45 với 5 nồng độ

khác nhau: 0,5 mM, 1mM, 2mM, 5mM và 10 mM trong 3 khoảng thời gian

24h, 48h và 120h. Các mẫu xử lí được so sánh với đối chứng. Kết quả đánh giá

tác động của vitamin C lên sự tăng sinh tế bào trong dòng tế bào ung thư dạ dày

MKN45 bằng kỹ thuật MTT được thể hiện ở hình 3.1.

Kết quả trong hình 3.1 cho thấy, tỉ lệ sống sót của các tế bào MNK45 phụ

thuộc vào nồng độ vitamin C và thời gian xử lí. Khi xử lí tế bào MKN45 với

nồng độ vitamin C là 0,5 mM, trong 3 mốc thời gian là 24 giờ, 48 giờ và 120h.

Ở cả 3 mốc thời gian xử lí, số lượng tế bào không có sự thay đổi đáng kể so với

đối chứng. Như vậy, ở nồng độ 0,5 mM vitamin C không ảnh hưởng rõ rệt đến

sự tăng tế bào MKN45.

Xử lí tế bào MKN45 với nồng độ vitamin C là 1 mM, trong 3 mốc thời

gian xử lí, ở mức 24 giờ không nhận thấy có sự thay đổi về tỷ lệ sống của tế

bào giữa mẫu đối chứng và mẫu xử lí. Sau 48 giờ tỷ lệ tế bào sống là khoảng

95% so với đối chứng, và sau 120h có sự thay đổi rõ rệt về tỷ lệ sống sót giảm

xuống còn 90% so với đối chứng ban đầu.

Khi xử lý tế bào ở nồng độ 2mM, chỉ sau 24h đã có sự giảm đáng kể về tỷ

lệ tế bào sống ở mẫu xử lí so với đối chứng. Đặc biệt sau 120h, tỷ lệ tế bào sống

ở mẫu xử lí còn khoảng 57% so với đối chứng.

Xử lí tế bào MKN45 với vitamin C ở nồng độ 5 mM cũng đã chỉ ra sự

giảm rõ rệt về số lượng tế bào chỉ sau 24h. Tế bào ở mẫu xử lý giảm mạnh so

với đối chứng sau 48h và 120h, tương ứng với tỷ lệ tế bào sống so với đối chứng

chỉ còn khoảng 60% (48h) và 25% (sau 120h).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

33

Ở nồng độ cao nhất trong dãy nồng độ nghiên cứu (10mM), có sự giảm

mạnh về số lượng tế bào ngay sau 24h xử lí, tương ứng với các tỷ lệ tế bào

sống là 55% (ở mốc 24h), 30% (ở mốc 48h) và khoảng 10% (ở mốc 120h) so

với đối chứng.

Như vậy, khi xử lý tế bào MKN45 ở nồng độ cao ở 5 mM và 10 mM trong

thời gian ngắn đã cho thấy có sự giảm mạnh về số lượng tế bào sống sót, điều

này đồng nghĩa với việc vitamin C gây ức chế tế bào theo nồng độ và theo thời

gian.

Một nghiên cứu của Zhang và các đồng nghiệp cũng cho thấy vitamin C

gây ức chế sự tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư dạ dày AGS và MKN45.

Vitamin C gây ra sự ức chế tăng trưởng theo cơ chế ức chế sự tổng hợp protein

và tổng hợp DNA trong các tế bào dạ dày AGS và MKN45. Ở nồng độ tương

tự trong dịch dạ dày của các đối tượng khỏe mạnh (≥50 M), vitamin C đã gây

độc tế bào rõ rệt cho các tế bào này và ảnh hưởng lên sự tổng hợp protein và

DNA của tế bào. Tuy nhiên, hiệu quả đã giảm đáng kể ở mức tương tự như

trong dịch dạ dày của bệnh nhân nhiễm H pylori (<50 μM). Nghiên cứu này

cũng đánh giá mối quan hệ giữa nồng độ tế bào và ức chế tăng trưởng tế bào

AGS do vitamin C. Hiệu quả của vitamin C đối với khả năng sống của tế bào

AGS được so sánh giữa các tế bào được xử lý trong 24 đĩa giếng ( nồng độ 1 ×

10 5/ml) và trong các đĩa 96 giếng ( nồng độ 1 × 10 4/ml). Sau 72 giờ ủ, vitamin

C chỉ gây ức 2,4 % trong 24 đĩa giếng với nồng độ vitamin C 400 μM nhưng

ức chế 3,7 % trong 96 đĩa giếng với nồng độ vitamin C 200 μM (p <

0,0001). Phát hiện này cho thấy rằng sự tác động của vitamin C phụ thuộc cả

vào mật độ tế bào dạ [67].

Trong nghiên cứu của Xisu và cộng sự vào năm 2019, Vitamin C giết

chết các tế bào ung thư tuyến giáp thông cơ chế phụ thuộc ROS và con đường

MAPK/ERK và PI3K/AKT. Tác dụng của vitamin C đối với sự tăng sinh tế

bào ung thư tuyến giáp và apoptosis được đánh giá bằng xét nghiệm MTT và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

34

phân tích dòng chảy tế bào. Vitamin C đã được chứng minh có khả năng tiêu

diệt tế bào ung thư đại trực tràng đột biến BRAF một cách chọn lọc. Đột

biến BRAF là sự thay đổi di truyền phổ biến nhất trong sự phát triển và tiến

triển của khối u tuyến giáp. Tuy nhiên, hiệu quả chống ung thư của vitamin C

trong ung thư tuyến giáp vẫn còn được khám phá. Các phân tích sâu hơn bằng

phân tử và sinh hóa cũng đã được sử dụng để làm sáng tỏ các cơ chế hoạt động

chống ung thư của vitamin C trong ung thư tuyến giáp [54].

3.2. Tác động của vitamin C lên kiểu hình tế bào

Để đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên kiểu hình tế bào MNK45, các

tế bào nuôi cấy được xử lý trong 120h ở các nồng độ 0,5mM, 1 mM, 2 mM, 5

mM, và 10 mM. Kết quả được trình bày trong hình 3.2.

Kết quả cho thấy đã có sự thay đổi hình thái tế bào được xử lý so với

đối chứng. Trong hình đối chứng hình thái ban đầu các tế bào có hình thoi

dài hoặc ovan điển hình, các tế bào phân bố đều và bám dính trên bề mặt

nuôi cấy.

Kết quả từ hình 3.2 cho thấy, ở giếng đối chứng, các tế bào tăng sinh

nhanh chóng và phủ kín bề mặt đĩa nuôi cấy. Các tế bào xếp liên tiếp nhau

và có hình dạng đồng đều. Ở nồng độ thấp từ 0,5mM – 1mM có rất ít sự

thay đổi về mặt số lượng và hình thái tế bào so với đối chứng. Tuy nhiên, sự

thay đổi rõ rệt về mật độ và hình thái tế bào ở nồng độ xử lí ở nồng độ 2mM

trở lên. Tế bào bị xử lý có hiện tượng co tròn và mất khả năng bám dính trên

bề mặt của đĩa nuôi cấy.

Các tế bào được xử lí với vitamin C ở mức nồng độ 10 mM, theo quan

sát nhận thấy, các tế bào bị biến đổi hoàn toàn về hình dạng và có hiện tượng

tan rã thành các tế bào đơn, mất khả năng bám dính trên bề mặt đĩa và trôi nổi

trong dịch nuôi cấy, như vậy ở mức nồng độ 10 mM các tế bào nuôi cấy đã bị

tan rã và có nhiều tế bào chết trên bề mặt nuôi cấy.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

35

Các tế bào được xử lí với vitamin C ở các nồng độ làm hình thái thông

thường của tế bào đã bị biến đổi sau xử lý và sự thay đổi có liên quan đến sự

phân chia và tăng sinh tế bào.

Các nghiên cứu của Qi Chen và các cộng sự đã cho thấy liệu vitamin C có

khả tiêu diệt tế bào ung thư một cách chọn lọc. Sự chết tế bào ở 10 bệnh ung

thư và 4 loại tế bào bình thường đánh giá sau 1h xử lý với vitamin C ở các

nồng độ khác nhau. Kết quả phân tích đã chỉ ra rằng, các tế bào bình thường

không bị ảnh hưởng bởi vitamin C ở nồng độ nồng độ 20mM, trong khi đó

5 dòng ung thư bị tác động mạnh và có giá trị IC50 < 4 mM. nghiên cứ này

cũng đã chỉ ra nằng các tế bào ung thư hạch ở người đã được chỉ ra là nhạy

cảm với vitamin C (IC50 = 0,5 mM). Những phát hiện này chỉ ra giá trị của

vitamin C ứng dụng trong điều trị ung thư giảm nguy cơ bị nhiễm trùng

[43].

3.3. Ảnh hưởng của vitamin C lên chu kỳ tế bào

Các kết quả phân tích về sự tăng trưởng và hình thái tế bào đã chỉ ra ảnh

hưởng ức chế của vitamin C lên tế bào ung thư MKN45. Để tìm ra cơ chế của

sự tác động đó, chúng tôi tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên chu kỳ

tế bào. Trong nghiên cứu này, tế bào được xử lí với vitamin C và được phân

tích chu kỳ tế bào bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào. Kết quả phân

tích được chỉ ra trong hình 3.3.

Đối với các tế bào đối chứng số lượng tế bào ở pha G0/G1 được xác định

là khoảng 65%, số lượng tế bào ở pha S là khoảng 10%, ở pha G2/M là khoảng

25%. Đối với tế bào xử lí với vitamin C ở nồng độ 0,5 mM, số lượng ở pha

G0/G1 không có sự khác biệt, ở pha S tăng và pha G2/M giảm tế bào có sự thay

đổi với đối chứng.

Đối với tế bào xử lí với vitamin C ở nồng độ 0,5mM - 1 mM, số lượng ở

pha G0/G1 không có sự khác biệt, ở pha S tăng so với đối chứng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

36

Đối với tế bào xử lí với vitamin C ở nồng độ 2 mM, số lượng ở pha G0/G1

tăng số lượng tế bào (79,1%) so với đối chứng ( 64,7%), ở pha G2/M số lượng

tế bào giảm so với đối chứng.

Như vậy, vitamin C đã dừng chu kỳ phân chia của tế bào ở pha G0/G1.

Wang cùng cộng sự đã nghiên cứu Metformin dừng chu kỳ tế bào pha

G0/G1 trong trường hợp của u tủy bằng cách nhắm mục tiêu các con đường

AMPK/mTORC1 và mTORC2. Các tế bào RPMI8226 và U266 được gieo xử

lý với metformin ở nồng độ 5 mM và 20 mM trong 24 và 48 giờ. Các tế bào

sau đó được xử lý với propidium iodide, sau đó được phân tích bằng phương

pháp tế bào học dòng chảy tế bào [57]. Kết quả phân tích đã cho thấy các tế bào

tích lũy trong pha G0 / G1, trong khi tỷ lệ các tế bào trong pha S giảm. Tiếp

theo đó, phân tích Western blot cho thấy rõ sự điều hòa giảm của cyclin D1,

trong khi p21 CIP1 và p27 KIP1 đã được biểu hiện tăng. Những kết quả này chỉ ra

rằng metformin đã ức chế sự phát triển của các tế bào RPMI8226 và U266 bằng

cách ngăn chặn sự tiến triển của chu kỳ tế bào trong pha G0/G1. Nghiên cứu

chỉ ra rằng metformin ức chế sự tăng sinh của các tế bào u nguyên bào bằng

cảm ứng thực bào và dừng chu kỳ tế bào ở pha G0/G1 thông qua một cơ chế có

thể liên quan đến việc ức chế kép con đường mTORC1 và mTORC2 qua trung

gian kích hoạt AMPK [61].

3.4. Ảnh hưởng của vitamin C lên apoptosis của tế bào

Kết quả phân tích apoptosis được chỉ ra trong hình 3.4. Kết quả phân tích

apoptosis cho thấy, sau 48h xử lí tế bào với vitamin C ở các nồng độ khác nhau

từ 0,5 – 2mM, không có sự thay đổi rõ rệt nào về tỷ lệ % tế bào apoptosis giữa

đối chứng (0mM) với mẫu xử lý (0,5 – 2mM). Như vậy rõ ràng vitamin C đã

ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày không theo cách cảm ứng quá

trình apoptosis. Nhiều thuốc chống ung thư hiện nay có cơ chế ức chế ung thư

bằng cách cảm ứng quá trình chết apoptosis của tế bào. Sự giết chết tế bào theo

con đường apoptosis thể hiện độc tính của thuốc chống ung thư. Một số loại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

37

thuốc mới tiềm năng như metformin, vitramin A hoặc một số hợp chất có nguồn

gốc từ tự nhiên lại được chỉ ra là ít gây độc cấp cho tế bào nhưng lại ức chế sự

tăng trưởng của tế bào ung thư theo cách gây lão hóa hoặc biệt hóa tế bào.

Tuy nhiên, một số phân tích tác động của viamin C lên các loại tế bào ung

thư khác như ung thư vú và ung thư ruột đã chỉ ra rằng viatimin đã làm tăng tế

bào chết theo con đường apoptosis bằng cách phá vỡ màng ti thể hoặc hoạt hóa

biểu hiện tăng cường của protein TRAIL [27] [31]. Tuy nhiên, đối với một số

dạng ung thư khác, vitamin C lại ức chế sự tăng sinh của tế bào bằng cách gây

lão hóa tế bào [60].

Các nghiên cứu của Ryungsa Kim và các cộng sự đã làm rõ mối liên hệ

giữa apoptosis và kết quả điều trị. Mặc dù apoptosis được cho là đóng vai trò

chính trong liệu pháp chống ung thư, nhưng sự liên quan lâm sàng của việc gây

ra apoptosis vẫn không chắc chắn, đặc biệt là trong các khối u rắn. Việc gây ra

apoptosis bằng các tác nhân chống ung thư đã được chứng minh là có liên quan

đến phản ứng của khối u, tuy nhiên, các hình thức chết tế bào không gây dị ứng,

chẳng hạn như autophagy và lão hóa ngoại sinh, cũng đã được chứng minh là

góp phần vào phản ứng khối u nói chung. Tổn thương tế bào gây ra sự ngừng

tăng trưởng và ức chế khối u bằng cách gây ra apoptosis, hoại tử và lão hóa, cơ

chế chết tế bào phụ thuộc vào mức độ tổn thương DNA sau khi tiếp xúc với các

nồng độ khác nhau của chất chống ung thư. Các tế bào kháng apoptosis và các

con đường dẫn truyền ức chế quá trình apoptosis có thể gây ra các cơ chế

nonapoptotic của tế bào chết và lão hóa, do đó bảo tồn tác dụng chống ung thư

của một số tác nhân chống ung thư. Phản ứng chống ung thư không đồng nhất

bao gồm các loại tế bào chết tế bào khác nhau, tùy thuộc vào mức độ tổn thương

tế bào hoặc DNA phát sinh bởi các tế bào ung thư. Là một chiến lược điều trị

mới, các loại tế bào chết thay thế có thể được khai thác để kiểm soát và tiêu

diệt các tế bào ung thư. Nghiên cứu đã thảo luận về ý nghĩa lâm sàng của

apoptosis, cũng như sự đóng góp tiềm năng của các loại chết tế bào khác đối

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

38

với sự nhạy cảm của khối u nói chung với hy vọng rằng các chiến lược điều trị

mới có thể theo sau. Phản ứng chống ung thư không đồng nhất bao gồm các

loại tế bào chết tế bào khác nhau, tùy thuộc vào mức độ tổn thương tế bào hoặc

DNA phát sinh bởi các tế bào ung thư. Là một chiến lược điều trị mới, các loại

tế bào chết thay thế có thể được khai thác để kiểm soát và tiêu diệt các tế bào

ung thư. Phản ứng chống ung thư không đồng nhất bao gồm các loại tế bào chết

tế bào khác nhau, tùy thuộc vào mức độ tổn thương tế bào hoặc DNA phát sinh

bởi các tế bào ung thư, các loại tế bào chết thay thế có thể được khai thác để

kiểm soát và tiêu diệt các tế bào ung thư [48].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhận thấy rằng ảnh hưởng của vitamin

C lên apopotosis là không đáng kể, rất có thể nó gây chết tế bào ở nồng độ xử

lý cao theo một cơ chế lão hóa hoặc stress tế bào và cần có nghiên cứu tiếp theo

để lãm rõ hơn.

3.5. Ảnh hưởng của vitamin C lên sự di trú của tế bào

Để đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên sự di trú của tế bào, chúng tôi

tiến hành xử lí các tế bào MKN45 ở nồng độ 0,5- 2mM, so với đối chứng và tế

bào trước khi được xử lý. Kết quả được thể hiện ở hình 3.5.

Kết quả thử nghiệm cho thấy, ở mẫu tế bào được xử lý với vitamin C nồng

độ 0,5 – 1mM, mức độ di trú của các tế bào vào vùng phân cách không có sự

khác biệt lớn. Hay nói cách khác, tốc độ tăng trưởng và xâm lập của các tế bào

bị xử lý hoặc không xử lý không có nhiều thay đổi. Tuy nhiên, khi tăng nồng

độ lên 2mM, các tế bào xâm lấn vào tế it đi rất rõ rệt so với đối chứng và tế bào

trước khi xử lý. Điều này có nghĩa rằng, ở nồng độ cao hơn, vitamin đã làm

giảm khả năng tăng sinh và di trú của tế bào.

Như những quả nghiên cứu trình bày trong mục 3.1 và 3.2 đã cho thấy

vitamin C ức chế sự tăng sinh tế bào thông qua việc làm dừng chu kỳ phân

chia tế bào ở pha G0/G1. Sự dừng chu kỳ tế bào G0/G1 đã được nhiều nghiên

cứu cho là có liên quan tới trạng thái lõa hóa hoặc biệt hóa tế bào. Những tế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

39

bào này thường mất khả năng phân chia và giảm khả năng di trú (di chuyển

vị trí).

Đối với ung thư dạ dày, di trú và xâm lấn của tế bào ung thư là quá trình

thiết yếu trong sự di căn ung thư. Các tế bào xâm nhập vào các mô xung quanh

là bước đầu tiên rất quan trọng.

Theo nghiên cứu của Yin và các cộng sự sự di cư và xâm lấn các tế bào

ung thư dạ dày bằng cách điều chỉnh quá trình chuyển dịch biểu mô – trung mô

(EMT). Trong nghiên cứu này, tác giả đã nuôi cấy Các dòng tế bào GC ở người

MGC803, HGC27, SGC7901 và MNK45 trong môi trường DMEM (Gibco;

Thermo Fisher Khoa học, Inc.), được bổ sung 10% huyết thanh bào thai (FBS;

Gibco; Thermo Fisher Khoa học, Inc.), và duy trì ở mức 370C trong môi trường

5% CO2. Sau đó, các tế bào xâm lấn ở bề mặt màng dưới được nhuộm bằng

Hoechst 33 342 và được đếm dưới kính hiển vi. Kết quả chỉ ra rằngtrong GC,

CircRNA_0023642 thúc đẩy di cư và xâm lấn các tế bào ung thư dạ dày bằng

cách điều chỉnh EMT [68]. Trong nghiên cứu gần đây, bằng các phân tích RT

-PCR và Western blot, các nghiên cứu đã tìm thấy hsa_circ_101882 làm giảm

sự biểu hiện gen đánh dấu trung mô bao gồm vimentin, Snail và N-cadherin

trong mRNA và mức protein trong tế bào GC, trong khi biểu mô E -cadherin

tăng mRNA và mức protein. Như vậy hsa_circ_101882 tăng cường kích hoạt

đường dẫn tín hiệu EMT trong ung thư dạ dày.

Theo nghiên cứu của Zhicheng Yao cùng cộng sự về cả gen ZKSCAN1 và

RNA tuần hoàn liên quan ( tuần hoàn ZKSCAN1 ) đều ức chế sự phát triển, di

chuyển và xâm lấn của tế bào ung thư tế bào gan nhưng thông qua các con

đường truyền tín hiệu khác nhau, đã phân tích một nhóm 102 bệnh nhân và thấy

rằng biểu hiện của cả ZKSCAN1 mRNA và CircZKSCAN1 thấp hơn đáng kể

( P <0,05) trong các mẫu HCC so với các mô không nhiễm trùng liền kề bằng

PCR phiên mã ngược (RT ‐ PCR). Mức biểu hiện thấp của ZKSCAN1chỉ liên

quan đến kích thước khối u ( P = 0,032), trong khi cirZKSCAN1 mức dao

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

40

động ở những bệnh nhân với số lượng khác nhau của khối u ( P < 0,01), xơ

gan ( P = 0,031), xâm lược mạch máu ( P = 0,002), hoặc xâm lược mạch máu

nhỏ ( P = 0,002), cũng như với loại khối u ( P < 0,001). Im lặng

cả ZKSCAN1 mRNA và CircZKSCAN1 thúc đẩy sự tăng sinh tế bào, di cư và

xâm chiếm. Ngược lại, sự biểu hiện quá mức của cả hai dạng RNA tiến triển

ức chế HCC in vivo và in vitro. Im lặng hoặc biểu hiện quá mức của cả hai dạng

RNA không can thiệp lẫn nhau. RNA ‐ seq tiết lộ một cơ sở phân tử rất khác

nhau cho các hiệu ứng quan sát được; ZKSCAN1 mRNA chủ yếu điều hòa

chuyển hóa tế bào, trong khi CircZKSCAN1 qua trung gian một số con đường

truyền tín hiệu liên quan đến ung thư, cho thấy vai trò không cần thiết đối

với ZKSCAN1 mRNA và CircRNA. Kết luận, kết quả của chúng tôi cho thấy

hai sản phẩm dịch mã ( ZKSCAN1 mRNA và CircZKSCAN1 ) đã hợp tác chặt

chẽ với nhau để kìm hãm sự phát triển, di cư và xâm chiếm

HCC. cirZKSCAN1 có thể là một dấu hiệu hữu ích để chẩn đoán HCC [62].

3.6. Ảnh hưởng của vitamin C lên sự hình thành tumorsphere của tế bào

Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng, Vitamin C đã ức chế sự tăng sinh tế bào

có thể sẽ dẫn tới ức chế sự hình thành các khối cầu ung thư (tumorsphere) trong

điều kiện nuôi cấy 3D.

Để đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên sự hình thành tumorsphere của

tế bào ung thư dạ dày MKN45, các tế bào được nuôi cấy trên đĩa có bề mặt

không bán dính để tạo ra các tumorsphere, kết quả nuôi cấy được trình bày ở

hình 3.6.

Kết quả nuôi cấy trong hình 3.6 cho thấy, ở nồng độ thấp 0,5mM, vitamin

C không làm ức chế sự hình thành các tumorsphere. Tuy nhiên, ở các nồng độ

cao hơn (từ 1 – 2mM), vitamin C đã làm giảm rõ rệt số lượng tumorsphere được

hình thành so với đối chứng (0mM).

Tumorsphere các khối cầu ung thư được hình thành lên từ các tế bào gốc

ung thư. Các tế bào gốc ung thư đã được chứng minh là những tế bào khởi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

41

nguồn, có khả năng tăng sinh, biệt hóa để tạo ra các tế bào khác trong khối u.

Các thuốc ức chế ung thư mới hiện nay có xu hướng nhắm trực tiếp vào loại tế

bào này nhằm ức chế hiệu quả sự tăng sinh của khối u. Các nghiên cứu gần đây

đã chỉ ra rằng all trans retinoic acid (một dạng biến đổi của vitamin A) đã ức

chế hiệu quả tế bào gốc ung thư dạ dày. Các tác giả đã chỉ ra rằng, all trans

retinoic đã làm giảm khả năng hình thành các tumorsphere của các tế bào gốc

ung thư đồng thời phá vỡ các tumorsphere đồng thời ức chế sự biểu hiện các

marker tế bào gốc ung thư trong các tế bào tumorsphere [39].

Trong nghiên cứu này, vitamin C ở nồng độ cao đã ức chế sự hình thành

các tumorsphere từ các tế bào gốc ung thư dày như là kết quả của sự ức chế

tăng sinh tế bào ung thư.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

1. Vitamin C ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày. Tỷ lệ ức chế

tăng theo nồng độ và thời gian xử lý.

2. Ở nồng độ từ 2mM, vitamin C đã làm thay đổi kiểu hình của tế bào ung

thư dạ dày. Ở nồng độ cao 10mM, toàn bộ tế bào ung thư có kiểu hình của tế

bào chết.

3. Vitamin C ở nồng độ 2mM đã làm dừng chu kỳ tế bào ở pha G0/G1 với

tỷ lệ tế bào ở pha này là 79% so với 64% của đối chứng.

4. Vitamin C ở nồng độ từ 0,5 – 2mM đã không làm tăng tỷ lệ tế bào

apoptosis so với đối chứng.

5. Ở nồng độ 2mM, Vitamin C đã làm giảm rõ rệt khả năng di trú của tế

bào ung thư dạ dày MKN45.

6. Vitamin C ở nồng độ từ 1 – 2mM đã làm giảm rõ rệt khả năng hình

thành các tumorsphere của tế bào gốc ung thư dạ dày MKN45.

2. Kiến nghị

- Tiếp tục phân tích ảnh hưởng của vitamin C lên con đường tín hiệu lão

hóa của tế bào ung thư MNK45.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

43

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Đặng Vĩnh Dũng (2011), “Nghiên cứu hiệu quả của phương pháp phục hồi lưu thông dạ dày-ruột theo Roux-en-Y và Billroth II trong phẫu thuật cắt đoạn dạ dày ung thư phần ba dưới”, Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện quân y.

2. Đổ Trọng Quyết (2010), “ Nghiên cứu điều trị ung thư dạ dày bằng phẫu thuật có kết hợp hóa chất ELF và miễn dịch trị liệu Aslem”, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.

3. Hoàng Mạnh An (2007), “Nhận xét sự liên quan của hạch bạch huyết với

ung thư 1/3 dưới dạ dày”, Y học thực hành, (8), tr.97-99.

4. Hoàng Trọng Thảng (2014), “Ung thư dạ dày - Giáo trình sau đại học,

Bệnh Tiêu hóa Gan-Mật”, nhà xuất bản Đại học Huế. tr. 146-161.

5. Hoàng Trọng Thảng (2014), Bệnh loét dạ dày tá tràng, nhà xuất bản Đại

học Huế, tr. 1-19, 115-120.

6. Nguyễn Đình Tùng và cộng sự (2012), “Ghi nhận ung thư Thừa Thiên Huế giai đoạn 2001-2009”, Tạp chí Y Dược - Trường Đại học Y Dược Huế, số 8, tr. 75-82.

7. Phạm Gia Khánh (2002), “Ung thư dạ dày”, Bệnh học ngoại khoa Tập II,

nhà xuất bản Quân đội Nhân dân, tr. 195-209.

8. Trần Thiện Trung (2008), “Ung thư dạ dày và nhiễm Helicobacter pylori”,

nhà xuất bản Y học, tr. 227-266

9. Trần Văn Hợp, Lê Trung Hợp (2008), “Tỉ lệ nhiễm Helicobacter pylori ở bệnh nhân ung dạ dày tại Hà Nội và khu vực nông thôn ngoài Hà Nội”, Chuyên đề Giải phẫu bệnh - Tế bào học, tr. 75-79.

10. Vũ Hải (2009), “Nghiên cứu chỉ định các phương pháp phẫu thuật, hoá chất bổ trợ và đánh giá kết quả điều trị ung thư dạ dày tại Bệnh viện K”, Luận án Tiến sĩ y học, Học viện Quân y, Hà Nội.

Tiếng Anh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

44

11. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff. M., Roberts K., Walter P. (2008), "Chapter 18 Apoptosis: Programmed Cell Death Eliminates Unwanted Cells". Molecular Biology of the Cell (textbook) (5th ed.). Garland Science, pp. 1115.

12. Barr H., Greenall. M.J. (2003), “Carcinoma of stomach”, Med-Lib-

Medical online.

13. Bates CJ. (1997), “Bioavailability of vitamin C”. Eur J Clin Nutr51(suppl

1), pp. 28–33.

14. Bram S, Froussard P, Guichard M. (1980), “Vitamin C preferential toxicity for malignant melanoma cells”. Nature 284, pp. 629–631.

15. Bray., F Ferlay., J Soerjomataram., I Siegel., RL Torre., LA Jemal, A. (November 2018), "Global cancer statistics 2018 GLOBOCAN estimates of in 185 incidence and mortality worldwide for 36 cancers countries". CA: a cancer journal for clinicians. 68 (6), pp. 394–424.

16. Brian J., Morrison., Marcus L., Hastie. (2012), “Proteomic Comparison of

MCF-7 Tumoursphere and Monolayer Cultures”.

17. Brigelius-Flohe R., Flohe L. (1996), “Ascorbic acid, cell proliferation, and

cell differentiation in culture”. Subcell Biochem25, pp. 83–107.

18. Campbell JD., Cole M., Bunditrutavorn B. (1999), “Ascorbic acid is a potent inhibitor of various forms of T cell apoptosis”. Cell Immunol,194, pp. 1–5.

19. Carr A., Frei B. (1999), “Does vitamin C act as a pro-oxidant under

physiological conditions”? Nutr.Cancer .13, pp. 1007–1024.

20. Carr AC., Shaw G.M., Fowler A.A. (2015), “Natarajan R. Ascorbate- dependent vasopressor synthesis: A rationale for vitamin C administration in severe sepsis and septic shock”? Crit. Care.19, pp. 418.

21. Cook MB., Kamangar F., Whiteman DC., Freedman ND., Gammon MD. , Bernstein L. (2010), “ Cigarette smoking and adenocarcinomas of the esophagus and esophagogastric junction”: a pooled analysis from the

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

45

international BEACON consortium. J Natl Cancer Inst 102 (17), pp. 1344–1353.

22. Correa P., Malcom G., Schmidt B. (1998), “Review article: Antioxidant micronutrients and gastric cancer”. Aliment Pharmacol Ther12(suppl 1), pp. 73–82.

23. Denk PO., Knorr M. (1998), “In vitro effect of ascorbic acid on the proliferation of bovine scleral and Tenon's capsule fibroblasts”. Eur J Ophthalmol,8, pp. 37–41.

24. Englard S., Seifter S. (1986), The biochemical functions of ascorbic

acid. Annu. Rev. Nutr.Cancer 6, pp. 365–406.

25. Green D. (2011), “Means to an End: Apoptosis and other Cell Death Mechanisms”. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

26. Herbert V. (1994), “The antioxidant supplement myth”. Am J Clin Nutr

.60, pp. 157–158.

27. Hong S-W., Jin D-H., Hahm E-S., Yim S-H., Lim J-S., Kim K-I., Yang Y., Lee S-S., Kang J-S., Lee W-J., Lee W-K., Lee M-S.(2007), Ascorbate (vitamin C) induces cell death through the apoptosis-inducing factor in human breast cancer cells. Oncol Rep 18, pp. 811–815.

28. Jarosz M., Dzieniszewski J., Dabrowska-Ufniarz E. (1998), “Effects of high dose vitamin C treatment on Helicobacter pylori infection and total vitamin C concentration in gastric juice”. Eur J Cancer Prev,7, pp. 449– 54.

29. Karam JA. (2009), “Apoptosis in Carcinogenesis and Chemotherapy”.

Netherlands.Springer.

30. Kelsen DP., Daly JM., Kern S.E. (2008), “Gastric cancer - section III”, Principles and Practice of Gastrointestinal Oncology, Second Edition, pp. 285 – 295.

31. Kim JE., Kang JS., Lee WJ.(2012), Vitamin C Induces Apoptosis in Human Colon Cancer Cell Line, HCT-8 Via the Modulation of Calcium

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

46

Influx in Endoplasmic Reticulum and the Dissociation of Bad from 14-3- 3β. Immune Netw 12, pp. 189–195.

32. Kuiper C., Vissers MC. (2014), “Ascorbate as a co-factor for Fe- and 2- oxoglutarate dependent dioxygenases”, Physiological activity in tumor growth and progression. Front. Oncol.4, pp. 359.

33. Kumar. (2010), “Pathologic Basis of Disease”, 8th ed Saunders Elsevier,

pp. 786.

34. Li H., Tu H., Wang Y., Levine M. ( 2012), “ Vitamin C in mouse and human red blood cells”.an HPLC assay. Anal Biochem. Nutr.Cancer 426, pp. 109–117.

35. Mandl J., Szarka A., Banhegyi G. (2009), “Vitamin C: Update on physiology and pharmacology”. Br. J. Pharmacol.157:1097–1110.

36. Montel-Hagen A., Kinet S., Manel N., Mongellaz C., Prohaska R., Battini JL., Delaunay J., Sitbon M., Taylor N. (2008), “Erythrocyte Glut1 triggers dehydroascorbic acid uptake in mammals unable to synthesize vitamin C”. Cell.132, pp. 1039–1048.

37. Nauman, G., Gray, J., Parkinson R., Levine M., Paller C. (2018), “Systematic Review of Intravenous Ascorbate in Cancer Clinical Trials”. Antioxidants 7, pp. 89.

38. Neuhouser ML. (2004), “Dietary flavonoids and cancer risk: evidence

from human population studies”, Nutr. Cancer 50, pp. 1-7.

39. Nguyen PH., Giraud J., Staedel C., Chambonnier L., Dubus P., Chevret E., Bœuf H., Gauthereau X., Rousseau B., Fevre M., Soubeyran I., Belleannée G., Evrard S., Collet D., Mégraud F., Varon C. (2016), All- trans retinoic acid targets gastric cancer stem cells and inhibits patient- derived gastric carcinoma tumor growth. Oncogene 35, pp. 5619–5628.

40. Pathak, AK., Singh N., Khanna N., Reddy VG., Prasad, KN.,Kochupillai V. (2002), “Potentiation of the effect of paclitaxel and carboplatin by antioxidant mixture on human lung cancer H520 cells”. J. Am. Coll. Nutr.21,pp. 416–421.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

47

41. Peterkofsky B., Prather W. (1997), “Cytotoxicity of ascorbate and other reducing agents towards cultured fibroblasts as a result of hydrogen peroxide formation”. J Cell Physiol.90, pp. 61–70.

42. Phull PS., Price AB., Thorniley MS. (1998), “Plasma free radical activity and antioxidant vitamin levels in dyspeptic patients: correlation with smoking and Helicobacter pylori infection”. Eur J Gastroenterol Hepatol,10, pp. 573–578.

43. Qi Chen., Michael Graham Espey., Murali C., Krishna., James B., Mitchell., Christopher P., Corpe., Garry R Buettner., Emily Shacter., Mark Levine. (2005), “Pharmacological ascorbic acid concentration selectively destroys cancer cells: Acting as a pro drug to supply hydrogen peroxide to tissues”.J. E. Rall, National Institutes 102 (38), pp. 13604-13609.

44. Reed PI. (1999), “Vitamin C, Helicobacter pylori infection and gastric

carcinogenesis”. Int J Vitam Nutr Res,69, pp. 220–7.

45. Riccardi C., Nicoletti I. (2006), Analysis of apoptosis by propidium iodide

staining and flow cytometry. Nat Protoc 1,pp. 1458–1461.

46. Robbins and Cotran; Kumar, Abbas, Fausto (2004), “Pathological Basis

of Disease. Elsevier”. ISBN .

47. Rubenstein., Irwin., and Susan M., Wick. (2008), "Cell." World Book

Online Reference Center.

48. Ryungsa Kim., Manabu Emi., Kazuaki Tanabe. (2016), “The role of apoptosis in cancer cell survival and therapeutic outcome”. Published online. 14 Nov, pp. 1429-1442.

49. Sakagami H., Satoh K. (1997), “Modulating factors of radical intensity

and cytotoxic activity of ascorbate”. Anticancer Res,17, pp. 3513–3520.

50. Smirnoff N., Conklin PL., Loewus FA. (2001), “Biosynthesis of Ascorbic Acid in Plants”: A Renaissance. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 52, pp. 437–467.

51. Smith JA., Martin L. (April 1973), "Do cells cycle?". Proc. Natl. Acad.

Sci. THE USA. 70 (4), pp. 1263–1267.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

48

52. Soerjomataram I., LortetTieulent J., Parkin DM., Ferlay J., Mathers C., F orman D. (2012), “Global burden of cancer in 2008: a systematic analysis of disability-adjusted life-years in 12 world regions”. Lancet, 380, pp.1840–1850.

53. Stockert JC., Blázquez-Castro A., Cañete M., Horobin RW., and Villanueva A. (2012), “MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets”. Acta Histochemica 114, pp. 785-79

54. Su X., Shen Z., Yang Q., Sui F., Pu J., Ma J., Ma S., Yao D., Ji M., Hou P. (2019), “Vitamin C kills thyroid cancer cells through ROS-dependent inhibition of MAPK/ERK and PI3K/AKT pathways via distinct mechanisms”. Theranostics 9(15), pp. 4461-4473.

55. The Institute of Medicine. (2006), Dietary diet reference: instructions needed tonutritional requirements. Washington: National Academy of Sciences.

56. Velauthapillai, N., Barfett, J Jaffer., H Mikulis., Murphy K. (2017), “Antioxidants Taken Orally prior to Diagnostic Radiation Exposure Can Prevent DNA Injury”. J Vasc. Interv. Radiol.28, pp. 406–411.

57. Wang, Y., Xu, W., Yan., Z. (2018), “Metformin induces auto-arrest and G0 / G1 phase cell cycles in myeloma by targeting the AMPK / mTORC1 and mTORC2 pathways”. J Exp Clinic Cancer Res 37, pp. 63.

58. Waring AJ., Drake IM., Schorah CJ. (1996), “Ascorbic acid and total vitamin C concentrations in plasma, gastric juice, and gastrointestinal mucosa”: effects of gastritis and oral supplementation. Gut, 38, pp. 171–176.

59. Williams MP., Pounder RE. (1999). “ Helicobacter pylori: from the

benign to the malignant”. Am J Gastroenterol,94, pp. 11–16.

60. Xi D. (2019), Vitamin C in Cancer Therapeutics and Metastasis. J Orthop

Res Ther 10.

61. Yan Wang., Wenbin Xu., Zixun Yan., Weili Zhao., Jianqing Mi., Junmin Li.,Hua Yan. (2018), “Journal of Experimental & Clinical Cancer Research.37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

49

62. Young JI., Zuchner S., Wang G. (2015), “Regulation of the epigenome by

vitamin C”. Annu. Rev. Nutr. Cancer 35, pp. 545–564.

63. Zhang HM., Wakisaka N., Maeda O. (1997), “Vitamin C inhibits the growth of a bacterial risk factor for gastric carcinoma”. Helicobacter pylori. Cancer.80, pp. 1897–1903.

64. Zhang ZW., Farthing MJG. (2000), “Helicobacter pylori and gastric malignancy: Importance of oxidants, antioxidants and other co-factors. In: Hunt RH, Tytgat GNJ, eds”. Helicobacter pylori: Basic mechanisms to clinical cure 2000. London: Kluwer Academic Publishers, pp. 513–524.

65. Zhang ZW., Patchett SE., Perrett D. (1998), “The relation between gastric vitamin C concentrations, mucosal histology, and CagA seropositivity in the human stomach”. Gut43, pp.322–326.

66. Zhang Z, Abdullahi M. (2002), Farthing MJGEffect of physiological concentrations of vitamin C on gastric cancer cells and Helicobacter pylori.

67. Zhicheng Yao., Jingyan Luo., Kunpeng Hu., Jizong Lin., He Huang., Qiangliang Wang., Peng Zhang., Zhiyong Xiong., Chonghua He., Zejian Huang., Bo Liu. (2017), “ZKSCAN1 gene and its related circular RNA (circZKSCAN1) both inhibit hepatocellular carcinoma cell growth, migration, and invasion but through different signaling pathways”. Mol Oncol, 11, pp. 422-437.

68. Zhou LH., Yang YC., Zhang RY., Wang P., Pang MH., Liang LQ. (2018), “CircRNA_0023642 promotes migration and invasion of gastric cancer cells by regulating EMT”. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 22, pp. 2297-2303.

regimen with and without

69. Zojaji H., Talaie R., Mirsattari D., Haghazali M., Molaei M., Mohsenian N., Derakhshan F., Zali MR. (2009), The efficacy of Helicobacter vitamin C pylori eradication supplementation. Dig Liver Dis, 4, pp. 644–647.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn