Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và ức chế emzyme α-glucosidase từ lá cây thanh trà

Chia sẻ: Bigates Bigates | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Lá thanh trà Bouea macrophylla được dùng làm thực phẩm tại một số địa phương ở Việt Nam và một số nước Đông Nam Á nhưng có rất ít các tài liệu nghiên cứu về tác dụng sinh học và thành phần hóa học. Để làm sáng tỏ điều này lá thanh trà được nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng emzyme α-glucosidase. Lá thanh trà đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt trên cả hai mô hình DPPH và FRAP với khả năng chống oxy hóa Rutin < Cao chiết cồn lá thanh trà < Vitamin C.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và ức chế emzyme α-glucosidase từ lá cây thanh trà

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ EMZYME α-GLUCOSIDASE TỪ LÁ CÂY THANH TRÀ Mã Phú Cường, Ngô Ngọc Phương Ngoan, Hà Kim Ngọc, Thái Thị Diễm Uyên* * Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hồng TÓM TẮT Lá thanh trà Bouea macrophylla được dùng làm thực phẩm tại một số địa phương ở Việt Nam và một số nước Đông Nam Á nhưng có rất ít các tài liệu nghiên cứu về tác dụng sinh học và thành phần hóa học. Để làm sáng tỏ điều này lá thanh trà được nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng emzyme α-glucosidase. Lá thanh trà đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt trên cả hai mô hình DPPH và FRAP với khả năng chống oxy hóa Rutin < Cao chiết cồn lá thanh trà < Vitamin C. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết cồn tốt hơn so với acarbose trong đó cao chiết cồn với IC50=42,73±1,16 µg/mL cao hơn đối chứng dương là acarbose với IC50= 651,79±21,43 µg/mL là gấp 15,25 lần. Định tính thành phần hóa học trong lá thanh trà cho thấy có sự hiện diện của các hợp chất thứ cấp như polyphenol, glycoside, flavonoid, triterpenoid và một ít tinh dầu. Ngoài ra nghiên cứu còn phân lập được hợp chất lupeol từ lá thanh trà là hợp chất đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học giá trị. Từ khóa: cao chiết, enzyme α-glucosidase, hoạt tính chống oxy hóa, thanh trà, thành phần hóa học. 1 MỞ ĐẦU Thanh trà Bouea macrophylla có nguồn gốc từ Bắc Sumatra, bán đảo Malaysia và Tây Java, được trồng rộng rãi như một loại cây ăn quả tại Thái Lan và Sumatra. Thanh trà cùng họ với xoài Anacardiaceae nhưng hương vị của nó rất khác biệt (Dechsupa et al, 2019) [1]. Đây là một loại trái cây có lợi cho sức khỏe, chúng cung cấp một lượng lớn vitamin, khoáng chất và các chất xơ. Ngoài ra, quả thanh trà còn thể hiện tiềm năng sinh học lớn thông qua các hoạt tính chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng khuẩn và kháng viêm (Dechsupa et al, 2007; Dechsupa et al, 2019) [1]. Ở Việt Nam, các bộ phận của cây thanh trà Bouea macrophylla như hoa, quả và hạt được người dân ở khu vực miền Tây sử dụng như một loại thực phẩm có lợi cho sức khỏe. Tuy nhiên, những nghiên cứu trên bộ phận lá của cây thanh trà có rất ít nghiên cứu đề cập đến. Do đó nhóm tác giả đã thực hiện nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và ức chế emzyme α-glucosidase nhằm khai thác thêm được một số lợi ích, tạo tiền đề phát triển một số sản phẩm ứng dụng từ nguồn thực vật này. 453
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu thực vật: lá thanh trà được thu nhận tại các vườn trồng thanh trà tại khu vực Thới Lợi, Quận Ô Môn, Thành phố Cần Thơ. Thực vật được định danh bởi PGS.TS Trần Hợp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết tách và phân lập hợp chất Lá thanh trà sau khi được thu nhận được loại bỏ bụi bẩn tạp chất, sấy ở nhiệt độ không quá 60oC/5h, xay và sàng bằng rây với kích thước 1,0 mm. Mẫu bột lá được bảo quản nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời. Ngâm bột lá thanh trà vào dung môi ethanol 70%, tỷ lệ khối lượng và dung môi là 1:10, lắc 24h với tốc độ lắc 150 vòng/phút, lặp lại 3 lần. Sau đó lọc, thu dịch. Loại dung môi bằng máy cô chân không để thu được cao chiết thô ethanol. Cao chiết được phân bố vào nước cất vừa đủ và tiến hành chiết lần lượt với n-hexan, n- hexane:ethylacetate (1:1) và ethylacetate. Cao chiết phân đoạn n-hexane được hòa tan trong lượng dung môi vừa đủ và trộn với silicagel, sau đó đem đi sấy khô. Tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi n- hexane:ethylacetate có độ phân cực tăng dần (từ 12:1 đến 8:1) thu được 6 phân đoạn ký hiệu H1-6. Quan sát thấy phân đoạn H4 xuất hiện kết tủa, tách được dịch H4A và tủa H4B. Tủa H4B được rửa liên tục bằng dung môi acetone thu được chất rắn dạng bột màu trắng ký hiệu là hợp chất BM1. Hợp chất BM1 đã được xác định thông qua việc đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR trên máy AVANCE 500 (Bruker) tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh – 200 Cô Bắc, phường Cô Giang, Quận 1. 2.2.2 Phương pháp định tính các thành phần hóa học trong lá thanh trà Cao cồn và cao nước được chia làm 2 phần. Phần thứ nhất pha với H2SO4 10% sau đó lọc hết cặn, dịch thu được dùng để thực hiện các thử nghiệm kiểm tra sự có mặt của nhóm alkaloid. Phần thứ hai sẽ pha trong DMSO 1% sau đó bỏ cặn thu dịch, dịch này được đem phân tích và định tính một số thành phần hóa học như chất khử, saponin, flavonoid, anthraquinone glycoside, steroid, polyphenol và tanin. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học (Bảng 1) được áp dụng phương pháp của bộ môn Dược liệu- Khoa Dược- Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh (cải tiến từ phương pháp của trường đại học Dược khoa Rumani), tham khảo thêm quy trình định tính của Yadav [2]. 2.2.3. Phương pháp đ nh giá hoạt tính chống oxy hóa Mô hình DPPH Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Von Gadow, Joubert và Hansmann (1997) [3]. Dung dịch DPPH 6.10-5 M trong Methanol dùng làm thuốc thử phản ứng với chất chống oxy hóa. Lấy 50 µL mẫu thêm vào 2 mL dung dịch DPPH 6.10-5 M trong Methanol. Hỗn hợp phản ứng được để trong tối 15 phút, sau đó đo sự giảm độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua IC50 là một giá trị nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do. 454
%DPPH reduction= % Mô hình FRAP Phương pháp FRAP (Ferric ion Reducing Antioxydant Power) dựa vào sự khử phức Fe (III)- TPTZ thành phức Fe (II)-TPTZ bền hơn bằng 1 chất khử (chất chống oxy hóa) ở pH thấp. Fe (II)-TPTZ có màu xanh dương đậm và có thể đo mật độ quang (A) ở bước sóng 593nm. Như vậy sau phản ứng nếu Fe2+-TPTZ sinh ra càng nhiều, màu của dung dịch càng đậm và ngược lại. Từ đó có thể suy ra hoạt lực của chất chống oxy hóa. Hoạt lực của chất chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị FRAP xác định từ đường chuẩn. Giá trị FRAP càng lớn, chất chống oxy hóa càng mạnh và ngược lại. Tiến hành theo phương pháp của Benzie và Strain (1996) [4]. 2.2.4 Phương pháp đ nh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase Quy trình nghiên cứu dựa trên phương pháp của Vũ Thị Bạch Phượng và cs 2016 [5]. Cho 50 µL dung dịch cao chiết vào 40 µL dung dịch enzyme α-glucosidase (0,2 U/mL) ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, bổ sung 40 µL cơ chất p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG) (3 mM), ở nhiệt độ phòng 20 phút. Cuối cùng, 130 µL dung dịch Na2CO3 0,2 M được cho vào sẽ bắt màu sản phẩm tạo ra là p-nitrophenol và dừng phản ứng. Dựa trên mật độ quang tại 405 nm (OD405), hoạt tính ức chế của mẫu thử được xác định và tính nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzyme (IC50). Chứng dương là viên thuốc glucarbose (acarbose 50 mg) của Công ty TNHH một thành viên dược phẩm và sinh học y tế. Mẫu blank là mẫu không chứa enzyme và mẫu chứng âm là mẫu không chứa cao chiết. Chỉ tiêu theo dõi: % ức chế α-glucosidase = x 100% 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft ® Excel ® 2019 và thống kê bằng phần mềm SPSS 21 (Statistical Package for the Social Sciences) 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Định tính một số thành phần hóa học từ cao chiết cồn của lá thanh trà Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học của lá cây thanh trà được thể hiện trong Bảng 2 cho thấy lá cây thanh trà có sự hiện diện diện của các hợp chất thứ cấp như polyphenol, hợp chất alkaloid, lavonoid, triterpenoid và một ít tinh dầu. Đặc biệt có sự hiện diện khá nhiều của thành phần polyphenol. Bảng 1. Kết quả định tính sơ bộ từ cao chiết cồn lá thanh trà Thành phần Các phản ứng nhận biết Phản ứng ương tính Kết quả Polyphenol Dung dịch FeCl3 Màu xanh đen +++ Tanin Gelatin- muối Tủa bông trắng + Dung dịch có màu vàng sau đó Flavonoid phản ứng với NaOH và HCl + mất màu 455
Thành phần Các phản ứng nhận biết Phản ứng ương tính Kết quả Chất hử Thuốc thử Benedict Tủa màu đỏ gạch ++ Thử nghiệm Liebermann- Steroid Không xuất hiện màu xanh – Burchard Thử nghiệm Liebermann- Triterpenoid Dung dịch chuyển màu vàng + Burchard Xác định Đun cách thủy, bốc hơi tới Cắn có mùi thơm + tinh dầu cắn Saponnin Sủi bọt Tạo lớp bọt trắng bền trên bề mặt ++ Phản ứng với thuốc thử Alkaloid Tạo tủa màu nâu đỏ + Mayer *Ghi chú: -: không có, +: có, ++ có nhiều 3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết cồn lá thanh trà Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện ở Hình 1A và Hình 1B. 12000 100 10000 Giá trị FR P (µmol Vitamin C 80 % DPPH bị ức chế 8000 Fe2+/mL) Cao chiết cồn lá 60 thanh trà 6000 Rutin 40 Vitamin C 4000 Cao chiết cồn lá thanh trà 20 2000 Rutin 0 0 0 5 10 15 20 25 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 µg/mL mg/mL (a) (b) Hình 1. Kết quả khả năng chống oxy hóa của cao chiết thanh trà trên mô hình DPPH (a) và mô hình FRAP (b) Theo nghiên cứu Kuete và Efferth (2010), những cao chiết thực vật thể hiện chỉ số IC50 dưới 50 µg/ml là những hợp chất có khả năng chống oxy hóa mạnh. Cao chiết cồn của lá thanh trà có hoạt tính chống oxy hóa tốt với giá trị IC50 = 3,94 ± 0,21 µg/mL cao hơn Rutin (IC50 = 4,89 ± 0,12 µg/mL) gấp 1,24 lần và thấp hơn Vitamin C (IC50 = 2,68 ± 0,11 µg/mL) 1,47 lần. Dựa vào đồ thị kết quả FRAP ở Hình 1B đo được theo nồng độ cho thấy tất cả các mẫu thí nghiệm đều thể hiện khả năng kháng oxy hóa trên mô hình FRAP. Giá trị FRAP (µmol Fe2+/mL) và nồng độ của mẫu có quan hệ tỷ lệ thuận với nhau. Nồng độ mẫu khảo sát càng cao thì giá trị FRAP càng cao. Hoạt tính chống oxy hóa của 3 mẫu được sắp xếp theo thứ tự tăng dần là Rutin < Cao cồn lá thanh trà < Vitamin C. Từ kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa trên hai mô hình DPPH và FRAP kết luận rằng lá thanh trà có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Kết quả DPPH và FRAP thể hiện mối tương quan chặt chẽ, kết quả DPPH càng cao thì kết quả FRAP càng cao. 456
3.3 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase Kết quả phần trăm ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết cồn và đối chứng dương là acarbose được trình bày trong Hình 2. 100 80 90 70 % ức chế α-glucosidase % ức chế α-glucosidase 80 60 70 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 240 480 720 960 1200144016801920 Nồng độ hảo sát (µg/mL) Nồng độ hảo sát (µg/mL) (a) (b) Hình 2. Kết quả ức chế enzyme α-glucosidase của acarbose và cao chiết cồn 800 [VALUE]±21,43 700 600 500 µg/mL 400 300 200 [VALUE]±1,16 100 0 Cao chiết cồn Acarbose Hình 3. Giá trị IC50 (µg/mL) của cao chiết cồn và thuốc acarbose. Các kết quả có ý nghĩa thống kê với p
Hợp chất BM1 thu được là chất có dạng bột mịn màu trắng. Thông qua phân tích dữ liệu 1H- NMR của hợp BM1 đo trong dung môi CDCl3 chất được xác định công thức phân tử là Lupeol. Hiện nay vẫn chưa có bất kỳ công bố chứng minh về hợp chất tự nhiên này có trong lá thanh trà. Hình 4. Công thức hợp chất BM1 Từ các nghiên cứu trên thế giới cho thấy lupeol là một chất có rất nhiều tiềm năng sinh học giá trị. Trong đó phải kể đến khả năng ức chế các ROS trong cơ thể giúp ngăn ngừa stress oxy hóa [7]. Ngoài ra, lupeol còn thể hiện tiềm năng trong điều trị nhiều loại ung thư như ung thư gan, ung thư da, ung thư tuyến tiền liệt [7]. Lupeol còn thể hiện tiềm năng lớn trong việc hỗ trợ điều trị tiểu đường thông qua khả năng ức chế enzyme α-glucosidase mạnh hơn cả thuốc acarbose [8]. 4 KẾT LUẬN Kết quả định tính sơ bộ một số thành phần hóa học cho thấy dịch chiết lá thanh trà có nhiều nhóm hợp chất thứ cấp như phenolic, flavonoid, tannin, triterpenoid, saponnin. Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa trên hai mô hình DPPH và FRAP kết luận rằng lá thanh trà có hoạt tính chống oxy hóa mạnh có ý nghĩa trong việc ngăn chặn hoặc hạn chế tổn thương tế bào gây ra bởi các gốc tự do, bảo vệ tế bào. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết cồn thể hiện tiềm năng lớn trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Ngoài ra nghiên cứu còn phân lập được hợp chất lupeol từ lá thanh trà là hợp chất được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học giá trị. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Dechsupa N., Kantapan J., Tungjai M., et al. (2019). Maprang “Bouea macrophylla Gri ith” seeds: proximate composition, HPLC fingerprint, and antioxidation, anticancer and antimicrobial properties of ethanolic seed extracts. Heliyon, 5(7), e02052. [2] Yadav R. and Agarwala M. (2011). Phytochemical analysis of some medicinal plants. J Phytol, 3. [3] Von Gadow A., Joubert E., and Hansmann C.F. (1997). Comparison of the Antioxidant Activity of Aspalathin with That of Other Plant Phenols of Rooibos Tea (Aspalathus linearis), α-Tocopherol, BHT, and BHA. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 458
[4] Benzie I.F.F. and Strain J.J. (1996). The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “ ntioxidant Power”: The FRAP Assay. Analytical Biochemistry, 239(1), 70–76. [5] Bạch Phượng V.T., Thanh Minh H.T., Ánh Hồng P.T., et al. (2016). Khảo sát hoạt tính sinh học và nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ cây cối xay Abutilon indicum (L.). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 19(T5), tr.95-102. [6] KWON Y., Apostolidis E., and Shetty K. (2008). Inhibitory potential of wine and tea against α-amylase and α-glucosidase for management of hyperglyemia linked to type 2 diabetes. Journal of Food Biochemistry, 32, 15–31. [7] Saleem M. (2009). Lupeol, a novel anti-inflammatory and anti-cancer dietary triterpene. Cancer Letters, 285(2), 109–115. [8] Ramu R., Shirahatti P.S., Zameer F., et al. (2014). Inhibitory effect of banana (Musa sp. var. Nanjangud rasa bale) flower extract and its constituents Umbelliferone and Lupeol on α-glucosidase, aldose reductase and glycation at multiple stages. South African Journal of Botany, 95, 54–63. 459