Luận văn Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:223

Thêm vào BST

Báo xấu

57
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của rễ củ hà thủ ô đỏ tạo cơ sở xây dựng quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt chất phân lập được, ứng dụng vào đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong một số mẫu dược liệu này. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội - 2021
ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Nguyễn Tiến Đạt 2. TS. Nguyễn Hải Đăng Hà Nội - 2021
iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Tiến Đạt và TS. Nguyễn Hải Đăng. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 16 tháng 02 năm 2021 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thoa
iv LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài VAST.ƯDCN.05/14- 16. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bảy tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng tới PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt và TS. Nguyễn Hải Đăng - những người thầy đã tận tâm hướng dẫn, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Hoạt chất sinh học, Trung tâm tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa sinh biển đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị tốt nhất để tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ hóa và đồng nghiệp đã giúp đỡ, luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi học tập và thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới toàn thể gia đình, bạn bè và người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Nguyễn Thị Thoa
v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iv MỤC LỤC ..................................................................................................................v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ viii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ xi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... xiii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................4 1.1. Giới thiệu chi Fallopia .....................................................................................4 1.2. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ .......................................................................5 1.3. Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ trên thế giới ................................................6 1.3.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học.....................................................6 1.3.1.1. Hợp chất stilbene ................................................................................7 1.3.1.2. Hợp chất quinone .............................................................................10 1.3.1.3. Hợp chất flavonoid ...........................................................................12 1.3.1.4. Hợp chất lipid ...................................................................................15 1.3.1.5. Một số hợp chất khác .......................................................................16 1.3.2. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học .....................................................19 1.3.3. Các nghiên cứu về khả năng gây độc gan của hà thủ ô đỏ .....................20 1.3.4. Các nghiên cứu về phân tích định tính, định lượng hoạt chất của hà thủ ô đỏ .......................................................................................................................21 1.4. Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ tại Việt Nam.............................................26 1.5. Tổng quan về thẩm định phương pháp phân tích ...........................................28 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...................................................30 2.1. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................30 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................31 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất........................................................31 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ............................31 2.2.3. Phương pháp xử lí mẫu ...........................................................................32 2.2.4. Phương pháp phân tích định tính, định lượng các hợp chất....................32 2.3. Phân lập các hợp chất .....................................................................................33 2.4. Hằng số vật lí và các dữ kiện phổ của các hợp chất ......................................37 2.4.1. Hợp chất FM3 .........................................................................................37
vi 2.4.2. Hợp chất FM4 .........................................................................................37 2.4.3. Hợp chất FM1 .........................................................................................37 2.4.4. Hợp chất FM2 .........................................................................................37 2.4.5. Hợp chất FM5 .........................................................................................38 2.4.6. Hợp chất FM6 .........................................................................................38 2.4.7. Hợp chất FM7 .........................................................................................38 2.4.8. Hợp chất FM8 .........................................................................................38 2.4.9. Hợp chất FM9 .........................................................................................39 2.4.10. Hợp chất FM10 .....................................................................................39 2.4.11. Hợp chất FM11 .....................................................................................39 2.5. Kết quả thiết lập điều kiện phân tích cho hệ thống HPLC .............................39 2.5.1. Kết quả khảo sát thể tích bơm mẫu .........................................................39 2.5.2. Kết quả lựa chọn cột sắc ký ....................................................................40 2.5.3. Kết quả khảo sát bước sóng phân tích ....................................................40 2.5.4. Kết quả khảo sát pha động ......................................................................42 2.5.5. Kết quả khảo sát thời gian lưu và độ tinh khiết của các chất tham chiếu ...........................................................................................................................43 2.5.6. Kết quả khảo sát hệ thống LC/MS ..........................................................45 2.6. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng ...................................................46 2.7. Quy trình xử lí mẫu phân tích ........................................................................49 2.8. Kết quả thẩm định phương pháp định tính, định lượng .................................50 2.8.1. Kết quả xác định tính chọn lọc của phương pháp ...................................50 2.8.2. Kết quả xác định LOD, LOQ ..................................................................50 2.8.3. Kết quả xác định độ chụm.......................................................................51 2.8.3.1. Kết quả xác định độ lặp....................................................................51 2.8.3.2. Kết quả xác định độ tái lặp...............................................................57 2.8.4. Kết quả xác định độ đúng .......................................................................60 2.9. Kết quả phân tích mẫu....................................................................................65 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ................................................................71 3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ hà thủ ô đỏ ................................71 3.1.1. Hợp chất FM3 .........................................................................................71 3.1.2. Hợp chất FM4 .........................................................................................78 3.1.3. Hợp chất FM1 .........................................................................................85 3.1.4. Hợp chất FM2 .........................................................................................86
vii 3.1.5. Hợp chất FM5 .........................................................................................89 3.1.6. Hợp chất FM6 .........................................................................................91 3.1.7. Hợp chất FM7 .........................................................................................93 3.1.8. Hợp chất FM8 .........................................................................................95 3.1.9. Hợp chất FM9 .........................................................................................97 3.1.10. Hợp chất FM10 .....................................................................................99 3.1.11. Hợp chất FM11 ...................................................................................101 3.2. Thiết lập quy trình định tính, định lượng hoạt chất trong hà thủ ô đỏ .........104 3.4. Hàm lượng hoạt chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ .......................................109 3.4.1. Sắc ký đồ DAD 280 nm của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ...........................109 3.4.2. Sắc ký đồ DAD 320 nm của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ...........................111 3.4.3. Sắc ký đồ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang ...........................................113 3.4.4. Kết quả phân tích 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ............................................114 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................120 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ....................................................121 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................... Error! Bookmark not defined.
viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 1 H-NMR Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ proton resonance spectroscopy 13 C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ carbon-13 resonance spectroscopy AOAC Association of Official Hiệp hội các nhà hóa phân Analytical Chemists tích chính thức ASTM American Society for Testing Hiệp hội xét nghiệm nguyên of Materials vật liệu Mỹ CC Column chromatography Sắc ký cột CL Chemiluminescence Phổ phát quang hóa 1 COSY H-1H Correlation Phổ COSY spectroscopy DAD Diod array detector Detector mảng diode DEPT Distortionless enhancement Phổ DEPT by polarisation transfer DMSO Dimethylsulfoxide (CH3)2SO EC50 Half maximal effective Nồng độ hiệu quả trung bình concentration ESI-MS Electron spray ionization Phổ khối lượng phun mù điện mass spectrum tử GI50 The average growth inhibition Ức chế tăng trưởng trung bình of 50% 50% HPLC High performance liquid Sắc kí lỏng hiệu năng cao chromatography
ix HR-MS High resolution - mass Phổ khối lượng phân giải cao spectrum HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ HMBC connectivity HSQC Heteronuclear single-quantum Phổ HSQC coherence IC50 Inhibitory concentration at Nồng độ ức chế 50% đối 50% tượng thử nghiệm ICH International Conference on Hội đồng hòa hợp quốc tế Harmonization ISO International Standard Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế Organization LC/MS Liquid chromatography Sắc ký lỏng khối phổ mass spectrometry LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú ở người MS Mass spectrum Phổ khối lượng NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân spectroscopy NOESY Nuclear overhauser Phổ NOESY enhancement spectroscopy PAD Photodiode array detection Detector mảng diode RP Reverse phase Pha đảo RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
x S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SW620 Ung thư ruột kết TCVN - Tiêu chuẩn Việt Nam THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene- - 2-O-β-D-glucoside TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethyl silan (CH3)4Si UPLC Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng chromatography UHPLC-MS/MS Ultra high performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng chromatography-mass cao kết nối hai lần khối phổ spectrum/mass spectrum USFDA United States Food and Cục dược phẩm và thực phẩm Drug Administration Mỹ USP United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ UV Ultraviolet Tử ngoại YMC-RP YMC-reversed phase Pha đảo YMC
xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất stilbene phân lập từ hà thủ ô đỏ ............................................7 Bảng 1.2. Các hợp chất quinone phân lập từ hà thủ ô đỏ .........................................10 Bảng 1.3. Các hợp chất flavonoid phân lập từ hà thủ ô đỏ .......................................13 Bảng 1.4. Các hợp chất lipid phân lập từ hà thủ ô đỏ ...............................................15 Bảng 1.5. Một số hợp chất khác phân lập từ hà thủ ô đỏ ..........................................16 Bảng 1.6. Điều kiện chiết và chỉ tiêu định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ ở một số Dược điển ..............................................................................................25 Bảng 2.1. Bảng thông tin nguồn gốc và ký hiệu mẫu nghiên cứu ............................30 Bảng 2.2. Bước sóng hấp thụ cực đại của các chất tham chiếu ................................42 Bảng 2.3. Kết quả thời gian lưu và độ tinh khiết các chất tham chiếu .....................45 Bảng 2.4. Pic ion giả phân tử giả phân tử và thời gian lưu các chất tham chiếu trên hệ thống LC/MS ........................................................................................................45 Bảng 2.5. Bảng nồng độ dung dịch lập đường chuẩn định lượng.............................46 Bảng 2.6. Kết quả phương trình đường chuẩn định lượng bảy hợp chất ..................49 Bảng 2.7. Kết quả xác định LOD và LOQ ................................................................51 Bảng 2.8. Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM2) ........................52 Bảng 2.9. Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM4) ........................54 Bảng 2.10. Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM5) ......................54 Bảng 2.11. Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM3) ......................55 Bảng 2.12. Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM8) ......................55 Bảng 2.13. Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM6) ......................56 Bảng 2.14. Kết quả xác định độ lặp của phương pháp (đối với FM1) ......................56 Bảng 2.15. Kết quả xác định độ tái lặp của phương pháp ........................................58 Bảng 2.16. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM2 .....................61 Bảng 2.17. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM4 .....................61 Bảng 2.18. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM5 .....................62 Bảng 2.19. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM3 .....................62 Bảng 2.20. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM8 .....................63 Bảng 2.21. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM6 .....................63 Bảng 2.22. Kết quả xác định độ thu hồi trên mẫu thực hợp chất FM1 .....................64
xii Bảng 2.23. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM2 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............66 Bảng 2.24. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM4 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............66 Bảng 2.25. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM5 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............67 Bảng 2.26. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM3 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............68 Bảng 2.27. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM8 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............68 Bảng 2.28. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM6 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............69 Bảng 2.29. Hàm lượng (mg/g) hoạt chất FM1 trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ.............70 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM3 và hợp chất tham khảo ..................77 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM4 và hợp chất tham khảo ..................83 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM1 và hợp chất tham khảo ..................86 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM2 và hợp chất tham khảo ..................88 Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM5 và hợp chất tham khảo ..................90 Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM6 và hợp chất tham khảo ..................92 Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM7 và hợp chất tham khảo ..................93 Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM8 và hợp chất tham khảo ..................96 Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM9 và hợp chất tham khảo ..................98 Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM10 và hợp chất tham khảo ..............99 Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM11 và hợp chất tham khảo ............102 Bảng 3.12. Hàm lượng các hoạt chất trong 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ (mg/g) ..........115
xiii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh cây, lá và hoa hà thủ ô đỏ ............................................................6 Hình 1.2. Một số chế phẩm từ hà thủ ô đỏ ................................................................26 Hình 2.1. Hà thủ ô đỏ dạng củ (a, b) và cắt lát khô (c) .............................................30 Hình 2.2. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu củ hà thủ ô đỏ .........................................33 Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn FMWC mẫu củ hà thủ ô đỏ ...35 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn ethyl acetate mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ .........36 Hình 2.5. Phổ UV của các chất tham chiếu FM1 ÷ FM6 và FM8 ............................41 Hình 2.6. Sắc ký đồ của các chất sạch tham chiếu phân lập từ rễ hà thủ ô đỏ .........44 Hình 2.7. Sắc ký đồ bảy chất tham chiếu ở bước sóng 320 nm ................................47 Hình 2.8. Sắc ký đồ bảy chất tham chiếu ở bước sóng 280nm .................................47 Hình 2.9. Đường chuẩn định lượng 7 chất tham chiếu trong hà thủ ô đỏ .................48 Hình 3.1. Phổ ESI-MS của hợp chất FM3 ................................................................71 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất FM3 ...............................................................72 Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất FM3..............................................................73 Hình 3.4. Phổ DEPT của hợp chất FM3 ...................................................................73 Hình 3.5. Phổ HSQC của hợp chất FM3 ...................................................................74 Hình 3.6. Phổ COSY của hợp chất FM3 ...................................................................75 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM3 .......75 Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất FM3..................................................................76 Hình 3.9. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất FM4 .........................................................79 Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của hợp chất FM4 .............................................................80 Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của hợp chất FM4............................................................81 Hình 3.12. Phổ DEPT của hợp chất FM4 .................................................................81 Hình 3.13. Phổ HSQC của hợp chất FM4 .................................................................82 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM4 .....82 Hình 3.15. Phổ HMBC của hợp chất FM4................................................................83 Hình 3.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất FM1 .......................................................85 Hình 3.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất FM2 .......................................................87 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM5 .....91 Hình 3.19. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM6 .....92 Hình 3.20. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM7 .....95 Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất FM8 .......................................................97
xiv Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất FM9 .......................................................98 Hình 3.23. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM10 .101 Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất FM11 ...................................................103 Hình 3.25. Cấu trúc của 11 hợp chất phân lập từ rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang .......104 Hình 3.26a. Sắc ký đồ của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ở bước sóng 280 nm ..............110 Hình 3.26b. Sắc ký đồ 3D của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ở bước sóng 280 nm ........111 Hình 3.27a. Sắc ký đồ của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ở bước sóng 320 nm ..............112 Hình 3.27b. Sắc ký đồ 3D của 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ ở bước sóng 320 nm ........113 Hình 3.28. Sắc ký đồ DAD 280 nm (A), sắc ký đồ DAD 280 nm - dãn (B) và sắc ký đồ DAD 320 nm - dãn (C) mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang ..................114
1 MỞ ĐẦU Ngày nay, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên đang có xu hướng tăng mạnh, do đó cần có biện pháp quản lý chất lượng dược liệu từ khâu nguyên liệu đến sản phẩm. Chất lượng dược liệu phần lớn phụ thuộc vào thành phần hoạt chất, những chất hoá học có hoạt tính sinh học đóng góp vào tác dụng dược lý của dược liệu đó. Có nhiều nguyên nhân có thể ảnh hưởng đến thành phần hoạt chất trong dược liệu bao gồm nguồn gốc nguyên liệu không đảm bảo; địa hình địa lí trồng trọt, thu hoạch và bảo quản dược liệu. Cũng có thể do quá trình chế biến dược liệu không đúng kỹ thuật dẫn đến mất hoạt chất hoặc biến đổi hoạt chất, từ hoạt chất có lợi thành chất gây hại cho con người. Ngoài ra, hoá chất độc hại cũng có thể được sử dụng trong bảo quản dược liệu. Thậm chí, một số dược liệu có thành phần hoạt chất thấp hoặc dược liệu giả mạo cũng được bán trên thị trường với danh nghĩa là dược liệu quý... Do vậy dược liệu nói chung cần được kiểm tra chất lượng sản phẩm đặc biệt là hàm lượng các hoạt chất có trong thành phần dược liệu nhằm đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng, bảo vệ sức khỏe con người. Hà thủ ô đỏ là một loại dược liệu phổ biến sử dụng trong chế biến thuốc đông dược. Dược liệu này được sử dụng trong các sản phẩm đông dược dùng làm thuốc bổ, nhuận tràng, trị thần kinh suy nhược, các bệnh về thần kinh, bổ máu, làm đen râu tóc... Ở Việt Nam, hà thủ ô đỏ được coi là một vị thuốc quý và an toàn do quan niệm dân gian và có nguồn gốc tự nhiên. Ngày nay, hà thủ ô đỏ đã được chế ở rất nhiều dạng khác nhau như: dược liệu miếng hà thủ ô chế, bột hà thủ ô, trà hà thủ ô, viên thuốc hà thủ ô đỏ... Các sản phẩm này được bày bán tại các hiệu thuốc tây y, hiệu thuốc đông y và có thể mua một cách dễ dàng. Điều này khẳng định dược liệu hà thủ ô đỏ đỏ được coi là sản phẩm an toàn. Tuy nhiên, trên sản phẩm, hàm lượng các hoạt chất của dược liệu được công bố không chi tiết và không có cảnh báo dùng trong bao lâu. Do vậy có thể dẫn đến hàm lượng hoạt chất không đủ để cải thiện trình trạng bệnh, hoặc tác dụng tích cực là không đáng kể. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính, quy trình phân tích định tính định lượng các hoạt chất của hà thủ ô đỏ. Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu khoa học về hà thủ ô đỏ còn khá khiêm tốn. Một số nghiên cứu
2 được tiến hành trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, song kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở phân tích định tính và định lượng một số ít hoạt chất chính của hà thủ ô đỏ đỏ. Để đánh giá đúng chất lượng của hà thủ ô đỏ, cần thiết phải xác định thành phần hóa học và thực hiện quá trình phân tích định lượng nhiều hoạt chất trong loại dược liệu này. Tuy nhiên, ở Việt Nam đến nay vẫn chưa có nhiều công trình công bố quy trình định lượng đồng thời nhiều hợp chất trong dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu hà thủ ô đỏ. Dược điển Việt Nam V chưa đưa quy trình định lượng đồng thời nhiều hoạt chất trong hà thủ ô đỏ. Sự hạn chế này một phần là do chúng ta còn thiếu các chất sạch làm chỉ thị phân tích trong khi ở một số nước khác có các ngân hàng chất sạch, có thể cung cấp phục vụ rộng rãi cho các nghiên cứu. Mặt khác, gần đây đã và đang có một số báo cáo khoa học công bố về một số tác dụng phụ có liên quan đến hà thủ ô đỏ. Các công bố này chủ yếu đưa ra các cảnh báo về các tác dụng phụ do sử dụng các chế phẩm hà thủ ô đỏ trong thời gian dài. Tuy cơ chế gây độc chưa được làm sáng tỏ nhưng đã cảnh báo rằng khi liều dùng không phù hợp sẽ gây lên những tác động xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng. Vì vậy, nhằm sử dụng dược liệu một cách an toàn và hiệu quả cần tăng cường quản lý chất lượng thông qua đánh giá hàm lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ. Để góp phần đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ trên thị trường Việt Nam, trước tiên phải xác định rõ thành phần hoá học của chúng, phân lập và xác định cấu trúc của những hoạt chất chính. Từ đó thiết lập các điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm phân tích định tính và định lượng các hoạt chất của các mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của rễ củ hà thủ ô đỏ tạo cơ sở xây dựng quy trình phân tích định tính, định lượng đồng
3 thời một số hoạt chất phân lập được, ứng dụng vào đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong một số mẫu dược liệu này. Nội dung của luận án: Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái tại Hà Giang, Việt Nam. Thiết lập một số điều kiện phân tích sắc ký HPLC trên thiết bị HPLC-DAD- MS từ chất sạch phân lập được. Lập đường chuẩn định lượng và thẩm định quy trình phân tích đã thiết lập theo tiêu chuẩn của hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức AOAC. Ứng dụng quy trình phân tích đã thiết lập phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt chất trên một số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ đang lưu hành trên thị trường Việt Nam, so sánh và đưa ra kết luận.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chi Fallopia Chi Fallopia, tên đồng nghĩa là Polygonum thuộc họ rau răm (Polygonaceae) với số lượng loài phong phú, gồm khoảng 300 loài khác nhau [1]. Các loài thuộc chi Polygonum được phân bố trên toàn thế giới, chủ yếu ở các vùng khí hậu ôn đới [2]. Chi Polygonum gồm các loài rất đa dạng, từ cây thân thảo cao dưới 5 cm đến các loại cây lâu năm thân thảo mọc thẳng cao đến 3 - 4 m, và những loại cây dây leo thân gỗ lâu năm mọc thành cây cao đến 20 - 30 m. Một số là thủy sinh, phát triển như thực vật nổi trong ao. Các lá của các loài dài khoảng 1 - 30 cm, hình dạng lá khác nhau giữa các loài từ hình mũi mác hẹp đến hình bầu dục, hình tam giác rộng, hình trái tim, hoặc các dạng đầu mũi tên. Thân cây thường có đốm đỏ hoặc hơi đỏ. Cây có hoa nhỏ, màu trắng, hồng hoặc xanh lục, xuất hiện vào mùa hè ở chùm sẫm màu từ các khớp lá hoặc ngọn thân [1]. Polygonum là chi được đánh giá là có nhiều đặc tính thú vị từ hoạt tính sinh học đến thành phần hóa học [1]. Các thành phần hóa học được công bố trong các loài thuộc chi Polygonum gồm flavonoid [3], triterpenoid [4], anthraquinone [5], coumarin [6], phenylpropanoid [7], lignan [8], sesquiterpenoid [9], stilbenoid [10], và tannin [2]. Trong số các lớp chất trên, các hợp chất flavonoid là thành phần phổ biến được tìm thấy trong các loài thuộc chi Polygonum [11]. Tuy đa dạng về loài cũng như thành phần hóa học nhưng dữ liệu công bố về cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất tinh khiết từ Polygonum còn khá khiêm tốn. Hai mươi chín loài khác nhau của chi Polygonum đã được báo cáo trong các tài liệu khoa học trong y học cổ truyền hoặc nghiên cứu hóa thực vật. Tuy nhiên, thông tin về thành phần hóa học chỉ có đối với một số ít loài. Vì vậy, nghiên cứu cấu trúc các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi Polygonum cần được quan tâm hơn. Cho đến nay nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện trên một số loài thuộc chi này. Các lớp chất phân lập được từ chi Polygonum bao gồm terpenoit, flavonoid, coumarin, axit béo, dẫn xuất axit cinnamic, steroid và ancaloit. Tuy nhiên, một số loài vẫn chưa được biết đến về mặt hóa học hoặc dược lý học như P. flaccidum, P. glabrum, P. lanatum, P.spectabile, P. stininum, P. tinctorium và P.
5 viviparum [1]. Vì vậy, trong tương lai, sẽ có nhiều nghiên cứu về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất mới từ các loài này đồng thời thu được giá trị lớn về mặt khoa học. Đồng thời, cần có những nghiên cứu chi tiết để hiểu rõ cấu trúc cũng như mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc của các hợp chất này. Về hoạt tính sinh học, một số loài thuộc chi Polygonum đã được khẳng định trong điều trị các bệnh khác nhau như trị rắn cắn, kháng viêm, chống ung thư, kháng khuẩn, chống vi rút, khử trùng, kháng nấm, điều trị bệnh tiểu đường, điều trị tăng huyết áp, tăng lipid máu, vàng da, xuất huyết, ho, sốt, loét, tình trạng da, thiếu máu, tiêu chảy và các rối loạn tiết niệu. Một số loài được dùng làm thực phẩm và thuốc đông y trong điều trị bệnh tim mạch [12], chống viêm [13], bảo vệ thần kinh [14] và giảm thiểu các quá trình sinh hóa liên quan đến thoái hóa thần kinh liên quan đến tuổi tác rối loạn như Alzheimer [15] và bệnh Parkinson [16]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều dịch chiết các loài thuộc chi Polygonum có hoạt tính gây độc tế bào, kháng u, kháng khuẩn, giảm đau, chống viêm, hạ nhiệt, lợi tiểu và tác dụng chống oxy hóa. Do đó, cần nghiên cứu về hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập được nhằm khẳng định hoạt tính là do hợp chất nào quyết định. Ngoài ra, một số chiết xuất thực vật chỉ được nghiên cứu hoạt tính sơ bộ; vì vậy, cần điều tra thêm một số hoạt tính khác để có được thông tin đầy đủ về hoạt tính các hợp chất trong mỗi loài. Qua đó, nghiên cứu thổ nhưỡng, địa lí, khí hậu... nhằm phát triển dược liệu một cách phù hợp và hiệu quả. 1.2. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ có danh pháp khoa học là Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson, tên đồng nghĩa là Polygonum multiflorum Thunb, là loài cây thân mềm, thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chướng (Caryophyllales) [17]. Một số tên gọi khác của hà thủ ô đỏ như: Địa tinh, Diệc liễm, Thủ ô, Trần tri bạch, Hồng nội tiêu, Mã can thạch, Hoàng hoa ô căn, Tiểu độc căn, Giao đằng, Dạ hợp, Dã miêu, Giao hành, Đào liễu đằng, Xích cát, Cửu chân đằng, Nhuế thảo, Xà thảo, Thân đầu thảo, Đa hoa liệu, Tử ô đằng [17, 18]. Hà thủ ô đỏ sống lâu năm, là loại cây thân mềm dạng dây leo quấn với nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, mặt thân nhẵn không có lông. Lá mọc so le, có
6 cuống dài, phiến lá hình tim hẹp, dài 4-8 cm, rộng 2,5-5 cm, đầu nhọn, phía cuống hình tim hoặc hình mũi tên, mép nguyên hoặc hơi dạng sóng, mặt trên sắc xanh thẫm, mặt dưới sắc xanh nhạt, hai mặt đều bóng láng, không có lông. Loại cây này có hoa nhỏ, đường kính khoảng 2 mm, có cuống ngắn 1-3 mm, hoa mọc thành chùm nhiều nhánh, cánh hoa màu trắng. Mùa hoa thường vào tháng 10, tháng 11 là thời kì ra quả [17]. Hình 1.1. Hình ảnh cây, lá và hoa hà thủ ô đỏ Bộ phận dùng làm dược liệu chủ yếu là rễ. Rễ củ có hình tròn hoặc hình thoi không nhất định, thường có sống lồi dọc theo củ. Mặt ngoài củ màu nâu đỏ, mặt cắt màu hồng, có bột, ở giữa thường có lõi, vị hơi đắng chát [17, 18]. Cây hà thủ ô đỏ có thể được trồng bằng cây hoặc bằng hạt. Sau khi trồng được khoảng từ 4 đến 5 năm thì có thể thu hoạch. Nên thu hoạch khi lá bắt đầu úa. Cách thu hoạch và sơ chế là đào lấy củ, cắt bỏ hai đầu, rửa sạch, củ to cắt miếng, phơi khô, sấy khô hoặc có thể đồ chín với đậu đen rồi phơi khô. Ở Việt Nam, hà thủ ô đỏ thường mọc hoang ở rừng núi, phân bố nhiều ở các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Lào Cai, Yên Bái... Hà thủ ô đỏ còn xuất hiện ở một số tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh và Tây Nguyên... [17, 19]. Hà thủ ô đỏ có nguồn gốc ở miền trung và miền nam Trung Quốc [20]. Trên thế giới, hà thủ ô đỏ phân bố nhiều nhất ở Trung Quốc, sau đó là một số nước thuộc khu vực Đông Á (như Nhật Bản) và Bắc Mỹ [20]. 1.3. Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ trên thế giới 1.3.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học Theo thống kê tài liệu [21-23], khoảng 100 hợp chất hóa học đã được phân lập từ hà thủ ô đỏ. Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính của hà thủ ô