Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của Bacillus amyloliquefacien N1

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của chủng B. amyloliquefaciens N1, phân lập từ nem chua Huế, như thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH ban đầu và thời gian lên men đã được nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của Bacillus amyloliquefacien N1

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, tập 71, số 2, năm 2012 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ THU NHẬN CHẾ PHẨM PROTEASE NGOẠI BÀO CỦA Bacillus amyloliquefacien N1 Đỗ Thị Bích Thủy Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế Tóm tắt. Một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của chủng B. amyloliquefaciens N1, phân lập từ nem chua Huế, như thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH ban đầu và thời gian lên men đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy rằng tinh bột hòa tan là nguồn carbon bổ sung vào môi trường cơ bản (MTCB), có chứa 1% petone, 0,3% cao thịt và 0,5% NaCl, làm cho quá trình thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của B. amyloliquefaciens N1 tốt nhất; hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy đạt được 0,758 HP/ml, lớn hơn so với mẫu đối chứng (0,613 HP/ml) 1,2 lần. Trong tất cả các nguồn nitơ bổ sung vào MTCB, chỉ có casein làm cho hoạt độ protease (0,758 HP/ml) cao hơn mẫu đối chứng (0,511 HP/ml). Các thí nghiệm có bổ sung kết hợp các nguồn nitơ và carbon vào môi trường nuôi cấy, hoạt độ protease không tăng so với khi khảo sát ảnh hưởng riêng rẽ nguồn tinh bột. Trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột (0,25%-1,75%) đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng này, hoạt độ quan sát đạt được giá trị cao nhất (0,760 HP/ml) ở hàm lượng tinh bột 0,75%. Môi trường nuôi cấy có thành phần thích hợp cho quá trình thu nhận chế phẩm protease ngoại bào B. Amyloliquefaciens N1 được gọi là môi trường thích hợp (MTTH). Nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens N1 trong MTTH, hoạt độ protease đạt cao nhất ở pH ban đầu bằng 8 và nhiệt độ 35oC. Thời gian thu nhận enzyme thích hợp nhất khi nuôi cấy chủng này trong các điều kiện trên là 32 giờ với hoạt độ đạt được là 0,777 HP/ml. Từ khóa: Bacillus amyloliquefaciens N1, môi trường, nhiệt độ, protease, thu nhận. 1. Đặt vấn đề Protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide trong phân tử protein. Nó được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng... và chiếm khoảng 60% thị trường enzyme. Chế phẩm enzyme này có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới, đa số các chế phẩm enzyme này được thu nhận từ vi sinh vật do có nhiều ưu điểm vượt trội như chu kỳ phát triển 279
ngắn, môi trường nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển…. Vì vậy, hai phần ba protease ứng dụng trong công nghiệp được sản xuất ra từ vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn. Quá trình thu nhận các chế phẩm protease phụ thuộc rất nhiều yếu tố như tính chất nguyên liệu, tác nhân vi sinh vật, điều kiện thu nhận... Vì vậy, tùy từng trường hợp cụ thể, cần nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp để thu nhận các chế phẩm protease phù hợp với mục đích sử dụng. Hiện nay, trên thế giới, các chế phẩm protease đã được thương mại hóa và được đưa vào ứng dụng một cách rộng rãi. Tuy vậy, trong thời gian gần đây, trên thế giới, nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục tiến hành nghiên cứu thu nhận, tinh chế, xác định các tính chất của chế phẩm thu được (Gessesse et al., 2002; Mehrotra et al., 1999; Gajju et al., 1996, Kim et al., 2001; Rai, Mussarat et al., 2009; ...). Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu về protease vi sinh vật, tuy nhiên chỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (Lê Gia Hy et al., 2000, Lê Đức Mạnh et al., 1995) ..., nghiên cứu ứng dụng enzyme vẫn còn hạn chế. Hiện nay, trong nước chưa có cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme, các chế phẩm sử dụng trong nước đều phải nhập ngoại. Từ chủng Bacillus amyloliquefacien N1 phân lập từ nem chua Huế có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào cao, trong công trình này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease ngoại bào của nó như thành phần môi trường, nhiệt độ, pH ban đầu và thời gian nuôi cấy. Kết quả này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm thiết lập được quy trình sản xuất chế phẩm protease ngoại bào từ B. amyloliquefaciens N1 có hiệu quả kinh tế cao. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu Chủng Bacillus amyloliquefacien N1 phân lập từ nem chua có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào cao được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Viện Tài nguyên môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme Phân phối 0,5 ml dịch canh trường vào bình tam giác dung tích 100 ml có chứa 20 ml môi trường. Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ ở 35oC. Dịch môi trường nuôi cấy có chứa enzyme được thu nhận bằng cách ly tâm tách tế bào ở 14.000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong 10 phút. 2.2.2. Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến Nguyên tắc của phương pháp là định lượng sản phẩm tạo thành do quá trình thủy phân cơ chất casein của protease bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Hỗn hợp 280
phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme và dung dịch casein 2,0%, tỷ lệ 1:2 (v/v) được ủ ở 30oC trong 10 phút; ngưng phản ứng bằng dung dịch tricloacetic acid (TCA) 5,0% theo tỷ lệ 5 thể tích dung dịch acid cho 1 thể tích enzyme; ly tâm thu dịch nổi để thực hiện phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na2CO3 6% (tỷ lệ dịch nổi: dung dịch Na2CO3: Folin 0,2N = 1:4:1). Thực hiện đồng thời mẫu kiểm tra bằng cách cho dung dịch TCA vào enzyme trước khi ủ với cơ chất. Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch màu thu được sau phản ứng được đo trên máy quang phổ kế ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để tính sản phẩm tạo thành tương ứng dưới tác dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt độ protease (HP) được định nghĩa là lượng enzyme mà trong một phút ở 30oC có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong tricloacetic acid, cho phản ứng màu tương đương với 1,0 µmol tyrosine. 2.2.3. Nghiên cứu thành phần môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào bởi B. amyloliquefaciens N1 Chủng B. amyloliquefaciens N1 được nuôi cấy để thu nhận enzyme trong môi trường cơ bản (MTCB) bao gồm 1% peptone, 0,3% cao thịt và 0,5% NaCl làm mẫu đối chứng (ĐC) và các môi trường có bổ sung các nguồn carbon (tinh bột hòa tan, lactose, glucose, saccharose) và nguồn nitơ (NH4Cl, casein, cao nấm, urê) vào MTCB. Mỗi nguồn bổ sung 0,5%. Sau đó, tiến hành phối hợp nguồn cacbon có tác dụng kích thích vi khuẩn sinh tổng hợp protease ngoại bào cao nhất với các nguồn nitơ khác; đồng thời khảo sát kết hợp nguồn nitơ kích thích vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cao nhất với các nguồn carbon khác. Xác định hoạt độ protease trong dịch môi trường thu được sau khi nuôi cấy bằng phương pháp Anson cải tiến. Môi trường có thành phần thích hợp cho vi khuẩn sinh tổng hợp protease ngoại bào cao nhất được gọi là môi trường thích hợp (MTTH). 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào B. amyloliquefaciens N1 B. amyloliquefaciens N1 được nuôi cấy để thu nhận enzyme trong MTTH có pH ban đầu thay đổi trong khoảng 5-11. Hoạt độ proease trong dịch môi trường thu được sau khi nuôi cấy được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến. 2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào B. amyloliquefaciens N1 Quá trình nuôi cấy thu nhận enzyme ngoại bào của chủng B. amyloliquefaciens N1 được thực hiện trong MTTH và pH ban đầu thích hợp. Nhiệt độ nuôi cấy được thay đổi trong các mẫu thí nghiệm từ 30oC đến 60oC. Hoạt độ protease trong môi trường sau khi nuôi cấy được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến. 2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào B. amyloliquefaciens N1 281
B. amyloliquefaciens N1 được nuôi cấy để thu nhận enzyme trong MTTH, pH ban đầu và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp và thay đổi thời gian nuôi cấy từ 8 giờ đến 72 giờ. Sau mỗi khoảng thời gian nuôi cấy 8 giờ, các mẫu thí nghiệm được lấy để xác định hoạt độ protease trong môi trường bằng phương pháp Anson cải tiến. 2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả thí nghiệm thu được trong quá trình nghiên cứu đều được phân tích sai số (Analysis Of Variance, ANOVA) và xử lý Ducan để xác định sự sai khác giữa các trung bình, có ý nghĩa với độ tin cậy P < 0,05. 3. Kết quả và thảo luận 3.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease ngoại bào của B. amyloliquefaciens N1 0,758 a 0,80 0,656 b 0,70 0,613 c 0,581d 0,542 e Ho t đ (HP/ml) 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Glu Sac Lac TB ĐC Nguồn carbon (0,5%) Hình 1. Ảnh hưởng của nguồn C đến hoạt độ protease trong dịch môi trường nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 (ĐC: Đối chứng; TB: Tinh bột; Glu: Glucose; Lac: Lactose; Sac: Saccharose). (Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test (P
trường, hoạt độ protease trong môi trường thấp hơn so với mẫu đối chứng. Sangeetha và cộng sự (1999) cũng công bố saccharose, glucose có tác dụng kìm hãm hoạt độ protease của Bacillus sp.. Trái lại, Ravichandra và đồng tác giả (2007) và Sangeetha và đồng tác giả (2008) cho rằng glucose có khả năng kích thích sự sinh enzyme mạnh nhất. Nguồn lactose cũng có kích thích chủng này sinh tổng hợp protease ngoại bào nhưng không nhiều. Nhiều công trình đã có những kết luận khác nhau về nguồn này. Có trường hợp công bố lactose làm giảm hoạt độ protease trong dịch môi trường nuôi Bacillus sp. (Sangeetha et al., 1999); trong khi một số trường hợp khác lại cho thấy rằng nguồn này làm tăng hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy (Gerritse et al., 2007; Sangeetha et al., 1999; Robert et al., 2008). Như vậy, các nguồn carbon khác nhau có tác dụng khác nhau lên khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào của vi sinh vật. Đối với B. amyloliquefaciens N1, tinh bột là chất cảm ứng mạnh nhất cho chủng này sinh tổng hợp protease ngoại bào cao. 3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh protease ngoại bào của B. amyloliquefaciens N1 0,567 a 0,60 c 0,511 b 0,502 0,50 Hoạt độ (HP/ml) 0,40 0,30 0,222 d 0,20 0,10 0,012 e 0,00 Ure CN NH4Cl Cas ĐC Nguồn N (0,5%) Hình 2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ protease trong dịch môi trường nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 (ĐC: Đối chứng; Cas: Casein; CN: Caonấm). (Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test (P
giảm ít hơn so với các nguồn nitơ vô cơ. Điều này trái ngược với nghiên cứu của Robert và đồng tác giả (2008) trên chủng Bacillus pumilus SG2 xác định cao nấm men là nguồn nitơ tốt nhất. Điều này có lẽ là do enzyme ngoại bào được tiết ra môi trường từ mỗi loài vi sinh vật có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau nên đòi hỏi các chất cảm ứng khác nhau. 3.3. Ảnh hưởng kết hợp của nguồn carbon và nitơ lên khả năng sinh protease ngoại bào của B. amyloliquefaciens N1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng riêng rẽ của một số nguồn carbon và nitơ đến hoạt độ protease của dịch môi trường nuôi cấy cho thấy nguồn carbon tốt nhất là tinh bột và nguồn nitơ tốt nhất là casein. Chúng tôi tiến hành thử khảo sát hoạt độ protease trong môi trường thu được sau khi nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 có sự bổ sung phối hợp các nguồn carbon và nitơ với nhau. Trong đó, tinh bột được chọn làm nguồn carbon chính phối hợp với các nguồn nitơ khác và casein là nguồn nitơ chính phối hợp với các nguồn carbon khác nhau (Hình 3). 0,736 a b 0,738 a 0,80 0,710 0,70 c c d d 0,564 0,567 0,509 e Hoạt độ (HP/ml) 0,525 0,522 0,60 0,50 0,40 0,30 0,157 f 0,20 0,10 0,00 TB TB Ca Ca Ca TB TB TB Ca s+ s+ s+ s + +C +U +C Gl La Sa N as rê c u c Bổ sung các nguồn dinh dưỡng (0,5%) Hình 3. Ảnh hưởng của sự kết hợp một số nguồn dinh dưỡng hoạt độ protease trong dịch môi trường nuôi cấy B. amylolyquefaciens N1 (ĐC: Đối chứng,; TB: Tinh bột; Glu: Glucose; Lac: Lactose; Sac: Saccharose; Cas: Casein; CN: Caonấm). (Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test (P
quả kinh tế thì chọn mẫu chỉ có bổ sung thích bột là hợp lý nhất. Các thí nghiệm tiếp theo chỉ khảo sát trong môi trường chỉ có bổ sung tinh bột vào MTCB. 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột bổ sung vào lên hoạt độ protease của môi trường nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 Khi bổ sung tinh bột với hàm lượng 0,75% hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy đạt giá trị cao nhất (0,760 HP/ml) so với các hàm lượng tinh bột còn lại (Hình 4). b 0,760 a 0,80 0,737 c c d 0,655 0,654 e f 0,70 0,631 0,627 0,618 0,60 Hoạt độ (HP/ml) 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,25% 0,50% 0,75% 1% 1,25% 1,50% 1,75% Hàm lượng tinh bột (%) Hình 4. Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột đến hoạt độ protease trong dịch môi trường nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 (Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test (P
a c b 0,762 0,80 0,702 0,716 d 0,70 0,621 e 0,60 0,518 Hoạt độ (HP/ml) 0,50 0,40 f 0,30 0,231 g 0,197 0,20 0,10 0,00 5 6 7 8 9 10 11 pH ban đầu của môi trường Hình 5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ của protease trong môi trường nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 (Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test (P
Hoạt độ protease đạt được cao nhất (0,771 HP/ml) ở nhiệt độ nuôi cấy 35oC khi nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 ở khoảng 30 – 60oC (Hình 6). Trong điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, 40oC hoạt độ protease chỉ bằng 0,84 và 0,82 lần so với hoạt độ protease ở 35oC. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ 45oC, hoạt độ protease giảm chỉ còn 0,517 HP/ml; nhiệt độ từ 50oC trở lên giảm hẳn đặc biệt ở nhiệt độ 60oC hoạt độ gần như không có. Điều này có lẽ là khi nhiệt độ càng lên cao enzyme ngoại bào protease bị bất hoạt, đồng thời các enzyme nội bào xúc tác các quá trình trao đổi chất của tế bào cũng bị ảnh hưởng nên vi khuẩn không thực hiện quá trình sinh tổng hợp protein được. Đã có nhiều công trình được công bố khác nhau về ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn. Rai và Ashis (2010) cho kết quả nhiệt độ thích hợp là 37 - 45oC; Kết quả nghiên cứu của Yong và đồng tác giả (2004) và Mussarat và đồng tác giả (2008) là 50oC; trong khi đó Wang và đồng tác giả (2006) công bố là 55oC. 3.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ protease trong môi trường của B. amyloliquefaciens N1 0.90 a 0.777 0.80 0.70 b Hoạt độ (HP/ml) 0.580 c 0.561 0.60 d d 0.50 0.430 0.428 e 0.40 g 0.356 0.289 f 0.293 0.30 h 0.203 0.20 0.10 l 0.001 0.00 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 Thời gian nuôi cấy (giờ) Hình 7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của chủng B. amyloliquefaciens N1 (Các chữ cái trên các số khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa, Duncan’s test (P
các chất dinh dưỡng giảm... làm cho tế bào vi khuẩn suy thoái, enzyme bị bất hoạt. Hơn nữa, đối với protease còn xảy ra hiện tượng autolysis (hiện tượng enzyme tự thủy phân chúng) hoặc do vi sinh vật tổng hợp nên các chất kìm hãm trong môi trường làm cho hoạt độ protease giảm. 4. Kết luận - Thành phần môi trường thích hợp để thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của chủng B. Amyloliquefaciens N1 tốt nhất bao gồm 1% peptone, 0,3% cao thịt, 0,5% NaCl và 0,75% tinh bột hòa tan. - Nuôi cấy trong môi trường trên ở pH ban đầu bằng 8 và nhiệt độ nuôi cấy 35oC, hoạt độ protease trong môi trường đạt được cao nhất. - Với các điều kiện trên, thời gian lên men thu nhận enzyme thích hợp nhất là sau 32 giờ nuôi cấy. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Gia Hy, Lỗ Tiến Sỹ, Phạm Kim Dung, Trương Nam Hải, Nghiên cứu sản xuất protease kiềm từ chủng xạ khuẩn ưa kiềm CD 2-1 phân lập ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 3, (2000), 88-89. 2. Lê Đức Mạnh, Ngô Tiến Hiển, Lê Đức Ngọc, Nghiên cứu thu nhận và bảo quản protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis, Các công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm (Giai đoạn 1986- 1995), Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 1995. 3. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xô, Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 49, (2004), 1667-1668. 4. Deepak V, Kalishwaralal K, Ramkumarpandian S, Babu SV, Senthilkumar SR, Sangiliyandi G., Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology, Bioresour Technol 99 (17): (2008), 8170-8174. 5. Gajju H, Bhalla, Agarwal T C, Thermostable alkaline proteinase from thermophilic Bacillus coagulants PB-77. Ind. J. Microbiol., 36, (1996), 153-155. 6. Ghafoor A, Shahida H., Production dynamics Bacillus subtilis strains AG-1 and EAG-2, producing an extracellular alkaline protease. Afr J of Microbiol Res, 3 (5), (2009), 258-263. 7. Gerritse SB, Shiva RR, Lokeswari N and Raja J., Optimization of Protease Production from Aspergillus oryzae Sp. using Box-Behnken Experimental Design, E-Journal of Chemistry, 4(2), (2007), 145-153. 288
8. Gessesse A, Hatti-Kaul R, Gashe B A, Mattiasson B., Novel alkaline proteinases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather, Enzyme and Microbial Technology, 32, (2002), 519-524. 9. Joo HS, Kumar CG, Park GC, Kim KT, Paik SR, Chang Cs., Optimization of the production of an extracellular alkaline proteinase from Bacillus horikoshi, Process Biochem, 38, (2002), 155-159. 10. Kim J M, Lim W J, Suh H J., Feather-degrading Bacillus species from poutry waste, Process Biochemistry, 37, (2001), 287-291. 11. Mehrotra S, Pandey P K, Gaur R, Darmwa N S., The production of alkaline proteinase by Bacillus species isolate, Bioresource Technology, 67, (1999), 201-203. 12. Mussarat S, Aamer AS, Abdul H, Fariha H., Influence of culture condition on production and activity of protease from Bacillus subtilis BS1, Parkistan J of Microbiol, 40 (5), (2008), 2161-2169. 13. Rai SK, Ashis KM., Statistical optimization of production, purification and industrial application of a laundry detergent and organic solvent-stable subtilisin-like serine protease (Alzwiprase) from Bacillus subtilis DM-04. Biochem Eng J, 48 (2), (2010), 173-180. 14. Robert S, Geetha A & Arulpandi I., Optimization of protease and lipase production by Bacillus pumilus SG2 isolated from an industrial effluent, The Internet Journal of Microbiology, 5(2), (2008), 2161-2169. 15. Sangeetha M, Pandey PK, Gaur R, Darmwal NS., The production of alkaline proteinase by Bacillus species isolated, Bioresoure Technology, 67, (1999), 201-203. 16. Sangeetha M, Pandey PK, Gaur R, Darmwal NS., The production of alkaline proteinase by Bacillus species isolated, Bioresoure Technology, 67, (1999), 201-203. 17. Sivasubramanian S, Manohar BS, Puvanakrishnan R., Mechanism of enzymatic dehairing of skins using a bacterial alkaline protease, Chemosphere, 70 (6), (2008), 1025-1034. 18. Sung JH, Sang JA, Na YK, Soo KJ, Joong KK, Joon KC, Hyung HL., Purification, molecular cloning, and biochemical characterization of subtilisin JB1 from a newly isolated Bacillus subtilis JB1, Appl Biochem Biotechnol, 162 (3), (2009), 900-911. 19. Wang CT, Baoping J, Bo L, Hong J, Long FC., Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from Chinese traditional douchi, J Ind Microbiol Biotechnol, 33 (9), (2006), 750-758. 20. Wang SH, Cheng Z, Yan LY, Miao D, Ming FB., Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547, World J Microbiol Biotechnol, 24, (2008), 475-482. 289
21. Wellingta CAN, Meire LLM., Production and properties of an extracellular protease from thermophilic Bacillus sp., Brazilian J of Microbiol, 35, (2004), 91-96. 22. Yong JK, Kim JH, Gal SW, Kim JE, Park SS, Chung KT, Kim YH, Kim BW, Joo WH., Molecular cloning and characterization of the gene encoding a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis strain A1, World J of Microbiol and Biotechnol, 20, (2003), 711- 717. THE FACTORS EFFECT ON EXTRACELLULAR PROTEASE PRODUCTION OF Bacillus amyloliquefaciens N1 ISOLATED FROM HUE ‘NEM CHUA’ Do Thi Bich Thuy College of Agriculture and Forestry, Hue University Abstract. This study was also carried out to examine the influence of optimal factors on production of extracellular protease from Bacillus amyloliquefaciens N1 such as culture medium, culture temperature, initial pH and fermentation period. Results showed that in the base culture medium (BCM), which containing 1% of peptone, 0,3% of meat extract and 0,5% of NaCl, added soluble starch the extracellular protease production of Bacillus amyloliquefaciens N1 with highest activity (0,758 HP/ml) compared to the other carbon sources. This value was significant higher (p