Mối liên quan giữa đa hình nucleotide đơn XRCC1 Arg399Gln với nguy cơ mắc lupus ban đỏ hệ thống

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN XRCC1<br /> ARG399GLN VỚI NGUY CƠ MẮC LUPUS BAN ĐỎ HỆ THỐNG<br /> Trần Tiến Đạt1, Trần Vân Khánh1,<br /> Tạ Thành Văn1, Nghiêm Trung Dũng2, Trần Huy Thịnh1,<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Bạch Mai<br /> <br /> Nhiều bằng chứng cho thấy tổn thương DNA có liên quan đến sự phát triển bệnh lupus ban đỏ hệ thống<br /> (SLE). XRCC1 là một trong những protein đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sửa chữa cắt bỏ base (BER).<br /> Do đó, chúng tôi tập trung vào đa hình Arg399Gln của gen XRCC1 trong tính nhạy cảm với SLE. DNA được<br /> tách chiết từ máu ngoại vi của 125 bệnh nhân SLE và 125 người khỏe mạnh. Xác định kiểu gen của đa hình<br /> XRCC1 Arg399Gln được thực hiện bằng kỹ thuật PCR - RFLP và được xác nhận bằng kỹ thuật giải trình tự<br /> DNA. Kết quả cho thấy tỉ lệ phân bố các kiểu gen Gln/Gln, Arg/Gln, Arg/Arg ở nhóm bệnh lần lượt là 12,8%,<br /> 39,2%, 48,0% và ở nhóm chứng lần lượt là 5,6%, 36,0%, 58,4%. Tỉ lệ alen Gln ở nhóm bệnh là 32,4%,<br /> ở nhóm chứng là 23,6%. Tỷ suất chênh (OR) đối với bệnh nhân SLE có kiểu gen Gln/Gln so với Arg/Gln<br /> hoặc Arg/Arg là 2,47 (95%CI = 0,98 - 6,24; p = 0,049). OR đối với alen 399Gln ở bệnh nhân SLE là 1,55<br /> (95% CI = 1,05 - 2,30, p = 0,029). Nghiên cứu của chúng tôi xác nhận rằng đa hình XRCC1 Arg399Gln có<br /> thể làm tăng nguy cơ mắc SLE.<br /> Từ khóa: Lupus ban đỏ hệ thống, XRCC1, Arg399Gln, đa hình<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Lupus ban đỏ hệ thống (SLE – Systemic<br /> Lupus Erythematosus) là bệnh lý của mô liên<br /> kết có tổn thương nhiều cơ quan do hệ thống<br /> miễn dịch của cơ thể bị rối loạn, đặc trưng bởi<br /> sự có mặt của kháng thể kháng nhân và nhiều<br /> tự kháng thể khác.<br /> Tỷ lệ mắc SLE khác nhau tùy theo nghiên<br /> <br /> giảm của hệ thống sửa chữa DNA ở bệnh<br /> nhân SLE đã dẫn đến sự tích tụ các đứt gãy<br /> trong DNA [4]. Sự tích tụ các đoạn DNA đứt<br /> gãy kết hợp với các protein nhân tế bào có thể<br /> hình thành các kháng nguyên miễn dịch, gây<br /> sản sinh kháng thể và đáp ứng tự miễn ở<br /> những người nhạy cảm [5].<br /> <br /> cứu của các tác giả trên thế giới, từ 14 - 172<br /> <br /> XRCC1 là một trong những protein quan<br /> <br /> ca/100.000 dân [1]. Bệnh chủ yếu gặp ở nữ<br /> <br /> trọng nhất có vai trò quan trọng trong con<br /> <br /> giới, đặc biệt độ tuổi sinh đẻ, tỷ lệ mắc bệnh<br /> <br /> đường sửa chữa cắt bỏ base (BER – Base<br /> <br /> của nữ/nam là 9/1 [2]. Mặc dù sinh bệnh học<br /> <br /> excision repair) [6]. Protein này chịu trách<br /> <br /> của SLE đến nay vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng,<br /> <br /> nhiệm cho việc sửa chữa hiệu quả các tổn<br /> <br /> nhưng bệnh có liên quan đến các yếu tố di<br /> <br /> thương DNA gây ra bởi oxy hoạt động, bức xạ<br /> <br /> truyền, hormon và môi trường [3].<br /> <br /> ion hóa và các chất alkyl hóa [7]. Mặc dù<br /> <br /> Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự suy<br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường<br /> Đại học Y Hà Nội<br /> <br /> XRCC1 không thể hiện hoạt động enzym,<br /> nhưng nó có chức năng tương tác để điều<br /> phối hoạt động của các protein enzym khác<br /> trong bộ máy BER, bao gồm: glycosylase,<br /> <br /> Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn<br /> <br /> endonuclease (APE1), DNA polymerase β,<br /> <br /> Ngày nhận: 18/9/2018<br /> <br /> ligase và Poly (ADP-ribose) Polymerases<br /> <br /> Ngày được chấp thuận: 11/10/2018<br /> <br /> (PARP1 và PARP2) [7; 8].<br /> <br /> 16<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Gen XRCC1 có vị trí nằm trên nhiễm sắc<br /> thể 19q13.31 và có 17 exon. Mặc dù có hơn<br /> 300 SNPs đã được mô tả trong gen XRCC1,<br /> ba SNPs thường xuyên được nghiên cứu là:<br /> Arg194Trp, Arg280His và Arg399Gln [9].<br /> Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cho<br /> thấy có mối liên quan giữa SNP Arg399Gln<br /> của gen XRCC1 với nguy cơ mắc SLE và một<br /> <br /> bệnh tự miễn khác và ung thư, tiền sử gia<br /> đình không có người mắc SLE.<br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu<br /> bệnh – chứng.<br /> Áp dụng công thức tính cỡ mẫu của WHO<br /> trong nghiên cứu bệnh – chứng [13]:<br /> <br /> số bệnh ung thư. Tuy nhiên, trên những<br /> chủng tộc người khác nhau, các nhà khoa học<br /> <br /> n = Z12−α /2 .<br /> <br /> {1/ [p (1 − p )] + 1/ [p (1 − p )]}<br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> [ln(1 − ε )]<br /> <br /> thu được kết quả trái chiều [3; 10 - 12].<br /> <br /> 2<br /> <br /> 2<br /> <br /> Việc xác định đa hình này có thể giúp tầm<br /> <br /> Dựa vào nghiên cứu của Warchol T. [3] lấy<br /> <br /> soát SLE ở những đối tượng có yếu tố nguy<br /> <br /> tỷ lệ cá thể mang alen Gln ở nhóm bệnh là<br /> <br /> cơ, giúp bệnh nhân được chẩn đoán sớm,<br /> <br /> p1 = 0,63 và ở nhóm chứng là p2 = 0,52. Lấy<br /> <br /> điều trị kịp thời, giảm các biến chứng cũng<br /> <br /> độ chính xác tương đối ε = 0,3, α = 0,05 tính<br /> <br /> như cải thiện tiên lượng bệnh.<br /> <br /> được cỡ mẫu tối thiểu n = 123 đối tượng mỗi<br /> <br /> Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về<br /> gen XRCC1 nói chung, SNP Arg399Gln trên<br /> bệnh nhân SLE nói riêng. Do đó nghiên cứu<br /> này được thực hiện nhằm mục đích xác định<br /> đa hình nucleotide đơn Arg399Gln của gen<br /> XRCC1 trên bệnh nhân SLE và tìm hiểu mối<br /> liên quan giữa SNP này với nguy cơ mắc<br /> SLE.<br /> <br /> nhóm. Thực tế lựa chọn được 125 bệnh nhân<br /> và 125 người khỏe mạnh đạt đủ tiêu chí và<br /> yêu cầu của nghiên cứu.<br /> 2.3. Thời gian và địa điểm<br /> Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm<br /> Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại Học Y<br /> Hà Nội từ tháng 10/2017 đến tháng 8/2018.<br /> 2.4. Quy trình kỹ thuật<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> - Nhóm bệnh: 125 bệnh nhân SLE được<br /> chẩn đoán và điều trị tại Khoa Thận - Tiết niệu<br /> Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01/2014 đến<br /> tháng 02/2017. Lựa chọn các bệnh nhân nam<br /> <br /> 2.4.1. Thu thập mẫu<br /> Lấy 2 ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA<br /> từ bệnh nhân và nhóm chứng.<br /> 2.4.2 Tách chiết DNA<br /> DNA từ máu toàn phần được tách chiết<br /> theo Kit Promega.<br /> <br /> và nữ được chẩn đoán xác định SLE theo tiêu<br /> <br /> Đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng<br /> <br /> chuẩn SLICC 2012, loại trừ các bệnh nhân<br /> <br /> máy Nanodrop 2000c. Nếu OD260nm/OD280nm =<br /> <br /> nhỏ hơn 15 tuổi, không đủ thông tin trong hồ<br /> <br /> 1,8 - 2,0 thì DNA được coi là tinh sạch.<br /> <br /> sơ bệnh án.<br /> - Nhóm chứng: 125 người tình nguyện,<br /> được xác định khỏe mạnh thông qua các đợt<br /> khám sức khỏe định kỳ, không mắc SLE, các<br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> 2.4.3. Xác định kiểu gen bằng kỹ thuật<br /> PCR – RFLP<br /> Khuếch<br /> <br /> đại<br /> <br /> vùng<br /> <br /> gen<br /> <br /> chứa<br /> <br /> SNP<br /> <br /> Arg399Gln của gen XRCC1 bằng kỹ thuật<br /> 17<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> PCR, cặp mồi sử dụng theo nghiên cứu của<br /> Warchol T. [3]:<br /> Mồi xuôi: 5’- ACC TTG TGC TTT CTC TGT<br /> GTC - 3’<br /> Mồi ngược: 5’ - TAG TCT GCT GGC TCT<br /> GGG CT - 3’<br /> <br /> NG_033799 của gen XRCC1 trên GeneBank.<br /> 3. Xử lý và phân tích số liệu<br /> Sử dụng phần mềm SPSS 22.0 để phân<br /> tích thống kê. So sánh 2 tỷ lệ dùng kiểm định<br /> χ2, tỷ suất chênh OR và khoảng tin cậy 95%<br /> CI. Các biến định lượng được kiểm định phân<br /> <br /> Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích<br /> <br /> phối chuẩn bằng Kolmogorov - Smirnov test.<br /> <br /> 10 µl gồm: 5 µl GoTaq Green Master Mix 2X,<br /> <br /> So sánh giá trị trung bình của 2 nhóm bằng<br /> <br /> 0,2 µl mồi xuôi, 0,2 µl mồi ngược, 1 µl DNA,<br /> <br /> T-student test (phân phối chuẩn) hoặc Mann-<br /> <br /> 3,6 µl H2O. Chu trình nhiệt 94ºC - 5 phút, 37<br /> <br /> Whitney test (không theo phân phối chuẩn).<br /> <br /> chu kỳ (94ºC - 30s, 55ºC - 30s, 72ºC - 40s),<br /> <br /> So sánh giá trị trung bình trên 2 nhóm bằng<br /> <br /> 72ºC - 5 phút, sản phẩm được bảo quản ở<br /> <br /> ANOVA test (phân phối chuẩn) hoặc Kruskal<br /> <br /> 15ºC.<br /> <br /> Wallis test (không theo phân phối chuẩn).<br /> <br /> Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên<br /> gel agarose 1,5%, sau đó được ủ với enzym<br /> giới hạn NciI ở 37ºC trong 8 - 16 giờ. Sản<br /> phẩm cắt enzym sau đó được điện di trên gel<br /> agarose 2% để xác định kiểu gen.<br /> <br /> Kiểm định có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.<br /> 4. Đạo đức nghiên cứu<br /> Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức<br /> nghiên cứu trong Y học. Các đối tượng tham<br /> gia nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện và có<br /> <br /> Alen 399 Arg chứa trình tự nhận biết của<br /> <br /> quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không muốn<br /> <br /> enzym NciI (CC↓SGG) sẽ bị cắt thành các<br /> <br /> tham gia. Các thông tin cá nhân của đối tượng<br /> <br /> đoạn 378 bp và 131bp. Ở alen 399 Gln,<br /> <br /> nghiên cứu được đảm bảo bí mật.<br /> <br /> nucleotide G bị thay thế bởi nucleotide A, làm<br /> mất trình tự nhận biết của enzym nên không bị<br /> cắt và vẫn giữ nguyên kích thước 509 bp.<br /> 2.4.4. Kỹ thuật giải trình tự gen<br /> Kỹ thuật giải trình tự gen được tiến hành<br /> trên một số mẫu nhằm đối chiếu kiểm tra lại<br /> kiểu gen thu được từ kỹ thuật PCR – RFLP.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên<br /> cứu<br /> Kết quả cho thấy SLE chủ yếu gặp ở nữ<br /> với tỷ lệ nữ/nam = 8,6/1. Không có sự khác<br /> biệt có ý nghĩa thống kê về độ tuổi trung bình<br /> <br /> Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được giải<br /> <br /> và tỷ lệ giới tính của nhóm bệnh và nhóm<br /> <br /> trình tự trực tiếp bằng máy ABI-3100 theo<br /> <br /> chứng. Điều này cho thấy nhóm bệnh và<br /> <br /> phương pháp Sanger và được phân tích bằng<br /> <br /> nhóm chứng được lựa chọn khá tương đồng<br /> <br /> phần mềm CLC Main Workbench. Kết quả<br /> <br /> nhau về tuổi và giới, phù hợp với một nghiên<br /> <br /> giải trình tự được so sánh với trình tự chuẩn<br /> <br /> cứu bệnh – chứng (bảng 1).<br /> <br /> 18<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu<br /> Đặc điểm<br /> <br /> Nhóm bệnh (n = 125)<br /> <br /> Nhóm chứng (n = 125)<br /> <br /> p<br /> <br /> 30,14 ± 9,34<br /> <br /> 32,86 ± 11,20<br /> <br /> 0,071<br /> <br /> X ± SD<br /> <br /> Tuổi<br /> <br /> Min – max<br /> <br /> Giới<br /> <br /> 15<br /> <br /> 58<br /> <br /> 15<br /> <br /> 66<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 112<br /> <br /> 89,6<br /> <br /> 113<br /> <br /> 90,4<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 13<br /> <br /> 10,4<br /> <br /> 12<br /> <br /> 9,6<br /> <br /> 0,833<br /> <br /> 2. Kết quả phân tích kiểu gen của đa hình Arg399Gln<br /> Sản phẩm PCR được xử lý bằng enzym cắt giới hạn NciI. Sản phẩm cắt enzym sau đó được<br /> điện di trên gel agarose 2% thu được kết quả như sau:<br /> M<br /> <br /> PCR<br /> <br /> (+)<br /> <br /> P101 P102 P103 P104 P105 P106 P107 P108 P109 -<br /> <br /> 509 bp<br /> 378 bp<br /> 131 bp<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt enzym của một số mẫu bệnh<br /> M: Marker 100 bp; PCR: Sản phẩm PCR; (+): Đối chứng dương kiểu gen Arg/Arg;<br /> Kiểu gen Arg/Arg có 2 vạch (mẫu P101, P102, P103, P106, P107, P108); Kiểu gen Arg/Gln có<br /> 3 vạch (mẫu P104, P109); kiểu gen Gln/Gln có 1 vạch (mẫu P105).<br /> Kết quả PCR – RFLP của mỗi kiểu gen tương ứng được kiểm tra lại bằng kỹ thuật giải trình tự<br /> gen.<br /> <br /> Hình 2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR tương ứng với mỗi kiểu gen XRCC1<br /> của bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống<br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br /> 19<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Kết quả ở hình 2 cho thấy tại codon 399 của gen XRCC1, nếu nucleotide là G sẽ cho bộ ba<br /> mã hóa CGG, mã hóa cho acid amin Arg; nếu nucleotide là A sẽ cho bộ ba mã hóa CAG, mã hóa<br /> cho acid amin Gln. Kết quả giải trình tự gen của các bệnh nhân P101, P104, P105 hoàn toàn<br /> trùng khớp với kết quả PCR - RFLP.<br /> Tiến hành kỹ thuật PCR - RFLP trên 125 mẫu bệnh và 125 mẫu chứng, kết quả được trình<br /> bày tại bảng 2:<br /> Bảng 2. Đa hình nucleotide đơn Arg399Gln của gen XRCC1<br /> trên nhóm bệnh nhân SLE và nhóm chứng<br /> <br /> Đa hình thái<br /> kiểu gen và alen<br /> <br /> Nhóm bệnh<br /> <br /> Nhóm chứng<br /> <br /> (n = 125)<br /> <br /> (n = 125)<br /> <br /> p<br /> <br /> OR (95%CI)<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Arg/Arg<br /> <br /> 60<br /> <br /> 48,0<br /> <br /> 73<br /> <br /> 58,4<br /> <br /> Arg/Gln<br /> <br /> 49<br /> <br /> 39,2<br /> <br /> 45<br /> <br /> 36,0<br /> <br /> 0,296<br /> <br /> 1,32 (0,78 - 2,25)<br /> <br /> Gln/Gln<br /> <br /> 16<br /> <br /> 12,8<br /> <br /> 7<br /> <br /> 5,6<br /> <br /> 0,030<br /> <br /> 2,78 (1,07 - 7,20)<br /> <br /> Tổ<br /> <br /> Arg/Arg + Arg/Gln<br /> <br /> 109<br /> <br /> 87,2<br /> <br /> 118<br /> <br /> 94,4<br /> <br /> hợp<br /> <br /> Gln/Gln<br /> <br /> 16<br /> <br /> 12,8<br /> <br /> 7<br /> <br /> 5,6<br /> <br /> kiểu<br /> <br /> Arg/Arg<br /> <br /> 60<br /> <br /> 48,0<br /> <br /> 73<br /> <br /> 58,4<br /> <br /> gen<br /> <br /> Arg/Gln + Gln/Gln<br /> <br /> 65<br /> <br /> 52,0<br /> <br /> 52<br /> <br /> 41,6<br /> <br /> Arg<br /> <br /> 169<br /> <br /> 67,6<br /> <br /> 191<br /> <br /> 76,4<br /> <br /> Gln<br /> <br /> 81<br /> <br /> 32,4<br /> <br /> 59<br /> <br /> 23,6<br /> <br /> Kiểu<br /> gen<br /> <br /> Alen<br /> <br /> 1,0<br /> <br /> 1,0<br /> 0,049<br /> <br /> 2,47 (0,98 - 6,24)<br /> 1,0<br /> <br /> 0,099<br /> <br /> 1,52 (0,92 - 2,51)<br /> 1,0<br /> <br /> 0,029<br /> <br /> 1,55 (1,05 - 2,30)<br /> <br /> Người mang kiểu gen Gln/Gln có nguy cơ mắc SLE cao gấp 2,78 lần người mang kiểu gen<br /> Arg/Arg (p = 0,03). Người mang kiểu gen Gln/Gln có nguy cơ mắc SLE cao gấp 2,47 lần người<br /> mang kiểu gen Arg/Gln hoặc Gln/Gln (p = 0,049). Tỷ lệ alen Gln của nhóm bệnh cao hơn so với<br /> nhóm chứng (p = 0,029), với OR = 1,55 nghĩa là nguy cơ phát triển bệnh SLE tăng lên 1,55 lần<br /> cho mỗi alen Gln.<br /> Bảng 3. Tuổi khởi phát bệnh trung bình của bệnh nhân SLE<br /> trong phân bố kiểu gen XRCC1 SNP Arg399Gln<br /> Đa hình thái kiểu gen<br /> <br /> Kiểu gen<br /> <br /> n<br /> <br /> Tuổi khởi phát bệnh (năm) ± SD<br /> <br /> Arg/Arg<br /> <br /> 60<br /> <br /> 29,29 ± 9,45<br /> <br /> Arg/Gln<br /> <br /> 49<br /> <br /> 28,99 ± 10,51<br /> <br /> Gln/Gln<br /> <br /> 16<br /> <br /> 27,05 ± 7,96<br /> <br /> p<br /> <br /> 0,671<br /> <br /> Bệnh nhân mang kiểu gen Gln/Gln có tuổi khởi phát bệnh trung bình nhỏ nhất, sau đó đến<br /> Arg/Gln và lớn nhất là Arg/Arg. Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (Kruskal<br /> Wallis test, p > 0,05).<br /> 20<br /> <br /> TCNCYH 115 (6) - 2018<br /> <br />