Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của dịch chiết lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf.) lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ HẢI HỒNG

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA DỊCH CHIẾT LÁ KHÔI (ARDISIA GIGANTIFOLIA STAPF.) LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN KIỂM SOÁT CHU KỲ TẾ BÀO CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ DẠ DÀY

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Thanh Hương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS.

Lê Thị Thanh Hương. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung

thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu

được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn

trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hải Hồng

iii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn tại Khoa Công

nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. Em đã nhận

được sự giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên và

cán bộ trong khoa và nhà trường.

Đầu tiên em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Cô giáo - TS. Lê Thị Thanh

Hương đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều

kiện tốt nhất trong suốt quá trình em tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận

văn này.

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô và cán bộ Khoa Công nghệ

Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy

dỗ, chỉ bảo và truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Xin chân

thành cảm ơn bộ phận sau đại học của nhà trường đã tạo điều kiện thuận lợi

trong quá trình em học tại trường.

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học và Công

nghệ Quốc gia (Nafosted) trong mã số đề tài 108.05-2017.331.

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã

nhiệt tình động viên cho em thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và

nghiên cứu khoa học.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hải Hồng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3

1.1. Ung thư dạ dày và tế bào gốc ung thư dạ dày ............................................ 3

1.1.1. Ung thư dạ dày ........................................................................................ 3

1.1.2. Tế bào gốc và tế bào gốc ung thư dạ dày ................................................ 9

1.2. Chu kỳ tế bào và ung thư ......................................................................... 12

1.2.1. Khái quát chung về chu kỳ tế bào ......................................................... 12

1.2.2. Rối loạn chu kỳ tế bào và ung thư ........................................................ 14

1.2.3. Các gen kiểm soát chu kỳ tế bào ........................................................... 16

1.3. Giới thiệu chung về cây Lá khôi .............................................................. 19

1.3.1. Phân loại và đặc điểm ........................................................................... 19

1.3.2. Thành phần hóa học của cây Lá khôi .................................................... 20

1.3.3. Các nghiên cứu về tác dụng của cây Lá khôi trong điều trị ung thư .... 22

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 25

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 25

2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................................ 25

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 25

2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 25

2.4.1. Phương pháp thu thập và xác định tên khoa học của cây Lá khôi ........ 25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

2.4.2. Phương pháp thu dịch chiết cây Lá khôi ............................................... 26

2.4.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào 2D .......................................................... 26

2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D .......................................................... 26

2.4.5. Phương pháp phân tích chu kỳ tế bào bằng Flow cytometry ................ 27

2.4.6. Phương pháp phân tích miễn dịch huỳnh quang ................................... 27

2.4.7. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA ................... 28

2.4.8. Phương pháp phân tích biểu hiện gen bằng Realtime PCR .................. 28

2.4.9. Phương pháp phân tích thống kê ........................................................... 29

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................... 30

3.1. Kết quả thu thập và xác định tên khoa học và thu dịch chiết ethanol cây

Lá khôi ............................................................................................................. 30

3.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện nuôi cấy 2D ........................... 30

3.3. Nuôi cấy tumorsphere của các tế bào ung thư dạ dày trong điều kiện nuôi

cấy 3D ............................................................................................................. 31

3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên số lượng và kích thước các

tumorsphere ..................................................................................................... 33

3.5. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên chu kỳ tế bào .............................. 32

3.6. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA ........................................... 34

3.7. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen của tế bào gốc ung thư .. 35

3.8. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen kiểm soát chu kỳ tế bào ... 38

3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu hiện của protein P21 ...... 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 43

1. KẾT LUẬN ................................................................................................. 43

2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ALDH : Aldehyde dehydrogenase

CDK : Cyclin-dependent kinases

CCNE1 : Cyclin E1

CT : Cryptotanshinone

cDNA : Complementary DNA

DNA : Deoxyribonucleic acid

FACS : Fluorescence-activated cell sorting

GC : Ung thư biểu mô dạ dày

mRNA : RNA thông tin

NST : Nhiễm sắc thể

PCNA : Proliferating cell nuclear antigen

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic acid

SAGA : Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase

SSE : Samsoeum

TBGUT : Tế bào gốc ung thư

TBGUTDD : Tế bào gốc ung thư dạ dày

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

USP22 : Ubiquitin specific peptidase 22

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các pha trong chu kỳ tế bào ......................................................... 13

Bảng 2.1. Mã số cặp mồi của các gen ............................................................. 28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Bảng 3.1. Nồng độ RNA từ mẫu đối chứng và mẫu xử lý.............................. 35

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Số ca ung thư mắc mới năm 2018 ở nam của Việt Nam ................. 4

Hình 1.2. Cơ chế phân chia của tế bào ung thư ............................................. 16

Hình 3.1. Mẫu cây Lá khôi ............................................................................. 30

Hình 3.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào MKN45 trong điều kiện nuôi cấy 2D ....... 30

Hình 3.3. Nuôi cấy tumorpshere hình thành từ các tế bào gốc ....................... 31

Hình 3.4. Dịch chiết Lá khôi tác động lên khả năng hình thành tumorsphere ... 32

Hình 3.5. Dịch chiết Lá khôi tác động lên chu kỳ tế bào ............................... 33

Hình 3.6. Phổ hấp thụ của RNA tổng số tách chiết từ các tumorsphere......... 35

Hình 3.7. Dịch chiết Lá khôi tác động lên sự biểu hiện các gen ................... 36

Hình 3.8. Dịch chiết Lá khôi tác động lên các gen ........................................ 39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.9. Dịch chiết Lá khôi tác động lên sự biểu hiện của protein .............. 42

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Việt Nam là một nước có sự đa dạng về các loài thực vật, trong đó có

các loài thực vật làm thuốc. Họ Đơn nem (Myrsinaceae) gồm 50 chi và

khoảng 1.400 loài được phân bố rộng rãi trên khắp thế giới. Trong đó, chi

cơm nguội (Ardisia) có khoảng 400 – 500 loài trên thế giới và ở Việt Nam có

khoảng 101 loài [2]. Các loài trong chi này có nhiều tác dụng trong điều trị

bệnh, bảo vệ sức khỏe cho con người, điển hình là cây Lá khôi (Ardisia

gigantifolia Stapf).

Ung thư dạ dày là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất, được

thống kê là dạng ung thư phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3

trong nhóm các bệnh ung thư. Các tế bào gốc ung thư dạ dày là nguyên nhân

gây ra các khối u dạ dày. Tế bào gốc ung thư dạ dày còn gọi là "tế bào nguồn"

của ung thư dạ dày, có nguồn gốc chủ yếu từ các tế bào gốc hoặc các tế bào

gốc định hướng dạ dày. Trong những năm gần đây, rất nhiều các nghiên cứu

cho thấy ung thư dạ dày có thể bắt nguồn từ các tế bào gốc bình thường hoặc

các tế bào trung mô có nguồn gốc từ tủy xương và các khối u dạ dày có chứa

các tế bào gốc ung thư [71]. Các khối u có thể bắt nguồn từ một tiểu quần thể

tế bào gốc ung thư có khả năng duy trì sự phát triển khối u lâu dài, tái phát

khối u, kháng apoptosis và hóa trị.

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, có nhiều hợp chất chiết xuất

từ dịch chiết của các bộ phận cây Lá khôi ảnh hưởng đến sự tăng sinh biểu

mô tuyến vú, gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư như: ung thư

bàng quang, ung thư biểu mô tế bào gan, ung thư cổ tử cung,... [14], [57]. Đặc

biệt đối với ung thư dạ dày, dịch chiết Lá khôi có khả năng biệt hoá tế bào

gốc ung thư dạ dày và ít độc cho các tế bào và khả năng ức chế cao sự phân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chia nhưng ít gây ra apoptosis [7]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về ảnh hưởng

của Lá khôi lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của các tế

bào gốc ung thư dạ dày còn hạn chế. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên

cứu đề tài “Nghiên cứu tác động của dịch chiết Lá khôi (Ardisia

gigantifolia Stapf.) lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào

của tế bào gốc ung thư dạ dày”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá tác động của dịch chiết Lá khôi lên mức độ biểu hiện của các

gen điều khiển chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày.

3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu thập mẫu Lá khôi và tách chiết dịch chiết Lá khôi.

Nội dung 2: Nuôi cấy các spheroid hình thành từ tế bào gốc ung thư

dạ dày.

Nội dung 3: Phân tích ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào bằng phương pháp Realtime PCR.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Ung thư dạ dày và tế bào gốc ung thư dạ dày

1.1.1. Ung thư dạ dày

1.1.1.1. Khái quát chung về dịch tễ học ung thư dạ dày

Ung thư dạ dày là một trong những bệnh ung thư phổ biến và gây tử

vong hàng đầu, đặc biệt là ở đàn ông lớn tuổi. Theo nguồn dữ liệu

GLOBOCAN 2018, ung thư dạ dày là loại ung thư phổ biến thứ 5 và ung thư

gây tử vong cao thứ 3, với ước tính 783.000 ca tử vong trong năm 2018 [1].

Vào năm 2018 theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư đang

là gánh nặng về y tế trên toàn cầu với 18,1 triệu ca mới mắc và 9,6 triệu ca tử

vong trong năm 2018. Tổng số bệnh nhân ung thư sống thêm 5 năm là 43,8

triệu người [78]. Hiện nay, ung thư dạ dày là loại ung thư đứng hàng thứ năm

với 1 triệu ca mắc mới chiếm 5,7%, chỉ sau ung thư phổi, ung thư vú ở nữ,

ung thư đại trực tràng và ung thư tiền liệt tuyến. Ung thư phổi là nguyên nhân

hàng đầu gây tử vong với 1,8 triệu ca chiếm 18,4%, ung thư đại trực tràng

với 881.000 ca chiếm 9,2%, ung thư dạ dày với 783.000 ca chiếm 8,2% [84].

Tỷ suất mới mắc chuẩn hoá theo tuổi của ung thư dạ dày trên phạm vi

toàn thế giới là 18/100.000 dân/năm. Tỷ suất mới mắc ung thư dạ dày cao

nhất ở các quốc gia Đông Á, tiếp theo là Trung và Đông Âu và thấp nhất là ở

các quốc gia Tây Phi. Tỷ suất mới mắc ở các quốc gia Đông Á vẫn là cao nhất

[28]. Tỷ lệ bệnh và tỷ lệ tử vong của ung thư dạ dày trên thế giới đã giảm

đáng kể trong 3 thập niên gần đây. Tỷ lệ giảm này được giải thích do điều

kiện sống được cải thiện, thay đổi thức ăn bằng việc sử dụng thức ăn tươi, đặc

biệt rau, quả tươi cùng với việc giảm tác nhân gây bệnh chủ yếu đó là trực

khuẩn Helicobacter pylori (HP) [70].

Việt Nam nằm trong khu vực tỷ lệ mắc ung thư dạ dày mới khá cao. Dựa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

vào kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi Diệu và cộng sự trong Chương trình

ghi nhận Ung thư Quốc gia, Việt Nam có tỷ suất ung thư dạ dày chuẩn hoá

theo tuổi ở nam giới có xu hướng tăng nhẹ (23,7/100.000 dân năm 2000 lên

24,5/100.000 dân năm 2010) [4]. Tương tự, tỷ suất ung thư dạ dày chuẩn hoá

theo tuổi ở nữ giới có xu hướng tăng nhẹ (10,8/100.000 dân năm 2000 lên

12,2/100.000 dân năm 2010). Ung thư dạ dày có xu hướng giảm dần theo thời

gian. Cho đến năm 2030, tỷ suất mắc mới ung thư dạ dày thô giảm xuống

7,9% chung cho cả nam và nữ, 10,3% cho nam giới và 7,3% cho nữ giới. Tỷ

suất mới mắc ung thư dạ dày chuẩn hoá theo tuổi chung và cả cho nam cũng

như nữ giảm (27/100.000 chung năm 2009 xuống 13,2/100.000 năm 2030;

cho nam: 41,4/100.000 năm 2009 xuống 19,6/100.000 năm 2030 và cho nữ:

16,3/100.000 năm 2009 xuống 11,4/100.000 năm 2030) [8].

Hình 1.1. Số ca ung thư mắc mới năm 2018 ở nam của Việt Nam

(Nguồn: Viet Nam Source: Globocan 2018) [79]

Năm 2018, GLOBOCAN cũng ghi nhận, tại Việt Nam tổng số ca ung

thư mới mắc là 164.671 (tỉ lệ từng loại ung thư mới mắc ở nam được thể hiện

ở hình 1.1), tổng số ca tử vong do ung thư là 114.871, tổng số ca ung thư sống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thêm sau 5 năm là 300.033 [10].

1.1.1.2. Các yếu tố liên quan đến dịch tễ ung thư dạ dày

Có rất nhiều yếu tố liên quan đến ung thư dạ dày trong đó nhiễm H.

pylori là yếu tố chính. Ngoài ra, yếu tố môi trường, điều kiện tiền ung thư và

yếu tố di truyền…

* Nhiễm H. pylori và ung thư dạ dày

Vào năm 1983, Marshall và Warren phân lập được vi khuẩn H. pylori từ

các mảnh sinh thiết biểu mô dạ dày, các nghiên cứu tiếp sau đó đã chứng

minh được nó có khả năng gây tổn thương niêm mạc dạ dày, gây viêm dạ dày

theo từng mức độ và dần dần dẫn đến dị sản, loạn sản rồi đến ung thư dạ dày.

H. pylori là loại vi khuẩn phổ biến, phát triển ở ống tiêu hóa. Vi khuẩn này

luôn có xu hướng tấn công niêm mạc dạ dày. Nhiễm H. pylori là nhiễm khuẩn

mãn tính, ảnh hưởng đến 50% dân số trên toàn thế giới nhưng <1% tiến triển

thành ung thư dạ dày [21]. Một điều đã được khẳng định là tỷ suất hiện mắc

của H. pylori liên quan mật thiết tới tỷ suất mắc ung thư dạ dày. Trên thế giới

có hơn 3,5 tỷ người nhiễm H. pylori và trên 700 triệu người bị bệnh lý đường

tiêu hóa liên quan đến nhiễm H. pylori. H. pylori liên quan đến tiến triển của

ung thư dạ dày như kích thích gây đợt cấp của viêm mãn tính làm cho biểu

mô niêm mạc dạ dày bị thay đổi, dẫn đến thay đổi yếu tố vi môi trường như

tăng các gốc tự do gây tổn thương DNA. H. pylori còn ảnh hưởng đến gen do

làm thay đổi quá trình metyl hóa gen áp chế ung thư như E-cadherin [20].

* Yếu tố môi trường

- Hút thuốc lá: Hút thuốc lá là một yếu tố nguy cơ làm tăng tỷ suất mắc

ung thư dạ dày cũng như một số loại ung thư khác. Những người hút thuốc lá

có nguy cơ mắc ung thư dạ dày cao hơn những người không hút thuốc lá là

1,6 lần. Trong một nghiên cứu ở quần thể lớn tại châu Âu cho thấy có 17,6%

ung thư dạ dày là do hút thuốc lá [49]. Những người bỏ thuốc lá giảm nguy cơ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

mắc ung thư dạ dày sau 10 năm cai thuốc. Trong một phân tích tổng hợp gồm

42 nghiên cứu cho thấy ở những người hút thuốc, nguy cơ ung thư dạ dày

tăng lên xấp xỉ 1,53 lần cao hơn ở nam giới so với ở nữ [29].

- Sử dụng rượu: Có mối liên quan không nhất quán giữa mức độ sử dụng

rượu với ung thư dạ dày. Kết quả một phân tích gộp cho thấy sử dụng rượu làm

tăng nguy cơ ung thư dạ dày hơn 1,39 lần so với không sử dụng rượu. Bên

cạnh đó, trong một nghiên cứu tại cộng đồng lớn tại châu Âu, ở nhóm đối

tượng sử dụng rượu nặng có nguy cơ ung thư dạ dày gấp 1,6 lần ở nam và 1,4

lần ở nữ [30].

- Chế độ ăn giàu muối: Muối được biết đến là yếu tố làm tăng quá trình

viêm và làm tăng tác dụng của tác nhân gây ung thư dạ dày như N-methyl-N-

nitro-N-nitrosoguanidine. Muối làm mất đi hàng rào bảo vệ của niêm mạc dạ

dày. Tập quán ăn đồ ăn mặn ngâm muối của người Nhật làm tăng nguy cơ

ung thư dạ dày, những người Nhật di cư đến Hoa Kỳ đã thay đổi tập quán ăn

uống giống như người phương Tây đã giảm đáng kể tỷ lệ ung thư dạ dày [40].

* Các hợp chất Nitroso: Hợp chất N-nitroso được sinh ra sau khi dùng các

nitrate, một thành phần tự nhiên của thức ăn như rau, cà chua và được sử

dụng như là chất gia vị trong một vài loại bơ và thịt đã chế biến. Nitrate trong

chế độ ăn uống được hấp thu tại dạ dày và được bài tiết trong nước bọt ở dạng

cô đặc. Tại đó chúng bị các vi khuẩn ở miệng khử thành các nitrite. Các

nitrite có thể phản ứng với các hợp chất có thể nitrosat hóa như các amine,

amide và amino acid để tạo thành hợp chất N-nitroso. Người ta cũng quan sát

thấy có sự gia tăng nitrite dạ dày ở những bệnh nhân dị sản ruột, loạn sản và

ung thư dạ dày. Sử dụng các loại phân bón nitrate và các thức ăn dầm có chứa

các sản phẩm nitrosate cũng có liên quan với ung thư dạ dày [84].

- Thịt nạc đỏ: Ăn nhiều thịt đỏ và thịt chế biến sẵn làm tăng nguy cơ

ung thư tâm vị dạ dày đặc biệt ở những trường hợp bệnh nhân bị nhiễm H.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

pylori. Do sắt của nhân Hem có trong thịt đỏ kích thích chất tiền thân của

nitroso. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cứ 50 g thịt nạc đỏ tăng thêm mỗi

ngày là tăng nguy cơ ung thư tâm vị dạ dày lên 2,45 lần [40].

- Rau, quả giàu vitamin C: Rau sống và quả giàu vitamin C là giảm nguy

cơ ung thư dạ dày. Vitamin C là giảm nguy cơ ung thư dạ dày do ức chế sự

hình thành các hợp chất nitroso. Một số vi chất dinh dưỡng nữa cũng làm

giảm nguy cơ ung thư dạ dày là đồng, vitamin E và caroten [40].

- Béo phì: Béo phì có liên quan đến ung thư đã được nghiên cứu trên

quần thể lớn số bệnh nhân ung thư. Trong một phân tích gộp gồm 16 nghiên

cứu đã chỉ ra rằng, béo phì có liên quan đến ung thư dạ dày đặc biệt là ở nam

giới trừ người châu Á [42].

- Tình trạng kinh tế xã hội: Bên cạnh sự khác nhau về giới, tỷ lệ ung thư

dạ dày cũng có liên quan với sự phân tầng xã hội. Tình trạng kinh tế xã hội có

tương quan ngược với tỷ lệ ung thư dạ dày. Những người có thu nhập thấp

thường có tỷ suất mắc ung thư dạ dày cao hơn những người có tình trạng kinh

tế-xã hội khá hơn [74].

- Địa lý: Một nét đặc biệt về dịch tễ ung thư dạ dày là tỷ lệ mắc ung thư

dạ dày có sự thay đổi theo từng khu vực địa lý và điều kiện kinh tế xã hội

khác nhau. Khoảng 60% trường hợp ung thư dạ dày trên thế giới xảy ra ở các

nước đang phát triển [22]. Tỷ lệ hiện mắc cao nhất là các nước Đông Á, đặc

biệt là Trung Quốc, Mongolia, Nhật Bản và Hàn Quốc (35,4 nam; 13,8 nữ),

Đông Âu (20,3 nam; 8,9 nữ) trong khi tỷ lệ hiện mắc thấp nhất là ở Bắc Mỹ

(5,5 nam; 2,8 nữ), Châu Phi (4,5 nam; 3,2 nữ). Trong vài thập niên qua, tỷ lệ

mắc mới trên toàn thế giới đều giảm và ước tính đến năm 2030, tỷ lệ giảm

hàng năm là 2,3% [17]. Ở một vài quốc gia, người ta cũng nhận thấy có sự

khác biệt về tỷ lệ mắc bệnh và tử vong giữa khu vực phía Bắc và khu vực phía

Nam, với những người ở phía Bắc có nguy cơ mắc và tử vong do ung thư dạ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

dày cao hơn những người ở phía Nam [80].

- Tuổi, giới tính với ung thư dạ dày: Tuổi và giới được ghi nhận là những

yếu tố nguy cơ quan trọng của ung thư dạ dày. Nam giới có tỷ suất mắc gấp

đôi nữ giới theo thống kê của Bệnh viện K. Tuổi từ 50 trở lên có nguy cơ ung

thư dạ dày cao hơn so với độ tuổi trẻ hơn. Ở Hoa Kỳ, theo ghi nhận từ năm

2005-2009 thì tỷ lệ ung thư dạ dày là 1% ở độ tuổi từ 20-34, tỷ lệ này là 29%

ở độ tuổi từ 75-84, tuổi trung bình được chẩn đoán ung thư dạ dày ở giai đoạn

này là 70 [38].

1.1.1.3. Các liệu pháp điều trị ung thư dạ dày hiện nay

- Phẫu thuật: Trong điều trị ung thư phần dạ dày, phẫu thuật được xem là

phương pháp điều trị hiệu quả nhất. Các phương pháp điều trị khác như hóa

trị, xạ trị và miễn dịch... chỉ là phối hợp và có tính chất bổ trợ, hoặc áp dụng

trong trường hợp đặc biệt không có khả năng mổ. Tùy vào từng giai đoạn của

bệnh mà các phẫu thuật viên có thể đưa ra phương pháp điều trị phẫu thuật

khác nhau: Nếu bệnh ở giai đoạn sớm; khi khối u còn nằm trong lớp niêm

mạc hoặc dưới lớp niêm mạc, dùng phẫu thuật nội soi cắt bỏ niêm mạc là một

lựa chọn điều trị lý tưởng [13].

- Hóa trị: Ung thư dạ dày di căn vẫn là một bệnh không thể chữa khỏi.

Hóa trị đã được chứng minh là kéo dài sự sống mà không ảnh hưởng đến chất

lượng cuộc sống. Tỷ lệ đáp ứng dao động từ 10-30% đối với trị liệu đơn tác

nhân và 30-60% đối với trị liệu đa tác nhân. Hầu hết các nghiên cứu về hóa trị

bổ trợ không chứng minh được lợi thế sống sót và do đó, nó không được coi

là điều trị tiêu chuẩn ở hầu hết các trung tâm [36]. Hoá chất và xạ trị thường

chỉ định điều trị phối hợp khi điều trị phẫu thuật có tính chất không triệt để,

ung thư đã có di căn hạch và xâm lấn các tạng lân cận hoặc trong những

trường hợp ung thư dạ dày tiến triển không còn khả năng phẫu thuật. Nhược

điểm của hóa chất điều trị ung thư là chúng không có khả năng lựa chọn hay

không thể phân biệt được đâu là tế bào ung thư, đâu là tế bào lành vì vậy sẽ bị

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ảnh hưởng tác dụng phụ rất nhanh [1].

- Xạ trị: Ung thư dạ dày tương đối đề kháng đối với xạ trị. Hiệu quả của

xạ trị đơn thuần hoặc phối hợp với hóa trị (hóa xạ trị liệu) chỉ giới hạn ở một

số bệnh nhân, nhưng vẫn chưa thực sự rõ ràng và cần phải được nghiên cứu

thêm [11]. Hầu hết các thử nghiệm cho thấy một lợi ích của liệu pháp điều trị

kết hợp so với hóa trị hoặc xạ trị đơn thuần. Việc sử dụng liệu pháp xạ trị

trước phẫu thuật, nội phẫu và cường độ điều trị trong ung thư dạ dày có triển

vọng nhưng cần nghiên cứu thêm [43].

- Điều trị đích: Điều trị đích là một trong những tiến bộ mới nhất hiện

nay trong điều trị ung thư dạ dày. Các thuốc điều trị đích tác dụng chọn lọc

lên tế bào ung thư ở mức phân tử, sinh hóa, di truyền mà không ảnh hưởng

lên chức năng của tế bào bình thường. Người ta đã và đang tiến hành nhiều

nghiên cứu pha II, III sử dụng các loại thuốc điều trị đích hướng đến các thụ

thể thuộc họ thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì người, họ yếu tố tăng

trưởng nội mô mạch máu, và một số đích khác trên bệnh nhân ung thư dạ dày

[11].

1.1.2. Tế bào gốc và tế bào gốc ung thư dạ dày

Tế bào gốc là các tế bào sinh học có khả năng biệt hoá thành các tế bào

khác. Chúng được tìm thấy trong các sinh vật đa bào. Trong cơ thể sống, có

thể lấy tế bào gốc từ hai nguồn chính: mô cơ thể đã trưởng thành và trong

phôi giai đoạn sớm [56]. Ở động vật có vú, có hai loại tế bào gốc: tế bào gốc

phôi, được phân lập từ trong của phôi nang giai đoạn sớm và tế bào gốc

trưởng thành, được tìm thấy trong các mô khác nhau. Trong các sinh vật

trưởng thành, tế bào gốc và các tế bào tiền thân đóng vai trò như một hệ thống

sửa chữa cho cơ thể, chúng thay thế và bổ sung các tế bào lão hoá hoặc bị hư

hại ở người trưởng thành.

Tế bào gốc trưởng thành thường được sử dụng trong các liệu pháp y

khoa khác nhau. Tế bào gốc có thể được phát triển nhân tạo và chuyển đổi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(biệt hoá) thành các tế bào chuyên biệt với các đặc tính phù hợp với các tế bào

của các mô khác nhau như cơ và dây thần kinh. Các dòng tế bào phôi và các

tế bào gốc phôi tự thân sinh ra thông qua việc chuyển gen hạt nhân là những

phương pháp điều trị rất tiềm năng trong tương lai [73].

Đặc điểm quan trọng và hữu ích nhất của tế bào gốc là tự đổi mới.

Thông qua đặc tính này, có thể tìm thấy sự tương đồng giữa tế bào gốc và tế

bào ung thư: khối u thường có thể bắt nguồn từ sự biến đổi của tế bào gốc

bình thường, các con đường truyền tín hiệu tương tự có thể điều chỉnh sự tự

tái tạo trong tế bào gốc và tế bào ung thư và tế bào ung thư có thể bao gồm "tế

bào gốc ung thư" - những tế bào hiếm có tiềm năng vô hạn để tự đổi mới thúc

đẩy quá trình tạo khối u [67].

Một trong những cơ chế phát sinh ung thư được đặc biệt quan tâm hiện

nay liên quan đến “tế bào gốc ung thư” (TBGUT- cancer stem cells). Tế bào

gốc ung thư dạ dày (TBGUTDD- gastric cancer stem cells) được cho là đóng

vai trò quan trọng trong việc di căn và kháng thuốc của khối u. Các liệu pháp

chống ung thư hiện nay thường không tiêu diệt chọn lọc các tế bào ung thư.

Kết quả là các TBGUT có khả năng kháng thuốc sẽ tiếp tục tồn tại và phân

chia dẫn đến sự tái phát ung thư sau điều trị [5].

Lý thuyết về TBGUT đã làm thay đổi phương pháp trong điều trị ung

thư, đó là việc phát triển các liệu pháp nhắm trực tiếp vào TBGUT.

TBGUTDD là cơ sở cho sự hình thành ung thư dạ dày. Tế bào này bắt nguồn

từ tế bào gốc dạ dày (TBGDD) trong các mô dạ dày hoặc các tế bào gốc trung

mô tủy xương [41]. TBGUTDD là yếu tố chính gây kháng hóa trị và xạ trị của

ung thư dạ dày. Những bằng chứng đầu tiên về tế bào gốc ung thư dạ dày

được cung cấp bởi Bjerknes và Cheng năm 2002. Các tác giả đã sử dụng các

tác nhân gây đột biến hoá học để đánh dấu các tế bào biểu mô một cách ngẫu

nhiên để làm mất chức năng gen chuyển trong mô hình chuột chuyển gen

Rosa26-lacZ biểu hiện Beta-galactoside [20]. CD44 là phân tử bám dính trên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

bề mặt TBGUTDD sớm nhất. Tiếp sau đó, tế bào ung thư cũng đã được phát

hiện trong các khối u phân lập trực tiếp từ bệnh nhân ung thư dạ dày bởi Lo và

cộng sự năm 2014, Nguyen và cộng sự năm 2016 [62]. Đặc biệt gần đây nhất,

Nguyen và cộng sự đã chỉ ra rằng ALDH (Aldehyde dehydrogenase) là một

marker dùng để xác định TBGUTDD ở người, đồng thời phát hiện ra rằng chính

những tế bào biểu hiện marker này đáp ứng mạnh với sự loại thải thuốc [63].

Ngay sau đó, cũng chính nhóm nghiên cứu này đã chứng minh rằng việc nhắm

đích các tế bào này bằng acid retinoic đã ức chế mạnh mẽ sự tăng trưởng của

TBGUTDD, gây biệt hóa TBGUT.

Các TBGUT không chỉ có khả năng phân chia, biệt hoá thành tất cả các

tế bào khác nhau trong khối u, làm tăng kích thước khối u mà có khả năng tạo

ra tế bào con với đủ các đặc tính của nó dựa vào đặc tính tự làm mới của loại

tế bào này. Tính tự làm mới của tế bào gốc thường cũng như TBGUT được

điều khiển bởi mạng lưới các tín hiệu phân tử như Wnt/β-catenin, Hedgehog,

Bmi-1, EGF, FGF, Src, Akt, Notch. Các tế bào gốc được phân biệt với các tế

bào khác trong cùng khối u thông qua sự biểu hiện một số marker trên bề mặt

của tế bào. Việc hiểu rõ đặc tính của các TBGUT đóng góp một phần không

nhỏ vào các liệu pháp điều trị ung thư mà ở đó các TBGUT trở thành đích

nhắm tới của liệu pháp [6].

Đối với ung thư dạ dày, các tế bào gốc ung thư được xác định lần đầu

tiên dựa vào marker bề mặt và phương pháp quần thể phụ. Năm 2002, tác giả

Bjerknes và cộng sự đã phân tích sự biểu hiện của 6 marker tế bào gốc tiềm

năng trên các dòng tế bào ung thư dạ dày và đã chỉ ra rằng, quần thể tế bào

CD44+ được phân tách bằng kỹ thuật dòng chảy tế bào FACS (Fluorescence-

activated cell sorting), các tế bào này mang các đặc tính cơ bản của tế bào gốc

ung thư như khả năng tạo các tumorsphere in vitro và hình thành khối u in

vivo [20]. Thêm vào đó, dựa trên phân tích quần thể phụ trong 5 dòng tế bào

ung thư dạ dày bằng phương pháp nhuộm Hoechst 33342, Fukada và cộng sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

đã chỉ ra các tế bào của một quần thể phụ chiếm tỷ lệ từ 0,02% đến 1,96% có

sự biểu hiện mạnh các gen vận chuyển ABC liên quan đến khả năng kháng

thuốc mà điển hình là gen MDR1 và BCPR1 kháng lại cisplatin 5-fluorouracil

và Doxorubicin. Đặc biệt, các tế bào thuộc quần thể phụ đã thể hiện hai đặc

điểm cơ bản của tế bào gốc ung thư đó là khả năng hình thành các

tumorsphere trong điều kiện in vitro và sự hình thành các khối u trong điều

kiện cấy ghép in vivo vượt trội so với các tế bào tách ra từ quần thể chính.

Đặc biệt, công bố của Nguyen và cộng sự (2017) đã lần đầu tiên xác định sự

tồn tại của các tế bào gốc ung thư dạ dày trong các dòng tế bào ung thư và

trong các khối u dạ dày phân lập từ các bệnh nhân dựa trên các sàng lọc in

vitro và in vivo [63]. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã chỉ ra, tế bào

gốc không chỉ biểu hiện các marker đặc trưng như CD44, ALDH mà chúng

còn thể hiện đặc tính kháng thuốc rất rõ rệt so với quần thể tế bào không phải

là tế bào gốc ung thư.

1.2. Chu kỳ tế bào và ung thư

1.2.1. Khái quát chung về chu kỳ tế bào

Chu kỳ tế bào, hay chu kỳ phân bào, là một vòng tuần hoàn các sự kiện

xảy ra trong một tế bào từ lần phân bào này cho đến lần kế tiếp, trong đó bộ

gen và các thành phần của tế bào được nhân đôi và sau đó tế bào phân chia

làm hai tế bào con. Ở các sinh vật đơn bào (nấm men, vi khuẩn,...) một cá thể

sau khi trải qua chu kỳ phân bào tạo ra hai cá thể mới; còn ở các sinh vật đa

bào thì chu kỳ tế bào là một quá trình tối quan trọng để một hợp tử phát triển

thành một cơ thể hoàn chỉnh và để cơ thể bổ sung số lượng tế bào thay cho số

đã chết [33].

Trong các tế bào nhân sơ, chu kỳ tế bào trải qua một quá trình mang

tên là trực phân. Trong các tế bào nhân chuẩn chu kỳ tế bào bao gồm hai

giai đoạn: giai đoạn thứ nhất kỳ trung gian lúc tế bào phát triển, tích lũy vật

chất và nhân đôi DNA; giai đoạn thứ hai là nguyên phân (Mitosis - M), lúc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

này tế bào thực thi quá trình phân chia thành hai tế bào con. Nhìn chung,

chi tiết của chu trình tế bào thay đổi tùy loại tế bào và tùy sinh vật, tuy

nhiên chúng có cùng những điểm chung nhất định và có cùng mục tiêu

là truyền đạt lại toàn bộ và chính xác thông tin di truyền của chúng cho các

tế bào con. Chính vì vậy, bộ gen của tế bào mẹ phải được nhân đôi một

cách chính xác và phải được chia đồng đều cho các tế bào con để mỗi tế

bào con đều nhận được bộ gen y hệt tế bào mẹ [33], [44].

Bảng 1.1. Các pha trong chu kỳ tế bào

Pha Mô tả Trạng thái Pha (viết tắt)

G0 Tĩnh lặng/ Lão hóa Gap 0 (khoảng cách 0) Trong pha này tế bào không tham gia vào chu kỳ và ngưng phân chia.

G1 Gap 1 (khoảng cách 1)

Trong pha này tế bào tăng kích thước. Điểm kiểm soát G1 điều khiển các cơ chế giúp cho tế bào chuẩn bị đầy đủ mọi thứ trong G1 rồi mới tiến tới pha S.

trung S Tổng hợp (Synthesis) Sự nhân đôi DNA và nhiễm sắc thể (NST) xảy ra trong pha này. Kỳ gian

G2 Gap 2 (khoảng cách 2)

Trong pha G2 tế bào tiếp tục sinh trưởng. Điểm kiểm soát G2 điều khiển các cơ chế giúp cho tế bào chuẩn bị đầy đủ mọi thứ trong G2 rồi mới tiến tới phân chia trong nguyên phân.

Phân bào M Nguyên phân (Mitosis)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Tế bào ngừng sinh trưởng và toàn bộ năng lượng được tập trung vào việc phân chia tế bào thành hai tế bào con một cách có trật tự. Ở giữa giai đoạn nguyên phân có một điểm kiểm soát ở kỳ giữa nhằm đảm bảo tế bào đã sẵn sàng hoàn tất quá trình phân bào.

Các pha trong chu kỳ tế bào (Bảng 1.1): Chu kỳ tế bào có thể được chia

thành các pha sau: G1, S, G2 (các pha G1, S, G2 được gộp lại thành kỳ trung

gian) và pha nguyên phân, hay pha M. Bản thân pha M bao gồm hai quá trình

liên quan chặt chẽ với nhau: quá trình nguyên phân trong đó nhiễm sắc

thể của tế bào mẹ được chia tách ra làm hai phần bằng nhau và quá trình phân

chia tế bào chất (Cytokinesis) trong đó tế bào chất của tế bào mẹ tách làm hai

phần bằng nhau và hình thành hai tế bào con. Việc kích hoạt mỗi pha phụ

thuộc vào sự tiến triển đúng cách của pha trước. Tế bào nếu có chu kỳ bị tạm

thời ngưng trệ hay bị đảo ngược thì được xem như rơi vào một trạng thái tĩnh

lặng gọi là pha G0 [33], [44].

1.2.2. Rối loạn chu kỳ tế bào và ung thư

Điểm kiểm soát chu kỳ tế bào là các cơ chế kiểm soát trong tế bào có

chức năng đảm bảo sự chính xác của quá trình phân bào trong các tế bào sinh

vật nhân chuẩn. Các điểm kiểm soát này sẽ xác minh xem sự tiến triển của

các pha trong chu kỳ tế bào có được hoàn tất một cách chính xác hay không

trước khi bước sang pha tiếp theo. Nếu cơ chế kiểm soát phát hiện ra các sai

sót, các vấn đề xảy ra trong tế bào hoặc ngoài tế bào, chúng sẽ chặn chu kỳ tế

bào ngay tại điểm kiểm soát và không cho tế bào tiến vào giai đoạn tiếp theo

của chu kỳ trước khi các vấn đề được giải quyết. Nhiều điểm kiểm soát như

vậy đã được nhận diện, trong đó một số điểm kiểm soát chưa được hiểu rõ

bằng các điểm khác [33]. Điểm kiểm soát chu kỳ tế bào được tế bào sử dụng

nhằm giám sát và điều tiết diễn biến chu kỳ tế bào [26]. Điểm kiểm soát có

vai trò ngăn chặn chu kỳ tế bào tại một số điểm nhất định, nhờ đó tế bào có

thể kiểm định lại một số diễn biến và quá trình cần thiết và sửa chữa những

chỗ sai hỏng của DNA. Tế bào không thể thực hiện pha kế tiếp của chu kỳ

cho đến khi nó thỏa mãn các yêu cầu mà điểm kiểm soát đặt ra.

Một số điểm kiểm soát được thiết kế để đảm bảo các DNA bị sai hỏng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hay thiếu sót sẽ không được truyền cho các tế bào con cháu. Hai điểm kiểm

soát như vậy tồn tại là điểm kiểm soát G1/S và điểm kiểm soát G2/M. Sự

chuyển tiếp G1/S là một bước hạn chế bởi tỉ lệ trong chu kỳ tế bào và cũng

được biết đến với cái tên điểm giới hạn (trong tế bào động vật) hay điểm bắt

đầu (trong nấm men) [33], [76]. Một mô hình về phản ứng của chu kỳ tế bào

trước các sai hổng của DNA đã được đề xuất, mang tên là điểm kiểm soát sau

nhân đôi DNA. Protein P53 đóng một vai trò quan trọng trong việc mở đầu

các cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào ở cả hai điểm kiểm soát G1/S và G2/M.

Vai trò trong việc hình thành khối u

Những bất thường trong việc điều hòa chu kỳ tế bào có thể dẫn tới việc

hình thành các khối u. Một số gen như các gen ức chế chu kỳ tế bào

(RB, P53...) khi bị đột biến có thể khiến tế bào sinh sản không kiểm soát và

hình thành khối u (hình 1.2). Mặc dù chu kỳ tế bào khối u bằng hay dài hơn tế

bào bình thường, trong các khối u tỉ lệ tế bào trong trạng thái sẵn sàng phân

bào so với các tế bào ở trạng thái pha G0 cao hơn nhiều so với các tế bào bình

thường; trong khi đó các tế bào bị chết rụng hay già lão vẫn không thay đổi).

Chính vì thế mà tính tổng cộng thì số tế bào khối u sẽ từ từ tăng dần lên [68].

Những tế bào đang trải qua chu kỳ một cách tích cực là mục tiêu trong

các liệu pháp chữa bệnh ung thư vì các DNA của chúng bộc lộ tương đối rõ

rệt trong quá trình phân bào và vì vậy chúng dễ bị tổn thương bởi các

loại thuốc hay tia bức xạ. Việc này được tận dụng tối đa trong việc điều trị

ung thư bởi một phương pháp mang tên là debulking, lúc này một số lớn các

tế bào khối u bị loại bỏ và điều này khiến một số lớn tế bào khối u còn trong

pha G0 bị chuyển sang pha G1 (do dinh dưỡng, ôxi, nhân tố sinh trưởng,... dồi

dào hơn vì các tế bào giảm đi). Các tế bào này nhanh chóng bị tiêu diệt bởi tia

bức xạ hay thuốc ngay khi mới chớm thực thi chu kỳ tế bào [82]. Nhìn chung,

các tế bào dễ bị tổn thương nhất vào cuối pha M và vào pha G2, còn sức

chống chịu đối với bức xạ cao nhất ở cuối pha S. Đối với những tế bào có chu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

kỳ dài và pha G1 dài, chúng cũng có sức kháng cự tốt ở cuối pha G1. Kiểu đề

kháng này liên quan đến mức độ các hợp chất sulfhydryl trong tế bào.

Sulfhydryl có tác dụng kháng bức xạ và có mức độ cao nhất ở pha S và thấp

nhất ở gần pha nguyên phân. Những sự khác biệt này chủ yếu do khác biệt về

thời gian ở pha G1, còn các pha M và S thì ít thay đổi.

Hình 1.2. Cơ chế phân chia của tế bào ung thư [45]

1.2.3. Các gen kiểm soát chu kỳ tế bào

P21 có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào, vì đột biến gen của P21

dẫn đến tăng khả năng hình thành khối u. Tuy nhiên, mất P27 dẫn đến một

kiểu hình rõ rệt hơn và bằng chứng mạnh mẽ cho thấy rằng P27 thực sự dẫn

đến tăng tỷ lệ mắc một số bệnh ung thư. P21 đóng vai trò là tác nhân chính

của nhiều con đường ức chế khối u để thúc đẩy các hoạt động chống tăng sinh

độc lập với con đường ức chế khối u P53. Nhưng trong các nghiên cứu gần

đây cho thấy, trong một số điều kiện nhất định, P21 có thể thúc đẩy sự tăng

sinh tế bào và gây ung thư. Do đó, P21 có thể hoạt động như một chất ức chế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

khối u hoặc là một gen gây ung thư [72]. P21 là chất ức chế quá trình tái bản

DNA và ức chế các cyclin-dependent kinases từ đó khiến cho tế bào rơi vào

trạng thái dừng chu kỳ tế bào. Ở nhiều dòng tế bào ung thư sự biểu hiện tăng

cường P21 thúc đẩy tế bào đi vào trạng thái nghỉ vĩnh viễn như một tế bào trải

qua quá trình lão hóa [31].

CCNE1 là gen mã hóa cho protein Cyclin-E1 đặc hiệu G1/S [46]. Protein

được mã hóa bởi gen này thuộc họ cyclin, được đặc trưng bởi tính tuần hoàn

mạnh mẽ của sự phong phú protein trong chu kỳ tế bào. Cyclins có chức năng

điều tiết CDK(Cyclin-dependent kinases). Cyclin này tạo thành một phức hợp

có chức năng như một tiểu đơn vị điều tiết của CDK2, có hoạt động cần thiết

cho quá trình chuyển đổi G1/S của chu kỳ tế bào. Protein này tích lũy ở ranh

giới pha G1-S và bị suy giảm khi các tế bào tiến triển qua pha S. Sự biểu hiện

quá mức của gen này đã được quan sát thấy ở nhiều khối u, dẫn đến mất ổn

định nhiễm sắc thể, và do đó có thể góp phần gây ra khối u. Năm 2019, Chao

Zhang và cộng sự đã chứng minh rằng CCNE1 (cyclin E) được coi là có liên

quan đến sự phát triển của các loại khối u khác nhau, và nó có vai trò quan

trọng trong ung thư biểu mô dạ dày (GC). Họ đã kiểm tra biểu hiện của

CCNE1 trong các tế bào GES-1 niêm mạc dạ dày và năm dòng tế bào GC.

CCNE1 đã được sử dụng để đánh giá hiệu quả của nó đối với sự tăng sinh và

chu kỳ tế bào trong các tế bào MGC-803 và NCI-N87. Kết quả cho thấy sự

điều chỉnh tăng CCNE1 chủ yếu được thể hiện trong các mô tế bào và các

dòng tế bào GC, cũng liên quan đến giai đoạn di căn hạch (TNM) và xâm lấn

bạch huyết [25]. Trong các tế bào ung thư buồng trứng, biểu hiện CCNE1

kích thích tăng sinh tế bào và tăng sự hình thành khuẩn lạc. Sự biểu hiện quá

mức CCNE1 liên quan đến khuếch đại gen CCNE1 có liên quan đến sự phát

triển của kháng hóa chất trong ung thư buồng trứng. Vì các khối u buồng

trứng có mức CCNE1 tăng cao thường biểu hiện biểu hiện Cdk2 cao hơn và

hầu hết các tác dụng thúc đẩy khối u liên quan đến CCNE1 cần có sự tham

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

gia của Cdk2 [47].

P27 được coi là một chất ức chế khối u vì chức năng của nó như là một

bộ điều chỉnh chu kỳ tế bào. Trong các bệnh ung thư, nó thường bị bất hoạt

thông qua quá trình tổng hợp bị suy yếu, suy thoái cấp tốc hoặc sai lệch vị

trí. Những hành động này để tăng tốc độ phân giải protein P27 và cho phép tế

bào ung thư trải qua quá trình phân chia nhanh chóng và tăng sinh không

kiểm soát [23]. Trong hầu hết các bệnh ung thư, mức độ hạt nhân P27 giảm

có liên quan đến việc tăng kích thước khối u, tăng khối u và xu hướng di căn

cao hơn [64]. P27 là một phân tử phức tạp, có nhiều chức năng được điều hòa

thông qua rất nhiều tương tác protein và sửa đổi sau dịch mã. Một số nghiên

cứu đã phân loại P27 như một chất ức chế khối u giả định: (1) nó hoạt động

như một bộ điều chỉnh tiêu cực của chu kỳ tế bào; (2) sự biểu hiện quá mức

của nó ngăn chặn sự phát triển của tế bào trong một số loại tế bào. Tuy nhiên,

P27 là một chất ức chế khối u không điển hình vì trái ngược với các thuốc ức

chế khối u nổi tiếng khác như P53 và RB1, nó không bị đột biến trong ung

thư ở người [64].

Năm 2018, Victoria J. Gennaro và cộng sự cũng đã nghiên cứu về khả

năng kiểm soát CCND1 bởi tiểu đơn vị SAGA xúc tác USP22 (Ubiquitin

specific peptidase 22) là điều cần thiết cho sự phát triển chu kỳ tế bào thông

qua G1 trong các tế bào ung thư. CCND1 là chất ức chế cyclin. Họ đã chứng

minh rằng kiểm soát CCND1 là một cơ chế chính mà USP22 làm trung gian

trong tiến trình chu kỳ tế bào. Về mặt chức năng, sự biểu hiện quá mức này

của USP22 góp phần tích cực vào sự hình thành khối u, vì sự suy giảm

USP22 ngăn chặn sự tiến triển của chu trình tế bào ung thư trong ống nghiệm

và ức chế sự tiến triển của khối u trong các mô hình động vật của phổi, vú,

bàng quang, buồng trứng và ung thư gan. USP22 và CCND1 tương quan

trong các mẫu ung thư phổi và ung thư đại trực tràng của bệnh nhân và các

nghiên cứu tiền lâm sàng của chúng tôi chỉ ra rằng việc nhắm mục tiêu

USP22 kết hợp với các thuốc ức chế CDK có thể đưa ra cách tiếp cận để điều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

trị bệnh nhân ung thư có khối u biểu hiện CCND1 tăng [77].

Kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh PCNA (Proliferating cell nuclear

antigen), là một protein phụ cho DNA polymerase delta điều chỉnh sự sao

chép và sửa chữa DNA, đã được báo cáo là đóng một vai trò quan trọng trong

việc điều chỉnh quá trình apoptosis. Liu XH và cộng sự đã chỉ ra rằng, GSK3β

đã tương tác với PCNA trong các tế bào ung thư biểu mô tuyến H1299.

Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng, sự tương tác của chúng có thể được tăng

cường trong vòng 3 giờ đầu sau khi chiếu xạ UVC và giảm dần theo thời gian.

Sự biểu hiện quá mức của protein PCNA làm giảm quá trình phosphoryl hóa

GSK3β Ser9, trong khi đó, việc giảm PCNA bằng cách sử dụng RNA can

thiệp nhỏ (siRNA) đã làm tăng sự ức chế phosphorylated GSK3 Ser, bị ức chế

bởi phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) [48].

1.3. Giới thiệu chung về cây Lá khôi

1.3.1. Phân loại và đặc điểm

Họ Đơn nem (Myrsinaceae) là một họ thực vật khá lớn, bao gồm 50 chi

và khoảng 1.400 loài, được phân bố rộng rãi trên thế giới, nhất là ở các nước

có khí hậu ôn đới và nhiệt đới. Trong đó, chi Cơm nguội (Ardisia) có khoảng

400-500 loài [18]. Trên thế giới chi Ardisia là một chi lớn thuộc họ

Myrsinaceae, có khoảng 500 loài, phân bố phần lớn ở vùng nhiệt đới châu

Mỹ, châu Á, số ít ở châu Úc và các đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam chi

Ardisia có khoảng 101 loài. Dạng sống chủ yếu của các loài thuộc chi này là

cây gỗ nhỏ, cây bụi hoặc nửa bụi gần với dạng cây thân thảo [9].

Cây Lá khôi thuộc chi Ardisia hay còn gọi là Lài sơn, cây Lá khôi có tên

khoa học là Ardisia gigantifolia Stapf. [2]. Trong cuốn “Thực vật chí Việt

Nam” của Trần Thị Kim Liên, tập 4 (trang 173) có mô tả như sau: Cây Lá

khôi là cây bụi lớn hoặc nửa bụi, cao khoảng 1-2(3) m, có thân rễ bò dày,

phần thân đứng thẳng có đường kính khoảng 1cm, thường không phân cành,

không có lông, trừ thân rất non có lông mềm thưa. Lá thường tập trung ở đầu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thân, phiến mỏng hình bầu dục hoặc hình mác dạng trứng, 24-48(60) x 7-

17(19) cm, chóp lá tù có mũi nhọn, gốc hình nêm và men xuống thành cánh ở

cuống lá, mép khía răng cưa nhỏ nhọn dày đặc, hai mặt không có lông hoặc

có lông mềm nhỏ thưa trên gân ở mặt dưới, có điểm tuyến lồi thưa thớt, nhiều

hơn ở gần mép lá, gân bên khoảng 15-20 đôi, hướng lên, cuống dài 2-4cm.

Cụm hoa hình chùm tán ở nách lá, dài 18-30(35) cm, có lông mềm nhỏ, mỗi

tán có 9-15 hoa; cuống hoa dài 1-1,5 cm; lá bắc và lá bắc con hình giải, có

lông nhỏ và điểm tuyến. Hoa màu hồng hoặc trắng. Lá đài hơi hợp ở gốc, hình

tam giác hoặc mác, đầu nhọn dài 1,5-2 mm, có điểm tuyến và có lông quanh

mép. Cánh hoa hình trứng dài 4-5 mm, có điểm tuyến. Nhị dài bằng 2/3 cánh

hoa, bao phấn hình trứng. Bầu hình cầu, nhẵn hoặc có lông rất nhỏ, vòi nhụy

dài gần bằng cánh hoa, noãn nhiều, 1 vòng. Quả hình cầu đường kính khoảng

6 mm, màu hồng có gân tuyến và điểm tuyến [9].

Theo tác giả Võ Văn Chi [2] và Trần Thị Kim Liên [9], nhiều loài Ardisia

ở Việt Nam được dân gian sử dụng làm thuốc được phân bố ở Sơn La, Bắc

Giang, Hà Nội (Ba Vì), Hà Nam, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên

- Huế, Kon Tum. Cây ra hoa tháng 3-6, có quả tháng 11-12. Mọc ở rừng thưa,

rừng rậm, sườn đồi, thung lung, khe núi, bờ suối nơi ẩm có bóng râm.

1.3.2. Thành phần hóa học của cây Lá khôi

Loài Ardisia gigantifolia có phần thân, rễ đã được sử dụng từ lâu để điều

trị 35 các bệnh thấp khớp, đau cơ, đau xương hay đau do chấn thương. Bốn

tritecpenoid saponin kiểu oleane được phân lập từ thân rễ loài này được thử

hoạt tính gây độc tế bào, kết quả cho thấy 3 trong 4 hợp chất thể hiện hoạt tính

gây độc tế bào lên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm là NCI-H460, SF-268,

MCF-7 và HepG2 [83]. Một hợp chất có khung coumarin được phân lập từ

phần thân rễ cũng cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh lên các dòng tế bào

ung thư PC-3 và A549 [75]. Một dẫn xuất resorcinol được phân lập từ phần

thân rễ chỉ ra hoạt tính gây độc tế bào mạnh lên các dòng tế bào PC-3, EMT6,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

A549, HeLa, RM-1 và SGC7901 [61].

Bằng các phản ứng hóa học đặc trưng đã xác định được nhóm chất chính

trong lá cây Lá khôi là tannin pyrogallic. Hàm lượng polyphenol tổng số trong

cao chiết nước và cao chiết cồn 80% từ lá cây Lá khôi lần lượt là 5,03±0,05%

và 8,09±0,11%, trong khi hàm lượng tannin tổng số tương ứng là 0,85±0,04%

và 0,52±0,01%. Cao chiết nước và chiết cồn 80% từ lá cây Lá khôi gây độc yếu

trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm SK-LU-1, MCF-7, Hela, AGS, và SK-

Mel-2. Cao chiết nước Lá khôi thể hiện tác dụng dọn gốc tự do SOD và ức chế

xanthin oxidase trung bình yếu trong khi cao chiết cồn lá cây Lá khôi không

thể hiện tác dụng này ở liều thử nghiệm trên in vitro [12].

Theo tác giả Nguyễn Hoàng Anh và cộng sự cũng đã nghiên cứu về

thành phần hóa học của hai loài Ardisia silvestris và Ardisia gigantifolia vào

năm 1996, trong đó công bố đã tìm thấy hai dẫn xuất resocinol là 2-methyl-5-

(Z-nonadec-14-enyl)resorcinol và 5-(Z-nonadec14-enyl)resorcinol. Ngoài ra,

từ lá của loài A. silvestris, một số sterol như 38 stigmasterol, spinasterol là

hàm lượng chính, còn có 24-methylenecholesterol, stigmast-22-en-3β-ol, 22-

dihydrospinasterol cùng một số các hợp chất tritecpen khác lanost-8-en-3β-ol,

taraxerol, lano-sterol, β-amyrin, 24-methylenelanost-8-en3β-ol và 24-

methylenecycloartanol đã được tìm thấy [39].

Bốn hợp chất triterpenoid saponin mới (1-4) đã được phân lập từ thân rễ

của Ardisia gigantifolia. Các cấu trúc của chúng được làm sáng tỏ bằng

phương pháp nghiên cứu quang phổ C-NMR, bao gồm kỹ thuật 2D-NMR. Các

hoạt động gây độc tế bào của saponin 1-4 được báo cáo đối với ba dòng tế bào

ung thư ở người, gồm tế bào ung thư cổ tử cung Hela, các tế bào ung thư bàng

quang EJ và tế bào ung thư dạ dày BCG-823 ở người [57].

Một saponin triterpenoid mới, có tên 3-O-β-d-glucopyranosyl- (1 → 3)

-β-d-xylopyranosyl- (1 → 2) - [α-l-rhamnopyranosyl- (1 → 3)] -- d-

glucopyranosyl- (1 → 4) - [β-d-glucopyranosyl- (1 → 2)] - α-l-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

arabinopyranosyl-3β, 16α, 28,30-tetrahydroxy-olean-12-ene (1) với bốn

triterpenoids đã biết (2-5), được phân lập từ thân rễ của Ardisia gigantifolia.

Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ bằng phương pháp quang phổ. Các

hợp chất 1-4 cho thấy hoạt động gây độc tế bào chống lại các dòng tế bào

Hela, EJ, BCG và HepG-2. Tỷ lệ tế bào apoptotic sớm sau khi điều trị bằng

một saponin triterpenoid đã tăng đáng kể so với các tế bào đối chứng (p

<0,05) [54].

Mười bảy 13,28-epoxy triterpenoid saponin thu được từ Ardisia

gigantifolia đã được đánh giá các hoạt động chống tăng sinh của chúng trên các

tế bào MCF-7. Phân tích mối quan hệ cấu trúc - hoạt động chỉ ra rằng nhóm

CH3 tại C-30, bốn đơn vị sacaride có L-rhamnose tại R6 trong các đơn vị

đường rất quan trọng đối với hoạt động gây độc tế bào trên MCF-7. Các hợp

chất 1, 2, 6, 7, 12 và 14 đã được chọn để xác định hoạt động chống tăng sinh

trên ba dòng tế bào ung thư vú khác (T47D, MDA-MB-231 và SK-BR-3) [52].

Trong quá trình phân lập định hướng hoạt tính kháng lao của dịch chiết

CHCl3 từ phần lá và thân của loài Ardisia gigantifolia, đã phân lập được hai

dẫn xuất alkylresorcinol là 5- (8Z-heptadecenyl) resorcinol (1) và 5- (8Z-

pentadecenyl) resorcinol (2) cùng với đó là 15 dẫn xuất khác đã được tổng

hợp từ các hợp chất tự nhiên. Những hợp chất này (gồm cả tách chiết từ thiên

nhiên và tổng hợp) sau đó được đánh giá hoạt tính chống lao thực hiện trên vi

khuẩn lao Mycobacterium H37 RV, một loại vi khuẩn gây ra bệnh lao ở

người. Kết quả hai dẫn xuất resorcinol (1) và (2) thể hiện hoạt tính chống lao

với các giá trị MIC lần lượt là 34,4; 79,2 μM trong phương pháp MABA và

91,7; 168,3 μM trong phương pháp Lora [14].

1.3.3. Các nghiên cứu về tác dụng của cây Lá khôi trong điều trị ung thư

Theo nghiên cứu của Mu L và cộng sự năm 2014 thì chiết xuất etanolic

của rễ loài Ardisia gigantifolia (AGB-5) (Trung Quốc), có thể ảnh hưởng đến

sự tăng sinh của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú ở người (MCF-7) trong ống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nghiệm và khám phá tế bào ung thư dưới tác dụng của AGB-5 trên chuột

được ghép với các tế bào MCF-7. Trong một mô hình in vivo, AGB-5 đã giảm

thể tích khối u, mang lại tế bào hồng cầu và tế bào bạch cầu gần bằng giá trị

bình thường, tăng cường superoxide disutase và catalase của chuột mang

MCF-7. Đây là nghiên cứu đầu tiên xác minh hoạt động chống ung thư của A.

gigantifolia in vivo. Kết quả cho thấy, AGB-5 có thể có tác dụng có lợi đối

với ung thư biểu mô tuyến vú ở người [53].

AG36 là sản phẩm biến đổi sinh học của triterpenoid saponin từ Ardisia

gigantifolia. Năm 2017, tác giả Li-Hua Mu và cộng sự đã chỉ ra hoạt động chống

ung thư và các cơ chế phân tử cơ bản của AG36 chống lại các tế bào ung thư vú

MCF-7, MDA-MB và SK-BR-3 ở người. Các nghiên cứu in vivo cho thấy AG36

ức chế đáng kể sự phát triển của khối u MCF-7 ở chuột so với đối chứng. Cụ thể,

AG36 ức chế sự tăng sinh tế bào MCF-7, MDA-MB-SK và SK-BR-3. Vì vậy,

AG36 có thể là một tác nhân điều trị ung thư vú tiềm năng [51].

Hợp chất 1, một saponin triterpenoid từ Ardisia gigantifolia cho thấy

hoạt động chống khối u tiềm năng, gồm có 3 dẫn xuất (2-4). Trong số đó, hợp

chất 2 và 3 là hợp chất mới. Các hợp chất 3 được đánh giá về khả năng gây

độc tế bào đối với ung thư biểu mô tế bào gan và tế bào gan bình thường. Hợp

chất 3 cho thấy độc tính tế bào tốt hơn đối với các dòng tế bào Bel-7402 và

HepG2 và độc tính tế bào yếu hơn nhiều so với tế bào L02 gan bình thường so

với kiểm soát dương tính [58].

Ba triterpenoid saponin mới, 1- 3, cùng với hai saponin được biết đến, 4

và 5, đã được phân lập từ thân rễ của Ardisia gigantifolia. Kết cấu của chúng

được làm sáng tỏ bằng các nghiên cứu quang phổ NMR 1D và 2D. Saponin 1,

2, 4, và 5 có tính độc tế bào đáng kể đối với bốn dòng tế bào ung thư của

người, như tế bào ung thư cổ tử cung Hela, tế bào u ác tính EJ, tế bào gan

hepatoma và các tế bào ung thư dạ dày BCG ở người [56].

Hợp chất 1, một saponin triterpenoid từ Ardisia gigantifolia cho thấy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hoạt động chống khối u tiềm năng, đã bị thủy phân thành hai dẫn xuất

deglycosyl (2 và 3) bởi Alternaria Alternata AS 3.6872. Cả hai dẫn xuất này

là các hợp chất mới. Cấu trúc của chúng đã được làm rõ trên cơ sở dữ liệu

quang phổ xoay 1D, 2D NMR, HR-ESI-MS và quang học. Các hợp chất 1-3

được đánh giá về khả năng gây độc tế bào chống lại ung thư tế bào gan và tế

bào gan bình thường [59].

Mười ba 13,28-epoxy triterpenoid saponin đã được phân lập từ cây Lá

khôi và một saponin có tiềm năng chống khối u đã được methyl hóa bởi

H2SO4 để tạo ra bốn hợp chất mới. Phân tích mối quan hệ cấu trúc và hoạt

động chỉ ra rằng sự kết hợp của nhóm O tại C-16, L-rhamnose tại R (5) và

nhóm acetyl ở OH-6 của D-glucose dẫn đến tăng đáng kể hoạt tính gây độc

trên A549 và HCT-8 nhưng làm giảm đáng kể hoạt tính gây độc tế bào trên

các tế bào Bel-7402 [55].

Mức độ ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên apoptosis 3 dòng tế bào

(AGS, MKN45, MKN74) khác nhau, cụ thể như sau: Tỷ lệ apoptosis ở dòng

AGS là 11,5 ± 5,2% cao nhất trong 3 dòng, tiếp theo là dòng MKN45 với tỷ

lệ 6,5 ± 0,5%; thấp nhất ở dòng MKN74 với tỷ lệ 3,3 ± 1,1%. Như vậy, mặc

dù ở nồng độ 100 µg là một nồng độ có khả năng ức chế 70 – 80% khả năng

sinh trưởng của tế bào nhưng khả năng cảm ứng apoptosis đối với cả 3 dòng

tế bào chỉ đạt từ 3,3 – 11,5%; đây là một tỷ lệ rất thấp so với một số nghiên

cứu khác. Kết quả này chỉ ra rằng dịch chiết Lá khôi là ít độc cho các tế bào

và khả năng ức chế cao sự phân chia nhưng ít gây ra apoptosis, đó có thể là do

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

một cơ chế sinh học khác như sự biệt hóa tế bào gốc, sự già hóa [7].

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45, do Phòng thí nghiệm Inserm

U1053 - Viện Sức khỏe và Nghiên cứu Y học Quốc gia - Cộng hòa Pháp cung

cấp, được lưu trữ tại phòng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học -

Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.

Cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia) thuộc chi Ardisia họ Đơn nem

(Myrsinaceae) thu thập tại huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên, được bảo quản

tại phòng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại

Khoa học - Đại học Thái Nguyên.

2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI 1640 và DMEM-F12 (Invitrogen),

huyết thanh bò (Invitrogen), Trypsin, Kháng sinh Ampicilin/Streptomycin

(Invitrogen), DMSO, MTT và propidium iodide (PI) (Sigma) và các Primer

do Quiagen cung cấp.

Trang thiết bị nghiên cứu: Kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipe 2 (Nhật

Bản); Kính hiển huỳnh quang Olympus (Nhật Bản); Máy đo quang phổ

SPECTROstar Nano – BMG Labtech (Đức); Tủ nuôi cấy tế bào ổn nhiệt CO2

(Thermo Fisher Scienetific) và các thiết bị phụ trợ khác.

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Y - Sinh - Khoa Công nghệ

Sinh học - Trường Đại Khoa học - Đại học Thái Nguyên.

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 05/2018 đến tháng 07/2019.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp thu thập và xác định tên khoa học của cây Lá khôi

Sử dụng phương pháp thu thập mẫu cây Lá khôi theo Nguyễn Nghĩa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Thìn (2007) [3].

Xác định tên khoa học theo phương pháp chuyên gia, kết hợp với cuốn

“Thực vật chí Việt Nam” tập 4, họ Đơn nem (Myrsinaceae) của Trần Thị Kim

Liên [9].

2.4.2. Phương pháp thu dịch chiết cây Lá khôi

300 gam mẫu lá của Lá khôi được thu nhận, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt

độ 42°C trong 48h. Tiếp theo, mẫu lá được nghiền nhỏ bằng chày cối sứ thành

bột mịn. 15 gam bột thu được sẽ được cho vào ống Falcon thể tích 50ml. Để

chiết rút dịch chiết tổng số, 30ml Ethanol tuyệt đối được bổ sung vào ống

Falcon chứa 15 gam bột lá và được lắc 200 rpm/ phút trong 48h. Dịch chiết

thu được được lọc bằng giấy lọc Whatman, sau đó được làm khô trong tủ sấy

ở nhiệt độ 50°C trong 48h. Cặn thu được sau bay hơi sẽ được sử dụng cho các

thí nghiệm tiếp theo.

2.4.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào 2D

Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 được nuôi cấy trong điều kiện nuôi

cấy bám dính (2D) trong môi trường DMEM/F12 Glutamax có bổ sung 10%

huyết thanh bò (FBS) và 1% hỗn hợp kháng sinh Ampicillin/Streptomycin (P/S), trong điều kiện 37oC, 5% CO2. 100.000 tế bào ung thư dạ dày dòng MKN45 được nuôi cấy trong hộp nuôi cấy diện tích 75cm2, trong môi trường

nuôi cấy RPMI 1640 (Invitrogen) bổ sung 10% huyết thanh bò và kháng sinh

1% Penicillin/Streptomycin.

Môi trường nuôi cấy được thay ngày một lần bằng một môi trường nuôi

cấy mới. Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với Trypsine 0,05%

trong 3 phút. Tế bào được thu lại bằng ly tâm 1.300 rpm/phút trong 5 phút và

được cấy chuyển sang một bình nuôi cấy mới. Tế bào sống, chết được đếm

dưới kinh hiển vi đảo ngược Nikon Eclipe 2, sử dụng Trypan blue làm thuốc

nhuộm cho tế bào chết.

2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Nuôi cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2.000 tế bào/giếng nuôi cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt không bám dính (3D) để hình

thành nên tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu). Sử dụng môi trường

DMEMF12/Glutamax có bổ sung 1% Ampicillin/Streptomycin, yếu tố tăng

trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml, 0,3% Glucose, 5µg/ml Insulin ở 370C, 5% CO2.

2.4.5. Phương pháp phân tích chu kỳ tế bào bằng Flow cytometry

2x105 tế bào của dòng MKN45 được nuôi cấy trên đĩa loại 12 giếng. Sau

24 giờ, tế bào được xử lý bằng môi trường nuôi cấy chứa dịch chiết Lá khôi ở

nồng độ 75 µg/ml. Các giếng đối chứng không bổ sung dịch chiết Lá khôi.

Thời gian xử lý là 48 giờ trong điều kiện 370C, 5% CO2. Tiếp theo, các tế bào

được tách khỏi bề mặt đĩa bằng cách xử lý với trysin/EDTA và được thu lại

bằng ly tâm 1.500 rpm/phút trong 3 phút và được cố định trong ethanol 75% ở

-20°C qua đêm. Tiếp theo, tế bào được nhuộm với dung dịch Fluorochrome

(0,1% Sodium citrate (wt/v); 0,1% Triton X-100 (v/v), 50 mg l-1 PI trong

nước khử ion vô trùng) trong thời gian 2 giờ ở 40C trước khi phân tích bằng

hệ thống Flow cytometry BD-Accuri C6 plus (BD-Bioscinces). Kết quả dữ

liệu được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng cho hệ thống BD-Accuri C6

plus.

2.4.6. Phương pháp phân tích miễn dịch huỳnh quang

Các tumorsphere sau 5 ngày nuôi cấy được thu nhận bằng ly tâm 1.300

rpm trong 3 phút và rửa 2 lần với đệm PBS 1X. Nhuộm tế bào lần lượt với

kháng thể 1 là kháng thể đơn dòng chuột kháng protein P21 của người được

cung cấp bởi Santa Cruz, tỷ lệ 1:500 ở 37ºC trong 45 phút và kháng thể 2

kháng IgG của chuột gắn chất phát quang Alexa Fluor 488 do Thermo

Scientific cung cấp, nồng độ 1:2.000 ở 37ºC trong 20 phút. Rửa tế bào 2 lần

với PBS 1X bằng phương pháp li tâm, ở lần rửa thứ 2 tế bào được rửa trong

đệm PBS chứa chất nhuộm nhân tế bào DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindole

do Sigma cung cấp) nồng độ 10µg/ml. Các tế bào sau khi được ủ với kháng

thể sẽ được đặt trên lamen và được quan sát, chụp ảnh dưới kính hiển vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

huỳnh quang NIKON ở độ phóng đại 200 lần với phần mềm chuyên dụng.

2.4.7. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA

RNA tổng số của tế bào MKN45 được tách chiết bằng Trizol theo hướng

dẫn của nhà sản xuất (Invitrogen). Tế bào nuôi cấy trên đĩa 6 giếng được bổ

sung 1.000 µl Trizol, dùng pipette 1ml mix nhiều lần để tách tế bào ra khỏi bề

mặt đĩa. Ủ tế bào ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó ly tâm 12.000 rpm

trong 10 phút ở 4ºC. Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới. Bổ sung 2ml

Choloroform, vontex mẫu trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.

Ly tâm 10.000 rpm/phút trong 15 phút ở 4ºC, lặp lại 2 lần. Làm khô RNA

trong 5 – 10 phút và bổ sung 100 µl nước khử ion. Đo quang phổ tại các bước

sóng 260/280 nm bằng máy đo quang phổ NanoDrop. Sử dụng 1µg RNA để

tạo cDNA bằng Quantitect Reverse Transcriptase (RT) kit (do Quiagen cung

cấp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.4.8. Phương pháp phân tích biểu hiện gen bằng Realtime PCR

Phân tích Realtime PCR sử dụng 20ng cDNA cho mỗi phản ứng PCR

với tổng thể tích là 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR do

Invitrogen cung cấp. Danh sách các gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương

ứng do Quiagen cung cấp và được trình bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Mã số cặp mồi của các gen

Tên gen Mã số cặp mồi Nguồn cung cấp

CD44 QT00073549 Qiagen

ALDH QT00013286 Qiagen

SOX2 QT00237601 Qiagen

CCNE1 QT00041986 Qiagen

CCND1 QT00495285 Qiagen

P21 QT00006615 Qiagen

P27 QT00244993 Qiagen

PCNA QT00024633 Qiagen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Ghi chú: Toàn bộ các mồi được Qiagen cung cấp ở dạng mã số, không cung cấp thông tin trình tự (bảo mật thiết kế).

Sự thay đổi về mức độ biểu hiện gen được tính theo phương pháp Delta

delta ct (ΔΔCt). Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình của 3 lần lặp lại

của thí nghiệm với độ lệch chuẩn SD, cỡ mẫu cho mỗi lần thí nghiệm n=3.

2.4.9. Phương pháp phân tích thống kê

Phân tích giá trị khác biệt về mặt thống kê giữa các nhóm đối chứng và

nhóm thí nghiệm theo Mann - Whitney, sử dụng phần mềm GraphPad Prism

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

5.0.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả thu thập và xác định tên khoa học và thu dịch chiết ethanol

cây Lá khôi

Cây Lá khôi được thu thập tại huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên, sau

đó được xử lý tươi ngoài thực địa và xử lý khô tại phòng thí nghiệm. Mẫu cây

Lá khôi được xác định tên khoa học là loài Ardisia gigantifolia Stapf. và lưu

trữ tại phòng thí nghiệm Sinh học – khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại

học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.

Hình 3.1. Mẫu cây Lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf.)

Từ 15 gam bột Lá khôi, sau khi tách chiết bằng ethnol đã thu được 1,81

gam cao khô tương ứng với tỷ lệ 12,1%. Toàn bộ cao khô được hòa tan trong

DMSO và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện nuôi cấy 2D

Nuôi cấy tế bào (2D) đã được sử dụng như mô hình in vitro để nghiên

cứu phản ứng của tế bào đối với các kích thích từ các tín hiệu sinh lý và sinh

hóa [38]. Để chuẩn bị vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo thì việc nuôi cấy

tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D có vai trò rất quan trọng. Trong nghiên

cứu này, dòng tế bào MKN45 đã được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường

RPMI 1640 bổ sung 10% FBS và kháng sinh. Kết quả nuôi cấy được trình

bày trong hình 3.2

Hình 3.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào MKN45 trong điều kiện nuôi cấy 2D

(Thang đo 50 µm)

Kết quả hình 3.2 cho thấy, sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào MKN45 sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

trưởng tốt trên bề mặt hộp nuôi cấy. Các tế bào có hình dạng ovan hoặc hình

tròn điển hình. Các tế bào sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy 2D được thu

nhận tế bào phục vụ cho nuôi cấy 3D và các nghiên cứu ảnh hưởng của dịch

chiết Lá khôi lên chu kỳ tế bào.

3.3. Nuôi cấy tumorsphere của các tế bào ung thư dạ dày trong điều kiện

nuôi cấy 3D

Để thử tác động của dịch chiết Lá khôi lên sự hình thành và phát triển của

các tumorsphere, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào từ các tế bào nuôi cấy

2D. Kết quả nuôi cấy hình 3.3 cho thấy, trên bề mặt không bám dính và môi

trường chứa các chất sinh trưởng FGF, EGF, insulin, các tế bào gốc ung thư

đã tạo ra các khối cầu hay còn gọi là tumorsphere. Các tumosphere được hình

thành và tăng dần kích thước theo thời gian nuôi cấy. Từ kích thước nhỏ gồm

5-7 tế bào trong ngày thứ 2 nuôi cấy, các tumosphere đã tăng kích thước

nhanh chóng sau 4–7 ngày nuôi cấy. Ở ngày nuôi cấy từ 5–7 ngày, các

tumorsphere đã có kích thước hình cầu điển hình chứa một lượng lớn tế bào

đơn so với ngày nuôi cấy thứ 2 hoặc 3.

Hình 3.3. Nuôi cấy tumorpshere hình thành từ các tế bào gốc ung thư dạ

dày MKN45 theo thời gian nuôi cấy từ 0 đến 7 ngày. Thang đo 50 µm.

Ảnh chụp ở độ phóng đại 200 lần.

Các tumosphere sau 7 ngày nuôi cấy có đường kính từ 100 - 300µm. Đây

là tiền đề quan trọng để chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo là xử lý các

tumorsphere với dịch chiết Lá khôi trước khi tiến hành phân tích ảnh hưởng

của dịch chiết lên chu kỳ tế bào và sự biểu hiện của các gen quan tâm.

3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên số lượng và kích thước các

tumorsphere

Để khẳng định được ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự phát triển

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

của các tumorsphere. Xử lý các tumorsphere sau 5 ngày nuôi cấy với dịch

chiết Lá khôi ở nồng độ 75µg/ml, thời gian xử lý 48h. Đây là nồng độ tương

ứng với giá trị IC50 của dịch chiết Lá khôi đã được chỉ ra trong một nghiên

cứu trước đó khi đánh giá độc tính của dịch chiết Lá khôi bằng ethanol lên tế

bào MKN45 trong điều kiện nuôi cấy 2D [7]. Kết quả chụp ảnh và đo, đếm số

lượng tumorsphere dưới kính hiển soi ngược thể hiện trong hình 3.4.

Hình 3.4. Dịch chiết Lá khôi tác động lên khả năng hình thành tumorsphere

và kích thước của tumorsphere. Thang đo 50 µm. Tumorsphere được đếm và

đo kích thước ở ngày thứ 5 của quá trình nuôi cấy

Kết quả xử lí các tumorsphere với dịch chiết Lá khôi trong hình 3.4 cho

thấy, dịch chiết Lá khôi ở nồng độ 75µg/ml đã làm giảm mạnh số lượng

tumorsphere cũng như kích thước các tumorsphere. Cụ thể so với mẫu đối

chứng sau 48h xử lý, số lượng các khối cầu giảm 50%, kích thước các khối

cầu cũng giảm khoảng 80% so với mẫu đối chứng. Thêm vào đó, hình thái

tumorsphere ở mẫu xử lý đã bị biến đổi mạnh, các khối cầu bị phân rã thành

các tế bào đơn. Điều này cũng đồng nghĩa là khi xử lý với dịch chiết Lá khôi

đã thay đổi đặc tính phân chia, tăng sinh của tế bào trong các tumorsphere.

Như vậy, dịch chiết Lá khôi đã tác động rõ rệt lên sự sinh trưởng và phát triển

của các tumorsphere.

3.5. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên chu kỳ tế bào

Để thực hiện mục tiêu trọng tâm của đề tài là đánh giá sự tác động của

dịch chiết Lá khôi lên các pha của chu kỳ tế bào ung thư dạ dày. Các

tumorsphere sau 48h xử lý với dịch chiết Lá khôi ở nồng độ 75µg/ml được

thu nhận và phân tách thành các tế bào đơn, sau đó phân tích chu kỳ tế bào

bằng hệ thống Flow cytometry. Kết quả phân tích chu kỳ tế bào được trình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

bày trong hình 3.5 dưới đây.

Kết quả hình 3.5 chỉ ra rằng, dòng tế bào MKN45 được xử lý với dịch

chiết Lá khôi có sự tích lũy cao các tế bào tại pha G0/ G1. Dòng tế bào ung thư

này sau khi được xử lý với dịch chiết Lá khôi đã giảm mạnh ở pha S và pha

G2/M nhưng lại có tăng tỷ lệ các tế bào phase G0/ G1 lên tới 63,3% so với đối

chứng là 46,7%. Như vậy, sự ức chế phân chia tế bào của dòng tế bào

MKN45 có thể được giải thích bởi sự dừng chu kỳ tế bào ở pha G0/ G1 – pha

nghỉ giữa 2 lần phân chia tế bào. Pha này đặc trưng cho các tế bào ở trạng thái

biệt hóa hoặc lão hóa. Rất có thể dịch chiết Lá khôi đã cảm ứng quá trình già

hóa, biệt hóa tế bào gốc ung thư dạ dày và làm dừng sự tăng trưởng của tế bào

ung thư MKN45.

Hình 3.5. Dịch chiết Lá khôi tác động lên chu kỳ tế bào của tế bào trong các

tumorsphere. Thang đo 50 µm

Năm 2014, Aeyung Kim và cộng sự cũng nghiên cứu về ảnh hưởng của

KIOM-C (là hợp chất chiết xuất từ các cây thuốc thảo dược bao gồm: Radix

Scutellariae, Radix Glycyrrhizae, Radix Paeoniae alba, Radix Angelicae

gigantis, Grandiflorum, Zingiber officinale và Lonicera japonica) đến khả

năng gây chết tế bào ung thư và làm sáng tỏ các cơ chế chống ung thư tiềm

ẩn. Phân tích chu trình tế bào cho thấy, xử lý KIOM-C trong 12h và 24h đã

tăng tỷ lệ tế bào trong pha G1 lên 57,14 và 55,53%, so với tế bào đối chứng

không được xử lý (36,69%). Sự tăng pha G1 này đi kèm với sự giảm tương

ứng tỷ lệ các tế bào trong các pha S và G2/M. Phân nhóm apoptotic G0/G1

đỉnh đã tăng đáng kể khi xử lý bằng KIOM-C lên 7,92 và 13,96% sau khi ủ

12h và 24h so với các tế bào đối chứng (3,24%), cho thấy việc ngừng chu kỳ

tế bào G1 do KIOM-C gây ra đã làm chậm quá trình tăng trưởng và sau đó

gây ra quá trình apoptosis [15]. Năm 2016, tác giả JIN ZHOU và cộng sự

cũng nghiên cứu về tác dụng của hợp chất Quercetin, là một hợp chất tự nhiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

có nguồn gốc từ thực vật lên các tế bào HepG2 bằng cách cho các tế bào

HepG2 được xử lý với 50 Quercetin trong 24h, 48h hoặc 72h và phân tích chu

kỳ tế bào bằng phương pháp Flow cytometry. Kết quả, chu kỳ tế bào của

HepG2 đã thay đổi đáng kể sau khi xử lý với nồng độ Quercetin phù hợp; tỷ

lệ tế bào trong pha G0/G1 tăng lên và những tế bào trong pha S giảm dần so

với các tế bào HepG2 đối chứng. Như vậy, Quercetin có thể gây ra sự dừng

pha G1 trong các tế bào HepG2. Dựa trên các quan sát đã nói ở trên, người ta

cho rằng Quercetin thực hiện hoạt động chống ung thư trong các tế bào

HepG2 thông qua nhiều con đường, bao gồm can thiệp vào biểu hiện gen

CCND1 để phá vỡ chu kỳ tế bào và tăng sinh của tế bào HepG2 [37]. Gần

đây, tác giả Ho Jeong Lee và cộng sự đã nghiên cứu Pectolinarigenin, một

flavonoid tự nhiên có trong Cirsium chanroenicum. Trong nghiên cứu này đã

chỉ ra cơ chế chống ung thư của Pectolinarigenin là làm chết tế bào gây ra bởi

bệnh autophagy và apoptosis trong tế bào ung thư dạ dày AGS và MKN28 ở

người. Hơn nữa, việc xử lý Pectolinarigenin đã làm giảm tỷ lệ phần trăm của

pha G1 và tăng các tế bào pha G1 và G2/M. Nghiên cứu này đã làm sáng tỏ cơ

chế chống ung thư mới của PEC đối với dòng tế bào ung thư dạ dày AGS và

MKN28 ở người bằng việc làm dừng pha G2/M, quá trình apoptosis trong in

vitro [34].

AG36 là sản phẩm biến đổi sinh học của Triterpenoid saponin từ cây

Lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf). AG36 làm giảm sự biểu hiện protein của

các protein quy định chu kỳ cyclin B1 hoặc cyclin D1. Trong các tế bào

MCF-7 và MDA-MB-231, AG36 đã tăng cường biểu hiện protein caspase-3

và caspase-8, trong khi đó ở các tế bào SK-BR-3, AG36 chỉ làm tăng sự biểu

hiện protein của caspase-3. Các nghiên cứu in vivo cho thấy, AG36 ức chế

đáng kể sự phát triển của khối u xenograft MCF-7 ở chuột nhắt BALB/c so

với mẫu đối chứng [51].

3.6. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA

Để đánh giá tác động của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu hiện của các gen

kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày. RNA tổng số từ các tế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

bào đối chứng không xử lý với dịch chiết Lá khôi và tế bào xử lý với dịch

chiết Lá khôi đã được tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp Trizol. Kết

quả tách chiết được biểu thị trong hình 3.6.

RNA tổng số được tách chiết từ các tế bào ung thư dạ dày thu nhận sau

quá trình nuôi cấy được định lượng bằng máy đo quang phổ NanoDrop ở

bước sóng hấp thụ 260 nm đối với acid nucleic và bước sóng hấp thụ 280nm

đối với protein. Kết quả được thể hiện ở hình 3.6 và bảng 3.1.

Hình 3.6. Phổ hấp thụ của RNA tổng số tách chiết từ các tumorsphere

Bảng 3.1. Nồng độ RNA từ mẫu đối chứng và mẫu xử lý

Kết quả trong hình 3.6 và bảng 3.1 cho thấy, phổ hấp thụ huỳnh quang

của các mẫu RNA tổng số đã cho thấy, RNA thu được có độ tinh sạch cao, thể

hiện qua giá trị 260/280 của tất cả các mẫu đối chứng (Control) và mẫu xử lý

với dịch chiết Lá khôi (LK 75µg/ml từ 1-3) đều trong khoảng từ 1,87 – 1,94

đáp ứng tốt cho các phản ứng PCR. Hơn nữa, RNA của các mẫu thu được đều

có hàm lượng cao thể hiện ở hàm lượng từ 212,7 đến 560,4ng/µl. Từ nồng độ

này, qua tính toán chúng tôi đã sử dụng lượng RNA là 1µg để tổng hợp lên

cDNA phục vụ cho phân tích Realtime-PCR trong các nghiên cứu tiếp theo.

3.7. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen của tế bào gốc ung thư

Như đã giới thiệu trong phần tổng quan, trong quần thể tế bào ung thư,

các tế bào gốc có chức năng phân chia, tăng sinh và biệt hóa tế bào. Chính vì

vậy, trước khi tiến hành đánh giá tác động của dịch chiết Lá khôi lên chu kỳ

tế bào, chúng tôi đánh giá ảnh hưởng của nó lên các gen đặc trưng của tế bào

gốc ung thư dạ dày. Các gen được lựa chọn để phân tích là các gen marker tế

bào gốc (CD44 và ALDH) và gen tự làm mới tế bào (SOX2). Kết quả phân

tích biểu hiện gen bằng Realtime PCR được trình bày trong hình 3.7.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.7. Dịch chiết Lá khôi tác động lên sự biểu hiện các gen mã hóa cho

marker tế bào gốc (CD44 và ALDH) và gen tự làm mới tế bào (SOX2)

Quan sát hình 3.7 cho thấy rằng, dịch chiết Lá khôi đã làm giảm rõ rệt mức

độ biểu hiện của CD44 và SOX2. Trong đó, mức độ giảm biểu hiện mạnh nhất

là ở gen SOX2 với mức giảm thiểu khoảng 50%, sau đó đến CD44 mức độ biểu

hiện giảm khoảng 30%. Tuy nhiên, gen ALDH không có sự thay đổi rõ rệt về

mức độ biểu hiện mRNA giữa các tế bào MKN45 xử lý với dịch chiết Lá khôi

và mẫu đối chứng được xử lý với DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian tương

ứng.

CD44 là một phân tử bề mặt tế bào đa cấu trúc và đa chức năng liên quan

đến sự tăng sinh tế bào, biệt hóa tế bào, di chuyển tế bào, tạo mạch… [60]. Năm

2015, Anasuya Ray và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động ức chế của hợp chất

6-shogaol có nguồn gốc từ Gừng (Zingiber officinale) chống lại các tế bào ung

thư vú và nhận thấy rằng, 6-shogaol có hiệu quả trong việc tiêu diệt cả tế bào

đơn nhân ung thư vú. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang đã cho thấy, sau khi

được xử lý với 6-shogaol biểu hiện của CD44 cao hơn đáng kể với các tế bào

MCF-7 không được xử lý với 6-shogaol. Đồng thời, phân tích Flow cytometry

cũng cho thấy, CD44 tăng cao trong các tế bào hình cầu so với các tế bào đối

chứng [22]. Năm 2017, hai tác giả Emika Ohkoshi và Naoki Umemura đã

nghiên cứu về Baicalein - một trong những thành phần chính trong rễ cây

Scutellaria. Họ đã kiểm tra xem các thành phần thuốc thảo dược có ảnh hưởng

đến biểu hiện CD44 và gây ra apoptosis tế bào ung thư như thế nào. Kết quả là

Baicalin tăng cường apoptosis không ảnh hưởng đến nồng độ CD44, trong khi

Baicalein không tăng cường apoptosis và điều hòa CD44 trong ung thư biểu mô

tế bào vảy ở đầu và cổ. Hơn nữa, Baicalein gây ra sự phosphoryl hóa CHK1, như

một dấu hiệu phản ứng phá hủy DNA đối với việc dừng pha G2/M. Kết quả này

đã chứng minh rõ ràng rằng, Baicalein tăng cường biểu hiện của CD44 và theo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

đó tăng cường phản ứng phá hủy DNA. Những dữ liệu này cho thấy rằng, cảm

ứng CD44 đã ức chế tế bào ung thư gây ra apoptosis bằng cách tăng phản ứng

phá hủy DNA [27]. Gần đây, Daliang Chen và cộng sự cũng đã nghiên cứu tác

động của Galangin (3,5,7 trihydroxyflavone), một loại flavonoid tự nhiên có

trong thực vật có thể ức chế EMT, sự hình thành mạch và biểu hiện CD44 trong

bệnh u thần kinh đệm. Họ quan sát thấy rằng, Galangin ức chế sự tăng sinh, di

cư, xâm lấn và tạo mạch của các tế bào u thần kinh đệm bằng cách phụ thuộc

vào liều lượng, ức chế sự biểu hiện của CD44 và ức chế sự hình thành mạch của

các tế bào glioma thông qua yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu. Ngoài ra, sự

biểu hiện quá mức của CD44 trong các tế bào U87 và U251 đã xóa bỏ một phần

ảnh hưởng của Galangin đối với các tế bào u thần kinh đệm. Những kết quả này

chỉ ra rằng, Galangin là một loại thuốc mới tiềm năng để điều trị u nguyên bào

thần kinh đệm do khả năng ức chế CD44, EMT và sự hình thành mạch. Kết quả

này cũng chứng minh rằng, Galangin giảm mức độ mRNA và protein của CD44,

Snail, vimentin và ZEB1 [24].

SOX2 là một yếu tố phiên mã rất cần thiết để duy trì khả năng tự đổi mới,

hoặc đa năng của các tế bào gốc phôi không biệt hoá. SOX2 có vai trò quan

trọng trong việc duy trì tế bào gốc phôi và tế bào thần kinh [32]. Năm 2016,

Zhang và cộng sự đã nghiên cứu về Cryptotanshinone (CT), một loại thuốc thảo

dược truyền thống của Trung Quốc. Kết quả chứng minh rằng, sử dụng CT làm

thay đổi sự tăng sinh tế bào, tình trạng chu kỳ tế bào, di cư, khả năng sống, sự

hình thành khuẩn lạc và đáng chú ý là sự hình thành khối cầu và điều chỉnh giảm

các gen (Nanog, OCT4, SOX2, β-catenin, CXCR4). Cụ thể là CT làm giảm mức

độ biểu hiện của một số gen nhất định trong tế bào, đặc biệt là biểu hiện của

Nanog, BMI1 và catenin. Mức giảm mRNA đáng kể về mặt thống kê đã được

quan sát ở 5 nhóm điều trị CT. Điều trị CT làm giảm mức độ biểu hiện protein

Nanog, SOX2 và OCT4 bằng cách phụ thuộc vào tổng số tế bào và các tế bào

hình cầu [85]. Năm 2018, Zhen-Fei Wang và cộng sự đã nghiên cứu tác động

của Astragaloside IV (được phân lập từ Radix Astragali là một loại thảo dược

quan trọng của Trung Quốc) và đưa ra kết luận rằng, Astragaloside IV ngăn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ngừa GCAFs, điều chỉnh tăng các yếu tố gây ung thư SOX2 và NANOG trong

các tế bào ung thư dạ dày [86]. Năm 2018, Lan Thị Hạnh Phi và cộng sự đã

nghiên cứu tác động của hợp chất Ginsenoside Rb2, một saponin từ Nhân sâm

Panax lên tế bào ung thư đại trực tràng. Kết quả cho thấy rằng, Ginsenoside Rb2

đã ức chế đáng kể biểu hiện của SOX2. Những kết quả này cho thấy,

Ginsenoside Rb2 ức chế các đặc tính giống như tế bào gốc thông qua SOX2.

Đặc biệt, chứng minh rằng việc kích hoạt EGFR gây ra biểu hiện SOX2 và

ngược lại, SOX2 liên kết với EGFR làm tăng mức độ biểu hiện EGFR và do đó,

hình thành mối quan hệ phản hồi tích cực giữa EGFR và SOX2 [50].

ALDH là một marker của tế bào gốc ung thư trong nhiều typ ung thư

khác nhau như: ung thư ruột, ung thư buồng trứng, ung thư gan. Một nghiên

cứu gần đây của Nguyễn Phú Hùng và cs tại đã xác định ALDH là một

marker đặc trưng của tế bào gốc ung thư dạ dày [6]. Tetrandrine là một

alcaloid bcdenzylisoquinoline được tìm thấy trong Stephania tetrandra. Hợp

chất này đã được tác giả Wei Xu và cộng sự nghiên cứu tác động của nó lên tế

bào ung thư vú năm 2011 và đã kết luận rằng, Tetrandrine làm giảm số lượng

ALDH+. Điều này có nghĩa là Tetrandrine ức chế các tế bào dương tính với

ALDH ở nồng độ tương tự [81]. Năm 2012, Qing-An Jia và cộng sự đã

nghiên cứu về tác động của hợp chất Songyou Yin (một loại thuốc truyền

thống của Trung Quốc) lên ung thư biểu mô tế bào gan và đã cho kết luận

rằng, Songyou Yin làm giảm biểu hiện của CD90, ABCG2, ALDH, CD44,

EPCAM, vimentin và MMP-9 và tăng biểu hiện của E-cadherin, trong các tế

bào ung thư biểu mô tế bào gan sau khi điều trị kết hợp [66].

Kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng, dịch chiết Lá khôi đã tác động là

giảm sự biểu hiện của 2 trong số 3 gen chủ chốt của tế bào gốc ung thư được

phân tích.

3.8. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen kiểm soát chu kỳ tế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

bào

Để nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên các gen kiểm soát

chu kỳ tế bào. Chúng tôi tiến hành phân tích ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi

lên sự phiên mã của 5 gen kiểm soát chu kỳ tế bào chính gồm: P21, P27,

CCND1, CCNE1, PCNA. Các phản ứng PCR đã được thực hiện với các cặp

mồi đặc hiệu tương ứng với 5 gen do Quiagene cung cấp. Kết quả biểu hiện

gen giữa các mẫu đối chứng và mẫu được xử lý với dịch chiết Lá khôi được

trình bày dưới dạng biểu đồ ở hình 3.8. Kết quả phân tích ở biểu đồ hình 3.8

cho thấy, sau khi xử lí với dịch chiết Lá khôi, các gen P21 và CCNE1 có sự

thay đổi biểu hiện ở mức độ phiên mã. Ngược lại, các gen P27, CDND1,

PCNA không có sự thay đổi đáng kể.

Hình 3.8. Dịch chiết Lá khôi tác động lên các gen kiểm soát chu kỳ phân chia

của tế bào

Trong nghiên cứu này, hai gen P21 và CCNE1 được chúng tôi lựa chọn để

nghiên cứu sự ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu hiện gen ở mức độ

phiên mã. Nhìn vào kết quả ở hình 3.8 ta thấy, dưới tác dụng của dịch chiết Lá

khôi mức độ biểu hiện mRNA của P21 tăng mạnh khoảng 5 lần so với mẫu đối

chứng. Kết quả phân tích cũng cho thấy, sự biểu hiện của gen CCNE1 ở mức

độ phiên mã bị giảm đi đáng kể khi chịu tác động của dịch chiết Lá khôi.

CCNE1 là gen mã hóa cho protein Cyclin-E1 đặc hiệu G1/S [46]. Trước đó, các

nghiên cứu khác nhau đã đề cập đến khả năng áp chế sự biểu hiện của P21 và

các một số gen kiểm soát chu kỳ tế bào của một số hợp chất từ thực vật. Điển

hình như, E-Chu Huang và cộng sự đã nghiên cứu tác động của Zyflamend,

một hỗn hợp chiết xuất của 10 loại thảo dược lên tế bào ung thư tuyến tiền liệt.

Kết quả cho thấy, Zyflamend đã cảm ứng của các chất ức chế chu kỳ tế bào

P21 ở mức độ mRNA và protein. Kết quả là, trong các tế bào CWR22Rv1,

Zyflamend làm cho nồng độ protein của P21 tăng gấp 2,4 lần so với đối

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chứng [25]. Cùng năm 2014, tác giả Ruowen Zhang và cộng sự đã thực hiện

nghiên cứu về tác động của Yuanhuacine (YHL-14), thành phần chính của

daphnane diterpene ester phân lập từ nụ hoa của Daphne genkwa. Việc tác

động các tế bào bằng YHL-14 không gây ra hiệu quả rõ rệt đối với quá trình

apoptosis của tế bào, nhưng nó đã gây ra sự dừng pha G2/M ở cả tế bào T24T

và HCT116, cho thấy rằng dừng pha G2/M có thể liên quan đến hiệu ứng chống

ung thư của YHL-14. Do P21 là chất ức chế chu kỳ tế bào quan trọng liên quan

đến điều hòa chu kỳ tế bào, nên tác dụng của YHL-14 đối với biểu hiện P21 và

biểu hiện của yếu tố phiên mã ngược dòng của nó được đánh giá trong cả tế

bào T24T và HCT116. Kết quả sau khi xử lý bằng YHL-14 trong 12h, biểu

hiện protein P21 được điều chỉnh tăng đáng kể ở cả tế bào T24T và HCT116

[69]. Năm 2017, tác giả Hyun-Woo Lee và cộng sự đã chứng minh tác dụng

của Celastrol, một triterpene được chiết xuất từ vỏ rễ của từ rễ

cây Trypterigium wilfordii đối với bệnh ung thư dạ dày. Kết quả cho thấy, sự

biểu hiện của các protein liên quan đến chu trình tế bào, như P21 và P27 đã

tăng lên rõ rệt và biểu hiện của cyclin D1 đã giảm khi tác động bằng celastrol

từ nồng độ 0,25 μM đến 1 μM [35]. Cũng trong năm 2017, Bing Hu và cộng sự

đã tìm hiểu về hợp chất Teng-Long-Bu-Zhong-Tang là một công thức thảo

dược của Trung Quốc để điều trị ung thư biểu mô đại trực tràng. Teng-Long-

Bu-Zhong-Tang có hiệu quả gây ra lão hóa tế bào trong ung thư biểu mô đại

trực tràng, kèm theo sự điều hòa P21. Trong nghiên cứu này, tác giả đã đánh

giá liệu sự lão hóa tế bào do Teng-Long-Bu-Zhong-Tang có liên quan đến P21

hay không, phân tích P21 bởi siRNA cụ thể đã loại bỏ đáng kể sự lão hóa tế

bào do Teng-Long-Bu-Zhong-Tang gây ra. Những quan sát này cho thấy sự lão

hóa tế bào do Teng-Long-Bu-Zhong-Tang gây ra phụ thuộc vào P21. Sự biểu

hiện P21 đã giảm đi bằng cách can thiệp RNA và làm suy giảm đáng kể sự lão

hóa tế bào do Teng-Long-Bu-Zhong-Tang gây ra trong các tế bào ung thư đại

trực tràng LS174T ở người [19].

Trong nghiên cứu này, kết quả phân tích cho thấy, sự biểu hiện ở mức độ

phiên mã của các gen P27, CCND1, PCNA không chịu ảnh hưởng của dịch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chiết Lá khôi. P27 được coi là một chất ức chế khối u vì chức năng của nó

như là một bộ điều chỉnh chu kỳ tế bào. Trong các bệnh ung thư, P27 thường

bị bất hoạt thông bị suy yếu hoặc sai lệch vị trí [23]. Năm 2013, Aeyung

Kim và cộng sự đã nghiên cứu về tác động của Samsoeum (SSE), một công

thức thảo dược truyền thống của Trung Quốc lên các tế bào ung thư. Trong

quá trình điều trị SSE sớm, tác giả đưa ra kết luận rằng, các tế bào đã dừng

pha G2/M đồng thời với sự điều hòa tăng của P21 và P27 và điều hòa giảm

của cyclin D1 và cyclin B1, sau đó là sự gia tăng các tế bào YO-PRO-1 (+)

apoptotic [16]. Nghiên cứu ảnh hưởng của KIOM-C đến sự biểu hiện

của protein điều hòa pha G1 của P21, P27 và cyclin D1 cho thấy điều trị

KIOM-C điều chỉnh tăng mức độ của các chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin

P21 và P27, trong khi nó điều chỉnh giảm mức độ của cyclin D1, so với các tế

bào đối chứng [15]. Trong quá trình phát triển của các khối u, cyclins loại D

đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển đổi chu kỳ tế bào. Các nghiên

cứu gần đây đã tập trung vào mối tương quan giữa CCND1 và các bệnh ác

tính, như ung thư dạ dày và ung thư vú. Những thay đổi trong biểu hiện

CCND1 đã được quan sát trong các tế bào ung thư gan sau khi điều trị bằng

Quercetin đã cho kết quả như sau, có ba peptide chứa Leu của CCND1 được

phát hiện và điểm MS là xấp xỉ 158. Mức độ biểu hiện protein trung bình của

CCND1 đã giảm xuống 0,55 sau khi điều trị bằng Quercetin. Mức độ biểu

hiện RNA và protein của CCND1 đã giảm liên tục trong các tế bào HepG2

khi tiếp xúc với 50 quercetin trong 48h [37].

3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự biểu hiện của protein P21

Sự tăng cường phiên mã của gen P21 có ý nghĩa rất quan trọng trong sự

hoạt hóa con đường tín hiệu lão hóa tế bào. Để đánh giá tác động của chiết Lá

khôi lên sự biểu hiện của P21 ở mức độ protein, chúng tôi đã sử dụng phương

pháp miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đơn dòng kháng P21. Kết quả thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

được, được trình bày trong hình 3.9.

Hình 3.9. Dịch chiết Lá khôi tác động lên sự biểu hiện của protein kiểm soát

chu kỳ tế bào P21. Mầu đỏ biểu thị sự biểu hiện của P21, mầu xanh lam biểu

thị sự biểu hiện của DAPI (thuốc nhuộm nhân tế bào)

Kết quả ở hình 3.9 đã chỉ ra rằng, P21 được biểu hiện mạnh trong nhân tế

bào MKN45 được xử lý với dịch chiết Lá khôi so với tế bào đối chứng điều

này được thể hiện qua sự bắt mầu đỏ (hoặc đen trắng ở pha contrast) với

cường độ cao ở mẫu xử lý so với mẫu đối chứng. Kết quả này khẳng định

dịch chiết Lá khôi đã điều hòa tăng mạnh các gen P21, đây là gen chủ chốt

liên quan đến quá trình lão hóa tế bào.

Năm 2014, Yim và cộng sự cũng chỉ ra rằng, việc điều trị bằng Guibi-

tang (một bài thuốc thảo dược truyền thống) đã thay đổi biểu hiện của protein

liên quan đến tiến trình pha G1. Cụ thể, biểu hiện của P21 và P27 đã tăng lên,

trong khi mức cyclin D1 bị giảm. Ngược lại, mức độ cyclin B1, điều chỉnh

pha G2/M, không bị ảnh hưởng bởi Guibi-tang [65]. CIL-102 là một hoạt chất

chính dẫn xuất alkaloid của Camptotheca acuminata cũng đã được chứng

minh rằng, CIL-102 gây ra dừng chu kỳ tế bào và apoptosis của các tế bào

ung thư ruột kết bằng cách điều chỉnh tăng biểu hiện P21 và GADD45 và

bằng cách kích hoạt JNK1/2, NFκB p50 và p300 để cung cấp một cơ chế mới

cho điều trị CIL-102 và trong việc tạo ra P21 và GADD45 cũng như sự liên

kết giảm của cdc2/cyclin B [82].

P21 giữ vai trò then chốt trong việc kiểm soát chu kỳ tế bào. Trong

nghiên cứu này chúng tôi đã chỉ ra rằng, dịch chiết Lá khôi đã làm hoạt hóa

sự biểu hiện của P21 biểu hiện tăng lên ở cả mức độ mRNA và protein của tế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

bào, dẫn tới làm dừng chu kỳ của tế bào.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN

1. Đã tiến hành thu thập mẫu lá từ cây Lá khôi, thuộc chi Ardisia họ Đơn

nem phân bố tại huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên. Đã thu được cao chiết

ethanol khô từ loài Ardisia gigantifolia với tỷ lệ 12,1%.

2. Dịch chiết Lá khôi 75µg/ml đã ức chế sự phát triển các tumorsphere

3D của các tế bào ung thư MKN45. Đã tách chiết thành công RNA tổng số từ

các tumorsphere của các tế bào MKN45 từ các tumorsphere trong điều kiện

xử lý hoặc không xử lý với dịch chiết Lá khôi với độ tinh sạch cao và hàm

lượng tốt.

3. Dịch chiết Lá khôi đã làm dừng chu kỳ tế bào ở pha G0/G1. Dịch chiết

Lá khôi đã ức chế mạnh sự biểu hiện của một số gen chủ chốt của tế bào gốc

ung thư gồm CD44 và SOX2 với mức giảm thiểu lần lượt là 30% và 50%.

Đặc biệt, dịch chiết Lá khôi đã điều hòa tăng cường sự biểu hiện của gen P21

ở cả hai mức độ mRNA và protein đồng thời làm giảm mức độ biểu hiện của

gen kiểm soát chu kỳ tế bào CCNE1.

Kết luận chung: Dịch chiết Lá khôi đã ức chế chu kỳ tế bào thông qua

điều hòa sự biểu hiện các gen kiểm soát chu kỳ tế bào và gen đặc trưng của tế

bào gốc ung thư dạ dày.

2. KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn ảnh hưởng của dịch chiết Lá khôi lên sự các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

các con đường tín hiệu của tế bào gốc ung thư dạ dày.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Quang Bộ (2017), ¨Nghiên cứu kết quả điều trị ung thư dạ dày 1/3

dưới bằng phẫu thuật triệt căn có kết hợp hóa chất¨, Luận án Tiến sĩ Y học,

Trường Đại học Y Dược Huế.

2. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 1, Nxb Khoa học và

Kỹ thuật, tr. 1276.

3. Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), Các phương pháp nghiên cứu thực vật, Nxb

Đại học Quốc gia Hà Nội.

4. Nguyễn Văn Hiếu (2010), Ung thư dạ dày, Điều trị phẫu thuật bệnh ung

thư, Nxb Y học, tr. 256-268.

5. Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2018), "Xác định tế bào gốc ung

thư dạ dày và liệu pháp trúng đích", Tạp chí Y học Việt Nam, tr. 116-125.

6. Lê Thị Thanh Hương, Lưu Thị Bình, Diệp Thị Hương Giang, Nguyễn Phú

Hùng (2018), "All trans retinoic acid ức chế sự biểu hiện của các gen liên

quan tới khả năng tự làm mới và con đường tín hiệu phân tử Notch của tế

bào gốc ung thư dạ dày", Tạp chí Khoa học – Đại học Quốc gia Hà Nội:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, tập 34, số 4, tr. 30-36.

7. Lê Thị Thanh Hương (2015), ¨Nghiên cứu tính đa dạng nguồn cây thuốc

được sử dụng trong cộng đồng các dân tộc ở tỉnh Thái Nguyên nhằm bảo

tồn và phát triển bền vững¨, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

8. Nguyễn Phúc Kiên (2015), ¨Đánh giá kết quả phẫu thuật ung thư dạ dày

sớm tại bệnh viện Việt Đức¨, Luận văn Bác sĩ chuyên khoa cấp II, Trường

Đại học Y Hà Nội.

9. Trần Thị Kim Liên (2002), Thực vật chí Việt Nam, tập 4, Nxb Khoa học và

Kỹ thuật.

10. Võ Duy Long (2017), ¨Đánh giá kết quả phẫu thuật nội soi điều trị ung

thư dạ dày theo giai đoạn I, II, III¨, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học

Y Dược TP. Hồ Chí Minh.

11. Lê Viết Nho (2014), ¨Nghiên cứu sự biểu lộ của EGFR, HER2 và mối liên

quan với lâm sàng, nội soi, mô bệnh học ở bệnh nhân ung thư biểu mô dạ

dày¨, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Dược Huế.

12. Lê Anh Sơn, Đỗ Thị Hà, Vũ Thị Diệp, Đậu Bá Thìn, Nguyễn Thị Thảo

(2017), "Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa và gây

độc tế bào ung thư của dịch chiết Lá khôi tía", Tạp chí Dược liệu, tập 22,

số 6, tr. 346 - 351.

13. Đặng Văn Thởi (2017), ¨Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, thương tổn và

đánh giá kết quả lâu dài phẫu thuật triệt căn ung thư phần trên dạ dày¨,

Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Dược Huế.

14. Trịnh Anh Viên (2017), ¨Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học một số loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae ở Việt Nam¨, Luận án Tiến

sĩ Hóa học, Học viện Khoa học Công nghệ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Tài liệu tiếng Anh

15. Aeyung Kim, Minju Im, Nam-Hui Yim, Taesoo Kim and Jin Yeul Ma.

(2014), "A Novel Herbal Medicine, KIOM-C, Induces Autophagic and

Apoptotic Cell Death Mediated by Activation of JNK and Reactive Oxygen

Species in HT1080 Human Fibrosarcoma Cells", PLoS One, 9 (5), pp. 98703.

16. Aeyung Kim, Nam-Hui Yim, and Jin Yeul Ma. (2013), "Samsoeum, a

traditional herbal medicine, elicits apoptotic and autophagic cell death by

inhibiting Akt/mTOR and activating the JNK pathway in cancer cells",

BMC Complement Altern Med, pp. 213: 233.

17. Ang TL, Fock KM. (2014), "Clinical epidemiology of gastric cancer",

Singapore Med J, 55 (12), pp. 621-628.

18. Anita F, Cholewa, John J, Pipoly III, Ricketson. (2009), Myrsinaceae.

Flora of North America, Vol. 8, pp. 251, 257, 258, 302, 303.

19. Bing Hu, Hong-Mei An, Shuang-Shuang Wang, Jia-Lu Zheng, Xia Yan,

Xiao-Wei Huang, and Jian-Hui Tian. (2017), “Teng-Long-Bu-Zhong-Tang

induces P21-dependent cell senescence in colorectal carcinoma LS174T

cells via histone acetylation”, J Exp Pharmacol, 9, pp. 67–72.

20. Bjerknes M1, Cheng H. (2002), "Multipotential stem cells in adult mouse

gastric epithelium", Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 283(3), pp.

767-777.

21. Cavaleiro-Pinto M, Peleteiro B, Lunet N, et al. (2011), "Helicobacter

pylori infection and gastric cardia cancer: systematic review and meta-

analysis", Cancer Causes Control, 22 (3), pp. 375-387.

22. Casamayor M, Morlock R, Maeda H, et al. (2018), "Targeted literature

review of the global burden of gastric cancer", E Cancer Medical Science,

12, pp. 883.

23. Chu IM, Hengst L, Slingerland JM. (2008), "The Cdk inhibitor P27 in

human cancer: prognostic potential and relevance to anticancer therapy",

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Nat Rev Cancer, pp. 253-267.

24. Chao Zhang, Qiang Zhu, Jianzhong Gu, Shan Chen, Qian Li, and Liping

Ying (2019), “Down-regulation of CCNE1 expression suppresses cell

proliferation and sensitizes gastric carcinoma cells to Cisplatin”, Biosci

Rep, 39(6), pp. BSR20190381.

25. E-Chu Huang, Yi Zhao, Guoxun Chen, Seung Joon Baek, Michael F

McEntee, Steven Minkin, John P Biggerstaff and Jay Whelan. (2014),

"Zyflamend, a polyherbal mixture, down regulates class I and class II

histone deacetylases and increases P21 levels in castrate-resistant prostate

cancer cells", BMC Complement Altern Med, 14, pp. 68.

26. Elledge SJ. (1996), Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis,

274(5293), pp. 1664-1672.

27. Emika Ohkoshi and Naoki Umemura. (2017), "Induced overexpression of

CD44 associated with resistance to apoptosis on DNA damage response in

human head and neck squamous cell carcinoma cells", Int J Oncol, 50(2),

pp. 387–395.

28. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. (2015), "Cancer incidence and

mortality worldwide: sources, methods and major patterns in

GLOBOCAN 2012", Int J Cancer, 136 (5), pp. E359-386.

29. Ferro A, Morais S, Rota M, et al. (2018), "Tobacco smoking and gastric

cancer: meta-analyses of published data versus pooled analyses of individual

participant data (StoP Project)", Eur J Cancer Prev, 27 (3), pp. 197-204.

30. Ferro A, Morais S, Rota M, et al. (2018), "Alcohol intake and gastric

cancer: Meta-analyses of published data versus individual participant data

pooled analyses (StoP Project)", Cancer Epidemiol, 54, pp. 125-132.

31. Gorospe M, Wang X, Holbrook N.J. (1998), "P53-dependent elevation of

P21 Wafl expression by UV light is mediated through mRNA stabilization

and involves a vanadate-sensitive regulatory system", Mol.Cell.Biol, 18,

pp. 1400-1407.

32. Graham V, Khudyakov J, Ellis P, Pevny L (August 2003). "SOX2 functions Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

to maintain neural progenitor identity". Neuron, 39 (5), pp. 749–765.

33. Harvey Lodish, Arnold Berk, S Lawrence Zipursky, Paul Matsudaira,

David Baltimore and James Darnell (2000), Molecular Cell Biology, New

York: W. H. Freeman.

34. Ho Jeong Lee, Venu Venkatarame Gowda Saralamma, Seong Min

Kim, Sang Eun Ha, Suchismita Raha, Won Sup Lee, Eun Hee Kim, Sang Joon Lee, Jeong Doo Heo, and Gon Sup Kim. (2018), "Pectolinarigenin

Induced Cell Cycle Arrest, Autophagy, and Apoptosis in Gastric Cancer

Cell via PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway", Nutrients, 10(8), pp. 1043.

35. Hyun-Woo Lee, Kenny Seung Bin Jang, Hye Ji Choi, Ara Jo, Jae-Ho

Cheong, and Kyung-Hee Chun. (2017), "Celastrol inhibits gastric cancer

growth by induction of apoptosis and autophagy", BMB Rep, 47(12), pp.

697–702.

36. Javier Sastre, Jose Angel García-Saenz, and Eduardo Díaz-Rubio. (2006),

"Treatment of stomach cancer with chemotherapy", World J

Gastroenterol, 12(2), pp. 204–213.

37. Jin Zhou, Lu Li, Li Fang, Hua Xie, Wenxiu Yao, Yiang Zhou, Zhujuan Xiong, Li Wang, Zhixi Li, and Feng Luo. (2016), "Quercetin reduces

cyclin D1 activity and induces G1 phase arrest in HepG2 cells", Oncol Lett,

12(1), pp. 516–522.

38. Karimi P, Islami F, Anandasabapathy S, et al. (2014), "Gastric cancer:

descriptive epidemiology, risk factors, screening, and prevention", Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev, 23 (5), pp. 700-713.

39. Kim H. S., Park J. W., Kwon O. K., Kim J. H., Oh S. R., Lee H. K., Bach

T. T., Quang B. H., Ahn K. S. (2014), Anti-inflammatory activity of a

methanol extract from Ardisia tinctoria on mouse macrophages and

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

pawedema. Mol Med Rep, 9(4), pp. 1388-1394.

40. Lahmidani N MEY, Nourdine Aqodad1, Dafr Allah Benajah1. (2018),

"Update on Gastric Cancer Epidemiology and Risk Factors ", Journal of

Cancer Therapy 9, pp. 242-254.

41. Li K, Dan Z, and Nie YQ. (2014), "Gastric cancer stem cells in gastric

carcinogenesis, progression, prevention and treatment", World J

Gastroenterol, 20 (18), pp. 5420-5426.

42. Lin XJ, Wang CP, Liu XD, et al. (2014), "Body mass index and risk of

gastric cancer: a meta-analysis", Jpn J Clin Oncol, 44 (9), pp. 783-791.

43. Lisa Hazard, John O’Connor, and Courtney Scaife. (2006), "Role of

radiation therapy in gastric adenocarcinoma", World J Gastroenterol,

12(10), pp. 1511–1520.

44. Lodish H, Berk A, Zipursky SL. (2000), Molecular Cell Biology, New

York: WH Freeman.

45. Lee Yeuan Ting, Dr. OonChernEin. (2017), Cancer and precision

medicine, Scientific-Malaysian.

46. Lew DJ, Dulić V, Reed SI. (1991). "Isolation of three novel human cyclins

by rescue of G1 cyclin (Cln) function in yeast". Cell, 66 (6), pp. 1197–1206.

47. Liu Yang, Dongdong Fang, Huijun Chen, Yiyu Lu, Zheng Dong, Han-Fei Ding, Qing Jing, Shi-Bing Su, and Shuang Huang. (2015), "Cyclin-

dependent kinase 2 is an ideal target for ovary tumors with elevated cyclin

E1 expression", Oncotarget, 6(25), pp. 20801–20812.

48. Liu XH, Tang DE, Dai Y, Gao XJ, Liu LX. (2019), "PCNA and GSK3β

interact with each other to regulate H1299 lung adenocarcinoma cells

apoptosis", Neoplasma, pp. 190116N48.

49. Lahmidani N MEY, Nourdine Aqodad1, Dafr Allah Benajah1. (2018),

"Update on Gastric Cancer Epidemiology and Risk Factors ", Journal of

Cancer Therapy 9, pp. 242-254.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

50. Lan Thi Hanh Phi, Yoseph Toni Wijaya, Ita Novita Sari, Ying Gui Yang,

Yun Kyung Lee, and Hyog Young Kwon. (2018), “The anti‐ metastatic

effect of ginsenoside Rb2 in colorectal cancer in an EGFR/SOX2 -

dependent manner”, Cancer Med, 7(11). pp. 5621–5631.

51. Li-Hua Mu, Yu-Ning Wang, Dong-Xiao Wang, Jing Zhang, Li Liu, Xian- Zhe Dong, Yuan Hu, and Ping Liu. (2017), “AG36 Inhibits Human Breast

Cancer Cells Proliferation by Promotion of Apoptosis In vitro and In

vivo”, Front Pharmacol, 8, pp. 15

52. Mu LH, Yan H, Wang YN, Yu TF, Liu P. (2019), “Triterpenoid Saponins

from Ardisia gigantifolia and Mechanism on Inhibiting Proliferation of

MDA-MB-231 Cells”, Biol Pharm Bull, 42(2), pp. 194-200.

53. Mu L. H., Bai L., Dong X. Z., Yan F. Q., Guo D. H., Zheng X. L., Liu P.

(2014), "Antitumor activity of triterpenoid saponin-rich Adisia gigantifolia

extract on human breast adenocarcinoma cells in vitro and in vivo", Biol

Pharm Bull, 37(6), pp. 1035-1041.

54. Mu LH, Huang XW, Guo DH, Dong XZ, Liu P. (2013), "

A new triterpenoid saponin from Ardisia gigantifolia", J Asian Nat Prod

Res, 15(10), pp. 1123-1129.

55. Mu LH, Huang CL, Zhou WB, Guo DH, Liu P. (2013), "Methanolysis of

triterpenoid saponin from Ardisia gigantifolia Stapf. and structure-activity

relationship study against cancer cells", Bioorg Med Chem Lett, 23(22),

pp. 6073-6078.

56. Mu L. H., Wei N. Y., & Liu P. (2012), “Cytotoxic triterpenoid saponins

from Ardisia gigantifolia”, Planta Med, 78(6), pp. 617-621.

57. Mu L.H., Gong Q.Q., Zhao H.X., & Liu P. (2010),"Triterpenoid saponins

from Ardisia gigantifolia", Chem Pharm Bull (Tokyo), pp. 1248-1251.

58. Mu LH, Gu YJ, Wang LH, Ma BP, Lu L, Liu P. (2015),

“Biotransformation on the triterpenoid saponin of Ardisia gigantifolia by

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Aspergillus avenaceus AS 3.4454", J Asian Nat Prod Res, 17(1), 40-46.

59. Mu LH, Gu YJ, Ma BP, Lu L, Liu P. (2015), "Two new triterpenoid

saponins obtained by microbial hydrolysis with Alternaria alternata AS

3.6872", Nat Prod Res, 29(7), pp. 638-643.

60. Naor D, Nedvetzki S, Golan I, Melnik L, Faitelson Y. (2002). "CD44 in

cancer". Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 39 (6), pp.

527–579.

61. Nguekeu Y. M., Ndontsa B. L., Mbouangouere R., Awouafack M.D., Ito

T., Tane P., Morita H. (2016), “A New Alkenylmethylresorcinol from the

Fruits of Ardisia kivuensis, Nat Prod Commun”, 11(5), pp. 661-662.

62. Nguyen PH, Giraud J, Staedel C, et al. (2016), "All-trans retinoic acid

targets gastric cancer stem cells and inhibits patient-derived gastric

carcinoma tumor growth", Oncogene, 35 (43), pp. 5619-5628.

63. Nguyen PH, Giraud J, Chambonnier L, et al. (2017), "Characterization of

Biomarkers of Tumorigenic and Chemoresistant Cancer Stem Cells in

Human Gastric Carcinoma", Clin Cancer Res, 23 (6), pp. 1586-1597.

64. N.J. Agnantis, M. Bai. (2002), Lung and Breast Carcinomas, Molecular

Genetics.

65. Nam-Hui Yim, Aeyung Kim, Chun Liang, Won-Kyung Cho, and Jin Yeul

Ma. (2014), "Guibitang, a traditional herbal medicine, induces apoptotic

death in A431 cells by regulating the activities of mitogen-activated

protein kinases", BMC Complement Altern Med, 14, pp. 344.

66. Qing-An Jia , Zheng-Gang Ren , Yang Bu , Zhi-Ming Wang , Qiang-Bo

Zhang , Lei Liang , Xue-Mei Jiang , Quan-Bao Zhang and Zhao-You

Đường. (2012), "Herbal Compound “Songyou Yin” Renders

Hepatocellular Carcinoma Sensitive to Oxaliplatin through Inhibition of

Stemness", Evid Based Complement Alternat Med, 2012, pp. 908601.

67. Reya T., Morrison S.J., Clarke M.F., Weissman I.L. (2001), "Stem cells,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cancer, and cancer stem cells", Nature, 414(6859), pp. 105-111.

68. Robbins and Cotran; Kumar, Abbas, Fausto. (2004). Pathological Basis of

Disease, Elsevier.

69. Ruowen Zhang, Yulei Wang, Jingxia Li, Honglei Jin, Shaojiang Song,

and Chuanshu Huang. (2014), "The Chinese Herb Isolate Yuanhuacine

(YHL-14) Induces G2/M Arrest in Human Cancer Cells by Up-regulating

P21 Protein Expression through an P53 Protein-independent Cascade", J

Biol Chem, 289(10), pp. 6394–6403.

70. Sierra MS, Cueva P, Bravo LE, et al. (2016), "Stomach cancer burden in

Central and South America", Cancer Epidemiol, 44 Suppl 1, pp. S62-S73.

71. Shree Ram Singh. (2013), " Gastric cancer stem cells: A novel therapeutic

target", Cancer Lett, 338(1), pp. 110–119.

72. Tarek Abbas and Anindya Dutta. (2009), "P21 in cancer: intricate

networks and multiple activities", Nat Rev Cancer, pp. 400–414.

73. Totey S, Totey S, Pal R, Pal R. (2009), "Adult stem cells: a clinical

update", J Stem Cells, 4(2), pp. 105-121.

74. Uthman OA, Jadidi E, and Moradi T. (2013), "Socioeconomic position

and incidence of gastric cancer: a systematic review and meta-analysis", J

Epidemiol Community Health, 67 (10), pp. 854-860.

75. Vermeersch M., Foubert K., da Luz R. I., Van Puyvelde L., Pieters L.,

Cos P., Maes L. (2009), “Selective antileishmania activity of 13,28-epoxy-

oleanane and related triterpene saponins from the plant families

Myrsinaceae, Primulaceae, Aceraceae and Icacinaceae”. Phytother Res,

23, pp. 1404–1410.

76. Vinay Kumar Abul Abbas Nelson Fausto Jon Aster (2009), Robbins and

Cotran Pathologic Basis of Disease, eBook ISBN.

77. Victoria J. Gennaro, Timothy J. Stanek, Amy R. Peck, Yunguang Sun,

Feng Wang, Shuo Qie, Karen E. Knudsen, Hallgeir Rui, Tauseef Butt, J.

Alan Diehl, and Steven B. McMahon. (2018), "Control of CCND1

ubiquitylation by the catalytic SAGA subunit USP22 is essential for cell Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cycle progression through G1 in cancer cells", Proc Natl Acad Sci U S A,

115(40), pp. E9298–E9307.

78. WHO (2018), "Cancer burden rises to 18.1 million new cases and 9.6

million cancer deaths in 2018". The Global Cancer Observatory.

79. WHO (2019), "VietNam sourcer: Globocan 2018", The Global Cancer

Observatory.

80. Wang LS, JL, ZWZ, et al. (2019), "The Chinese Society of Clinical

Oncology (CSCO): clinical guidelines for the diagnosis and treatment

of gastric cancer", Cancer Communications, 39 (10), pp. 1-31.

81. Wei Xu , Bisrat G. Debeb , Lara Lacerda , Jessica Li and Wendy A.

Woodward. (2011), "Tetrandrine, a Compound Common in Chinese

Traditional Medicine, Preferentially Kills Breast Cancer Tumor Initiating

Cells (TICs) In Vitro", Cancers (Basel), 3(2), pp. 2274–2285.

82. Wen-Shih Huang, Yi-Hung Kuo, Hsing-Chun Kuo, Meng-Chiao Hsieh, Cheng-Yi Huang, Ko-Chao Lee, Kam-Fai Lee, Chien-Heng Shen, Shui-Yi

Tung, and Chih-Chuan Teng. (2017), "CIL-102-Induced Cell Cycle Arrest

and Apoptosis in Colorectal Cancer Cells via Upregulation of P21 and

GADD45", PLoS One, 12(1), pp. e0168989.

83. Wen P, Zhang XM, Yang Z, Wang NL, Yao XS. (2008), ¨Four new

triterpenoid saponins from Ardisia gigantifolia Stapf. and their cytotoxic

activity¨, J. Asian Nat Prod Res, 10(9-10), pp. 873-880.

84. Xu L, Qu YH, Chu XD, et al. (2015), "Urinary levels of N-nitroso

compounds in relation to risk of gastric cancer: findings from the shanghai

cohort study", PLoS One, 10 (2), pp. e0117326.

85. Ying Zhang, Stephanie M. Cabarcas, Ji zheng, Lei sun, Lesley A.

Mathews, Xiaohu Zhang, Hongsheng Lin, And William L. Farrar. (2016),

“Cryptotanshinone targets tumor-initiating cells through down-regulation

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

of stemness genes expression”, Oncol Lett, 11(6), pp. 3803–3812.

86. Zhen-Fei Wang, Da-Guang Ma, Zhe Zhu, Yong-Ping Mu, Yong-Yan

Yang, Li Feng, Hao Yang, Jun-Qing Liang, Yong-Yan Liu, Li Liu,

and Hai-Wen Lu. (2017), "Astragaloside IV inhibits pathological functions

of gastric cancer-associated fibroblasts", World J Gastroenterol, 23(48),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

pp. 8512–8525.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của dịch chiết lá khôi (Ardisia gigantifolia Stapf.) lên sự biểu hiện của các gen kiểm soát chu kỳ tế bào của tế bào gốc ung thư dạ dày

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

1. KẾT LUẬN

2. KIẾN NGHỊ

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hành vi sử dụng dịch vụ ngân hàng điện tử tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Ngoại thương Việt Nam – Chi nhánh Thủ Đức

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố tác đồng đến nợ xấu tại Ngân hàng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Chi nhánh Tiền Giang

Luận văn Thạc sĩ: Yếu tố ảnh hưởng đến quyết định sử dụng dịch vụ thanh toán không dùng tiền mặt tại Ngân hàng TMCP Công thương Việt Nam (Vietinbank)

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về du lịch biển, thực tiễn tại tỉnh Bình Định

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của các yếu tố thương hiệu với vai trò trung gian của Marketing truyền miệng đến quyết định chọn việc làm của nhân viên GenZ tại chuỗi nhà hàng gà rán Popeyes khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok