Luận văn : Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) part 3

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Thêm vào BST

Báo xấu

133
lượt xem 23
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện hai loài virus MrNV, XSV trên mẫu tôm thịt đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tôi tiến hành thực hiện đồng thời mẫu chứng âm (đầy đủ các thành phần trừ RNA bản mẫu) và 1 mẫu tôm bình thƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp mô học, để xác định mức độ đặc hiệu của mồi và kiểm tra mức độ ngoại nhiễm khi tiến hành trong phòng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) part 3

27 Tôm mẹ Trại Thực Nghiệm TĐ 10 Tôm mẹ ĐBSCL 8 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐUÔI TRẮNG ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện hai loài virus MrNV, XSV trên mẫu tôm thịt đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tôi tiến hành thực hiện đồng thời mẫu chứng âm (đầy đủ các thành phần trừ RNA bản mẫu) và 1 mẫu tôm bình thƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp mô học, để xác định mức độ đặc hiệu của mồi và kiểm tra mức độ ngoại nhiễm khi tiến hành trong phòng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau cho mẫu chứng dƣơng, không có sự thay đổi. Hình 4.1 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3. 1 2 3 M 4 55 5 6 6 XSV 500 bp 681 bp MrNV Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tôm càng xanh nhiễm MrNV, XSV. Giếng 1: mẫu chứng âm. Giếng 2: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm bình thƣờng không nhiễm XSV. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm XSV.
28 Giếng 4: sản phẩm từ RT - PCR từ mẫu tôm bệnh nhiễm MrNV. Giếng 5: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm bình thƣờng không nhiễm MrNV. Giếng 6: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Mẫu tôm thịt bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ đƣợc tách chiết bằng bộ Kit có 1 vạch sản phẩm có kích thƣớc 500 bp là XSV (giếng 3) và 1 vạch sản phẩm có kích thƣớc 681 bp là MrNV (giếng 4), các kết quả này đúng với Widada, Sahul Hameed và cộng sự. Để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi chúng tôi thực hiện một mẫu tôm bình thƣờng. RNA của tôm không nhiễm MrNV, XSV (giếng 2, 5). Ở các giếng (2, 5) không thấy có sản phẩm khuếch đại chứng tỏ mồi sử dụng trong phản ứng Single - Step RT - PCR rất đặc hiệu. Để kiểm tra vấn đề ngoại nhiễm chúng tôi tiến hành làm hai mẫu chứng âm (giếng 1, 6), mẫu này có đầy đủ các thành phần của phản ứng chỉ trừ RNA bản mẫu. Mẫu này không cho sản phẩm khuếch đại nào chứng tỏ phản ứng Single - Step RT - PCR mà chúng tôi thực hiện không bị ngoại nhiễm. Kết luận: từ kết quả hình 4.1 cho thấy qui trình mà chúng tôi ứng dụng cho kết quả tốt phù hợp với những nghiên cứu từ trƣớc. 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR 4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết Trong phản ứng RT - PCR công đoạn tách chiết RNA đƣợc xem là một trong những bƣớc quyết định. Do đó chúng tôi tiến hành hai phƣơng pháp tách chiết khác nhau trên 1 mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ theo bộ Kit và theo phƣơng pháp Trizol để có thể đánh giá đƣợc hiệu quả của hai phƣơng pháp tách chiết này. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
29 1 2 3 M 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 A B C D MrNV XSV Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol. Phần A, C: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng bộ Kit. Phần B, D: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng Trizol. Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm MrNV. Giếng 8, 9, 10, 11, 12, 13: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm XSV. Giếng 7, 14: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol Tách chiết Lần 1 Lần 2 Lần 3 Kết quả Virus giếng 1 giếng 2 giếng 3 MrNV ++++ Bộ Kit giếng 8 giếng 9 giếng 10 XSV ++ giếng 4 giếng 5 giếng 6 MrNV +++ Trizol giếng 11 giếng 12 giếng 13 XSV + (+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm. Qua 3 lần thử nghiệm trên mẫu chứng dƣơng, chúng tôi nhận thấy vạch sản phẩm từ RNA tách chiết bằng bộ Kit có độ sáng đậm hơn vạch sản phẩm của RNA tách chiết theo phƣơng pháp Trizol. Nhìn chung cả hai qui trình tách chiết đều đạt yêu cầu. Tuy nhiên mỗi phƣơng pháp có ƣu và nhƣợc điểm riêng:
30  Phƣơng pháp Trizol là phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số phƣơng pháp này đơn giản ít tốn thời gian, hoá chất có thể tƣ pha. Lƣợng RNA thu đƣợc dễ bị lẫn phenol và các tạp chất khác trong quá trình tách chiết nếu thao tác không cẩn thận, phƣơng pháp Trizol sử dụng phenol và chloroform, hai chất này rất độc đối với ngƣời tách chiết. Hoá chất Trizol có thể tự pha nên có thể sai sót trong quá trình pha, nhƣ việc hút phenol không đúng cách, không đủ thể tích, cân không đủ lƣợng, dễ nhiễm RNAase, các vi sinh vật. Các yếu tố đó ảnh hƣởng lớn đến quá trình tách chiết.  Phƣơng pháp tách chiết theo bộ Kit đòi hỏi theo điều kiện tách chiết của bộ Kit, hoá chất sử dụng trong bộ Kit tuân theo qui trình sản xuất nghiê m ngặt, không nhiễm RNAase, các vi sinh vật nên lƣợng RNA thu đƣợc sẽ rất nhiều và không gãy vụn, không có sử dụng phenol và chloroform nên không độc đối với ngƣời tách chiết. Trong quá trình tách chiết không bị lẫn tạp chất nhiều. Tuy nhiên tách chiết phả i ủ trên đá trong suốt quá trình tách chiết. Nếu thực hiện trong thời gian dài thì lƣợng đá phải đƣợc bổ sung, công việc này làm ngắt quảng quá trình tách chiết và làm mất thời gian. Nhƣ vậy, qua hai quá trình tách chiết từ mẫu tôm bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tôi nhận thấy rằng trong dịch tách chiết của mẫu tôm thịt bị nhiễm bệnh luôn tồn tại hai virus MrNV và XSV. 4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi Tiến hành pha loãng mồi từ ống gốc có nồng độ là 30 mol theo dãy sau: 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau, không có sự thay đổi đáng kể. Hình 4.3 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3. Tiến hành 10 phản ứng Single - Step RT - PCR trên bản mẫu RNA của mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ pha loãng khác nhau với kết quả nhƣ sau:
31 10 15 20 25 30 M 11 12 10 15 20 25 30 M 9 10 A B Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau Hình A: dãy khảo sát nồng độ của MrNV. Hình B: dãy khảo sát nồng độ của XSV. (-): mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Ở Hình A, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 20 mol vạch sản phẩm có độ sáng rõ và khá đậm và gần tƣơng đồng với nồng độ 25 mol, ở nồng độ 30 mol các vạch sản phẩm này có hiện tƣợng smear khá nhiều chứng tỏ lƣợng mồi thừa cho nên để tiết kiệm mồi mà có thể phát hiện đƣợc MrNV nên chúng tôi chọn ở nồng độ 20 mol. Ở Hình B, nồng độ 20 mol có vạch sản phẩm gần bằng nồng 25 mol nhƣng yếu hơn 30 mol. Vậy để tiết kiệm lƣợng mồi mà vẫn có thể phát hiện đƣợc XSV nên chúng tôi chọn nồng độ 20 mol. 4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt lai của mồi Trƣớc khi tiến hành khảo sát hai dãy nhiệt độ của MrNV, XSV chúng tôi lựa chọn ra mẫu chứng dƣơng đã tách chiết theo bộ Kit để khảo sát. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
32 540 550 560 570 580 540 550 560 570 580 M A B MrNV XSV Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV. Phần A: dãy khảo sát nhiệt độ của XSV. Phần B: dãy khảo sát nhiệt độ của MrNV. (-): mẫu chứng âm. Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ 540C 550C 560C 570C 580C Nhiệt độ Tín hiệu sản phẩm ++ +++++ +++ ++ ++ (MrNV) Tín hiệu sản phẩm ++ ++++ + + +++ (XSV) (+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm. Để dễ đánh giá mức độ sáng của sản phẩm, chúng tôi dùng ký hiệu dấu cộng, quan sát từ bản điện di ta thấy tín hiệu sản phẩm tối ƣu của MrNV ở nhiệt độ 550C có độ sáng cao hơn tín hiệu sản phẩm tối ƣu của XSV ở nhiệt độ 550C , nên chúng tôi cho ký hiệu năm dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của MrNV và bốn dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của XSV. Cứ lần lƣợt nhƣ thế, tùy theo mức độ sáng của sản phẩm mà ta ký hiệu dấu cộng nhiều hay ít. Ở đây chúng tôi chỉ dựa vào độ sáng tƣơng đồng để ký hiệu theo bảng trên. Dựa vào kết quả khảo sát dãy nhiệt độ của MrNV, chúng tôi nhận thấy không có sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm, từ nhiệt độ 540C -> 580C, ngoài nhiệt độ 550C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 560C là sáng nhất so với các nhiệt độ còn lại. Ngƣợc lại với dãy nhiệt độ của MrNV thì trong dãy nhiệt độ của XSV có sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm giữa các nhiệt độ, từ 540C -> 580C, ngoài nhiệt độ
33 550C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 580C sáng nhất so với các nhiệt độ còn lại. Từ những nhận xét đó, ta thấy từ nhiệt độ tối ƣu 55 0C chỉ tăng 10C (550C - 560C) trong dãy khảo sát của MrNV thì tín hiệu sản phẩm sáng nhất ở 560C so với các nhiệt độ còn lại , trong khi dãy nhiệt độ của XSV tăng lên đến 30C (550C - 580C) thì mới thấy ở 580C là sáng nhất so với các nhiệt độ còn lại trừ nhiệt độ 550C. Điều đó cho thấy hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV tỷ lệ nghịch nhau về tín hiệu sáng của sản phẩm. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex. So sánh hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV ở cặp nhiệt độ 560C, ta thấy có sự tƣơng quan ngƣợc rõ rệt của hai tín hiệu sản phẩm ở nhiệt độ 560C, tín hiệu sản phẩm của MrNV sáng hơn rất nhiều so tín hiệu sản phẩm của XSV. Ngoài trừ c ặp nhiệt độ 550C là tối ƣu nhất thì tất cả các cặp nhiệt độ đều không cho sản phẩm tối ƣu. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex. Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 550C theo qui trình Single - Step RT - PCR là tối ƣu nhất cho hai mồi MrNV và XSV. 4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR KHẢO SÁT ĐƢỢC PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ NHỮNG MẪU TÔM THU THỰC ĐỊA. Dựa qui trình đã khảo sát đƣợc, chúng tôi tiến hành khảo sát 50 mẫu tôm càng xanh thu từ Trại Thực nghiệm Thủ Đức và các mẫu tôm mẹ thu tại ĐBSCL. Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 8 mẫu tôm mẹ thu tại ĐBSCL và 1 mẫu tôm postlarvae nghi là bệnh trắng đuôi trƣớc. Kết quả ở hình 4.5.
34 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 A MrNV 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 B XSV 4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tôm càng xanh. Hình A: kết quả điện di phát hiện MrNV. Hình B: Kết quả điện di phát hiện XSV. Giếng 1, 2 , 4, 6, 7, 8: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm mẹ nhiễm MrNV và XSV. Giếng 9: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm postlarvae nhiễm MrNV và XSV. Giếng 5: âm tính. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm mẹ nhiễm MrNV. Giếng 10: mẫu chứng dƣơng. Giếng 11: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Kết quả thu đƣợc 7 mẫu tôm mẹ dƣơng tính thu ở ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae dƣơng tính thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức. Trong đó có 5 mẫu bệnh rất nặng nhiễm đồng thời 2 virus MrNV và XSV ở các giếng 1, 2, 4, 7, 9. 2 mẫu bệnh ở mức độ trung bình nhiễm đồng thời MrNV và XSV ở các giếng 6, 8. 1 mẫu bệnh ở mức độ nhẹ nhiễm MrNV ở giếng 3.
35 Tiếp tục khảo sát 40 mẫu tôm càng xanh còn lại. Các mẫu này không thấy có biểu hiện của bệnh trắng đuôi. 1 2 3 4 5 6 M7 8 9 10 11 12 MrNV 1 2 3 4 5 6 M7 8 9 10 11 12 XSV 4.6: Kết quả điện di mẫu tôm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức (hình đại diện 10 mẫu). Giếng :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 âm tính. Giếng 11: mẫu chứng dƣơng. Giếng 12: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Kết quả điện di 40 mẫu đều âm tính tuy nhiên trong 10 mẫu tôm mẹ mà chúng tôi thu không có mẫu tôm mẹ sinh ra đàn postlarvae bệnh trắng đuôi, nên chƣa thể xác định có sự lây bệnh từ tôm mẹ cho đàn ấu trùng hay không. Chúng tôi đã tiến hành phản ứng Single - Step PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh ở các giai đoạn ấu trùng, tôm postlarvae, tôm mẹ có đƣợc kết quả nhƣ sau:
36 Kết quả Ký hiệu mẫu Địa điểm thu Giai đoạn MrNV XSV Bản Ấu trùng Trại Thực Nghiệm TĐ 1 -> 30 - - g Trại Thực Nghiệm TĐ 31 Postlarvae - - 4.3: Trại Thực Nghiệm TĐ 32 Postlarvae +++ +++ Kết Tôm mẹ Trại Thực Nghiệm TĐ 33-> 42 - - quả Tôm mẹ ĐBSCL 43 +++ +++ thực Tôm mẹ ĐBSCL 44 +++ +++ hiện Tôm mẹ ĐBSCL 45 + - phản Tôm mẹ ĐBSCL 46 +++ +++ ứng Tôm mẹ ĐBSCL 47 - - RT- Tôm mẹ ĐBSCL 48 ++ + PCR Tôm mẹ ĐBSCL 49 +++ + trên Tôm mẹ ĐBSCL 50 ++ ++ 50 mẫu tôm càng xanh (+) : biểu hiện mức độ nhiễm bệnh trắng đuôi
37 Tóm lại trong 50 mẫu mà chúng tôi thực hiện có 7 mẫu tôm nhiễm đồng thời MrNV, XSV và 1 mẫu tôm nhiễm MrNV (giếng 3, hình 4.5). Ở mẫu này ta thấy chỉ có sự hiện diện MrNV không có sự hiện diện của XSV. Ở đây chúng tôi đƣa ra hai lý do đƣợc cho là thích hợp để giải thích kết quả này, theo Widada và Bonami (2004), XSV sử dụng RNA Polymerase của MrNV nên sẽ phụ thuộc vào khả năng sao chép của MrNV rất nhiều, ở mẫu này ta thấy sản phẩm khuếch đại của MrNV là rất yếu chứng tỏ lƣợng RNA không đủ nhiều, điều này chứng tỏ sự hiện diện MrNV trong mẫu bệnh là không cao, trong khi XSV sử dụng RNA Polymerase của MrNV nên lƣợng RNA của XSV sẽ ít hơn lƣợng RNA của MrNV rất nhiều nên không đủ sản phẩm khuếch đại đủ để thấy trên bảng điện di. Hoặc do thao tác tách chiết không đƣợc tốt nên chỉ phát hiện MrNV trong mẫu bệnh. Tuy nhiên kết quả này chỉ giải thích cho một mẫu bệnh trong khi mối quan hệ của MrNV và XSV vẫn chƣa đƣợc biết nên cần phải có nhiều mẫu bệnh mới khẳng định đƣợc hai lý do trên có hợp lý hay không.
38 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Cả hai phƣơng pháp tách chiết bằng bộ Kit và Trizol đều cho kết quả tƣơng thích nhau. Phát hiện đƣợc sự hiện diện đồng thời MrNV, XSV nhiễm trên những mẫu tôm mẹ bệnh trắng đuôi thu tại ĐBSCL và một mẫu tôm postlarvae thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức. Thử nghiệm thành công kỹ thuật Single - Step RT - PCR của Widada, Sahul Hameed và cộng sự với điều kiện hoá chất tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II: Nồng độ Mg2+ là 1,5 mM.   Nồng độ mồi 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV. Nhiệt độ lai 550C.  Ngoài ra chúng tôi có thử nhiệt độ lai tạo cDNA ở 460C và thử nồng độ Mg2+ là 2 mM. Thì thấy ở nồng độ Mg2+ 2 mM làm cho Taq - polymerase hoạt động mạnh tạo ra sản phẩm không chuyên biệt và sản phẩm chính không thấy rõ, còn ở nhiệt độ lai tạo cDNA 460C thì thấy sản phẩm không đặc hiệu, do nhiệt độ lai không đúng làm cho các mồi bắt cặp với RNA không chuyên biệt. Do đó nhiệt độ lai tạo cDNA và nồng độ Mg2+ là một những nhân tố quan trọng cần đƣợc khảo sát thêm nếu phản ứng chƣa đạt tối ƣu. Trong quá trình thực hiện phản ứng RT - PCR chúng tôi phát hiện tần xuất hiện diện MrNV và XSV trong những mẫu tôm bệnh trắng đuôi là rất cao. Có thể khẳng định có sự hiện của hai virus gây bệnh trắng đuôi trên tôm càng đã xuất hiện tại Việt Nam. 5.2. Tồn tại Chƣa xác định đƣợc có hay không sự lây nhiễm từ tôm mẹ bị bệnh trắng đuôi cho đàn ấu trùng. Chƣa phát hiện đƣợc sự hiện diện của hai virus MrNV và XSV trên giai đoạn ấu trùng của tôm càng xanh.
39 Số lƣợng mẫu bệnh ít nên chƣa thể khẳng định tần xuất hiện diện MrNV và XSV trong những mẫu tôm bệnh trắng đuôi là cao hay không. 5.3. Đề xuất Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi thu đƣợc một số kết quả nhất định và mở ra một số vấn đề nghiên cứu sâu hơn. Do đó chúng tôi có một số đề nghị:  Phát triển kỹ thuật multiplex để phát hiện đồng thời hai virus MrNV và XSV.  Ở nhiệt độ 550C là nhiệt độ lai tối ƣu cho cả hai virus, điều này rất thuận lợi phát triển kỹ thuật multiplex. Tuy nhiên khi sử dụng cùng một nhiệt độ tối ƣu cho cả hai virus sẽ có hiện tƣợng cạnh tranh mồi. Vì vậy tôi đề nghị cần khảo sát dãy nhiệt độ lai lớn hơn để tìm nhiệt độ lai tối ƣu riêng của từng virus, ở nhiệt độ lai tối ƣu của MrNV chỉ có mồi của MrNV bắt cặp, ở nhiệt độ lai tối ƣu của XSV chỉ có mồi của XSV bắt cặp. Sau đó đƣa thêm nhiệt độ lai tối ƣu của mồi MrNV là một chu kỳ, và nhiệt độ lai tối ƣu của mồi XSV là một chu kỳ. Mục đích của việc này là phát kỹ thuật multiplex và để tránh hiện tƣợng cạnh tranh giữa hai cặp mồi, nếu thành công thì so sánh giữa hai phƣơng pháp, phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ tối ƣu chung cho cả hai virus là 550C và phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ lai tối ƣu của từng mồi, để xác định phƣơng pháp nào tối ƣu nhất cho việc phát hiện đồng thời MrNV và XSV.  Cần phải có cảm nhiễm trên tôm càng xanh ở các giai đoạn khác nhau để xem sự hiện của virus xuất hiện nhiều ở giai đoạn nào.  Cảm nhiễm trên tôm mẹ, sau lấy chân bơi tôm mẹ để kiểm tra bằng qui trình Single - Step RT - PCR để xác định có sự hiện diện của virus hay không, nếu tôm mẹ bị nhiễm, ta cho tôm mẹ đẻ ra đàn ấu trùng, sau đó kiểm tra đàn ấu trùng xem có sự hiện diện của virus hay không.  Cần tách riêng hai virus MrNV và XSV, sau đó thực hai lô thí nghiệm, một lô cảm nhiễm MrNV và một lô cảm nhiễm đồng thời cả hai virus MrNV và XSV, các thí nghiệm này đƣợc tiến hành trên tôm thịt. Việc tiến hành thí nghiệm này với mục đích xác định vai trò của XSV nhƣ thế nào trong bệnh trắng đuôi.  Cần có bƣớc giải trình tự của hai virus MrNV và XSV từ sản phẩm PCR để so sánh với mẫu chứng dƣơng từ Ấn Độ, để xác định hai virus ở Việt Nam có sự đột biến hay giống hoàn toàn với sản phẩm PCR từ mẫu đối chứng dƣơng từ Ấn Độ.
40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục. 2. Trần Ngọc Hải và ctv, 2000. Hiện trạng triển vọng và giải pháp phát triển sản xuất giống tôm càng xanh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Viện Hải Sản, Đại Học Cần Thơ. 3. Trần Thanh Phục, 2001. Cải tiến công nghệ sản xuất, hạ giá thành con giống tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. BCKH. 50 trang. 4. Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000. Kỹ thuật sản xuất giống tôm càng xanh. NXB Nông nghiệp. 67 trang. 5. Nguyễn Việt Thắng, 1993. Một số đặc điểm sinh học và ứng dụng quy trình sản xuất giống tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man (1879) ở đồng bằng Nam Bộ. Luận án PTS khoa học Nông Nghiệp.Trƣờng Đại Học Thủy Sản Nha Trang. 175 trang. 6. Nguyễn Việt Thắng, 1997. Đặc điểm sinh học và kỹ thuật sản xuất giống tôm càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ. BCKH. 7. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh học phân tử. ĐH Quốc gia TPHCM. Khoa Sinh Học - Trƣờng ĐHKHTN.144 trang. 8. Báo Cáo Hội Thảo, 1999. Phát triển nuôi tôm càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ. An Giang, 5/1999. 9. Bộ Thủy Sản, 2004. Tuyển tập hội Thảo toàn quốc Về Nghiên Cứu Và ứng Dụng Khoa Học Công Nghệ Trong Nuôi Trồng Thủy Sản. NXB Nông Nghiệp
41 TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 10. Akiyama D.M ., Brock J.A. and Haley S.R ., 1982. Idiopathic Muscle Necrosis in the fresh prawn, Macrobrachium rosenbergii de man. Veterinary Medicine, Small Clinician: 1119 – 1121 11. Anderson I.G., Nash. and M. Shariff.,1990. Mass larval mortalities in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii De Man, cultured in Malaysian modified static “green water” systems. Jounal of Fish Diseases 13: 127 – 134 12. Aquacop ., 1977. Macrobrachium rosenbergii De Man Culture Polynesia: progress in the developing a mass intensive larval rearing technique in clear water. Proceedings of the World Mariculture Society 8: 311 - 326. 13. Arcier J.M., Herman F., Lightner D.V., Redman R ., Mari J ., Bonami, J.R ., 1999. A viral disease associated with mortalities in the hatchery - reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Org 38: 177 - 181. 14. Ban N ., Larson S. B. and McPherson A. (1995). Structural comparison of the plant satellite viruses. Virology 214: 571 - 583. 15. Bespalova I.N ., Adkins S. and Burmeidter M ., 1998. 3’- Race Skewed Ratio of specific to general PCR primers improves yield and specificity. Biotechniques 24: 375 - 577. 16. Bonami J.R ., Shi Z ., Qian D. and Widada J.S ., 2005. White tail disease of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: separation of the associated virions and characterization of MrNV as a new of nodavirus. Journal of Fish Disease 28 (1): 23 – 32 17. Brock J.A ., 1983. Diseases (infectious and non-infectious), metazoan parasites, predators and public health considerations in Macrobrachium culture and fisheries. CRC Handbook of Mariculture.
42 18. Brock J.A ., 1988. Diseases and husbandry problems of cultured Macrobrachium rosenbergii. . Disease Diagnosis and Control in North American Marin Aquaculture (C.J Sidermann ., and D.U Lightner ). p .134 - 180. 19. Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S ., 1995. PCR primer: A laboratory manual. Molecular cloning. (J Sambrookp. and D W. Russell). Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Habor, New York. p. 133 - 142 20. Forhman ., 1995. Rapid amplification of cDNA ends. In PCR primer: A Laboratory manual. Molecular cloning (J Sambrookp. and D W. Russell). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.p.381- 409. 21. Johnson S.K ., 1982. Diseases of Macrobrachium. In:Giant Prawn Farming. Developments in Aquaculture and Fisheries Science (M.B New ),Vol.10. p.269 - 277. 22. Lee C.C. and Caskey C.T., 1990. cDNA cloning using degenerate primers. In PCR protocols: A guide to methods and applications ( M.A Innis . et al) . p. 46 - 53. Academic Press, SanDiego, California. 23. Lightner D.V ., 1993. Diseases of culture penaeid shrimp. Handbook of Marine culture, (J.P Mevei ), vol 1 , Crustacean Aquaculture. 24. Mori K.I ., Nakai T ., Muroga ., Arimoto M ., Musiake.K. and Furusawa. I ., 1992. Properties of a new virus belonging to Nodaviridae found in larval striped jack (Pseudocarnx dentex) with nervous necrosis. Virology 187: 368 - 371. 25. Nash G ., S.Chinabut. and Limsuwan C., 1987. Idiopathic Muscle Necrosis in the fresh prawn, Macrobrachium rosenbergii de man, Cultured in Thailand.Jounal of Fish Diseases 10: 109 - 120. 26. Qian D ., Shi Z ., Zhang S ., Cao Z ., Liu W ., Li L ., Xie Y ., Cambournac I. and Bonami J. R ., 2003. Extra small virus-like particles (XSV) and nodavirus associated with whitish muscle disease in the giant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii. Journal of Fish Disease 26:521 - 527. 27. Roegge M.A ., Rutle W.P. and Guest W.C ., 1979. Chemical control of Zoothamnium on larval Macrobrachium acanthurus. In: Proceedings of the Second
43 28. Biennial Crustacean Health Workshop (ed. D.H Lewis .and J.K Leong). p 295-299. TAMU - SG - 117, College Station, Texas. 29. Romestand B ., and Bonami J.R ., 2003. A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (S - ELISA) for detection of MrNV in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man). Journal of fish Diseases 26: 71 - 75. 30. Sahul Hameed A.S ., 2003. Studies on white tail disease of Macrobrachium rosenbergii. In Freshwater Prawns 2003, International Symposium, Cochin, 20 - 23 August 2003. 31. Sahul Hameed A.S .,Yoganandhan K ., Widada J.S ., Bonami J.R ., 2004. Experimental transmission and tissue tropsim of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus like-particles in Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Org 62: 191 - 196. 32. Salin K.R . and Nair C.M ., 2003. Emerging diseases of giant freshwater prawn in India - a potential threat to sustainability. In the In Freshwater Prawns 2003, International Symposium, Cochin , 20 - 23 August 2003. 33. Sahul Hameed A.S ., Yoganandhan K ., Widada J.S. and Bonami J.S ., 2004a. Studies on the occurrence of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus - like (XSV) associated with white tail disease (WTD) of Macrobrachium rosenbergii in India by RT - PCR detection. Aquaculture 238: 127 - 133. 34. Schaefer B.C ., 1995. Revolution in Rapid amplification of cDNA ends: New strategies for polymerase chain reaction cloning of full-length ends. Anal, Biochem 227: 255 - 273. 35. Tonguthai Kamonporn., 1997. Diseases of Fresh Prawn, Macrobrachium rosenbergii. The AAHRI Newsletter Article, Vol.4, No.2, December 1997 Bangkok 10900, Thailand. 36. Tung C. W ., Wang C. S. and Chen S. N ., 1999. Histological and electron microscopy study on Macrobrachium. 37. Muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), cultured in Taiwan. Journal of Fish Disease 22 : 1 - 5.
44 42. Tung C.W., Wang CS. and Chen S.N ., 1999. Histologiacal and electron microscopic study on Macrobrachium muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de man), cultures in Taiwan. Jounal of Fish Diseases 22: 319 - 324. 43. Van Regenmortel M.H.V ., Fauquer C.M ., Bishop D.H.L ., Cartens E.B ., Estes M.K ., Lemon S.M ., Maniloff. J ., Mayo M.A ., McGeoch D.J ., Pringle C.R. and Wickner R.B ., 2000. Virus taxaonomy:Classifisstion and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, CA. 44. Vijayan K.K ., Raj V.S ., Alavandi S.V ., Sekhar V.T ., Vaseeharan.B. and Santiago T.C ., 2003. Need of novel diagnotics in the health management of Macrobrachium rosenbergii, with special reference to an emerging epizootic in India, the white muscle syndrome (WMS). In Freshwater Prawns 2003. 45. Walker P.J ., 2003. Molecular characteristic of Yellow head Virus (YHV) and White Spot Syndrome Virus. CSIRO Tropical Agriculture, Private Bag 3, Indooroopilly, Qld 4068, Australia 46. Widada J.S ., Durand S ., Cambournac ., Qian D ., Shi Z ., Dejonghe E ., Richard V ., Bonami J.R ., 2003. Genome - based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: dot - blot, in situ hybridization and RT - PCR. Jounal of Fish Diseases 26 : 583 - 590. 47. Widada J.S ., Richard V ., Shi Z ., Qian D. and Bonami J.R ., 2004. Dot - lot hybridization and RT - PCR detection of extra small virus (XSV) associated with white tail disease of prawn Macrobrachium rosenbergii. Disease of Aquatic Organism 58: 83 - 87. 48. Yoganandhan K ., Widada J.S ., Bonami J.R. and Sahul Hameed A.S ., 2005. Simultaneous detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus by a single tube, one - step multiplex RT - PCR assay. Journal of Fish Disease 28: 65 - 69.