Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ part 3

Chia sẻ: Asdfadf Adgsg | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

133
lượt xem 17
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V. cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao). Gen cần thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông thường. c. Dịch tễ của...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ part 3

19 mô. Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V. cholerae b ám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao). Gen cần thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông thường. c. Dịch tễ của sự nhiễm EPEC Cũng như những E. coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm. Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi. Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em. Người trưởng thành và trẻ em lớn có ph ần đề kháng hơn với bệnh m à nguyên nh ân có thể là do m ất các thụ thể đặc hiệu. Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu ch ảy ở người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ cao. 2.1.5.3. Nhóm ETEC a. Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là đ ộc tố ruột (enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)  Độc tố ruột enterotoxin Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột. Có hai loại: độc tố ruột ch ịu nhiệt (ST) và độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT). (1) Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT): Độc tố LT của E. coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên động vật h ay trong nuôi cấy tế b ào. LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I và LT-II không có ph ản ứng chéo về mặt miễn dịch. - LT-I: Được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. LT-I là một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành
20 vòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột (các thụ thể của LT). Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp -I) đ ầu tiên đ ược phân lập từ heo và LTh (LTh- I) được phân lập từ người. Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I n ằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen m ã hóa ST và / ho ặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA). Sau khi bám vào màng tế b ào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) trong tế b ào. cAMP ho ạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng không hoạt động th ành dạng hoạt động. Điều n ày dẫn đến sự phosphoryl những kênh chloride ho ạt động trên m ức bình thường ở m àng tế bào biểu mô. Kết quả là kích thích những tế bào mào ruột tiết ra Cl- một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl bởi những tế b ào nhung mao (villus). Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu ch ảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998). - LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đ ơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II cũng làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không liên quan đến bệnh trên người và thú. (2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST) Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai nhóm là STa và STb. Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ ch ế hoạt động. Gen m ã hóa cho cả hai nhóm đư ợc tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transp oson. Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V. cholerae không phải O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1. Trong khi đó, STb ch ỉ được tìm thấy ở ETEC. - STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử khoảng 2 kDa. STa đ ược chia th ành hai lo ại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E. coli phân lập được trên heo và STh (ST human ho ặc STIb) của E. coli phân lập trên người. Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên n gười.
21 Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C). STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, d ẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl- và / hoặc ngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đ ến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy. - STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo, vài chủng ETEC được phân lập từ n gười cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột nh ư mất tế bào nhung mao của lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Thụ thể của STb ch ưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế b ào ch ất trước khi vào bên trong tế bào. Không gây ra sự tiết Cl- n hưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-). STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội b ào mặc dù nó kích th ích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào. STb còn kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992).  Yếu tố định vị (colonization factor – CF) Cơ ch ế m à ETEC kết dính và cư trú trên lớp m àng nh ầy ruột đã được nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên ph ải kết dính vào tế b ào ruột non nhờ vào lông trên b ề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens). CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm. Có ít nhất 20 loại CF trong ETEC ở người. Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên plasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996). Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên rất mạnh. b. Dịch tễ Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch. Dịch tễ của bệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại m àng nh ầy khác nhau của từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biểu hiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt được khi liều gây nhiễm kh á cao. Ba đặc tính này tạo n ên tình trạng ô nhiễm ETEC
22 trong môi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đ ương đầu với ETEC trong thời kì thôi bú. Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ tiêu ch ảy do ETEC rất thấp. Dòng ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các trường hợp bệnh. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là những phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981). Sự nhiễm ETEC, ở những vùng d ịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước. Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những ngư ời trưởng thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm. Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gây tiêu ch ảy trên du khách trư ởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những vùng có dịch ETEC. Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách n ày có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC. Tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến thăm những nư ớc đang phát triển. Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và nư ớc uống bị ô nhiễm. c. Khía cạnh lâm sàng Triệu chứng bệnh thư ờng xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50 giờ). Bệnh nhân tiêu ch ảy to àn nước, thư ờng không có máu; một vài bệnh nhân có hiện tượng sốt và ói mửa. Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng cũng có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae. Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm cũng làm giảm mức độ tiêu ch ảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả th ì không sẵn có ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòn g ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm. Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lư ợng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy. d. Phát hiện và chẩn đoán Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST. Có nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked immun osorbent assay (ELISA), DNA-prob e, PCR… 2.2. Kỹ thuật PCR 2.2.1. Nguyên tắc
23 PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. PCR là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn (tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào). Sự khuếch đại những primer oligonucleotide. Primer là những phân tử DNA đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiện phản ứng thích hợp. Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và primer “ngược” (reverse primer). Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với sợi DNA mẫu. Những chuỗi này sẽ tồn tại d ưới dạng DNA chuỗi đôi. Sự tổng hợp n ày sẽ đ ược lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập. Multiplex – P CR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một phản ứng. Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online). 2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:  Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation) Hai m ạch của phân tử DNA tách rời nhau th ành hai m ạch đ ơn. Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao h ơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút.  Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing) Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 600C tu ỳ thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.  Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension) Nhiệt độ giai đoạn này đ ược tăng lên 720C giúp DNA polymerase ho ạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo th ành chuỗi DNA.
24 * Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ đ ược lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức: Tổng DNA khuếch đại = m*2 n Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi m ã hóa * Sản phẩm kéo d ài ở chu kỳ đầu tiên có chiều d ài không xác định vì DNA polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy b ởi chu kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo d ài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định. Tuy nhiên, ở chu kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định. Từ chu k ỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại. Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tính theo công thức: Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2 n – 2n) * x n : Số chu kỳ 2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2 x : Số bản sao của chuỗi m ã hóa * Số chu kỳ của phản ứng PCR - Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì ph ản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn: + Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu ban đ ầu. + Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:  Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.  Xu ất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.  Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt cặp với nhau. Số chu kỳ của phản ứng tù y thuộc số lư ợng mẫu ban đầu. DNA mẫu ban đầu là 105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40. Giai đoạn biến tính (denaturation) Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing) Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
25 Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR Nhiệt độ (0C) Laëp laïi n laàn Bieán tính 94 -950C Keùo daøi 7 20 C UÛ baét caëp 40-700C Thời gian (phuùt) Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR 2.2.3. Các thành phần của một phản ứng PCR - DNA m ẫu: là thành ph ần cần khuếch đại. - Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide m ạch đ ơn, có trình tự bổ sung với trình thự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Việc chọn primer là giai đo ạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer đư ợc chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer. Chiều dài các primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide). Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tố i ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb. - Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, đư ợc chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối n ước nóng. Taq DNA polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổn g hợp từ đầu đến cuối quá trình phản
26 ứng dưới sự hiện diện của Mg2+. Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng 5’3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C. - Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, d GTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. - Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tù y loại enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hư ởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Ngo ài ra nồng độ MgCl2 có th ể ảnh hưởng đến quá trình b ắt cặp của primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, ho ạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 2.2.4. Phân tích kết quả PCR Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA đư ợc khuếch đại) sẽ đ ược phát hiện bằng phương pháp điện di. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA. DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên kh ắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trư ờng, chúng sẽ di chuyển về điện cực dương của điện trường. Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vào khối lượng của các phân tử (tức là số nucleotide), nồng độ các thành phần của gel và điện thế. Điện di đ ược thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng. Các DNA trong gel agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide. Chất này có kh ả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát hu ỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bư ớc sóng  =300 nm) thành vạch màu đỏ da cam. Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder). 2.2.5. Những ứng dụng của PCR 2.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ
27 PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại. Việc khuếch đại thành công DNA được ly trích từ tế bào gốc chỉ chứa một copy đơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này. Khía cạnh n ày của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong các phân tích pháp lý, cho phép kỹ thuật genetic fingeprinting đư ợc sử dụng chỉ với một sợi tóc và thậm chí với những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó có thể lọt lưới pháp luật. PCR cũng được sử dụng để khuếch đại DNA từ xương của những nạn nhân bị giết (trong một vài trư ờng hợp xác định danh tánh của họ) trong khi các phần thân xác còn lại đ ã bị phân rã, do đó không thể sử dụng các phương pháp phân tích thông thường. Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cổ và cổ sinh vật học, bằng cách làm cho các trình tự nu cleotide được thu nhận từ các dấu vết DNA hiện diện trong các nguyên liệu được b ảo tồn hay nguyên liệu hóa thạch. Phương pháp PCR cũng được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của người cổ xưa thông qua khuếch đại và phân tích các trình tự di truyền từ các dấu vết DNA đư ợc giữ trong xương hay đư ợc bảo tồn trong các xác ướp. 2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận một cách nhanh chóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa trên các kết quả phân tích trực tiếp từ các sản phẩm của PCR. Khả năng nhận biết đột biến một cách nhanh chóng không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng mà nó cũng làm gia tăng các nghiên cứu các bệnh di truyền. PCR cũng đ ược ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh. Ví dụ: Khuếch đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các m ẫu bệnh phẩm trư ớc khi các triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng. Từ đó ta có thể đề ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại. 2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũng được khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp (cDNA) n hờ enzyme reverse transcriptase. Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối của một mRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nh ưng tại các thời điểm khác