Nghiên cứu phương pháp bảo quản nấm men (Saccharomyces Cerevisiae), nấm mốc (Aspergillus Niger) và vi khuẩn (Acetobacter Xylinum)

Chia sẻ: Tran Minh Hai Hai | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

380
lượt xem 70
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chủng nấm men bánh mỳ Saccharomyces cerevisive là một tác nhân quan trong trong quá trình làm nở bột nhào khi sản xuất bánh mỳ, vi khuẩn Acetobarter xylium là một tác nhân lên men để tạo ra sản phẩm thạch dừa và nấm mốc Aspergillus niger là một phần quan trọng để sinh tổng hợp một số loại enzym như amylase....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu phương pháp bảo quản nấm men (Saccharomyces Cerevisiae), nấm mốc (Aspergillus Niger) và vi khuẩn (Acetobacter Xylinum)

1 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Công trình ñư c hoàn thành t i Đ I H C ĐÀ N NG Đ I H C ĐÀ N NG NGÔ TH MINH PHƯƠNG Ngư i hư ng d n khoa h c: PGS.TS TR N TH XÔ NGHIÊN C U PHƯƠNG PHÁP B O QU N N M MEN (SACCHAROMYCES CEREVISIAE), N M M C Ph n bi n 1: TS. Đ ng Minh Nh t (ASPERGILLUS NIGER) VÀ VI KHU N (ACETOBACTER XYLINUM) Ph n bi n 2: PGS.TS. Lê Th Liên Thanh Chuyên ngành: CÔNG NGH TH C PH M VÀ Đ U NG Mã s : 60.54.02 Lu n văn ñã ñư c b o v t i H i ñ ng ch m Lu n văn nghi p th c sĩ k thu t h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 23 tháng 4 năm 2011. TÓM T T LU N VĂN TH C SĨ K THU T Có th tìm hi u lu n văn t i: - Trung tâm Thông tin - H c li u, Đ i h c Đà N ng - Trung tâm H c li u, Đ i h c Đà N ng. Đà N ng – Năm 2011
2 3 M Đ U 3. PH M VI NGHIÊN C U - Nghiên c u trên các ch ng n m men Saccharomyces cerevisiae, 1. TÍNH C P THI T C A Đ TÀI vi khu n Acetobacter xylinum, n m m c Aspergillus niger Ch ng n m men bánh mì Saccharomyces cerevisiae là m t tác - Nghiên c u trên các phương pháp: L nh sâu, ñông khô và s y nhân quan tr ng trong quá trình làm n b t nhào khi s n xu t bánh chân không trong ñi u ki n có và không có ch t b o v . mì, vi khu n Acetobacter xylinum là m t tác nhân lên men ñ t o ra 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U s n ph m th ch d a và n m m c Aspergillus niger là m t ngu n Phương pháp v t lý, phương pháp hóa sinh, phương pháp vi sinh. quan tr ng ñ sinh t ng h p m t s lo i enzym như amylase, 5. Ý NGHĨA KHOA H C C A Đ TÀI protease, pectinase… Chính vai trò to l n c a chúng nên ñã ñ t ra - Tìm ra ñư c các ñi u ki n kĩ thu t thích h p ñ b o qu n t ng v n ñ là ph i b o qu n nh ng ch ng gi ng này. ch ng gi ng n m men, n m m c, vi khu n. Trong quá trình b o qu n vi sinh v t, hai m c tiêu chính ñ t ra ñó - Đưa ra phương pháp thích h p ñ b o qu n t ng ch ng gi ng là ñ m b o kh năng s ng sót và s n ñ nh ñ c tính di truy n c a n m men, n m m c, vi khu n. chúng. Vi c b o qu n ch ng gi ng vi sinh v t hi n nay ph bi n v n 6. Ý NGHĨA TH C TI N C A Đ TÀI b ng phương pháp b o qu n l nh 40C trên môi trư ng v i hàm Kéo dài th i gian b o qu n và tránh ñư c s thoái hóa gi ng và lư ng cao các h p ch t c a nitơ và cacbon. V i phương pháp này s t p nhi m c a các ch ng gi ng t i các phòng thí nghi m. trong m t s ñi u ki n sau khi m t s ch ng hình thành bào t thì 7. C U TRÚC C A LU N VĂN chúng l i làm bi n d ch ng gi ng. Lu n văn g m 86 trang, ngoài ph n m c l c, danh m c các ch T i Vi n Công ngh sinh h c và Công ngh Th c ph m vi t t t, danh m c các b ng và hình v , m ñ u, k t lu n và ki n TP.HCM và Hà N i ngư i ta gi gi ng b ng phương pháp c y ngh , tài li u tham kh o, ph l c còn có các chương sau: truy n, b o qu n dư i d u parafin, l nh sâu và ñông khô. Mu n có Chương 1: T ng quan tài li u, 25 trang. các ch ng gi ng này chúng ta ph i mua v i giá r t ñ t. Chương 2: Nguyên li u và phương pháp nghiên c u, g m 8 Vì v y “Nghiên c u phương pháp b o qu n n m men trang. (Saccharomyces cerevisiae), n m m c (Aspergillus niger) và vi Chương 3: K t qu nghiên c u và th o lu n, g m 43 trang. khu n (Acetobacter xylinum)” là m t vi c làm c n thi t. 2. M C ĐÍCH NGHIÊN C U - Phâp l p, ho t hóa các ch ng vi sinh v t. - Ki m tra hi u qu c a các phương pháp b o qu n l nh sâu, ñông khô và s y chân không cho t ng ch ng gi ng vi sinh v t. - ng d ng c th c a ch ng vi sinh v t v a sưu t m ñư c.
4 5 CHƯƠNG 1: T NG QUAN TÀI LI U 1.2.1.2. Sinh s n c a n m m c 1.1. GI I THI U CHUNG V N M MEN BÁNH MÌ N m m c là m t trong nh ng vi sinh v t có nhi u ki u sinh s n 1.1.1. Đ c ñi m hình thái và c u t o c a n m men bánh mì khác nhau: Sinh s n dinh dư ng, sinh s n vô tính, sinh s n h u tính. Men bánh mì thu c gi ng Saccharomyces, loài cerevisiae l p 1.2.2. Gi i thi u v Aspergillus niger Ascomycetes, ngành n m. Là t bào hình c u hay hình tr ng, có kích 1.2.2.1. Đ c ñi m hình thái c a Aspergillus niger thư c nh t 5 - 6 ñ n 10 - 14µm, sinh s n b ng cách t o ch i và t o Khi m i phát tri n s i n m màu tr ng, sau ñó s m l i nhưng bào t . không hoàn toàn ñen. Bào t c a chúng là có màu ñen tuy n. T m t 1.1.2. Thành ph n hóa h c c a t bào n m men s i ñ u tiên chúng phân nhánh t o ra 2 - 4 nhánh s i nh . Thành ph n hóa h c c a t bào n m men khác nhau tùy ñi u ki n 1.2.2.2. Đ c ñi m sinh hóa môi trư ng nuôi. N m men ép có ch a 70 - 75% nư c và 25 - 30% N m s i này có kh năng t o ra nhi u enzym khác nhau như: còn l i là ch t khô. amylase, invertase, maltase, protease, pectinase, cellullase, … 1.1.3. Các y u t nh hư ng ñ n quá trình sinh trư ng và phát 1.2.2.3. Vai trò c a Aspergillus niger trong công ngh th c ph m tri n c a n m men bánh mì 1.3. GI I THI U V VI KHU N ACETOBACTER XYLINUM 1.1.3.1. Nhi t ñ 1.3.1. C u t o chung c a vi khu n 1.1.3.2. Đ pH c a môi trư ng 1.3.1.1. Thành t bào 1.1.3.3. nh hư ng c a ch t hóa h c 1.3.1.2. Màng sinh ch t 1.1.3.4. nh hư ng c a n ng ñ r ñư ng 1.3.1.3. T bào ch t 1.1.3.5. nh hư ng c a cư ng ñ không khí và khu y tr n lên t c 1.3.1.4. Nhân t bào vi khu n ñ tăng trư ng c a n m men 1.3.1.5. Bao nh y 1.1.4. Yêu c u ch t lư ng n m men bánh mì 1.3.2. Gi i thi u v vi khu n Acetobacter xylinum N m men Saccharomyces cerevisiae dùng cho s n xu t bánh mì Ch ng A. xylinum này có ngu n t Philippin. A.xylinum thu c ph i ñ m b o là l c n b t < 45 phút. nhóm vi khu n acetic. Acetobater xylinum là tr c khu n không di 1.2. GI I THI U CHUNG V N M M C ASPERGILLUS ñ ng, t o thành váng nhăn và khá dày. NIGER 1.3.2.1. Đ c ñi m hình thái c a Acetobacter xylinum 1.2.1. Gi i thi u v n m m c Theo h th ng phân lo i c a nhà khoa h c Bergey thì A.xylinum 1.2.1.1. C u t o c a n m m c thu c l p Schizommycetes, b Pseudomonadales, h D a vào c u t o c a chúng ngư i ta chia n m m c ra làm hai Pseudomonadieae, là lo i vi khu n dài kho ng 2µm, ñ ng riêng l lo i: Lo i n m m c có vách ngăn, lo i n m m c không có vách ngăn. ho c x p thành chu i.
6 7 1.3.2.2. Đ c ñi m sinh lý, sinh hóa c a Acetobacter xylinum 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U V B O QU N CÁC CH NG Acetobacter xylinum là vi khu n gram âm, là vi khu n hi u khí. N M MEN BÁNH MÌ SACCHAROMYCES CEREVISIAE, 0 A. xylinum sinh trư ng pH < 5, nhi t ñ 28 - 32 C và có th tích ASPERGILLUS NIGER VÀ ACETOBACTER XYLINUM lũy 4,5% axit acetic. M t t bào A.xylinum có kh năng polyme hóa 1.5.1. Tình hình nghiên c u ngoài nư c 200 000 phân t glucose/giây t o thành β 1,4-glucan và sau ñó ñư c Theo nghiên c u trong năm 2010 c a Stefan Toegel và c ng s : bài ti t vào môi trư ng xung quanh t o thành d ng s i. V i ch ng M. anisopliae thì s d ng saccarose, fructose, maltose, 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP B O QU N GI NG VI KHU N, glucose làm ch t b o v có hi u qu hơn c , ñ m b o t l s ng sót N M MEN VÀ N M M C sau khi ñông khô t 25 – 45%. Còn v i ch ng B. brongniartii thì có 1.4.1. M c ñích c a quá trình b o qu n gi ng th dùng glucose, saccarose, lactose, maltose, fructose, s a g y làm Gi gi ng ph i ñ m b o nh ng m c ñích t i thi u là gi ng không ch t b o v và sau khi ñông khô trong ñi u ki n có nh ng ch t b o ñư c l n và không b thoái hoá. v này t l s ng sót c a m u n m m c này ñ t 50 – 85%. 1.4.2. Nh ng phương pháp b o qu n gi ng vi sinh v t Theo nghiên c u c a M. Abadias và c ng s năm 2001, khi 1.4.2.1. C y chuy n ñ nh kì ñông khô n m men Candida sake thì ph i l nh sâu nhi t ñ -200C. 1.4.2.2. Gi gi ng dư i l p d u khoáng Khi s d ng ch t b o v , t l s ng sót cao nh t là glutamat v i 1.4.2.3. Phương pháp l nh sâu 19,6%, ti p ñó là galactose v i 16,6%, các lo i ñư ng saccarose, Phương pháp l nh sâu d a trên cơ s : S phát tri n c a vi sinh lactose v i 11 và 12%, tinh b t ñ t 11,9%, còn glycerol ch ñ t 0,3%, v tb c ch nhi t ñ l nh sâu, ñây là phương pháp ñang ñư c s khi dùng s a g y + saccarose thì t l s ng sót tăng lên 37%. d ng khá r ng rãi ñ gi gi ng vi sinh v t. Năm 2009, R. Sidari và A. Caridi nghiên c u kh năng s ng 1.4.2.4. Phương pháp s y chân không sót c a các ch ng n m men rư u sau quá trình b o qu n l nh sâu - 0 Nguyên t c c a phương pháp này là dùng nhi t s y khô nguyên 20 C có ch t b o v là glycerol cho th y r ng: Khi tính kh năng li u k t h p s d ng bơm chân không ñ hút khí và hút m trong s ng sót b ng log (CFU/ml) c a ch ng F15, v i s lư ng t bào ban nguyên li u ñ n ñ m theo yêu c u. ñ u là 9,59. Sau 3 tháng b o qu n, s lư ng t bào là 5,11. 1.4.2.5. Phương pháp ñông khô 1.5.2. Tình hình nghiên c u trong nư c Nguyên t c c a phương pháp là làm thăng hoa ph n nư c có Trong ñ tài “Nghiên c u ng d ng công ngh sinh h c trong trong môi trư ng nhũ hoá vi sinh v t ñi u ki n chân không. x lí môi trư ng nuôi tôm công nghi p năng su t cao” năm 2004, 1.4.2.6. M t s phương pháp b o qu n khác Tác gi kh o sát quá trình s y trên thi t b s y t ng sôi và rút ra k t lu n: Nhi t ñ s y 45 - 500C cho s n ph m có hàm m trong kho ng 8% và t l t bào s ng sót sau s y khá cao (ñ t 66,67 - 69,44%).
8 9 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.3.2. Xác ñ nh ho t l c làm n c a n m men bánh mì 2.1. NGUYÊN LI U VÀ D NG C Saccharomyces cerevisiae 2.1.1. Nguyên li u nghiên c u Chu n b b t nhào v i 1% n m men d ng paste. Cho kh i b t - Vi khu n Acetobacter xylinum, n m men bánh mì nhào (kho ng 30 - 50g) vào c c có chia v ch ml. Đ c chính xác th Saccharomyces cerevisiae, n m m c Aspergillus niger. tích ban ñ u và c sau 30 phút ti n hành ño th tích kh i b t nhào 2.1.2. Hóa ch t và thi t b m t l n. Tính th i gian mà kh i b t nhào ñ t th tích l n nh t. Th i - Các hóa ch t: S d ng hóa ch t ch y u s n xu t t i Trung gian càng ng n, ho t l c làm n bánh càng cao. Qu c. 2.2.3.3. Xác ñ nh kh năng t o kh i ñông th ch d a c a - Máy, thi t b : S d ng các thi t b ph bi n. Acetobacter xylinum 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U L y 10ml nư c d a già, b sung 1g ñư ng saccarose, 0,05g 2.2.1. Phương pháp vi sinh (NH4)2HPO4, 0,08ml axit acetic 40% băng. Dùng axit acetic này ñ 2.2.1.1. Phương pháp phân l p và ho t hóa gi ng vi sinh v t ñi u ch nh pH môi trư ng ñ n pH = 5. Thanh trùng môi trư ng b ng N m men bánh mì Saccharomyces cerevisiae, n m m c cách ñun sôi nh trong th i gian 15 – 20 phút. Đ ngu i và c y vi Aspergillus niger ñư c phân l p và ho t hóa trên môi trư ng PDA, vi khu n Acetobacter xylinum vào v i t l gi ng 10%, ñ lên men khu n Acetobacter xylinum ñư c ho t hóa trên môi trư ng HS. nhi t ñ 300C và gi trong 8 ngày. Sau ñó x lí m u và ti n hành cân 2.2.2.2. Phát hi n và ch n khu n l c ñ c trưng ñ bi t kh i lư ng. 2.2.1.3. Xác ñ nh gián ti p s lư ng t bào b ng cách ñ m s lư ng 2.2.4. Phương pháp b o qu n vi sinh v t khu n l c phát tri n trên môi trư ng th ch 2.2.4.1. Phương pháp l nh sâu S lư ng t bào xác ñ nh theo phương pháp này tính b ng Tr n d ch t bào v i ch t b o v v i n ng ñ thích h p. Sau ñó CFU/ml. ñưa vào l nh sâu nhi t ñ -200C. 2.2.2. Phương pháp hóa sinh 2.2.4.2. Phương pháp s y chân không 2.2.2.1. Xác ñ nh ho t tính amylase c a Aspergillus niger Tr n d ch t bào v i ch t b o v r i ñưa vào s y chân không Nguyên t c: Xác ñ nh lư ng enzym ít nh t có th phân gi i hoàn nhi t ñ 400C toàn m t lư ng b t xác ñ nh d a theo ph n ng màu v i i t. 2.2.4.3. Phương pháp ñông khô 2.2.3. Phương pháp v t lý Chu n b d ch t bào r i l nh sâu -200C, sau ñó m u ñư c ñưa 2.2.3.1. Đánh giá s sinh trư ng và phát tri n c a vi sinh v t vào ñông khô 400C trong 8 gi . S d ng phương pháp ño m t ñ quang OD.
10 11 CHƯƠNG 3: K T QU VÀ TH O LU N Bào t c a chúng là có màu ñen tuy n. 3.1. HO T HÓA, PHÂN L P CÁC CH NG GI NG VI SINH 3.1.3. Ho t hóa ch ng vi khu n Acetobacter xylinum V T NGHIÊN C U Ch ng vi khu n A. xylinum ñư c ho t hóa trên môi trư ng HS t 3.1.1. Phân l p ch ng n m men bánh mì Saccharomyces ch ng g c mua Vi n Công ngh sinh h c TP.HCM. K t qu ñư c cerevisiae t bánh men ư t trình bày hình 3.2. Ch ng n m men bánh mì S. cerevisiae ñư c phân l p t bánh men ư t. K t qu phân l p ñư c trình bày hình 3.1. Hình 3.3. Vi khu n A. xylinum ho t hóa ñư c Nh n xét: Khu n l c c a vi khu n Acetobacter xylinum có màu Hình 3.1. N m men S. cerevisiae phân l p ñư c tr ng ñ c, khu n l c tròn, to, kích thư c nh hơn khu n l c c a n m Đ c ñi m c a khu n l c: Ch ng n m men này có khu n l c màu men bánh mì nhi u. tr ng s a, tròn, to, b m t trơn bóng. 3.2. QUAN SÁT Đ C ĐI M HÌNH THÁI CÁC CH NG VI 3.1.2. Ho t hóa ch ng n m m c Aspergillus niger SINH V T NGHIÊN C U Ch ng n m m c A. niger ñư c ho t hóa trên môi trư ng PDA t Hình thái c a các ch ng ch p ñư c qua kính hi n vi ñư c trình ch ng g c có t i phòng thí nghi m c a khoa Hóa, trư ng Đ i h c bày hình 3.4, 3.5 và 3.6. Bách khoa Đà N ng. K t qu ñư c trình bày hình 3.2. Hình 3.4. Hình thái Hình 3.5. Hình Hình 3.6. Hình thái c a S. cerevisiae thái c a A. niger c a A.xylinum Hình 3.2. N m m c A. niger ho t hóa ñư c T k t qu quan sát ñư c, chúng tôi th y r ng n m men này có Đ c ñi m c a khu n l c: Khu n l c có màu ñen. Khi m i phát d ng hình ovan và hình tròn, ch ng n m m c có d ng hình s i, s i tri n, s i n m màu tr ng, sau ñó s m l i nhưng không hoàn toàn ñen. n m có màu nâu bóng, còn bào t có d ng bông tròn có màu nâu hơi
12 13 ñen và có gai, vi khu n có d ng hình que dài, ñ ng riêng r . Kho ng th i gian thích h p nh t ñ l y m u mang ñi b o qu n là 3.3. KH O SÁT KH NĂNG SINH TRƯ NG VÀ PHÁT sau 48 – 90 gi nuôi c y trên môi trư ng th ch trong ñĩa Petri và TRI N C A CÁC CH NG VI SINH V T NGHIÊN C U trong môi trư ng d ch th PDA. 3.3.1. Kh năng sinh trư ng và phát tri n c a ch ng n m men 3.3.3. Kh năng sinh trư ng và phát tri n c a ch ng vi khu n Saccharomyces cerevisiae Acetobacter xylinum Đo trên máy so màu UV – Vis bư c sóng 600nm, chúng tôi K t qu giá tr OD trung bình qua 3 l n ño c a ch ng vi khu n A. xây d ng ñ th bi u di n s sinh trư ng và phát tri n c a xylinum ñư c chúng tôi bi u di n ñ th hình 3.9. 4.0 Saccharomyces cerevisiae b ng ñ th hình 3.7. Nh n xét: Lư ng sinh 3.5 2.0 3.0 kh i ñ t ñư c cao nh t T k t qu hình 3.7 ta th y OD (600nm) 2.5 1.5 sau 120 gi nuôi c y và OD - 600nm t c ñ sinh trư ng và phát 2.0 1.0 1.5 ch s ODmax = 2,89. Như tri n c a n m men ñ t c c 1.0 0.5 v y chúng tôi l y m u ñ i sau 39 gi , giá tr ODmax 0.5 0.0 0.0 mang ñi b o qu n sau khi 0 10 20 30 40 50 60 = 1,612. Vì v y th i ñi m 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Th i gian (gi ) b t ñ u nuôi c y 72 gi . thích h p ñ l y m u ñem Th i gian (gi ) Hình 3.7. Đ th bi u di n s Hình 3.9. Đ th bi u di n s sinh b o qu n là 39 gi . sinh trư ng và phát tri n c a trư ng và phát tri n c a A. xylinum S.cerevisiae 3.4. KH O SÁT M T S Đ C TÍNH SINH HÓA C A CÁC 3.3.2. Kh o sát s sinh trư ng và phát tri n c a Aspergillus niger CH NG VI SINH V T NGHIÊN C U 60 50 Chúng tôi ki m tra s 3.4.1. Kh o sát kh năng làm n c a n m men bánh mì Đư ng kính khu n l c (mm) sinh trư ng và phát tri n Kh i lư ng sinh kh i khô (mg) 50 40 Saccharomyces cerevisiae 40 30 c a A. niger b ng hai Chu n b m u như m c 2.2.3.2, k t qu ñư c trình bày t i 30 20 20 cách ñ ng th i: Đo kích hình 3.10. 100 10 10 thư c khu n l c và xác 80 Th tích kh i b t (ml) 0 0 0 30 60 90 120 150 ñ nh sinh kh i khô b ng 60 Th i gian (gi ) Đư ng kính khu n l c Kh i lư ng sinh kh i khô phương pháp l c và cân 40 Hình 3.8. Đ th bi u di n s thay ñ i xác ñ nh tr ng lư ng. K t 20 ñư ng kính khu n l c và qu ño ñư c bi u di n 0 0 30 60 90 120 150 sinh kh i n m m c A. niger ñ th hình 3.8. Th i gian (phút) Hình 3.10. Đ th bi u di n ho t l c làm n kh i b t nhào c a n m men bánh mì S. cerevisiae
14 15 D a vào k t qu hình 3.10, chúng tôi th y r ng kho ng th i gian 3.5. NGHIÊN C U B O QU N GI NG 30 phút ñ u tiên, t c ñ n c a kh i b t là l n nh t. 3.5.1. Nghiên c u b o qu n gi ng b ng phương pháp l nh sâu 3.4.2. Kh o sát kh năng sinh enzym amylase c a Aspergillus 3.5.1.1. B o qu n l nh sâu n m men bánh mì Saccharomyces niger cerevisiae Chúng tôi xác ñ nh ho t l c enzym amylase c a Aspergillus Tr n d ch t bào vào dung d ch b o v , ñưa m u vào b o qu n niger b ng phương pháp Wolthgemuth, k t qu ño ñư c ñư c bi u nhi t ñ -200C và ki m tra ñ nh kì sau th i gian b o qu n là 10 ngày, di n t i hình 3.11. 1,5 tháng và 3,5 tháng. K t qu ñư c bi u di n hình 3.12 và hình 350 T ñ th bi u di n ho t 3.13. 300 Ho t ñ enzym, ĐV/g 250 l c enzym amylase c a A. 1.00E+10 S lư n g t b à o , C F U /m l 200 1.00E+08 niger chúng tôi th y r ng, 1.00E+06 150 100 ho t l c c a enzym tăng 1.00E+04 50 0 d n trong 4 ngày ñ u, 1.00E+02 1.00E+00 0 1 2 3 4 5 6 nhưng ñ n ngày th 5 thì Lactose Glucose Glycerol Saccarose S ag y Không có ch t Th i gian (ngày) S lư ng t bào ban ñ u S lư ng t bào sau khi l nh sâu 10 ngày b ov ho t l c enzym amylase S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 1,5 tháng S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 3,5 tháng Hình 3.11. Đ th bi u di n ho t Hình 3.12. Hình nh n m c a chúng l i gi m xu ng. Hình 3.13. Đ th bi u di n kh năng l c enzym amylase c a A. niger men sau b o qu n l nh sâu 3.4.3. Xác ñ nh kh năng t o kh i ñông th ch d a c a vi khu n s ng sót c a n m men khi l nh sâu Acetobacter xylinum Nh n xét: Sau th i gian b o qu n l nh sâu, khu n l c m c trên Chu n b m u như m c 2.2.3.3. K t qu ñư c bi u di n b ng ñĩa th ch có ñ c ñi m hình thái gi ng h t hình thái c a ch ng n m 3.1. B ng 3.1. Kh năng t o th ch d a c a vi khu n A. xylinum men trư c khi b o qu n. Sau 3,5 tháng b o qu n n m men v n còn Th i gian, Kh i lư ng kh i ñông s ng sót m c tương ñ i cao, h u h t là trên 104 – 105 CFU/ml. Đi u ngày thu ñư c, g này ch ng t có th áp d ng phương pháp l nh sâu ñ b o qu n n m 5 1,7 men. 6 2,2 K t qu trên cho th y s a g y 10% cùng v i glycerol 15% là phương pháp b o qu n t t hơn c trong th i gian dài. Sau 3,5 tháng 7 2,3 b o qu n v i ch t b o v s a g y t l s ng sót c a n m men là 2.105 8 2,4 CFU/ml ñ t 0,1% và glycerol là 2,5.105 CFU/ml ñ t 0,125%. S a g y Nh n xét: Sau 6 ngày lên men thì kh i ñông t o thành l n, t có th nh hư ng ñ n hàm lư ng axit béo c a màng t bào, do ñó làm ngày th 7 tr ñi kh i lư ng ti p t c tăng nhưng ch m hơn trư c. thay ñ i tính lưu màng ho c canxi có th góp ph n s n ñ nh c a các
16 17 enzym trong t bào do ñó duy trì kh năng s ng sót cho n m men t t 1.00E+10 S lư ng t bào, CFU/ml 1.00E+08 hơn. Còn glycerol do th m vào ñư c bên trong t bào do ñó b o v 1.00E+06 ñư c t t hơn. 1.00E+04 3.5.1.2. B o qu n l nh sâu n m m c 1.00E+02 1.00E+00 Chu n b m u như n m men. Sau 3,5 tháng l nh sâu, quan sát s Lactose Glucose Glycerol Saccarose S ag y Không có ch t b o v S lư ng t bào ban ñ u S lư ng t bào sau khi l nh sâu 10 ngày hình thành khu n l c trên m t th ch hình 3.14. Ki m tra kh năng S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 1,5 tháng S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 3,5 tháng s ng sót c a n m m c ñư c bi u di n hình 3.15. Hình 3.16. Hình nh vi khu n Hình 3.17. Đ th bi u di n kh năng 1.00E+10 sau b o qu n l nh sâu s ng sót c a vi khu n khi s y chân không S lư ng t bào, CFU/ml 1.00E+08 Phương pháp l nh sâu này thích h p v i vi khu n hơn so v i 1.00E+06 Hình 3.16. Hình nh vi khu n 1.00E+04 n m men, n m m c. T l s ng sót c a vi khu n cao nh t khi ñư c sau 3,5 tháng b o qu n l nh sâu 1.00E+02 b o qu n v i glycerol ñ t 0,5% tương ng v i s lư ng t bào là 1.00E+00 Lactose Glucose Glycerol Saccarose S ag y Không có 4.106 CFU/ml so v i s lư ng t bào ban ñ u là 8.108 CFU/ml. ch t b o v S lư ng t bào ban ñ u S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 1,5 tháng S lư ng t bào sau khi l nh sâu 10 ngày S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 3,5 tháng Chúng tôi ki m tra l i ñ c tính sinh h c c a các ch ng sau 3,5 Hình 3.14. Hình nh n m Hình 3.15. Đ th bi u di n kh năng tháng l nh sâu. K t qu ñư c trình bày b ng 3.2. m c sau b o qu n l nh sâu s ng sót c a n m m c khi l nh sâu B ng 3.2. Đ c tính sinh h c c a các ch ng vi sinh v t sau th i gian b o qu n b ng phương pháp l nh sâu Nh n xét: Hình thái khu n l c c a n m m c gi ng h t hình thái Th i Ho t l c làm n Ho t l c Kh năng t o c a ch ng n m m c trư c khi b o qu n nhưng ñư ng kính khu n l c gian kh i b t nhào c a amylase c a kh i ñông c a l i nh hơn so v i ban ñ u. kh o sát S.cerevisiae A.niger A.xylinum Khi l nh sâu n m m c thì nên s d ng dung d ch ch t b o v là Ho t % so Kh i % so lactose, s a g y và glycerol. Khi l nh sâu v i các ch t b o v là % so ñ v i lư ng v i glycerol, các lo i ñư ng thì các khu n l c c a n m m c sau khi ho t Th tích, v i ban enzym, ban th ch, ban hóa l i có ñư ng kính to hơn so v i các m u có ch t b o v khác. T ml ñ u ĐV/g ñ u g ñ u l s ng sót c a n m m c sau 3,5 tháng b o qu n v i ch t b o v Trư c glycerol là 0,01%. 88 100 133 100 2,4 100 l nh sâu 3.5.1.3. B o qu n l nh sâu vi khu n Sau 3,5 Chu n b m u và ki m tra tương t như n m men, k t qu ki m 80 90,9 113 85 2,1 87,5 tháng tra ñư c bi u di n hình 3.16 và hình 3.17. Ho t l c c a các ch ng b gi m ñi nhưng gi m không ñáng k ,
18 19 1.00E+10 S lư ng t bà o , C FU /m l t t c các m u ñ u ñ t trên 85% so v i ban ñ u. 1.00E+08 3.5.2. Nghiên c u b o qu n gi ng b ng phương pháp s y chân 1.00E+06 1.00E+04 không 1.00E+02 3.5.2.1. B o qu n n m men 1.00E+00 Saccarose Saccarose + Saccarose + Saccarose + S ag y Tinh b t Không ch t 0 Tr n d ch t bào v i ch t b o v r i ñưa vào s y 40 C. Sau khi gelatin pepton cao n m men b ov S lư ng t bào ban ñ u S lư ng t bào sau khi s y chân không 2 ngày s y, m u ñư c b o qu n 40C trư c khi ho t hoá tr l i. K t qu S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 1 tháng S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 3 tháng Hình 3.20. Hình nh Hình 3.21. Đ th bi u di n kh năng ki m tra ñư c bi u di n hình 3.18 và hình 3.19. 1.00E+10 n m m c sau b o qu n s ng sót c a n m m c khi s y chân không S lư ng t bào, C F U /m l 1.00E+08 s y chân không 1.00E+06 Các khu n l c n m m c m c ñ u trên ñĩa th ch và có hình thái 1.00E+04 1.00E+02 gi ng h t như hình thái ban ñ u. Sau khi ho t hóa l i thì ñư ng kính 1.00E+00 khu n l c không l n như ban ñ u. Đi u này ch ng t n m m c hút Saccarose Saccarose + Saccarose + Saccarose + S ag y Tinh b t Không ch t gelatin pepton cao n m men b ov S lư ng t bào ban ñ u S lư ng t bào sau khi s y chân không 2 ngày nư c l i kém do ñó quá trình sinh trư ng c a n m m c b tr . Hình 3.18. Hình nh S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 1 tháng S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 3 tháng Sau th i gian 3 tháng b o qu n thì chúng tôi nh n th y m u tinh n m men sau b o qu n Hình 3.19. Đ th bi u di n kh năng b t còn gi kh năng s ng sót cao nh t là 2.106 CFU/ml ñ t 0,2%. s y chân không s ng sót c a n m men khi s y chân không B i vì m u tinh b t sau khi s y xong thì ñ m cao hơn so v i các Sau khi s y chân không, n m men có t l s ng sót cao nhưng b m u khác do ñó không làm ch t nhi u t bào m c dù v n ñ o b m gi m nhi u trong quá trình b o qu n. Khi s y s d ng ch t b o v hi u qu c a vi c b o qu n. Còn m u không ch t b o v t l s ng sót tinh b t và s a g y ho c h n h p saccarose + cao n m men và ch 105 CFU/ml ñ t 0,01%. saccarose + gelatin thì s lư ng t bào duy trì ñư c cao trong th i 3.5.2.3. B o qu n vi khu n Acetobacter xylinum gian b o qu n 3 tháng, t l s ng sót sau 3 tháng b o qu n ñ t 0,15 – Chu n b m u và ti n hành các bư c b o qu n gi ng như ph n s y 0,23%. chân không n m men. Hình nh vi khu n sau khi ho t hóa l i ñư c 3.5.2.2. B o qu n n m m c Aspergillus niger bi u di n hình 3.22. Chúng tôi ti n hành ho t hóa và xác ñ nh l i s Chu n b m u và ti n hành các bư c b o qu n gi ng như ph n s y lư ng t bào vi khu n sau khi s y chân không và theo th i gian b o chân không n m men. Chúng tôi ti n hành ho t hóa và xác ñ nh l i s qu n thì thu ñư c k t qu như hình 3.22. lư ng t bào vi khu n sau khi s y chân không và theo th i gian b o T k t qu hình 3.22, chúng tôi nh n th y r ng t kh năng s ng qu n thì thu ñư c k t qu như hình 3.20 và ñ th hình 3.21. sót c a vi khu n sau quá trình s y chân không cao hơn so h n so v i quá trình s y chân không n m men, n m m c. M u s y có ch t b o v là tinh b t ñ m b o s s ng cao nh t v i t l s ng sót tính ñư c là
20 21 1.00E+10 Trong ñó n m m c b gi m ho t l c ñi nhi u nh t, ch còn 53,1% so S lư ng t bào,CFU/ml 1.00E+08 1.00E+06 v i ban ñ u. 1.00E+04 1.00E+02 3.5.3. Nghiên c u b o qu n gi ng b ng phương pháp ñông khô 1.00E+00 3.5.3.1. B o qu n n m men Saccarose Saccarose + Saccarose + S ag y Tinh b t Không ch t pepton cao n m men b ov D ch huy n phù t bào ñư c tr n v i d ch b o v và sau ñó ñư c Hình 3.22. Hình nh S lư ng t bào ban ñ u S lư ng t bào sau khi s y chân không 2 ngày S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 1 tháng S lư ng t bào sau th i gian b o qu n 3 tháng làm l nh sâu -200C. Sau ñó m u ñư c s y ñông khô 400C trong 8 vi khu n sau b o qu n Hình 3.23. Đ th bi u di n kh năng gi . Sau khi s y, m u ñư c b o qu n 40C trư c khi ho t hoá. s y chân không s ng sót c a vi khu n khi s y chân không 1.00E+10 1.00E+08 S lư n g t b à o , C F U /m l 15%, sau th i gian b o qu n 1 tháng thì t l s ng sót là 10% và sau 3 1.00E+06 tháng b o qu n thì t l s ng sót là 1,25%. 1.00E+04 Ti n hành ki m tra ho t l c c a các ch ng vi sinh v t nghiên c u 1.00E+02 1.00E+00 thu ñư c k t qu như trình bày b ng 3.3. Saccarose Lactose Saccarose + Saccarose + Saccarose + Tinh b t S ag y Không ch t gelatin cao n m men pepton b ov B ng 3.3. Đ c tính sinh h c c a các ch ng vi sinh v t sau th i gian S lư ng t bào ban ñ u S lư ng t bào sau khi ñông khô S lư ng t bào sau khi b o qu n 1 tháng S lư ng t bào sau khi b o qu n 2,5 tháng b o qu n b ng phương pháp s y chân không Hình 3.24. Hình nh Hình 3.25. Đ th bi u di n kh năng n m men sau b o qu n s ng sót c a n m men sau khi ñông khô Th i Ho t l c làm n Ho t l c Kh năng t o ñông khô Trong t t c các ch t b o v thì sau quá trình ñông khô, s a g y gian kh i b t nhào c a amylase c a th ch d a c a cho k t qu t t nh t vì protein trong s a g y hình thành m t l p b o kh o sát S.cerevisiae A.niger A.xylinum v trên thành t bào và canxi trong s a làm tăng s s ng sót sau khi Ho t % so Kh i % so làm l nh ho c ñông khô, n ñ nh pH nó t o ra s n ph m ñông khô có % so ñ v i lư ng v i c u trúc x p làm cho vi c bù nư c d dàng hơn. Khi ñông khô n m Th tích, v i ban enzym ban th ch ban men v i m u ch t b o v là s a g y v i t l s ng sót ñư c tính là ml ñ u , ĐV/g ñ u d a,g ñ u 2,96%, sau 1 tháng b o qu n thì t l s ng sót còn l i c a m u này là Trư c 88 100 133 100 2,4 100 0,89%. khi s y 3.5.3.2. B o qu n n m m c Aspergillus niger Sau 3 75 85,2 70,7 53,1 1,8 75 Chu n b m u như ñông khô n m men. K t qu quan sát khu n tháng l c và ki m tra kh năng s ng sót c a n m m c sau khi ñông khô Ho t tính sinh h c c a các ch ng vi sinh v t nghiên c u b gi m ñư c bi u di n hình 3.26 và hình 3.27. ñi nhi u sau 3 tháng b o qu n b ng phương pháp s y chân không.
22 23 hơn hai ch ng n m men và n m m c nhi u nhưng l i gi m ñi nhanh 1.00E+10 hơn so v i n m men, n m m c sau 1 tháng b o qu n. Và sau 2,5 S lư n g t b à o , C F U /m l 1.00E+08 tháng b o qu n thì t l s ng sót c a vi khu n gi m không ñáng k so 1.00E+06 1.00E+04 v i sau 1 tháng. 1.00E+02 Ki m tra ho t tính c a các ch ng vi sinh v t khi b o qu n b ng 1.00E+00 Saccarose Lactose Saccarose + Saccarose + Saccarose + Tinh b t S ag y Không ch t ñông khô, chúng tôi thu ñư c k t qu như trình bày b ng 3.4. gelatin cao n m men pepton b ov B ng 3.4. Đ c tính sinh h c c a các ch ng vi sinh v t sau th i gian Hình 3.26. Hình nh S lư ng t bào ban ñ u S lư ng t bào sau 1 tháng ñông khô S lư ng t bào sau khi ñông khô S lư ng t bào sau 2,5 tháng ñông khô b o qu n b ng phương pháp ñông khô n m m c sau b o qu n Hình 3.27. Đ th bi u di n kh năng Ho t l c làm n Ho t l c Kh năng t o ñông khô s ng sót c a n m m c sau khi ñông khô Th i gian kh i b t nhào c a amylase c a th ch d a c a kh o sát Nh n xét: T l s ng sót c a n m m c sau khi ñông khô cao hơn S.cerevisiae A.niger A.xylinum so v i n m men, kh năng s ng sót c a n m men cao nh t là 2,96% Ho t % so Kh i % so trong khi ñó c a n m m c là 9% và ch t b o v thích h p nh t cũng % so ñ v i lư ng v i là s a g y. Th tích, v i ban enzym ban th ch ban 3.5.3.3. B o qu n vi khu n Acetobacter xylinum ml ñ u , ĐV/g ñ u d a, g ñ u Hình nh c a vi khu n sau th i gian b o qu n b ng ñông khô Trư c ñư c bi u di n hình 3.28 và kh năng s ng sót c a vi khu n ñư c 88 100 133 100 2,4 100 ñông khô bi u di n ñ th 3.29. Sau 2,5 1.00E+10 84 95.4 121 91,1 2,2 91,6 tháng S lư n g t b à o , C F U /m l 1.00E+08 1.00E+06 Chúng tôi nh n th y phương pháp ñông khô này ít làm gi m ho t 1.00E+04 l c c a các vi sinh v t, ho t l c c a ba ch ng nghiên c u ñ u ñ t trên 1.00E+02 1.00E+00 90% so v i ban ñ u. Saccarose Lactose Saccarose + Saccarose + Saccarose + Tinh b t S ag y Không ch t gelatin cao n m men pepton b ov 3.6. NG D NG S lư ng t bào ban ñ u S lư ng t bào sau khi ñông khô Chúng tôi ti n hành lên men t o s n ph m th ch d a t vi khu n Hình 3.28. Hình nh S lư ng t bào sau 1 tháng ñông khô S lư ng t bào sau 2,5 tháng ñông khô A.xylinum thu ñư c sau quá trình b o qu n ñông khô theo quy trình vi khu n sau b o qu n Hình 3.29. Đ th bi u di n kh năng hình 3.30 và thu ñư c s n ph m như hình 3.31. ñông khô s ng sót c a vi khu n sau khi ñông khô Nh n xét: T l s ng sót c a vi khu n sau khi ñông khô cao
24 25 Nư c d a K T LU N VÀ KI N NGH * K T LU N L c T nh ng k t qu thu ñư c trong quá trình nghiên c u chúng tôi ñưa ra m t s k t lu n chính như sau: Nư c DAP ñư ng Tr n ñ u 1. Phương pháp l nh sâu: Phương pháp này t t nh t khi s d ng ch t b o v glycerol 15%. Kh năng s ng sót c a vi khu n cao hơn so v i Đun sôi 15 n m men, n m m c ñ t t l s ng sót 0,5% sau 3,5 tháng b o qu n. Đ c tính sinh h c c a các ch ng nghiên c u b gi m, ñ t trên 85% so Đ ngu i v i ho t l c ban ñ u. 2. Phương pháp s y chân không: Ch t b o v t t nh t là tinh b t. Cho axit axetic Nhìn chung phương này cho kh năng s ng sót cao hơn so v i phương pháp l nh sâu. Nhưng sau 3 tháng b o qu n, ho t l c c a các C y ch ng vi sinh v t b gi m ñi r t nhi u. Lên men 3. Phương pháp ñông khô: Ch t b o v t t nh t là s a g y 10%. T l s ng sót c a các ch ng nghiên c u cao nh t trong ba phương pháp. Ho t l c c a các ch ng vi sinh v t ñ u ñ t trên 90% so v i ban ñ u. Th ch d a 4. Vì v y ñ b o qu n các ch ng vi sinh v t nghiên c u, phương pháp t t nh t là ñông khô vì nó ñ m b o t l s ng sót c a các ch ng vi Hình 3.30. Sơ ñ quy trình công ngh s n xu t th ch d a sinh v t cao và gi ñư c g n nguyên v n ñ c tính sinh h c ban ñ u, ti p ñ n là phương pháp l nh sâu và cu i cùng là s y chân không. 5. Lên men t o s n ph m th ch d a t ch ng vi khu n A.xylinum. * KI N NGH 1. Ti p t c kh o sát kh năng s ng sót và ñ c tính sinh hóa c a các ch d ng vi sinh v t nghiên c u trong th i gian b o qu n dài hơn ñ Hình 3.31. Hình nh s n ph m th ch d a tìm ra th i gian b o qu n t i ña có th . 2. Kh o sát ba phương pháp b o qu n l nh sâu, s y chân không và ñông khô v i nhi u ch ng vi sinh v t khác. 3. T o ra ch ph m vi sinh v t ti n l i lưu hành ñư c trên th trư ng.