Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện cấy đến khả năng sinh cellulase của 2 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng và bông thải trồng nấm rơm

HNUE JOURNAL OF SCIENCE DOI: 10.18173/2354-1059.2019-0060<br /> Natural Sciences, 2019, Volume 64, Issue 10A, pp. 120-127<br /> This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn<br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG<br /> SINH CELLULASE CỦA 2 CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP<br /> TỪ ĐẤT TRỒNG VÀ BÔNG THẢI TRỒNG NẤM RƠM<br /> <br /> Trần Thị Hồng Nguyệt1 và Phan Duệ Thanh2*<br /> 1<br /> Trường THPT Phạm Công Bình, huyện Yên Lạc, tỉnh Vĩnh Phúc<br /> 2<br /> Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội<br /> <br /> Tóm tắt. Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng<br /> hợp cellulase của chủng vi khuẩn (A19) phân lập từ đất trồng và (C1) từ bã bông thải trồng<br /> nấm rơm đã được nghiên cứu. Chủng A19 sinh tổng hợp cellulase tối ưu khi nuôi cấy trên<br /> môi trường CSM chứa nguồn carbon cám gạo và nguồn nitơ (NH 4)2SO4, sau 48 giờ nuôi<br /> cấy ở 35°C với pH ban đầu là 5,5. Điều kiện nuôi cấy tốt nhất đối với khả năng sinh<br /> cellulase của chủng C1 là trên môi trường CSM với CMC và NH 4Cl là nguồn carbon và<br /> nitơ, sau 72 giờ nuôi cấy ở 35°C với pH ban đầu 5. Với những điều kiện nuôi cấy tối ưu đó,<br /> hoạt độ cellulase của hai chủng A19, C1 lần lượt là 5,03±0,39 và 4,1±0,34 (IU/mL).<br /> Từ khóa: Cellulase, cellulose, endoglucanase, exoglucanase, vi khuẩn.<br /> <br /> 1. Mở đầu<br /> Cellulose là hợp chất sinh học phong phú nhất trong hệ sinh thái trên cạn và dưới nước và là<br /> thành phần chính của sinh khối thực vật. Phế phẩm chủ yếu từ ngành nông nghiệp gồm lá, thân cây,<br /> lõi ngô, bã mía, rơm rạ, vỏ trấu, thân cây gỗ. Nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm sử dụng<br /> cellulose làm nguồn nhiên liệu sinh học và thức ăn [1]. Cellulose do các đơn vị D-glucose liên kết<br /> với nhau nhờ các liên kết ß-1,4-glycosid để tạo thành chuỗi đồng hợp [2].<br /> Cellulose thường bị phân hủy bởi cellulase. Hệ enzyme này gồm ba thành phần chính<br /> endoglucanase, exoglucanase và ß-glucosidase. Cellulase có tiềm năng sử dụng trong công nghệ<br /> sinh học và công nghiệp như công nghiệp dệt may, công nghiệp đồ uống, sản xuất phân bón, thức ăn<br /> chăn nuôi và cồn sinh học [3,4]. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme<br /> cellulase có trong tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nhóm nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn. Vi khuẩn<br /> với ưu điểm thời gian thế hệ ngắn, sinh trưởng nhanh là nguồn sinh tổng hợp cellulase nhiều triển<br /> vọng, bên cạnh nguồn cellulase từ nấm đã được khai thác từ lâu.<br /> Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy và dinh dưỡng đối với<br /> khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng và bông thải<br /> trồng nấm rơm được đánh giá để định hướng ứng dụng xử lý phế phụ phẩm từ nông nghiệp<br /> thành phân bón.<br /> <br /> <br /> <br /> Ngày nhận bài: 19/6/2019. Ngày sửa bài: 29/7/2019. Ngày nhận đăng: 1/9/2019.<br /> Tác giả liên hệ: Phan Duệ Thanh. Địa chỉ e-mail: thanhpd@hnue.edu.vn<br /> <br /> 120<br />  Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện cấy đến khả năng sinh cellulase của 2 chủng vi khuẩn…<br /> <br /> <br /> 2. Nội dung nghiên cứu<br /> 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> 2.1.1. Vật liệu<br /> Trong nghiên cứu này, 02 chủng vi khuẩn ký hiệu là A19 (4,89 IU/mL và 1,23 FPU/mL)<br /> và C1 (3,15 IU/mL và 1,16 FPU/mL) sinh enzyme cellulase (gồm endoglucanase và<br /> exoglucanase) được phân lập và tuyển chọn từ các mẫu đất trồng lúa, ngô, lac thu tại thị trấn<br /> Thanh Lãng - Bình Xuyên - Vĩnh Phúc và mẫu bã bông thải trồng nấm rơm thu tại Sóc Sơn,<br /> Hà Nội.<br /> 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> Môi trường sử dụng trong nghiên cứu:<br /> - Môi trường CSM (cellulase selective medium) - thành phần gồm (g/L): peptone 10;<br /> cao nấm men 1; NaCl 0,5; Na2HPO4 6; NH4Cl 1; KH2PO4 3; CMC 5, pH 7,2 [5].<br /> - Môi trường khoáng chứa CMC (carboxymethyl cellulose) - thành phần gồm (g/L):<br /> KH2PO4 3; NaCl 0,5; NH4NO3 2; NH4Cl 1; Na2HPO4 6; CMC 5 [6].<br /> - Môi trường chứa CMC - thành phần gồm (g/L): Peptone 0,2; NaNO3 2; KCl 0,5;<br /> K2HPO4 1; MgSO4 0,5; CMC 2 [7].<br /> - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Cellulomonas - thành phần gồm (g/L): cao nấm men<br /> 0,5; NaNO3 1; KCl 1; K2HPO4 1; MgSO4.7H2O 0,5; glucose 1; CMC 5 [6].<br /> Vi khuẩn nghiên cứu đươc nuôi trong 25mL mỗi loại môi trường nghiên cứu dịch thể lắc<br /> 180v/p, trong thời gian 48 giờ ở 37C. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 5<br /> phút, thu dịch nổi để kiểm tra hoạt tính cellulose.<br /> Xác định thời gian sinh cellulase mạnh nhất: Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy 96 giờ<br /> trong môi trường CSM lỏng, lắc với tốc độ 180 vòng/phút, ở ứ mỗi 24 giờ thu dịch<br /> nuôi cấy để xác định hoạt độ cellulase.<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon: Hai chủng vi khuẩn được nuôi lắc ở tốc độ 180<br /> vòng/phút, nhiệt độ 37C trong môi trường CSM có nguồn carbon CMC (5 g/L) được sử dụng<br /> làm đối chứng (ĐC). Nguồn carbon này trong môi trường được thay thế bằng một số nguồn<br /> carbon (đánh số La Mã từ I đến X) như sau: CMC 10 g (I); bột giấy 5 g (II); bột giấy 10 g (III);<br /> cám gạo 5 g (IV); rơm 5 g (V); CMC 2,5 g và bột giấy 2,5 g (VI); CMC 2,5 g và cám gạo 2,5 g<br /> (VII); CMC 2,5 g và rơm 2,5 g (VIII); bột giấy 2,5 g và rơm 2,5 g (IX); bột giấy 2,5 g và cám<br /> gạo 2,5 g (X). Dịch nuôi cấy được thu nhận ở thời điểm nuôi cấy tối ưu đối với từng chủng để<br /> định lượng hoạt độ cellulase.<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ: Nuôi lắc hai chủng vi khuẩn với tốc độ 180<br /> vòng/phút, nhiệt độ 37C trong môi trường CSM dịch thể chứa nguồn carbon tối ưu với cao<br /> nấm men và pepton được thay thế bằng các nguồn nitơ (kí hiệu từ A đến G) gồm: NH4Cl (A);<br /> (NH4)2SO4 (B); NH4NO3 (C); NH4HCO3 (D); (NH4)2C2O2.H2O (E); NaNO3 (F) và urê (G). Dịch<br /> nuôi cấy được thu nhận ở thời điểm nuôi cấy tối ưu đối với từng chủng để định lượng hoạt độ<br /> cellulase.Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu: Nuôi lắc hai chủng vi khuẩn ở điều kiện 180<br /> vòng/phút, nhiệt độ 37C trong môi trường CSM dịch thể chứa nguồn carbon, nitơ tối ưu với dải<br /> pH từ 4 đến 8, bước nhảy 0,5. Dịch nuôi cấy được thu nhận ở thời điểm tối ưu đối với từng<br /> chủng để định lượng hoạt độ cellulase.<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi<br /> trường CSM dịch thể với nguồn carbon, nitơ và pH tối ưu trong dải nhiệt độ từ 30C - 55C,<br /> bước nhảy là 5C. Dịch nuôi cấy được thu nhận ở thời điểm nuôi cấy tối ưu đối với từng chủng<br /> để định lượng hoạt độ cellulase.<br /> <br /> 121<br />  Tran Thi Hong Nguyet* và Phan Due Thanh<br /> <br /> Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase: Sau mỗi thí nghiệm, dịch nuôi cấy vi sinh<br /> vật được ly tâm thu dịch nổi với tốc độ 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút và dùng để định<br /> lượng cellulase theo phương pháp đường khử DNS (Dinitrosalysilic acid) [8]. D-glucose ở các<br /> nồng độ 0; 2; 4; 6; 8; 10 (µmol/mL) được sử dụng để dựng đồ thị chuẩn. Phản ứng màu giữa<br /> đường khử sinh ra dưới tác dụng của enzyme và cơ chất (CMC - endoglucanase và bột giấy -<br /> exoglucanase) với thuốc thử DNS khi đun nóng ở 90C được xác định độ hấp phụ tại bước sóng<br /> 540nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong phản ứng.<br /> Quy ước: một đơn vị hoạt tính endoglucanase (IU) hoặc exoglucanase (FPU) là lượng enzyme cần<br /> thiết để giải phóng 1µmol đường khử D-glucose trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm.<br /> Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel<br /> để tìm giá trị trung bình và độ lệch chuẩn.<br /> 2.2. Kết quả nghiên cứu và thảo luận<br /> Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy cơ sở<br /> Hai chủng vi khuẩn A19 và C1 đều có khả năng sinh tổng hợp cellulase trên các môi trường<br /> nghiên cứu gồm môi trường khoáng, môi trường CMC, môi trường dành cho vi khuẩn<br /> Cellulomonas và môi trường CSM (hình 1). Hai chủng vi khuẩn C1, A9 thể hiện hoạt độ<br /> cellulase mạnh nhất trên môi trường CSM, tương ứng với 3,23±0,23 và 4,89±0,32 (IU/mL).<br /> Hoạt độ cellulase của chủng vi khuẩn C1 thấp hơn khi nuôi cấy trong các môi trường dành cho<br /> vi khuẩn Cellulomonas, môi trường khoáng và thấp nhất ở môi trường CMC và lần lượt đạt<br /> 1,64±0,12; 1,57±0,3 và 1,36±0,1 (IU/mL). Trong khi đó, hoạt độ cellulase của chủng A19 nuôi<br /> cấy trên môi trường dành cho vi khuẩn Cellulomonas đạt 2,7±0,18; trên môi trường CMC là<br /> 1,5±0,12 và trên môi trường khoáng là 1,37±0,2 (IU/mL).<br /> 6<br /> A19 C1<br /> Hoạt độ enzyme (IU/mL)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 5<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> MT khoáng MT CMC MT cho MT CSM<br /> Cellulomonas<br /> Môi trường cơ sở<br /> <br /> Hình 1. Hoạt độ cellulase của chủng A19 và C1 trên các môi trường nuôi cấy<br /> Như vậy cả hai chủng nghiên cứu đều sinh enzyme cellulase mạnh nhất khi nuôi cấy trên<br /> môi trường CSM. Môi trường CSM cũng là môi trường có thành phần nitơ hữu cơ khá cao<br /> (pepton 10g/L, cao nấm men 1g/L). Khả năng này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc<br /> định hướng ứng dụng các chủng trong sản xuất phân bón hữu cơ từ phế phụ phẩm nông nghiệp<br /> mà nghiên cứu hướng tới. Trong các phế phụ phẩm nông nghiệp, bên cạnh thành phần cellulose,<br /> còn có một số hợp chất hữu cơ khác như tinh bột và protein. Trong tiền thí nghiệm, bên cạnh<br /> khả năng sinh cellulase, các chủng vi khuẩn nghiên cứu còn khả năng sinh tổng hợp các enzyme<br /> khác như: amylase, protease. Các enzyme sinh bởi các chủng này sẽ tham gia phân giải các hợp<br /> chất hữu cơ từ các phế phụ phẩm nông nghiệp. Vì vậy, môi trường CSM được lựa chọn làm môi<br /> trường cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.<br /> 122<br />  Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện cấy đến khả năng sinh cellulase của 2 chủng vi khuẩn…<br /> <br /> Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy<br /> Khi nuôi cấy trên môi trường CSM lỏng, hoạt độ cellulase thể hiện cao nhất ở thời điểm 48<br /> giờ với chủng A19 đạt 4,75±0,4 (IU/mL) và 72 giờ đối với chủng C1 đạt 3,47±0,31 (IU/mL)<br /> (hình 2). Hoạt độ cellulase giảm dần từ 48 giờ đến 96 giờ nuôi cấy đối với chủng A19 và từ 72<br /> giờ đến 96 giờ đối với chủng C1. Do đó, thời điểm 72 giờ nuôi cấy đối với chủng C1 và 48 giờ<br /> đối với chủng A19 đã được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.<br /> <br /> <br /> 6<br /> A19 C1<br /> 5<br /> Hoạt độ enzyme (IU/mL)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> 24 48 72 96<br /> Thời gian nuôi cấy (giờ)<br /> <br /> Hình 2. Hoạt độ cellulase của hai chủng A19 và C1 theo thời gian nuôi cấy<br /> <br /> Ảnh hưởng của nguồn carbon<br /> Khả năng đồng hoá các nguồn carbon của các chủng vi khuẩn được quyết định bởi môi<br /> trường sống tự nhiên của các chủng vi khuẩn. Hình 3 là kết quả đánh giá ảnh hưởng của nguồn<br /> carbon trong môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng vi khuẩn. Trong<br /> môi trường nuôi cấy, nguồn carbon là cám gạo với hàm lượng 5 g/L (IV) có ảnh hưởng tích cực<br /> nhất tới khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng A19 (hình 3) với hoạt độ đạt 4.99±0,31<br /> (IU/mL). Kết quả này cao hơn lô đối chứng với CMC là nguồn carbon (ĐC). Chủng A19 trong<br /> các lô thí nghiệm sử dụng duy nhất cám gạo là nguồn carbon (IV) hoặc cám gạo kết hợp cùng<br /> nguồn carbon khác (VII, X) đều cho hoạt tính cellulase cao hơn 4 (IU/mL). Cám gạo là nguồn<br /> carbon tự nhiên với thành phần dinh dưỡng đa dạng như: xơ, khoáng, acid béo không no… [9].<br /> Mặt khác, kết quả tiền thí nghiệm cho thấy chủng A19 có khả năng sinh enzyme amylase phân<br /> giải tinh bột. Vì vậy, chủng A19 có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân bón hữu cơ từ phế<br /> phụ phẩm nông nghiệp. Với nguồn carbon tự nhiên là cám gạo, phế phẩm từ lúa gạo, có giá<br /> thành thấp được dùng thay thế cho CMC sẽ rất thuận lợi cho quá trình lên men thu cellulase từ<br /> chủng vi khuẩn A19 trên quy mô công nghiệp. Đối với chủng C1, nguồn carbon CMC có ảnh<br /> hưởng tích cực nhất đối với quá trình lên men sinh tổng hợp cellulase. Trong tất cả các lô thí<br /> nghiệm có bổ sung CMC (I, VI, VII, VIII, IX), hoạt tính cellulase của chủng C1 đạt trên 2 đến<br /> 3,78 (IU/mL) và cao hơn các thí nghiệm sử dụng các nguồn carbon khác (đạt dưới 2 IU/mL).<br /> Với lượng CMC bổ sung là 10 g/L (I), hoạt tính cellulase của chủng C1 đạt cao nhất 3,78±0,2<br /> (IU/mL) và cao hơn lô đối chứng sử dụng CMC với hàm lượng thấp hơn (5 g/L). Kết quả này<br /> cũng tương tự kết quả trong các nghiên cứu khác. Với nguồn carbon là CMC, các chủng vi<br /> khuẩn thuộc chi Bacillus, Microbacterium thể hiện hoạt độ cellulase tăng gấp 3-6 lần [10,11].<br /> <br /> <br /> 123<br />  Tran Thi Hong Nguyet* và Phan Due Thanh<br /> <br /> Dựa trên kết quả nghiên cứu và những phân tích như trên, nguồn carbon được lựa chọn bổ sung<br /> vào môi trường nuôi cấy đối với chủng A19 là cám gạo (5 g/L) và chủng C1 là CMC (10 g/L).<br /> 6<br /> A19 C1<br /> Hoạt độ enzyme (IU/mL)<br /> <br /> 5<br /> 4<br /> 3<br /> 2<br /> 1<br /> 0<br /> I II III IV V VI VII VIII IX X ĐC<br /> <br /> Nguồn carbon<br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hoạt độ cellulase của hai chủng A19 và C1<br /> Ảnh hưởng của nguồn nitơ<br /> Khả năng đồng hoá các nguồn nitơ khác nhau của hai chủng A19 và chủng C1 được thể<br /> hiện trong hình 4.<br /> 6<br /> A19 C1<br /> Hoạt độ enzyme (UI/mL)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 5<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> A B C D E F G<br /> Nguồn nitơ<br /> <br /> Hình 4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới hoạt độ cellulase của hai chủng A19 và C1<br /> Chủng A19 sinh cellulase mạnh nhất với nguồn nitơ là (NH4)2SO4 (B) và đạt 5,18±0,42<br /> (IU/mL). Chủng này cho thấy khả năng đồng hoá khá tốt các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Hoạt<br /> tính enzyme cellulase với nguồn nitơ NH4Cl (A) đạt 4,99±0,35; NH4HCO3 (D) là 4,56±0,29;<br /> (NH4)2C2O2.H2O (E) là 4,35±0,3; NaNO3 (F) là 4,24±0,29; NH4NO3 (C) là 3,95±0,21 và urê (G)<br /> là 3,14±0,25 (IU/mL). Kết quả này rất thuận lợi cho quá trình lên men trong nghiên cứu khả<br /> năng sinh tổng hợp cellulase từ chủng A19 cũng như đưa chủng này vào ứng dụng thực tế<br /> chuyển hóa phế phụ phẩm nông nghiệp thành phân bón hữu cơ. Nguồn NH4Cl (A) là nguồn nitơ<br /> cảm ứng phù hợp nhất để với chủng C1 sinh cellulase với hoạt độ enzyme đạt 3,78±0,26<br /> (IU/mL). Đối với các nguồn nitơ còn lại (B-G), cellulase sinh bởi chủng này có hoạt độ nhỏ hơn<br /> 2 (IU/mL). Dựa trên kết quả nghiên cứu, nguồn nitơ là (NH4)2SO4 đối với chủng A19 và NH4Cl<br /> đối với chủng C1 được lựa chọn trong các bước nghiên cứu tiếp.<br /> 124<br />  Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện cấy đến khả năng sinh cellulase của 2 chủng vi khuẩn…<br /> <br /> Ảnh hưởng của pH ban đầu<br /> Ảnh hưởng của điều kiện pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của<br /> hai chủng nghiên cứu được thể hiện trong hình 5.<br /> <br /> 7<br /> A19 C1<br /> 6<br /> Hoạt độ enzyme (IU/mL)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 5<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0<br /> pH ban đầu của môi trường nuôi cấy<br /> <br /> <br /> Hình 5. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới hoạt độ cellulase của hai chủng A19 và C1<br /> Hai chủng vi khuẩn đều chịu ảnh hưởng mạnh bởi điều kiện pH môi trường. Hoạt tính<br /> enzyme mạnh nhất khi nuôi cấy chủng A19 trong môi trường có pH 5,5 và đạt 5,41±0,41<br /> (IU/mL) và chủng C1 ở môi trường có pH 5,0 và đạt 3,75±0,31 (IU/mL) (hình 5). Cả hai chủng<br /> nghiên cứu đều sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện pH môi trường từ 4 đến 8. Khả năng<br /> sinh cellulase trong dải pH môi trường từ 4,5 – 6,5 cũng được thấy ở chủng vi khuẩn<br /> Cellulomonas uda [12] và các chủng thuộc chi Bacillus trong một số nghiên cứu [13,14]. Dựa<br /> vào kết quả thu được, pH môi trường là 5,5 và 5,0 được lựa chọn cho môi trường nuôi cấy<br /> tương ứng với chủng vi khuẩn A19 và C1 trong các nghiên cứu tiếp.<br /> Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy<br /> Đối với các enzyme ngoại bào, nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến việc tiết enzyme bằng cách<br /> thay đổi tính chất vật lý của màng tế bào [15]. Mức độ tiết của enzyme sẽ tỷ lệ thuận với hoạt độ<br /> của nó. Các tác giả Murao và cộng sự (1988) báo cáo rằng nhiệt độ tối ưu để sản xuất cellulase<br /> phụ thuộc vào chủng vi sinh vật [16]. Do đó, nhiệt độ tối ưu để sản xuất enzyme này do vi sinh<br /> vật tạo ra là khác nhau. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ cellulase sinh bởi hai<br /> chủng vi khuẩn được thể hiện trong hình 6. Hai chủng A19 và C1 có khả năng sinh tổng hợp<br /> cellulase mạnh nhất khi nhiệt độ nuôi cấy là 35°C (chủng A19 đạt 5,03±0,39 IU/mL và chủng<br /> C1 đạt 4,1±0,34 IU/mL). Hoạt độ cellulase của hai chủng giảm dần khi nhiệt độ nuôi cấy tăng<br /> trên 35°C.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 125<br />  Tran Thi Hong Nguyet* và Phan Due Thanh<br /> <br /> <br /> 6<br /> A19 C1<br /> Hoạt độ enzyme (IU/mL)<br /> <br /> 5<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C 55°C<br /> Nhiệt độ nuôi cấy<br /> <br /> <br /> Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ cellulase của hai chủng A19 và C1<br /> <br /> 3. Kết luận<br /> Hai chủng vi khuẩn phân lập từ đất và bã bông thải trồng nấm rơm gồm A19 và C1. Hai<br /> chủng này đều có khả năng sinh enzyme cellulase tốt nhất với môi trường cơ sở là CSM, sau 48-<br /> 72 giờ nuôi cấy. Hai chủng nghiên cứu sinh cellulase trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy từ 35°C-<br /> 55°C (tốt nhất là 35°C) với dải pH ban đầu khá rộng từ 4 đến 8. pH ban đầu tốt nhất đới với<br /> chủng A19 là 5,5 và C1 là 5. Hai chủng thể hiện khả năng đồng hoá nhiều nguồn carbon nhưng<br /> sinh cellulase mạnh nhất với nguồn carbon là cám gạo đối với A19 và CMC đối với C1. Nguồn<br /> nitơ tốt nhất đối với khả năng sinh tổng hợp cellulase bới hai chủng A19 và C1 lần lượt là<br /> (NH4)2SO4 và NH4Cl.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> [1] A. Balachandrababu, M.M. Revathi, A. Yadav and N. Sakthivel, 2012. Purification and<br /> characterization of a thermophilic cellulose from a novel cellulolytic strain, Paenibacillus<br /> barcinonensis. J. Microbiol. Biotechnol., 22, pp.1501-1509.<br /> [2] S. Salmon and S.M. Hudson, 1997. Crystal morphology, biosynthesis and physical<br /> assembly of cellulose, chitin, and chitosan. Rev. Macromol. Chem. Phys., 37, pp.199-276.<br /> [3] M.K. Bhat, 2000. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Adv.<br /> Biotechnol.;1:355–83.<br /> [4] S.J. Sreeja, P.W.J. Malar, F.R.S. Joseph, T. Steffi, G. Immanuel and A. Palavesam, 2013.<br /> Optimization of cellulase production by Bacillus altitudinis APS MSU and Bacillus<br /> licheniformis APS2 MSU, gut isolates of fish Etroplus suratensis. IJOART, 2, pp.401-406.<br /> [5] J.M. Kim, I.S. Kong and J.H. Yu, 1987. Molecular cloning of an endoglucanase gene<br /> from an alkalophilic Bacillus sp. and its expression in Escherichia coli. Appl. Environ.<br /> Microbiol., 53(11), pp.2656-2659.<br /> [6] K. Apun, 1995. Lecture notes on cellulase production. National Centre for Biotechnology<br /> Education, London<br /> [7] R.C. Kasana, R. Salwan, H. Dhar, S. Dutt and A. Gulati, 2008. A rapid and easy method<br /> for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine. Cur.<br /> 126<br />  Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện cấy đến khả năng sinh cellulase của 2 chủng vi khuẩn…<br /> <br /> Microbiol, 57, pp.503-507.<br /> [8] G.L. Miller, 1959. Use of dinitrosalycylic acid reagent for determination of reducing<br /> sugar. Anal. Chem., 31, pp.538-542.<br /> [9] S.A.S.C. Faria, P.Z. Bassinello and M.V.C. Penteado, 2012. Nutritional composition of<br /> rice bran submitted to different stabilization procedures. Braz. J. Pharm. Sci., 48(4),<br /> pp.651-657.<br /> [10] D. Deka, P. Bhargav, A. Sharma, D. Goyal, M. Jawed and A. Goyal, 2011. Enhancement<br /> of cellulase activity from a new strain of Bacillus subtilis by medium optimization and<br /> analysis with various cellulosic substrates. Enzyme Res., 2011, 151656. 
<br /> [11] S. Sadhu, P. Saha, S. Mayilraj and T.K. Maiti, 2011. Lactose-enhanced cellulase<br /> production by Microbacterium sp. isolated from fecal matter of zebra (Equus zebra). Curr.<br /> Microbiol., 62, pp.1050-1055.<br /> [12] K. Nakamura and K. Kitamura, 1988. Cellulases of Cellulomonas uda. Meth. Enzymol.,<br /> 160, pp.211-216.<br /> [13] Y.H. Li, M. Ding, J. Wang, G.J. Xu and F. Zhao, 2006. A novel thermoacidophilic<br /> endoglucanase, Ba- EGA, from a new cellulose-degrading bacterium, Bacillus sp. AC-1.<br /> Appl. Microbiol. Biotechnol., 70, pp.430-436.<br /> [14] M.A. Patel, M.S. Ou, L.O. Ingram and K.T. Shanmugam, 2005. Simultaneous<br /> saccharification and co-fermentation of crystalline cellulose and sugar cane bagasse<br /> hemicellulose hydrolysate to lactate by a thermo-tolerant acidophilic Bacillus sp..<br /> Biotechnol. Prog., 21, pp.1453-1460.<br /> [15] J. Vortruba, J. Pazlarova M. Dvorakova, L. Vachora, M. Strnadov, H. Kucerova, V. Vinter,<br /> R. Zourabian and J. Chaloupka, 1991. External factors involved in the regulation of<br /> synthesis of an extracellular proteinase in Bacillus megaterium: Effect of temperature.<br /> Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, pp.352-357.<br /> [16] S. Murao, R. Sakamoto and M. Arai, 1988. Cellulase of Aspergillus aculeatus: Methods in<br /> Enzymology. In: Wood, W.A. dan Kellog, S.T. London: Academic Press Inc.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> <br /> Effect of culture conditions on two cellulase-producing bacteria isolated from cultivated<br /> soil and cotton residue of straw mushroom production<br /> Tran Thi Hong Nguyet1 and Phan Due Thanh2*<br /> 1<br /> Pham Cong Binh High School, Yen Lac District, Vinh Phuc Province<br /> 2<br /> Faculty of Biology, Hanoi National University of Education<br /> In this study, the effect of culture conditions on the ability of cellulase production by two<br /> bacterial strains, isolated from cultivated soil (A19) and from cotton residue of straw mushroom<br /> production (C1), were studied. Strain A19 synthesized cellulase optimally when it was cultured<br /> on CSM medium containing a carbon source of rice bran and a nitrogen source of (NH4)2SO4,<br /> after 48 hours of culturing at 35°C, and initial pH of 5.5. The best culture conditions for<br /> cellulase production of strain C1 were on CSM medium containing CMC as a carbon source and<br /> NH4Cl as a nitrogen source, after 72 hours of incubation at temperature of 35°C, initial pH of 5.<br /> At these optimal culture conditions, cellulase activity of these two strains A19 and C1 were<br /> 5.03±0.39 and 4.1±0.34 (IU/mL), respectively.<br /> Keywords: Bacteria, cellulase, cellulose, endoglucanase, exoglucanase.<br /> <br /> <br /> <br /> 127<br />