Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn Led và Bioreactor chìm ngập cách quãng đến sinh trưởng quang tự dưỡng cây hông (Paulownia fortunei) in vitro

Journal of Science – 2016, Vol. 12 (4), 28 – 35<br /> <br /> Part D: Natural Sciences, Technology and Environment<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐÈN LED VÀ BIOREACTOR CHÌM NGẬP<br /> CÁCH QUÃNG ĐẾN SINH TRƯỞNG QUANG TỰ DƯỠNG<br /> CÂY HÔNG (PAULOWNIA FORTUNEI) IN VITRO<br /> Nguyễn Đức Minh Hùng1, Đỗ Thị Tuyến1, Trần Văn Minh2<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Viện Sinh học Nhiệt đới - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam<br /> Trường ĐH Quốc tế - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh<br /> <br /> Thông tin chung:<br /> Ngày nhận bài: 22/07/2015<br /> Ngày nhận kết quả bình duyệt:<br /> 12/08/2015<br /> Ngày chấp nhận đăng: 12/2016<br /> Title:<br /> A study on the effects of LED<br /> and TIS-bioreactor on<br /> autophototrophic growth of<br /> hông (Paulownia Fortunei ) in<br /> vitro<br /> Keywords:<br /> Bioreactor, internodes, LED,<br /> plantlets, TIS-temporary<br /> immersion system<br /> Từ khóa:<br /> Bình phản ứng sinh học, đốt<br /> thân, đèn LED, cây cấy mô,<br /> TIS-chìm ngập cách quãng<br /> <br /> ABSTRACT<br /> Paulownia plantlets could not develop without sucrose and be combined with<br /> the aeration at least 1 minute/1 time/hour. The plantlets’ growth was slowly<br /> while its leaves became sere because of the lack of CO2 during the<br /> photosynthesis. Within the CO2 supplement by 10% of its total flowed into TISbioreactor, the development of plantlets was better in the combination of ratio<br /> LED colors by 20 % blue-LED + 80 % red-LED with plant height of 44.3 cm,<br /> root number 6.6, fresh weight 0.64 g/shoot, and chlorophyll concentration of<br /> 4.397 mg/ml. Rerarding the use of IC to set up the immersion programing in<br /> TIS-bioreactor to 2, 3, 4 times per hour, it was shown that immersion of 2<br /> times/hour under LED by 20 % blue-LED + 80 % red-LED would give the<br /> plantlet with the best growth.<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Cây hông không phát triển được trên môi trường không đường với mặc định<br /> thấp nhất của hệ thống là sục khí 1 phút 1 lần/giờ. Cây phát triển chậm và lá bị<br /> vàng do không đủ CO2 cho quang hợp. Khi có bổ sung khí CO2 với tỷ lệ 10%<br /> lượng khí thổi vào hệ thống TIS. Sinh trưởng và phát triển chồi tốt nhất ở<br /> nghiệm thức chiếu sáng là 20% LED xanh + 80% LED đỏ, có chiều cao thân<br /> chồi 44,3 cm, có 6,6 rễ, trọng lượng tươi 0,64 g/chồi và hàm lượng chlorophyll<br /> đạt 4,397 mg/ml. Việc dùng vi mạch cải tiến tăng số lần ngập chìm của hệ<br /> thống TIS lên 2, 3, 4 lần/giờ được sử dụng trong thí nghiệm đã cho thấy ở<br /> nghiệm thức ngập chìm 2 lần/giờ và chiếu sáng bằng 20% LED xanh + 80%<br /> LED đỏ cho cây phát triển tốt nhất. Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể dùng<br /> hệ thống TIS cải tiến để nuôi cấy quang tự dưỡng cây hông và sử dụng nguồn<br /> sáng 20% LED xanh + 80% LED đỏ là tốt nhất cho cây này.<br /> <br /> là một hệ thống tận dụng được các ưu điểm của<br /> nuôi cấy lỏng và nuôi cấy trên thạch (Preil, 1991).<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Kỹ thuật nuôi cấy quang tự dưỡng, bioreactor,…<br /> để nhân giống cây trồng nông nghiệp và dược liệu<br /> (Paek và cs., 2005). Hệ thống nuôi cấy ngập chìm<br /> cách quãng TIS (Temporary Immersion System)<br /> <br /> Trên thế giới đèn LED (Light Emitting Diode<br /> nghĩa là điốt phát quang) ít tỏa nhiệt và ít tốn kem<br /> điện năng đã có rất nhiều ứng dụng thực tiễn. Đèn<br /> LED xanh và đỏ với nhiều tỷ lệ để chiếu sáng cho<br /> 28<br /> <br /> Journal of Science – 2016, Vol. 12 (4), 28 – 35<br /> <br /> Part D: Natural Sciences, Technology and Environment<br /> <br /> từng giai đoạn phát triển của thực vật in vitro<br /> (Kang và cs., 2013). Dưới ánh sáng đèn LED,<br /> sinh trưởng của nhiều loài cây trồng đã được cải<br /> thiện như: dâu tây (Kim và cs., 2011), hoa lan vũ<br /> nữ (Mengxi và cs., 2011), Jatropha curcas (Daud<br /> và cs., 2013), tảo chlorella (Choi và cs., 2013).<br /> <br /> cây hông in vitro với phương pháp quang tự<br /> dưỡng bằng hệ thống TIS bioreactor và chiếu sáng<br /> bằng đèn LED nhằm đem lại sự phát triển tốt hơn<br /> cho cây nuôi cấy và là cơ sở khoa học cho các<br /> nghiên cứu ứng dụng mới trong nuôi cấy mô tế<br /> bào thực vật.<br /> <br /> Cây hông thuộc họ Bignoniaceae có bản địa Đông<br /> Nam Á và được di thực đến Châu Âu, Bắc và<br /> Nam Mỹ. Có các loài trồng trọt chủ yếu P.<br /> fortunei, P. kawakamii, P. taiwaniana và P.<br /> tomentosa; trong đó P. fortunei có giá trị kinh tế<br /> cao nên được phổ biến trồng rừng phòng hộ đầu<br /> nguồn (Burger, 1989). P. fortunei sau khi trồng 3<br /> năm có thể khai thác gỗ làm các loại giấy cao cấp<br /> như giấy in tiền, làm than hoạt tính, làm ván ép.<br /> <br /> 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Vật liệu cấy: chồi cây hông (paulownia) in vitro.<br /> Môi trường nuôi cấy: môi trường MS (Murashige<br /> và Skoog, 1962) không bổ sung chất kích thích<br /> sinh trưởng, khử trùng môi trường nuôi cấy ở 121<br /> o<br /> C, 1 at trong 25 phút.<br /> Điều kiện nuôi cấy: Phòng sáng có nhiệt độ 26 +<br /> 2 oC, ẩm độ Rh = 65%, cường độ chiếu sáng đèn<br /> huỳnh quang trắng 50 µmol/m2/s, thời gian chiếu<br /> sáng 12 giờ/ngày.<br /> <br /> Nuôi cấy tái sinh cây hông từ lá (Rao và cs.,<br /> 1996) hay tái sinh phôi trực tiếp (Ipekci và<br /> Gozukirmizi, 2003) và gián tiếp (Ipekci và<br /> Gozukirmizi, 2004) nhằm mục tiêu nhân giống<br /> (Bermann và Whetten, 1998). Chất lượng ánh<br /> sáng đèn (Stefano và Rosario, 2003), sự trao đổi<br /> khí (Nguyễn Thị Quỳnh và cs., 2000), nước<br /> (Khan và cs., 2003) và nguồn ánh sáng đèn LED<br /> xanh và đỏ (Nguyễn Đức Minh Hùng và Trần Văn<br /> Minh, 2014) ảnh hưởng đến quá trình nhân giống<br /> tự dưỡng và quang tự dưỡng cây hông in vitro.<br /> <br /> Đèn LED được sử dụng trong thí nghiệm gồm 2<br /> loại LED vuông 50 x 50 của Đài Loan sản xuất, 2<br /> loại đèn LED có màu đỏ bước sóng 640 đến 660<br /> nm và đèn màu xanh dương có bước sóng 451 đến<br /> 460 nm, cường độ chiếu sáng đèn LED kết hợp<br /> xanh và đỏ nhiều tỷ lệ khác nhau cùng là 50<br /> µmol/m2/s.<br /> <br /> Do đó, sự cần thiết nghiên cứu kết hợp nuôi cấy<br /> <br /> Hình 1. Đèn LED 50 x 50 tỷ lệ 80% đỏ + 20 %xanh<br /> <br /> 29<br /> <br /> Journal of Science – 2016, Vol. 12 (4), 28 – 35<br /> <br /> Part D: Natural Sciences, Technology and Environment<br /> <br /> Các thí nghiệm được nuôi cấy trên hệ thống<br /> bioreactor bán ngập chìm Plantima do Đài loan<br /> sản xuất. Lượng khí mỗi lần bơm vào bình cấy<br /> được hiệu chỉnh là 1 lít/phút.<br /> <br /> đối xứng được nuôi cấy trong một bình bioreactor<br /> ngập chìm cách quãng Plantima có chứa 300 ml<br /> môi trường nuôi cây không đường. Thí nghiệm<br /> gồm 3 lần lặp lại bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với<br /> nghiê ̣m thức chiếu sáng bằng đèn LED theo tỷ lê ̣<br /> đỏ và xanh là: 80% đỏ + 20% xanh đă ̣t trong dàn<br /> sáng đã đươ ̣c cách ly với ánh sáng bên ngoài, đố i<br /> chứng là cây đươ ̣c nuôi cấ y trong hệ thống<br /> bioreactor ngập chìm cách quãng dưới ánh sáng<br /> huỳnh quang thông thường. Các nghiệm thức<br /> được hiệu chỉnh với thời gian cách quãng là 15,<br /> 20 và 30 giây (tương đương 1, 2, 3 lần ngập/giờ)<br /> và thời gian ngập là 1 phút.<br /> <br /> Mạch điều khiển bằng bộ đếm digital tương tự<br /> như bộ công tắc đóng cắt nguồn theo thời gian<br /> định sẵn (timer) tính bằng giây. Mạch có thể điều<br /> khiển cùng một lúc nhiều máy với thời gian chạy<br /> khác nhau và điều khiển thời gian ngập cách<br /> quãng là phần mềm QEE_STARLED được cung<br /> cấp bởi công ty LED Ánh Sáng Việt.<br /> Thiết kế thí nghiê ̣m<br /> Thí nghiệm 1: Nuôi cây hông hoàn chỉnh bằng<br /> bioreactor bán ngập chìm trên môi trường không<br /> đường so sánh với môi trường có đường: 30 đoạn<br /> thân cây hông cấy mô có chứa 2 mắt mầm được<br /> nuôi cấy trong 1 bình bioreactor ngập chìm cách<br /> quãng Plantima có chứa 300 ml môi trường<br /> không đường so sánh với môi trường có đường<br /> bình thường và chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang,<br /> thời gian ngập là 1 phút và thời gian cách quãng là<br /> 1 giờ. Ghi nhận kết quả sau 5 tuần nuôi cấy.<br /> <br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Thí nghiệm 1: So sánh nuôi cây hông hoàn<br /> chỉnh bằng bioreactor bán ngập chìm trên môi<br /> trường không đường:<br /> Do hệ thống ngập chìm cách quãng bơm không<br /> khí vào bình nuôi mỗi giờ 1 lần và bơm khí trong<br /> 1 phút, có sự thay đổi không khí bên trong bình<br /> nuôi cấy nên tiến hành thử nghiệm nuôi trên môi<br /> trường không đường để cây quang hợp như trong<br /> tự nhiên. Tuy nhiên không được kết quả như<br /> mong muốn, có lẽ do thời gian cung cấp khí quá<br /> ngắn (1 phút/1 giờ không ngập) nên cây không đủ<br /> CO2 cho quang hợp. Lá cây bị nhạt màu và phát<br /> triển chậm so với đối chứng có đường nên các thí<br /> nghiệm sau chúng tôi sẽ thử bổ sung khí CO2.<br /> <br /> Thí nghiệm 2: So sánh nuôi cây hông hoàn chỉnh<br /> dưới đèn LED trên môi trường không đường có<br /> bổ sung CO2: Thí nghiệm này được bố trí tương<br /> tự như thí nghiệm 1, cây được nuôi trên môi<br /> trường không đường có bổ sung khí CO2 tỷ lệ<br /> 1/10 lượng khí bơm vào (0,1 lít khí CO2 /1 lít khí<br /> bơm vào một phút cho mỗi bình nuôi cây). Thí<br /> nghiệm gồm 3 lần lặp lại bố trí hoàn toàn ngẫu<br /> nhiên gồm 5 nghiệm thức chiếu sáng bằng đèn<br /> LED đỏ và xanh với các tỷ lệ khác nhau 90/10;<br /> 85/15; 80/20; 70/30 và chiếu sáng bằng đèn huỳnh<br /> quang thông thường làm đối chứng để xác đinh lại<br /> tỷ lệ đèn LED đã thí nghiệm trước đây (Nguyễn<br /> Đức Minh Hùng và Trần Văn Minh, 2014;<br /> Nguyễn Đức Minh Hùng và cs., 2011). Đo đạt kết<br /> quả thí nghiệm sau 5 tuần nuôi cấy.<br /> <br /> Thí nghiệm 2: So sánh nuôi cây hông hoàn<br /> chỉnh dưới đèn LED trên môi trường không<br /> đường có bổ sung CO2:<br /> Sau khi cải tạo bổ sung khí CO2 vào luồng khí<br /> thổi vào bình. Sau 5 tuần nuôi cấy cây hông trên<br /> môi trường không đường có bổ sung khí CO2<br /> (10% lượng khí thổi vào bình) nuôi cấy dưới sự<br /> chiếu sáng của đèn LED đỏ và xanh với tỷ lệ khác<br /> nhau thu được kết quả qua Bảng 1, Hình 2. Đo<br /> đa ̣c hàm lươ ̣ng chlorophyll tổng số trong lá các<br /> nghiệm thức thí nghiệm trên, thu đươ ̣c các kế t quả<br /> ở Bảng 2.<br /> <br /> Thí nghiệm 3: Nuôi cây hông hoàn chỉnh dưới<br /> đèn LED 20% xanh, 80% đỏ và đèn so sánh với<br /> đèn huỳnh quang trên môi trường không đường.<br /> Thời gian ngập cách quãng là 2, 3, 4 lần/giờ: 30<br /> đoạn thân cây hông cấy mô có chứa 2 mắt mầm<br /> 30<br /> <br /> Journal of Science – 2016, Vol. 12 (4), 28 – 35<br /> <br /> Part D: Natural Sciences, Technology and Environment<br /> <br /> Bảng 1. Kế t quả thí nghiêm<br /> ̣ so sánh nuôi cây hông trên môi trường không đường có bổ sung khí CO2<br /> <br /> Số lá<br /> <br /> Chiề u cao<br /> cây (cm)<br /> <br /> Số rễ<br /> <br /> Chiề u dài rễ<br /> (cm)<br /> <br /> Tro ̣ng lươ ̣ng<br /> tươi (g)<br /> <br /> Đố i chứng<br /> <br /> 5,5<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 7,9<br /> <br /> 2,4<br /> <br /> 0,54<br /> <br /> NT 1 (10%X:90%Đ)<br /> <br /> 4,8<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> 5,9<br /> <br /> 5,8<br /> <br /> 0,48<br /> <br /> NT 2 (15%X:85%Đ)<br /> <br /> 6,5<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> 6,2<br /> <br /> 5,3<br /> <br /> 0,63<br /> <br /> NT 3 (20%X:80%Đ)<br /> <br /> 6,6<br /> <br /> 4,3<br /> <br /> 6,6<br /> <br /> 6,1<br /> <br /> 0,64<br /> <br /> NT 4 (30%X:70%Đ)<br /> <br /> 5,2<br /> <br /> 3,1<br /> <br /> 5,8<br /> <br /> 5,9<br /> <br /> 0,59<br /> <br /> 17,32<br /> <br /> 16,04<br /> <br /> 21,96<br /> <br /> 23,90<br /> <br /> 30,71<br /> <br /> Nghiêm<br /> ̣ thức<br /> <br /> CV(%)<br /> <br /> Hình 2. Thí nghiệm cây hông trên bioreactor<br /> (1) Trên môi trường không đường; (2) Môi trường có đường bình thường<br /> <br /> Các kết quả thí nghiệm trên Bảng 2 cho thấy cây nuôi trên môi trường không đường ở nghiệm thức 3<br /> (ánh sáng đèn LED 20% màu xanh + 80% màu đỏ) là tốt nhất, số lượng chlorophyll cũng cao hơn các<br /> nghiệm thức còn lại kể cả đối chứng. Kết quả này khác với kết quả nuôi cây trên môi trường có đường ở<br /> trên là nghiệm thức 2 tốt nhất nhưng chỉ có khác biệt có ý nghĩa đối với chiều cao cây, các chỉ tiêu còn lại<br /> không khác biệt có ý nghĩa thống kê có thể do lượng khí CO2 cung cấp chưa đầy đủ cho quang hợp. Tuy<br /> nhiên kết quả này cũng cho thấy bioreactor ngập chìm cách quãng có thể nuôi cấy cây trên môi trường<br /> không đường với sự bổ sung CO2 thích hợp.<br /> Bảng 2. Kế t quả phân tích chlorophyll tổng số lá cây hông nuôi cấy dưới đèn LED trên môi trường không đường có<br /> bổ sung CO2<br /> <br /> Nghiệm thức<br /> <br /> Chlorophyll (mg/ml)<br /> <br /> Đối chứng<br /> <br /> 3,955c<br /> <br /> Nghiệm thức 1 (10%X:90%Đ)<br /> <br /> 3,906c<br /> <br /> Nghiệm thức 2 (15%X:85%Đ)<br /> <br /> 4,011b<br /> <br /> Nghiệm thức 3 (20%X:80%Đ)<br /> <br /> 4,397a<br /> <br /> Nghiệm thức 4 (30%X:70%Đ)<br /> <br /> 3,200d<br /> <br /> 31<br /> <br /> Journal of Science – 2016, Vol. 12 (4), 28 – 35<br /> <br /> Part D: Natural Sciences, Technology and Environment<br /> <br /> Hình 3. Kết quả thí nghiê ̣m so sánh nuôi cây hông trên môi trường không đường có bổ sung khí CO2.<br /> (a) Đối chứng, ánh sáng đèn huỳnh quang; (b) Ánh sáng đèn LED 10% màu xanh + 90% màu đỏ;<br /> (c) Ánh sáng đèn LED 15% màu xanh + 85% màu đỏ; (d) Ánh sáng đèn LED 20% màu xanh + 80% màu đỏ;<br /> (e) Ánh sáng đèn LED 30% màu xanh + 70% màu đỏ.<br /> <br /> chiếu sáng bằng đèn LED tỷ lệ xanh 20% và đỏ<br /> 80% so sánh với đèn huỳnh quang truyền thống,<br /> với số lần ngập cách quãng là 2, 3, 4 lần /giờ, mỗi<br /> lần ngập 1 phút. Đo đạt chiều cao cây, số lá, số rễ,<br /> chiều dài rễ, trọng lượng tươi và khô ta thu được<br /> các kết quả ở Bảng 3.<br /> <br /> Thí nghiệm 3: Nuôi cây hông hoàn chỉnh dưới<br /> đèn LED 20% xanh và 80% đỏ và đèn so sánh<br /> với đèn huỳnh quang trên môi trường không<br /> đường (thời gian ngập cách quãng là 2, 3, 4<br /> lần/giờ):<br /> Sau 5 tuần nuôi cấy cây hông trên môi trường ra<br /> rễ bằng hệ thống Bioreactor ngập cách quãng<br /> <br /> Bảng 3. Kết quả thí nghiệm so sánh chiều cao, số lá, số rễ, chiều dài rễ của cây paulownia trên môi trường không<br /> đường chiếu sáng bằng đèn LED so với đèn huỳnh quang<br /> <br /> Số rễ<br /> <br /> Chiề u<br /> dài rễ<br /> (cm)<br /> <br /> Trọng<br /> lượng<br /> tươi<br /> (g/cây)<br /> <br /> Trọng<br /> lượng<br /> khô<br /> (g/cây)<br /> <br /> Tỷ lệ<br /> khô/tươi<br /> (%)<br /> <br /> 8,30a<br /> <br /> 3,35a<br /> <br /> 1,34ab<br /> <br /> 0,601a<br /> <br /> 0,029<br /> <br /> 4,84<br /> <br /> 3,641b<br /> <br /> 6,71b<br /> <br /> 2,84ab<br /> <br /> 1,11ab<br /> <br /> 0,564a<br /> <br /> 0,026<br /> <br /> 4,64<br /> <br /> 4L (Ngập 4 lần, LED<br /> <br /> 3,545b<br /> <br /> 6,44b<br /> <br /> 2,35b<br /> <br /> 1,01b<br /> <br /> 0,473bc<br /> <br /> 0,022<br /> <br /> 4,56<br /> <br /> 2H (Ngập 2 lần, HQ)<br /> <br /> 3,326b<br /> <br /> 6,53b<br /> <br /> 2,75ab<br /> <br /> 1,25ab<br /> <br /> 0,539ab<br /> <br /> 0,026<br /> <br /> 4,90<br /> <br /> 3H (Ngập 3 lần, HQ)<br /> <br /> 3,246b<br /> <br /> 6,97b<br /> <br /> 2,15b<br /> <br /> 1,06b<br /> <br /> 0,405c<br /> <br /> 0,019<br /> <br /> 4,63<br /> <br /> 4H (Ngập 4 lần, HQ)<br /> <br /> 2,548c<br /> <br /> 4,51c<br /> <br /> 3,33a<br /> <br /> 1,45a<br /> <br /> 0,407c<br /> <br /> 0,019<br /> <br /> 4,60<br /> <br /> 5,85<br /> <br /> 6,36<br /> <br /> 9,29<br /> <br /> 15,32<br /> <br /> 5,85<br /> <br /> 6,36<br /> <br /> 9,29<br /> <br /> Chiề u<br /> cao cây<br /> (cm)<br /> <br /> Số lá<br /> <br /> 2L (Ngập 2 lần, LED)<br /> <br /> 5,100a<br /> <br /> 3L (Ngập 3 lần, LED)<br /> <br /> Nghiêm<br /> ̣ thức<br /> Số lần/giờ<br /> <br /> CV(%)<br /> <br /> Quan sát các bình thí nghiệm khi đo đạc, chúng<br /> tôi nhận thấy phần lớn các bình cây hông ở các<br /> nghiệm thức ngập 3 và 4 lần/giờ cây có hiện<br /> tượng úng lá dưới gốc ở cả 2 phương thức chiếu<br /> sáng bằng đèn LED và đèn huỳnh quang, hiện<br /> <br /> tượng này có thể do gốc cây bị ngập trong môi<br /> trường trong thời gian dài cây chưa thích nghi<br /> được.<br /> Các kết quả thí nghiệm trên Bảng 3 và 4 cho thấy<br /> <br /> 32<br /> <br />