Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng HBV-RNA huyết tương ở bệnh nhân viên gan B mạn tính

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

TRIỆU THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2019

HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Triệu Thị Nguyệt

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược Học Quân sự - HVQY

HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

Hà Nội – Năm 2019

TS. Mai Thị Đàm Linh – Đại học Khoa học Tự nhiên

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS. Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y

Dược học quân sự - Học viện Quân Y, người thầy đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và

hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Mai Thị Đàm Linh- Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người thầy đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và anh chị trong Phòng Công nghệ gen và Di

truyền tế bào - Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y vì các

thầy cô và anh chị đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài tại phòng.

Tôi đặc biệt cảm ơn CN. Vũ Nguyễn Quỳnh Anh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình hoàn thành luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học cùng

các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc

gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình học tập

và nghiên cứu tại trường.

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và

tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.

Hà Nội, 10 tháng 01 năm 2020

Học viên

Triệu Thị Nguyệt

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... 7

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... 8

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. 10

Chương 1 - TỔNG QUAN .......................................................................................... 3

1.1. Tổng quan về HBV ........................................................................................ 3

1.1.1. Đặc điểm phân loại HBV ..................................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái HBV ..................................................................... 4

1.1.3. Cấu trúc hệ gen HBV ........................................................................... 5

1.1.4. Các protein HBV ................................................................................. 7

1.1.5. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe ...................................... 10

1.1.6. Chu trình nhân lên của HBV ............................................................. 12

1.1.7. Con đường lây nhiễm của virus HBV ................................................ 14

1.2. Tổng quan về viêm gan B mạn tính ............................................................. 15

1.2.1. HBV và viêm gan B ........................................................................... 15

1.2.2. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới ................................................... 16

1.3. Tình hình nghiên cứu HBV ......................................................................... 18

1.3.1. Trên thế giới ............................................................................................ 18

1.3.2. Trong nước ........................................................................................ 21

1.4. Tính mới và tính sáng tạo của đề tài ............................................................ 23

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 26

2.1. Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu ....................................................... 26

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 26

2.1.2. Vật liệu, hóa chất .................................................................................... 27

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 28

2.2.1 . Thiết kế nghiên cứu ................................................................................ 28

2.2.2. Thu thập, bảo quản mẫu ......................................................................... 29

2.2.3. Tách chiết acid nucleic ........................................................................... 29

2.2.4. Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương ..... 29

2.2.5. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA .............................. 32

Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược: ............................................................. 34

Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược ...................................................... 35

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi .................................................................................... 36

Tối ưu thời gian luân nhiệt ................................................................................ 36

Tối ưu nồng độ mồi ........................................................................................... 37

Tối ưu nồng độ probe ........................................................................................ 37

Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR ..................................................... 38

2.2.6. Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA .......................... 38

2.2.7. Phân tích, xử lý số liệu ............................................................................ 39

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................. 41

3.1. Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương

bệnh nhân CHB. .................................................................................................... 41

3.1.1. Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA được tổng hợp in-vitro,

chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh. ........................... 41

3.1.2. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng

hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn

trước khi hoàn thiện. ......................................................................................... 41

3.1.3. Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV

pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB....................................................... 42

3.1.4. Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-

qPCR đo tải lượng HBV pgRNA. ...................................................................... 44

3.2. Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết

tương bệnh nhân CHB. .......................................................................................... 47

3.2.1. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các

bước và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR. ....... 47

3.2.2. Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme

DNA polymerase, nồng độ mồi và probe. Thành phần phản ứng bao gồm cả

dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm. ................... 54

3.2.3. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA ......................................... 56

3.3. Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR. ..................................................... 57

3.3.1. Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét

nghiệm. Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy

trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. . 57

3.3.2. Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải

lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. .................................. 61

3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB. ............................... 64

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 67

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………85

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT Từ viết tắt Nghĩa

1 cccDNA Covalently closed circular DNA – DNA kép, mạch

vòng

CHB 2 Chronic Hepatitis B – Viêm gan B mạn tính

Ct 3 Crossing threshold

CV 4 Coefficient of Variation - Hệ số biến thiên

ER 5 Endoplasmic Reticulum – Mạng lưới nội chất

6 HBeAg Hepatitis B envelope Antigen – Kháng nguyên e

của HBV

7 HBcAg Hepatitis B core antigen – Kháng nguyên lõi của

HBV

8 HCC Hepatocellular Carcinoma – Ung thư biểu mô tế

bào gan

9 HBV Hepatis B Virus – Virus viêm gan B

10 HBsAg Hepatitis B surface Antigen – Kháng nguyên vỏ

của HBV

11 ME Meaning – Độ lệch phép đo

12 ORF Open Reading Frame – Khung đọc mở

13 NAs Nucleos(t)ide Analogues

14 RT-qPCR Reverse Transcription Realtime - quantitative

Polymerase Chain Reaction

15 rcDNA Relaxed circular DNA – DNA dạng vòng không

kín

16 SD Standard Deviation – Độ lệch chuẩn

17 pgRNA Pre-genomic RNA

18 UNG Uracil Deoxyribonucleic Acid Glycosylase

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [99]. ............................................................. 5

Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV ..................................................................................... 7

Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [47]. ...................................................... 14

Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [47]. ..................................................... 14

Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S ................................................. 30

Hình 6: Kết quả phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe. ....................................... 43

Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR .................................... 44

Hình 8: Panel độ nhạy ............................................................................................... 45

Hình 9: Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy. .............................................................. 46

Hình 10: Kết quả dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy. ........................................... 46

Hình 11: Kết quả bộ panel độ đặc hiệu ..................................................................... 47

Hình 12: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ

45°C. .......................................................................................................................... 48

Hình 13: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ

50°C. .......................................................................................................................... 49

Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút. ........................................................... 50

Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút. ........................................................... 51

Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C. ............................................................................. 52

Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C. ............................................................................. 52

Hình 18: Kết quả ở thời gian gắn mồi 15 giây. ......................................................... 53

Hình 19: Kết quả ở thời gian gắn mồi 30 giây. ......................................................... 53

Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mồi. ...................................................................... 54

Hình 21: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,2 µM ................................................ 55

Hình 22: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,1 µM ................................................ 55

Hình 23: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn ........................... 59

Hình 24: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tuần. ............................................ 61

Hình 25: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau một tháng. ........................................ 62

Hình 26: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tháng. .......................................... 62

Hình 27: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau ba tháng. ........................................... 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị................................................................................ 27

Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu .................................................................................... 27

Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCR ................................................................. 31

Bảng 4: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR ..................................................... 32

Bảng 5: Thành phần phản ứng RT-qPCR ................................................................. 34

Bảng 6: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR với hai nhiệt độ khác nhau ở bước

phiên mã ngược ......................................................................................................... 35

Bảng 7: Thành phần tối ưu của một phản ứng RT-qPCR ......................................... 56

Bảng 8: Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng RT-qPCR ................................... 56

Bảng 9: Kết quả đánh giá quy trình định lượng trên dải nồng độ 104 – 1,25

copy/phản ứng trong 10 lần chạy .............................................................................. 57

Bảng 10: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn .......................... 59

Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua các chỉ số SD, CV, độ lệch phép đo (ME)..60

Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR ................................. 63

Bảng 13: Nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn tính

ở nhóm HBeAg dương tính và âm tính. .................................................................... 64

MỞ ĐẦU

Nhiễm Hepatitis B virus (HBV) là một vấn đề y tế toàn cầu. Mặc dù đã có sự

phát triển các vaccine ngăn chặn bệnh hiệu quả cao từ những năm 1980 và việc bổ

sung chương trình tiêm chủng vaccine mở rộng tại hơn 168 quốc gia, bệnh gan do

nhiễm mạn tính HBV vẫn là gánh nặng khổng lồ đối với toàn xã hội. Tính đến thời

điểm hiện nay, trên thế giới, nhiễm HBV là nguyên nhân của 30% bệnh nhân xơ

gan và 53% trong số họ tiến triển thành HCC, với khoảng hơn 200,000 và 300,000

người mang HBsAg chết mỗi năm tương ứng do xơ gan và ung thư gan.

Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay được cấp phép là Peg-IFN α-

2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside

(nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir,

Tenofovir. Peg-IFN vừa có tác dụng điều hòa miễn dịch vừa có tác dụng kháng

virus trực tiếp, nhờ đó có thể duy trì sự ức chế HBV DNA sau khi ngừng điều trị ở

một nhóm bệnh nhân. Ngược lại, việc sử dụng NAs làm giảm mạnh HBV DNA và

các biến chứng ở hầu hết các bệnh nhân. Tuy nhiên NAs sẽ không ảnh hưởng tới sự

tổng hợp RNA tiền bộ gen (pgRNA) của HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

hay tổng hợp protein virus như HBsAg vì cccDNA không bị ảnh hưởng và vẫn giữ

nguyên hoạt tính phiên mã. Hệ quả là, ngừng điều trị NAs thường dẫn tới bệnh tái

phát và hầu hết các bệnh nhân cần điều trị cả đời. Không may là việc điều trị bằng

thuốc NAs (như lamivudine) trong một khoảng thời gian dài có thể dẫn đến các đột

biến kháng thuốc và một số nguy cơ nghiêm trọng khác liên quan tới gan. Chính vì

vậy, việc đánh giá được nồng độ của cccDNA ở các bệnh nhân điều trị NAs là vô

cùng quan trọng giúp xác định thời điểm và hiệu quả của các loại thuốc kháng virus.

Tuy nhiên, việc đánh giá cccDNA lại yêu cầu phải sử dụng các mẫu mô sinh thiết,

gây khó khăn trong quá trình đánh giá lâm sàng.

Chức năng cơ bản của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất

cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp

tạo ra các DNA của virion. Do đó, nồng độ của cccDNA lại được phản ánh bởi

RNA. Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm

viêm gan B, HBV pgRNA gần đây đã được báo cáo là một dấu ấn sinh học mới đầy

hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân CHB.

Việt Nam nằm trong khu vực có tỉ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng vào

loại cao nhất trên thế giới, nhiễm HBV mạn tính là một vấn đề y tế nặng nề tại nước

ta. Sự cấp thiết trong việc tìm ra hay thiết lập các công cụ theo dõi, kiểm soát điều

trị cũng như quản lý sự lây nhiễm trong cộng đồng là rất rõ ràng trong bối cảnh phổ

biến của nhiễm HBV mạn tính. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu nào trong nước

đề cập đến dấu ấn tiềm năng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân CHB. Chính vì

vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu: Xây dựng và tối ưu quy trình RT-

qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao trên đối tượng là các

bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng các đồng đẳng nucleoside ở Việt

Nam.

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về HBV

1.1.1. Đặc điểm phân loại HBV

Hepatitis B virus (HBV) là một thành viên của họ Hepadnaviridae [130].

Sở dĩ họ virus này có tên như vậy là bởi vì những virus này là nguyên nhân gây ra

các bệnh về viêm gan (hepatitis) và genome là DNA. Một số virus thuộc họ này có

khả năng lây nhiễm ở các động vật có vú và chim; ví dụ bao gồm woodchuck HBV

và heron HBV. HBV được biết đến nhiều nhất là virus có khả năng lây nhiễm ở

người, và là một trong những nguyên nhân gây bệnh gan ở người [46].

Các virus thuộc họ Hepadnaviridae đều có những đặc điểm chung như sau [121]:

- Hệ gen là DNA sợi đôi không hoàn chỉnh bao gồm 2 sợi: sợi âm đầy

đủ và sợi dương không đầy đủ.

- Enzyme DNA polymerase

- Nhân lên thông qua mạch khuôn là pre-genomic RNA (pgRNA)

- Có mức độ đặc trưng về mô và loài cao

Việc nghiên cứu về các HBV từ lâu đã được quan tâm vì hai lý do. Thứ nhất,

các virus này có bộ gen rất nhỏ, tuy nhiên chúng vẫn có khả năng mã hóa các

protein của virus và kiểm soát sự biểu hiện gen của virus. Thứ hai, bộ gen DNA của

các virus được nhân lên thông qua trung gian RNA. Nói cách khác, sự nhân lên của

virus bao gồm quá trình phiên mã ngược, vì vậy các virus thuộc nhóm này khác

biệt rất lớn với các virus có bộ gen là DNA có khả năng nhân lên một cách trực tiếp.

DNA của virus được nhân lên thông qua trung gian RNA còn được tìm thấy ở các

loài thực vật. Những virus này, cùng với HBV còn được gọi là Pararetrovirus [46].

Các nghiên cứu về giải trình tự nucleotide của HBV được phân lập ở người

trên khắp thế giới đã được thiết lập, 8 tuýp của virus HBV đã được xác định (A-H)

dựa trên sự khác biệt về trình tự lớn hơn 8% và không vượt quá 17% [61, 102]. Các

tuýp này có sự phân bố khác nhau, như tuýp A và D thường xuất hiện ở Châu Phi,

Châu Âu và Ấn Độ; tuýp B và C thường phân bố ở Châu Á; tuýp E được tìm thấy ở

Tây Phi, và tuýp F xuất hiện ở cả Trung và Nam Mỹ. Sự phân bố của tuýp G và

tuýp H vẫn chưa rõ ràng, nhưng đã có những báo cáo cho rằng hai tuýp này đã xuất

hiện ở Trung Mĩ và Nam Âu [54]. Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng

có sự xuất hiện của các tuýp virus mới, như tuýp I là tuýp có độ tương đồng lớn với

tuýp C là tuýp được phát hiện ở một số nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào và

Đông Ấn [106]; và tuýp J được phát hiện ở một người Nhật Bản sống ở Borneo, là

dạng tái tổ hợp giữa tuýp C và HBV ở vượn [102]. Các tuýp A, B, C, D, F, I có thể

được phân ra thành các nhóm nhỏ hơn dựa trên sự khác biệt khoảng 4% nucleotide.

Có 44 nhóm các tuýp phụ: A1–6, B1–9, C1–16, D1–7, F1–4 và I1–2 [54, 84]. Thêm

vào đó, còn có một số dạng tái tổ hợp của các tuýp như đã kể trên, nhưng phần lớn

là các dạng tái tổ hợp B/C và C/D, trong khi các tái tổ hợp giữa các tuýp khác xảy ra

ít hơn các trường hợp kể trên [8].

1.1.2. Đặc điểm hình thái HBV

Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác

nhau (Hình 1): tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm, tiểu thể

hình ống (tubµLar particle) kích thước 22nm có chiều dài 40 - 400nm và tiểu thể

hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm. Tiểu thể hình cầu nhỏ và

hình ống là thành phần vỏ của HBV mà trong quá trình nhân lên tổng hợp dư thừa.

Đây chính là kháng nguyên bề mặt (HBsAg). Các tiểu thể này có thể đứng riêng rẽ

hay đứng hợp với nhau thành từng đám, chúng không có khả năng lây truyền bệnh

[48]. Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm. Đây chính là

hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp:

- Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein. Lớp này có các kháng

nguyên bề mặt (HBsAg) [28].

- Lớp lõi: Capsid đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõi HBcAg.

Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòng không kín,

enzyme phiên mã ngược polymerase và protein kinase [28, 34].

Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [100].

(A) Tiểu thể hình cầu lớn (tiểu thể Dane); (B) Tiểu thể hình cầu nhỏ; (C)

Tiểu thể hình ống.

1.1.3. Cấu trúc hệ gen HBV

Cấu trúc nucleocapsid HBV chứa bộ gen với chiều dài khoảng 3,2 kilobase

(kb) và là phân tử DNA sợi đôi không hoàn chỉnh dạng vòng không kín hoàn toàn

(relaxed circular DNA - rcDNA) [11, 17]. Nucleocapsid là một cấu trúc nhị thập

diện đều được hình thành bởi 240 phân tử protein capsid của virus với đường kính

khoảng 27 nm, và mỗi một nucleocapsid chứa một bản sao DNA của virus và

enzyme polymerase liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm [17, 58]. Một vài

protein của tế bào bao gồm protein kinase cũng được đóng gói vào trong cấu trúc

nucleocapsid [17]. Một trong những đặc điểm độc đáo của hệ gen HBV đó chính là

cấu trúc bất đối xứng giữa hai sợi. Sợi âm được tổng hợp đầy đủ và có chiều dài

bằng kích thước hệ gen, còn sợi dương bổ sung với sợi âm lại có sự khác biệt về

chiều dài, chiều dài của sợi dương cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu chính

xác, thay đổi theo từng tuýp, từng dòng [30]. Ngoài ra, cả sợi âm và sợi dương đều

có chung một điểm đặc biệt đó là cả 2 sợi đều là DNA dạng thẳng nhưng nhờ sự bổ

sung giữa 2 sợi mà hình thành cấu trúc vòng rcDNA.

Hệ gen của virus có chứa các khung đọc mở (open reading frame - ORF) xếp

chồng lên nhau kí hiệu là S, C, P và X mã hóa cho bốn protein khác nhau [58]. Cấu

trúc xếp chồng lên nhau của các vùng mã hóa khiến cho virus có thể sử dụng hệ gen

với hiệu suất 150% (Hình 2) [124].

- Gen PreS1/PreS2 và S (mã hóa cho 3 protein vỏ L-, M- và S)

- Gen precore/core (mã hóa cho protein nucleocapsid; HBcAg và các protein

không cấu trúc; HBeAg)

- Gen polymerase (enzyme reverse transcriptase, RNase H)

- Gen X (mã hóa cho protein điều hòa X)

Các gen S và C nằm ở các ORF riêng có các bộ ba mã mở đầu khác nhau,

tổng hợp các sản phẩm gen có chức năng khác nhau [30, 58]. Các ORF S và C lần

lượt kéo dài đến preS1 (preS1 và preS2) và vùng preC ở đầu 5’. Ở các vùng ORF

xếp chồng lên nhau có sự xuất hiện của các gen điều hòa là 4 vùng khởi động

(preC/C, preS1/S và X) và 2 trình tự tăng cường, các gen này cho phép sự biểu hiện

của 7 protein khác nhau được phiên mã từ các bộ ba mã mở đầu khác nhau bởi ít

nhất 5 mRNA khác nhau với đuôi tự do. Sản phẩm phiên mã đầu tiên có chiều dài

0,7 kb mã hóa cho protein HBx; các sản phẩm phiên mã có chiều dài 2,1 kb và 2,4

kb lần lượt mã hóa cho M- và S-HBsAg, L-HBsAg [30]. Sản phẩm phiên mã mã

hóa cho cả protein core và polymerase là pregenomic RNA (pgRNA). Pregenomic

RNA là mạch khuôn cho quá trình tổng hợp virus HBV và được phiên mã ngược để

hình thành nên hệ gen DNA của HBV. Như chúng ta đã biết, hệ gen của virus có

chiều dài 3,2 kb, và chiều dài của pgRNA là 3,5 kb, tức là dài hơn hệ gen của virus,

đó chính là bản sao “dự phòng” của hệ gen virus [75, 95]. Hai vùng gen với 11 nu

lặp lại được gọi là DR1 và DR2 nằm ở đầu 5’ ở cả sợi âm và sợi dương và hai gen

này có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của DNA virus [33, 58]. Hai trình

tự tăng cường (enhancer) kí hiệu là Enh1 và Enh2, giúp tăng biểu hiện của các sản

phẩm gen virus đặc hiệu với tế bào gan [58].

Vùng ORF S mã hóa cho các protein bề mặt của virus, HBsAg có cấu trúc

được phân chia và phân hóa tại các vùng preS1, preS1 và S với 3 bộ ba mã mở đầu

AUG khác nhau [92]. Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụ

thể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein

M và S HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [30, 33, 107].

Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV

1.1.4. Các protein HBV

Hệ gen HBV mã hóa cho 7 protein: HBx, core, polymerase, L-, M- và S-

HBsAg. Trong số các protein này, HBx là protein điều hòa không tham gia vào hình

thành cấu trúc của virus, HBeAg không tham gia vào cấu trúc của virion và protein

này được giải phóng một cách riêng biệt khỏi tế bào, polymerase chịu trách nhiệm

cho quá trình nhân lên của cả hệ gen, và protein core và HBsAg có chức năng hình

thành cấu trúc của virion. Chức năng của từng protein của virus HBV sẽ được nhắc

đến chi tiết hơn ở phần dưới đây.

Kháng nguyên E

HBeAg là sản phẩm cuối cùng của quá trình sau dịch mã ORF precore. Là

một trong những protein được mã hóa bởi sản phẩm phiên mã từ bộ gen của virus,

sự biểu hiện của protein này phụ thuộc vào vùng khởi động của bộ gen virus. ORF

HBeAg mã hóa cho một trình tự với đích là lưới nội chất (endoplasmic reticulum -

ER) và đồng thời cũng dịch mã ra các peptide hướng ngoài ER, nơi mà protein sau

khi hoàn thiện tồn tại ở dạng 15kD HBeAg - chính là các kháng nguyên được tiết ra

từ các tế bào nhiễm HBV [113].

Kháng nguyên bề mặt

HBsAg là protein vỏ của virion HBV. Như sự tồn tại của HBsAg ở các

virion trưởng thành, người lành mang HBV có chứa một lượng dư các tiểu thể hình

cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg không có khả năng gây nhiễm cũng tồn tại

trong huyết thanh của họ. Những tiểu thể này được tiết ra nhiều hơn (100 -100,000

lần) khi so với số lượng các virus trưởng thành được tiết ra [107]. Có một số báo

cáo đã chỉ ra rằng lý do các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg

được tổng hợp với số lượng gấp hàng nghìn lần so với tiểu thể Dane có thể là cái

bẫy dành cho hệ miễn dịch, từ đó, sự nhiễm mạn tính có thể được hình thành [30,

35]. HBsAg không chỉ được tạo ra bởi quá trình dịch mã của mRNA mà còn từ các

DNA tích hợp với bộ gen của người. Điều kiện này có thể giúp chúng ta biết được

trạng thái nhiễm của bệnh nhân một cách toàn diện hơn [107].

Chức năng chính của các kháng nguyên bề mặt đó là hình thành nên lớp vỏ

của virus. Ba dạng khác nhau của hạt virus được giải phóng từ tế bào nhiễm HBV là

kết quả của quá trình biểu hiện không đồng đều của ba kháng nguyên bề mặt này. S-

HBsAg là protein có mức biểu hiện cao nhất trong các kháng nguyên bề mặt của

virus HBV và protein này chính là thành phần chính cấu thành nên vỏ virus [25].

Protein lõi (protein core)

Protein core (protein lõi) (21 kD) hay còn gọi là HBcAg, là protein có vai trò

định hình cho virion. Khi được biểu hiện trong tế bào, protein này thường tồn tại ở

dạng nhị hợp, hoặc ở dạng capsid nhị thập diện đều T = 3 hoặc T = 4. Khoảng 95%

các nucleocapsid được phân lập từ tiểu thể Dane có chứa capsid T = 4 tạo nên

khoảng 120 lõi nhị hợp, với 5% còn lại là các capsid T = 3 với 90 nhị hợp.

Protein lõi được dịch mã từ pgRNA và 149 axit amin đầu tiên hình thành nên

vùng lắp ráp, có chức năng cho sự hình thành in vitro của capsid, capsid này sẽ có

sự khác biệt với capsid được phân lập từ tiểu thể Dane [16]. Khoảng 34 - 36 axit

amin còn lại sẽ tạo nên vùng C-terminal giàu Arginine (CTD); quá trình phosphoryl

hóa của một số axit amin trong vùng CTD có chức năng điều hòa một số giai đoạn

trong chu trình sống của virus [57, 65, 73, 81].

Polymerase/Reverse transcriptase (RTase)

Không lâu sau khi xác định được dạng virus giống HBV ở vịt [69], mô hình

DHBV đã được sử dụng để xác định bộ gen của DHBV có trải qua trung gian RNA,

cho thấy HBV nhân đôi thông qua quá trình phiên mã ngược (RT) [99]. Trong khi

quá trình phiên mã ngược là một cơ chế đã được nhiều virus sử dụng, HBV trải qua

quá trình sao chép bộ gen với nhiều đặc điểm độc đáo. Protein polymerase (reverse

transcriptase/RTase/Pol/P) là protein 90kD và có khoảng 838 axit amin được tạo

thành từ 3 vùng chức năng và một vùng đệm thay đổi. Ở vùng N-terminal là vùng

TP (terminal protein), là vùng có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trình

sao chép bộ gen virus. Mặc dù vùng này có vai trò quan trọng giúp polymerase bám

vào pgRNA, đóng gói RNA, liên kết các protein [9, 119, 129], vùng TP là một

domain độc đáo không có ở các virus RT không thuộc nhóm HBV. Một vùng đệm

thay đổi có khả năng phân chia TP domain từ RT domain, và đã có một số nghiên

cứu cho thấy gần như tất cả axit amin thuộc vùng đệm này có thể bị đột biến mà

không làm thay đổi chức năng của P [86]. Thực tế là, chỉ có 3 phân tử cysteine nằm

trong vùng C-terminal của vùng đệm, cùng với một phần tư của đầu N-terminal của

RT domain là quan trọng đối với chức năng của enzyme RTase/polymerase [53].

RT domain có vai trò trong quá trình nhân lên của bộ gen virus bằng cách phiên mã

ngược pgRNA để hình thành sợi âm trong DNA của bộ gen virus và sau đó sợi âm

này được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp sợi dương của DNA. Domain

này có độ tương đồng cao đối với các loại retrovirus khác [122]. Hiện nay domain

RT là liệu pháp đích duy nhất chống lại HBV [91], dựa trên hiệu quả của các loại

thuốc NAs có khả năng ức chế khả năng của enzyme RTase của virus HIV. Thực tế

là, các thành phần trong HBV RTase có thể được thay thế bằng các thành phần

đồng hợp của HIV RTase [116].

Domain cuối cùng, P, là domain của enzyme RNase H. Domain này chịu

trách nhiệm cho việc cắt bỏ mạch khuôn pgRNA trong suốt quá trình tổng hợp sợi

âm của hệ gen DNA. Sự định hướng của các liên kết ion kim loại là rất quan trọng

đối với hoạt tính của RNase H, đạt được qua 4 carboxylate được bảo toàn [103].

Một vài nghiên cứu về domain RNase H cho thấy vai trò quan trọng của domain

này trong việc đóng gói pgRNA [10].

Protein X

HBx là protein có chức năng điều hòa duy nhất được mã hóa bởi HBV.

Protein này gồm có 154 axit amin, 17 kD và được mã hóa bởi ORF nhỏ nhất của

HBV. Đã có rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy những bằng chứng xác thực về vai trò

cần thiết của HBx trong suốt quá trình nhân lên của HBV. Đặc biệt, có một vài

nghiên cứu đã chỉ ra rằng HBx liên kết với cccDNA [13], và HBx là yếu tố cần cho

quá trình phiên mã từ cccDNA [94]. Ngoài ra còn một số nghiên cứu về các HBV ở

động vật có vú cho thấy vai trò của các protein X đối với quá trình nhân lên của bộ

gen virus [128]. Những thử nghiệm về việc ức chế HBx đều cho thấy sự suy giảm

về mức độ nhân lên của virus HBV đã cho chúng ta thấy một điều rằng có thể HBx

không thật sự cần thiết cho quá trình nhân lên của virus nhưng không thể nghi ngờ

gì về khả năng tăng cường mức độ nhân lên của virus [108]. Quan trọng là, sự cần

thiết của HBx đã được chứng minh trong các tế bào gan của người trực tiếp nhiễm

HBV kiểu dại hoặc HBV có gen HBx bị bất hoạt [64].

1.1.5. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe

a) Lựa chọn vùng trình tự ổn định, đặc hiệu cho HBV pgRNA làm đích thiết

mồi/probe.

HBV là virus rất được quan tâm từ nhiều thập kỷ trước, tuy nhiên cho đến

nay HBV vẫn còn là một bí ẩn do hệ gen của HBV chứa nhiều biến dị di truyền và

đột biến ngẫu nhiên. Do đó, bước quan trọng trước khi lựa chọn vùng trình tự

pgRNA để thiết kế mồi, probe là phân tích tính đa dạng di truyền, các đột biến trong

hệ gen HBV để từ đó xác định được vùng gen ổn định, đặc hiệu nhất.

Đa dạng di truyền của virus viêm gan B:

Như các virus khác, biến dị di truyền và sự tiến hóa của hệ gen là những yếu

tố quan trọng trong chu trình sống của virus HBV. Tuy nhiên, khác với những virus

có hệ gen là DNA khác, HBV có những đặc tính riêng biệt làm chúng trở nên khác

biệt với các virus đó. Đáng chú ý là enzyme polymerase của HBV thiếu đi chức

năng đọc sửa, và virus này có một bước trung gian qua RNA (pgRNA) trong chu

trình nhân lên của chúng. Hai đặc điểm này làm tăng khả năng xảy ra những sai số

ngẫu nhiên trong suốt quá trình nhân lên của hệ gen virus, dẫn đến sự biến đổi của

hệ gen [19, 51, 52]. Nói chung, tỉ lệ đột biến thay thế nucleotide của HBV ước tính vào khoảng 1,4 – 5,0 × 10−5 trên từng vị trí mỗi năm, gấp gần 10 lần so với những

virus có bản chất hệ gen là DNA và RNA [76]. Mặt khác, nhờ vào cấu trúc xếp

chồng phức tạp của các khung đọc mở (open reading frame - ORFs) trong hệ gen

của HBV, thuận lợi cho việc phát sinh các biến dị [74, 77].

Đột biến ngẫu nhiên:

Đột biến điểm ngẫu nhiên có thể xuất hiện ở những cá thể tùy thuộc vào áp

lực chọn lọc khác nhau, như đã đề cập đến ở trên, hoặc xuất hiện trong quá trình

nhân lên của hệ gen, phân cắt hoặc nối hệ gen virus hoặc quá trình ghép nối và sửa

chữa của pgRNA [29, 98, 112]. Các đột biến ở những vùng khác nhau trên hệ gen

xuất hiện xuyên suốt các pha đặc hiệu trong quá trình lây nhiễm, ví dụ như đột biến

xảy ra ở vùng precore (đột biến PC), ở vùng lõi nền vùng khởi động (đột biến BCP),

thêm hoặc mất ở gen C, preS1 hoặc preS2, thay thế yếu tố quyết định kháng nguyên

‘a’ của HBsAg, đột biến kháng thuốc lamivudine hay các loại thuốc kháng virus

khác xảy ra ở protein Pol và đã được nghiên cứu xuyên suốt. Những loại đột biến

này giúp cho virus có thể sống dai dẳng trong các tế bào gan và có khả năng trốn

thoát khỏi hệ thống miễn dịch và áp lực của điều trị. Dù sao, dựa trên lý thuyết là

chủng dại (wild type) sẽ không bị thay thế dù trải qua hàng trăm năm của quá trình

tiến hóa, cho đến khi chúng vẫn là những kiểu gen không gây hại, ít nhất là ở những

giai đoạn đầu của pha dung nạp miễn dịch, trong khi chúng được thay thế sau đó

bởi các biến dị ở các giai đoạn sau của quá trình lây nhiễm [37].

Mặc dù hệ gen của HBV tồn tại nhiều biến dị, đột biến ngẫu nhiên song vẫn

tồn tại một số vùng bảo thủ cho thiết kế mồi, probe. Các vùng bảo thủ trong các

vùng gen của HBV đã được khảo sát từ nhiều nghiên cứu trước. Karinova và cộng

sự [50] đã tìm ra hai vùng được bảo thủ trong vùng gen S và X. Hai vùng gen này

có liên quan đến sự sao chép của HBV và lây nhiễm tế bào gan. Đặc biệt, vùng gen

X có liên quan mật thiết với HCC. Trong nghiên cứu này, vùng gen S được lựa

chọn là vùng có tỉnh ổn định và đặc hiệu cho HBV, vùng đích thiết kế mồi, probe

cho phản ứng RT-qPCR.

b) Đánh giá sơ bộ tính đa hình, đột biến của vùng gen dự định thiết kế mồi/probe

của HBV trên người Việt Nam.

Vùng gen S được đánh giá là vùng trình tự pgRNA ổn định, đặc hiệu. Tuy

nhiên, không phải tất cả vùng S đều ổn định. Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát

vùng trình tự ổn định nhất thuộc gen S trên đối tượng người Việt Nam. Các nghiên

cứu trên thế giới cho thấy vùng trình tự đầu N-terminal là vùng bảo thủ nhất của gen

S. Ngoài ra, vùng này cần thiết cho sự lắp ráp và bài tiết các hạt virus, tương tác với

kháng nguyên bề mặt [85]. Do đó, vùng đầu N-terminal của gen S được lựa chọn

làm vùng gen đích cho thiết kế mồi, probe trong phản ứng RT-qPCR định lượng

HBV RNA.

1.1.6. Chu trình nhân lên của HBV

HBV là một tác nhân truyền nhiễm chủ yếu qua đường máu và dịch cơ thể.

Qua tương tác với thụ thể vận chuyển nhân tế bào và protein nhận, lõi capsid và

relaxed circular HBV DNA (rcDNA) (hệ gen virus) được chuyển vào tế bào gan

[47]. Tuy nhiên, trước đó rcDNA được cải biến để chuyển thành dạng cccDNA

(DNA dạng vòng mạch kép). Cơ chế chuyển đổi như sau: Đầu tiên, rcDNA được

gắn với polymerase để khởi động quá trình. Sau đó, loại RNA primer ở đầu 5’ sợi

dương, loại trình tự thừa r và protein P ở đầu 5’ sợi âm. Bước tiếp theo là hoàn thiện

sợi dương không hoàn chỉnh. Cuối cùng, lai sợi âm và sợi dương với nhau hình

thành cccDNA, cccDNA được chuyển vào trong tế bào gan [31].

Qua sự hình thành cccDNA trong lây nhiễm tế bào gan, sự nhân lên của virus

trong tế bào gan như sau: cccDNA là khuôn phiên mã ra 5 loại RNA của virus cần

thiết choc ho việc tạo các kháng thể và quá trình nhân lên của virus. Sau đó, quá

trình diễn ra trong bào tương phiên mã ngược pgRNA trong các nucleocapsid mới

hình thành. RcDNA có chứa nucleocapsid tiếp theo được bao gói trong hạt virus và

được tiết ra dòng máu [115].

Hoạt tính phiên mã của cccDNA có thể được xác định qua đo tải lượng

pgRNA trong tế bào gan. Để tránh sinh thiết gan, các marker tự do trong huyết

tương được sử dụng để đánh giá hoạt tính phiên mã của cccDNA trong dự báo đáp

ứng điều trị CHB. Thêm vào đó, HBV RNA được xác định có mặt trong máu ngoại

vi bệnh nhân CHB và quan trọng nhất là pgRNA được bao gói trong hạt virus.

PgRNA huyết tương phản ánh lượng pgRNA trong tế bào gan, vì vậy pgRNA trong

huyết tương gián tiếp phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA trong tế bào gan

[7].

Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [49].

Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [49].

1.1.7. Con đường lây nhiễm của virus HBV

Theo WHO, HBV có thể tồn tại bên ngoài cơ thể ít nhất 7 ngày. Trong

khoảng thời gian đó, virus vẫn có khả năng lây nhiễm nếu như virus có thể xâm

nhập vào cơ thể của một người không được bảo vệ bởi vaccine. Quá trình ủ bệnh

của virus HBV trung bình khoảng 75 ngày, nhưng có thể nằm trong khoảng từ 30

đến 180 ngày. Virus có thể được phát hiện trong khoảng từ 30 đến 60 ngày sau khi

bị nhiễm virus và có thể kéo dài dai dẳng và phát triển thành viêm gan B mạn tính.

Ở các vùng có mật độ lây nhiễm cao, HBV thường có xu hướng lây truyền từ

mẹ sang con trong khoảng thời gian mang thai, hoặc qua truyền thẳng (lây nhiễm

qua máu người mang virus), đặc biệt là từ trẻ nhiễm virus sang trẻ không nhiễm

trong khoảng 5 năm đầu. Sự phát triển của viêm gan B mạn ở trẻ sơ sinh thường là

do người mẹ truyền sang trong khoảng thời gian mang thai hoặc trong 5 năm đầu

đời.

HBV còn lan truyền qua da hoặc niêm mạc với máu của người bị nhiễm bệnh

và một số dịch cơ thể, ví dụ như nước bọt, kinh nguyệt, dịch âm đạo và tinh dịch.

Lây truyền qua đường tình dục cũng có thể xảy ra, đặc biệt là người nam chưa tiêm

vaccine có quan hệ tình dục với nhiều người người đồng giới và khác giới. Nhiễm

HBV ở người trưởng thành có ít hơn 5% là dẫn đến hình thành tình trạng viêm gan

mãn tính. Sự lây truyền của virus còn có thể xảy ra qua việc sử dụng lại kim và ống

tiêm ở các trung tâm chăm sóc sức khỏe. Thêm vào đó, sự lây nhiễm có thể xảy ra

trong quá trình phẫu thuật, chăm sóc sức khỏe hay nha khoa, thông qua xăm hình

hoặc qua sử dụng dao cạo hoặc những vật dụng tương tự có nhiễm với máu của

người mang virus.

1.2. Tổng quan về viêm gan B mạn tính

1.2.1. HBV và viêm gan B

Viêm gan B mạn tính [104]:

 HBsAg dương tính > 6 tháng.

 Nồng độ DNA HBV huyết thanh > 20000 IU/mL (105 copy/mL), giá

trị thấp hơn khoảng 2000-20000 IU/mL (104-105 copy/mL) thường gặp ở bệnh

nhân viêm gan B mạn tính có HBeAg âm tính.

 Nồng độ ALT/AST tăng cao liên tục và kéo dài.

 Sinh thiết gan cho thấy mức độ viêm gan vừa hoặc nặng.

Viêm gan B mạn tính là hiện tượng viêm hoại tử gan do nhiễm HBV kéo dài

trên 6 tháng. Viêm gan B mạn tính chia thành 2 thể là HBeAg dương tính và

HBeAg âm tính. Viêm gan B mạn tính nếu không được điều trị có thể tiến triển

thành xơ gan hay HCC [63].

Các triệu chứng lâm sàng thường không nhiều và đôi khi khá mờ nhạt, gồm

mệt mỏi, đau hạ sườn phải, vàng da và ngứa khi có tắc mật. Khám lâm sàng thấy

gan to mức độ vừa, đôi khi đau, có thể thấy lách to.

1.2.2. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Nhiễm HBV là một vấn đề sức khỏe mang tính toàn cầu, ước tính khoảng

248 triệu người mang virus này trên toàn thế giới, trong đó tỉ lệ tử vong có thể lên

đến 600,000 người/năm do các bệnh lý liên quan đến HBV [70, 78]. Mặc dù đã có

sự phát triển của các vaccine ngăn chặn bệnh với hiệu quả cao từ những năm 1980

và việc bổ sung chương trình tiêm chủng vaccine mở rộng tại hơn 168 quốc gia,

bệnh gan do nhiễm mạn tính HBV vẫn là gánh nặng khổng lồ đối với toàn xã hội.

Hepatitis B virus (HBV) là virus thuộc họ Hepadnviridae và có đặc tính

phiên mã ngược từ RNA giống như các retrovirus. Virus viêm gan B (HBV) là

nguyên nhân gây ra nhiễm thoáng qua và mạn tính ở gan. Nhiễm thoáng qua có thể

gây nên một số bệnh lý nghiêm trọng, khoảng 0,5% người nhiễm thoáng qua có khả

năng tử vong, viêm gan cấp tính. Nhiễm viêm gan B mạn tính có thể có những hậu

quả nghiêm trọng như: khoảng 25% bệnh nhân nhiễm viêm gan B mạn tính có thể

tiến tới ung thư gan [12]. Số bệnh nhân tử vong do ung thư gan liên quan đến HBV

trên toàn thế giới có thể lên đến một triệu người mỗi năm [79].

Hiện nay trên thế giới ước tính có khoảng hai tỷ người đã từng nhiễm HBV,

trong đó có 248 triệu người nhiễm viêm gan B mạn tính (dương tính với kháng

nguyên bề mặt HBsAg) [78, 93]. Tỷ lệ dương tính với HBsAg theo báo cáo là 3,6%,

tuy nhiên tỷ lệ này có thể thay đổi tùy thuộc vào từng khu vực địa lý khác nhau. Tỷ

lệ của viêm gan B mạn tính thấp hơn 2% ở các khu vực như Mỹ, Canada và Tây

Âu; các nước có tỷ lệ trung bình (2-7%) như các nước ở Địa Trung Hải, Nhật Bản,

Trung Á, Trung Đông và một vài nước Nam Mĩ; và các nước có tỷ lệ cao (trên 8%)

là các nước ở Tây Phi, Nam Sudan [78, 93, 125].

Sự khác biệt dẫn đến tỷ lệ nhiễm viêm gan B mạn tính khác nhau ở từng khu

vực trên thế giới phần lớn liên quan đến độ tuổi có mối liên quan nghịch với nguy

cơ tiến triển thành mạn tính. Tỷ lệ tiến triển từ nhiễm HBV cấp tính sang mạn tính

là khoảng 90% đối với trường hợp nhiễm khi còn trong thai kỳ của người mẹ [97],

khoảng từ 20 - 50% cho trẻ em từ 1 đến 5 tuổi [101, 117] và nhỏ hơn 5% ở giai

đoạn trưởng thành [101].

1.2.3. Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam

Ở Việt Nam có rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV nước ta

đứng hàng cao nhất thế giới. Tần suất HBsAg dương tính ở người lớn từ 15 đến

21% thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu người

mang HBV mạn tính [2]. Tỷ lệ mang anti-HBs trên 60%, tuy vậy tỷ lệ nhiễm HBV

ở từng nhóm đối tượng, từng vùng theo từng tác giả cũng khác nhau.

HBV là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh liên quan đến gan và nó có

thể dẫn đến viêm gan cấp tính và mạn tính [92]. HBV có thể gây ra các biến chứng

muộn như viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan; do đó nó vẫn

là một vấn đề sức khỏe mang tính toàn cầu [127].

Hiện nay, interferon-α (IFN) thông thường, interferon-α duy trì (Peg-IFN) và

các thuốc kháng virus đồng đẳng nucleot(s)ide (NAs - nucleos(t)ide analogs) là các

loại thuốc được chấp nhận cho điều trị viêm gan B mạn tính (CHB). Trong khi IFN

có khả năng kháng virus, chống sự tăng sinh của virus và hiệu ứng miễn dịch thì các

loại thuốc kháng virus đồng đẳng nucleoside (như lamivudine, entecavir,

telbivudine) và các loại thuốc kháng virus đồng đẳng nucleotide (như adefovir,

tenofovir) lại có khả năng ức chế hoạt tính của DNA polymerase của virus HBV và

khiến cho quá trình phiên mã ngược từ RNA sang DNA bị dừng lại [109]. Mặc dù,

các loại thuốc kháng virus đồng đẳng như vậy ức chế sự nhân lên của HBV, giảm

quá trình gây viêm gan và liên quan đến sự thuyên giảm bệnh gan, không có loại

thuốc đang được sử dụng hiện nay có khả năng chữa khỏi nhiễm HBV do các loại

thuốc đó đều hiếm khi có thể loại bỏ virus hoàn toàn [15, 109]. Việc tìm ra phân tử

đích hiệu quả của các loại thuốc kháng HBV mới hiện nay là vô cùng cần thiết để

có thể chữa trị khỏi cho bệnh nhân nhiễm HBV. Các phân tử đích đó có thể là các

phân tử nằm trong quá trình nhiễm và nhân lên của virus HBV [118]. Vì vậy, việc

hiểu về bản chất sinh học của virus HBV cũng như chu trình sống của virus này là

rất cần thiết cho việc xác định những phân tử đích của các loại thuốc kháng virus và

phát triển các loại thuốc kháng virus mới có khả năng chữa trị khỏi và loại bỏ hoàn

toàn virus HBV.

1.3. Tình hình nghiên cứu HBV

1.3.1. Trên thế giới

a) Các dấu ấn virus học ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

 Kháng nguyên bề mặt HBsAg

HBsAg là kháng nguyên bề mặt, xuất hiện đầu tiên khi có sự xâm nhập của

HBV, khoảng vài tuần trước khi có triệu chứng lâm sàng. Trên thực tế, chỉ tiêu

HBsAg là bằng chứng đầu tiên và rõ ràng cho tình trạng nhiễm HBV ở người bệnh.

Anti-HBs: là kháng thể sinh ra do đáp ứng với kháng nguyên bề mặt của

HBV. Anti-HBs là dấu ấn phản ánh tình trạng đã khỏi bệnh hoặc đã miễn nhiễm.

Anti-HBs xuất hiện khoảng 3 tháng sau khi bệnh khởi phát và thường khoảng 1-10

tuần sau khi HBsAg âm tính.

 HBcAg: là kháng nguyên cấu trúc của phần nucleocapsid (kháng nguyên lõi),

thường phát hiện trong nhân tế bào gan nhiễm HBV và không bao giờ xuất hiện

trong máu.

 Anti-HBc: là dấu ấn rất quan trọng để khẳng định bệnh nhân đã từng nhiễm

HBV, anti-HBc không được tạo ra trong tiêm chủng. Đồng thời các lớp kháng thể

của anti-HBc còn có ý nghĩa trong chẩn đoán giai đoạn cấp hay mạn tính của nhiễm

HBV. Trong giai đoạn viêm gan B cấp tính, anti-HBc IgM dương tính ở nồng độ

cao, sau đó sẽ giảm dần và biến mất trong giai đoạn mạn tính, lúc này chỉ còn anti-

HBc IgG dương tính. Tuy nhiên anti-HBc IgM (+) trong các đợt kịch phát cấp tính

của viêm gan B mạn tính.

 HBeAg: có cùng nguồn gốc gen với HBcAg, HBeAg được tổng hợp vượt trội

trong giai đoạn nhân lên của virus, vì vậy kháng nguyên này có ý nghĩa trong đánh

giá tình trạng tiến triển hay tiềm tàng của HBV trong cơ thể người bệnh và khả

năng lây nhiễm (vợ/chồng, con).

 Anti-HBe: sự chuyển đảo huyết thanh xảy ra khi anti-HBe từ âm tính chuyển

sang dương tính và HBeAg từ dương tính chuyển sang âm tính. Hiện tượng này

phản ánh sự nhân lên của HBV giảm dần hoặc chấm dứt.

HBV DNA: dương tính trong các giai đoạn virus đang hoạt động và nhân lên

mạnh ở tế bào ký chủ. Trong thực hành điều trị lâm sàng viêm gan B mạn tính, chỉ

số nồng độ HBV DNA có ý nghĩa quan trọng, là một trong các chỉ số quyết định

liên quan đến quyết định điều trị, phác đồ điều trị cũng như tiên lượng sau điều trị.

b) Các xét nghiệm định lượng hiện nay về dấu ấn virus học

 Định lượng HBV DNA

Phần lớn các xét nghiệm định lượng HBV DNA được sử dụng trên lâm sàng

đều dựa trên nguyên lý khuếch đại chuỗi phản ứng polymerase (PCR) với ngưỡng

phát hiện 50 – 200 IU/ml (250-1000 copy/ml) [80], và dải đo lên tới 4-5 log10

IU/mL. Gần đây, công nghệ PCR xét nghiệm HBV DNA với độ nhạy cải thiện (5-

10 IU/mL), cho phép mở rộng dải đo lên tới 8-9 log10 IU/mL [120]. Tải lượng HBV

DNA là một dấu ấn chủ yếu để đánh giá bệnh nhân viêm gan B mạn tính và làm cơ

sở để đưa ra biện pháp điều trị chống virus hiệu quả.

Một khó khăn trong việc sử dụng nồng độ HBV DNA trong huyết tương để

đánh giá là tìm ra giới hạn có ý nghĩa được sử dụng để xác định các chỉ định điều trị

và sự đáp ứng. Do HBV DNA tồn tại trong cả huyết thanh của những người đã khỏi

sau khi nhiễm HBV cấp tính [88], nồng độ HBV DNA thấp có thể không liên quan

đến sự tiến triển của bệnh gan và sự loại bỏ hoàn toàn virus là một một mục tiêu điều trị không thực tế. Một giá trị chuẩn 20,000 IU/mL (105 copy/mL) được lựa

chọn như một tiêu chuẩn chẩn đoán viêm gan B mạn tính tại hội nghị NIH 2000

[62]. Tuy nhiên, viêm gan B mạn tính, xơ gan và HCC đã gặp ở những bệnh nhân

có nồng độ HBV DNA dao động nhiều từ không xác định được cho đến nồng độ >

2,000,000 IU/mL [26].

 Định lượng HBeAg và HBsAg

Ngoài nồng độ HBV DNA, một số khảo sát lâm sàng đã cung cấp bằng

chứng cho thấy mối quan hệ giữa các kháng nguyên khác với virus, ví dụ như kháng

nguyên e (HBeAg) và kháng nguyên bề mặt (HBsAg) với quá trình tiến triển tự

nhiên của bệnh cũng như bệnh nhân đáp ứng với điều trị kháng virus [14, 40, 89,

121]. Theo đó, sự phát triển của những xét nghiệm định lượng các kháng nguyên

quan trọng của virus bao gồm cả HBeAg và HBsAg đã trở thành một trọng tâm của

giai đoạn tiếp theo trong nghiên cứu lâm sàng.

Trong quá trình nhân lên của HBV, các sản phẩm protein như HBsAg có thể

được tổng hợp dư thừa dẫn đến hiện tượng ở một số bệnh phẩm chúng ta thấy các

tiểu thể kích thước nhỏ (32nm) hình cầu hoặc hình ống. Đây là một trong những

nguyên nhân giải thích tại sao việc định lượng nồng độ HBsAg trong máu ít có giá

trị trong việc đánh giá mức độ hoạt động của HBV. Tất cả các hạt HBV hoàn chỉnh

cũng như các tiểu thể không hoàn chỉnh đều có trong máu và lưu hành trong hệ tuần

hoàn.

c) Phát hiện về dấu ấn phân tử HBV pgRNA huyết tương và vai trò của dấu

ấn mới

 Phát hiện dấu ấn phân tử HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân viêm

gan B mạn tính

Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh có sự hiện diện phổ biến của

HBV pgRNA trong máu ngoại vi của bệnh nhân nhiễm HBV [36, 55, 123] và nó

vẫn còn sau khi mất HBsAg huyết thanh [22, 68], nhưng không thể xác định rõ liệu

virus có tái tạo trong các tế bào hay không. Sau đó, Colucci và CS đã sử dụng

phương pháp lai Southern blot [27] và Hadchouel cùng CS sử dụng kỹ thuật lai tại

chỗ (in-situ hybridization) đã phát hiện HBV pgRNA không chỉ có ở những bệnh

nhân HBsAg dương tính mà còn có ở những bệnh nhân HBsAg âm tính [38]. Tuy

nhiên, các phương pháp này chưa đủ độ nhạy để phát hiện các bản sao phiên mã ở

những bệnh nhân bị nhiễm HBV với nồng độ thấp trong máu ngoại vi [38]. Ngoài

ra, cũng có một số báo cáo về việc phát hiện HBV pgRNA trong máu ngoại vi bằng

kỹ thuật PCR, nhưng những báo cáo này thực hiện trên số lượng bệnh nhân không

nhiều. Do đó, mối quan hệ giữa HBV pgRNA trong máu ngoại vi và đặc điểm lâm

sàng chưa được khảo sát ở những báo cáo trên.

Những năm sau đó, Shi và CS đã sử dụng phương pháp Reverse

Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) để phát hiện HBV pgRNA lưu

hành trong máu ngoại vi của bệnh nhân [72]. Kết quả là đã phát hiện được HBV

pgRNA ở 19/57 (37,1%) bệnh nhân có HBsAg dương tính và 1/10 (10%) bệnh nhân

có HBsAg âm tính, trong khi đó 6 bệnh nhân khỏe mạnh đều không xuất hiện sự có

mặt của HBV pgRNA. Tần số của HBV pgRNA dương tính được phát hiện ở

những bệnh nhân có mức ALT cao, HBeAg huyết thanh dương tính và mức độ

HBV DNA ≥ 0,7 Meq/ml.

Năm 2015, Louis và CS đã sử dụng kỹ thuật Realtime PCR có độ nhạy cao

để phát hiện và định lượng nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương của những

bệnh nhân viêm gan B mạn tính [43]. Kết quả là đã phát hiện được HBV pgRNA

trong huyết tương của tất cả bệnh nhân viêm gan B mạn tính có HBeAg dương tính

và HBeAg âm tính. Thêm vào đó, đã có nhiều báo cáo cho thấy phát hiện được

HBV pgRNA có mặt trong huyết tương trong khi điều trị với NA [39, 41, 90, 126].

1.3.2. Trong nước

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng ở nước ta

đứng hàng cao nhất thế giới. Tần suất có HBsAg (+) ở người lớn từ 15 đến 21%

thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu người mang

HBV mạn tính [3]. Với diễn biến phức tạp trong điều trị bệnh viêm gan B mạn tính

và tiên lượng nặng nề của các biến chứng liên quan HBV về bệnh gan như xơ gan

và ung thư biểu mô tế bào gan, vấn đề quản lý, giám sát người nhiễm HBV mạn

tính ở nước ta những năm gần đây rất được quan tâm nghiên cứu. Đã có nhiều công

trình nghiên cứu đề cập về vai trò của các dấu ấn huyết thanh virus học trong dự

báo đáp ứng điều trị và tiên lượng sau điều trị.

Năm 2012, Trần Ngọc Ánh công bố kết quả nghiên cứu về nồng độ HBsAg,

HBV DNA huyết tương trên 279 bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Kết quả cho thấy

nồng độ HBsAg trung bình 3,66 ± 0,44 log10IU/ml, HBV DNA trung bình 7,3 ±

1,67 log10 copies/ml. Nồng độ HBsAg, HBV DNA cao hơn đáng kể ở các bệnh

nhân viêm gan B mạn tính HBeAg dương tính so với nhóm HBeAg âm tính, không

có sự liên quan giữa nồng độ HBsAg và HBV DNA (p = 0,231, r = 0,136) ở cả hai

nhóm bệnh nhân [1] .

Tuy nhiên, tác giả Phạm Hoàng Phiệt và Nguyễn Phương Thảo trong một

công bố năm 2010 trên 97 bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính đã đưa ra nhận định

khác. Nhóm bệnh nhân nghiên cứu có HBV DNA ở mức cao và ALT > 60 IU/ml đã

cho thấy nồng độ HBsAg có mối tương quan khá chặt chẽ với nồng độ HBV DNA

ở nhóm bệnh nhân có HBeAg dương tính, mối tương quan này chặt chẽ hơn ở thể

viêm gan có HBeAg âm tính (r=0,6336;p=0,000 so với r=0,303;p<0,0287 tương

ứng) [5]. Kết luận này cũng được tác giả Hoàng Tiến Tuyên và CS xác nhận trong

một nghiên cứu công bố năm 2017, đồng thời nhóm tác giả cũng nhận thấy không

có sự tương quan giữa nồng độ HBsAg, HBV DNA với hoạt độ ALT trên các nhóm

bệnh nhân viêm gan mạn tính [4].

Tác giả Võ Triều Lý và CS năm 2015 đã công bố một nghiên cứu bước đầu về

định lượng HBsAg giúp phân biệt người mang HBV không hoạt động (I) và viêm gan

B mạn tái hoạt (II) cho thấy HBsAg định lượng của nhóm I (inactive carrier) thấp hơn

nhóm II (active carrier) có ý nghĩa thống kê. HBsAg định lượng tại một thời điểm với

giá trị < 1000 IU/mL có thể giúp phân biệt người mang HBV không hoạt động và viêm

gan B mạn tính tái hoạt [6].

Kết quả của các tác giả trong nước tương đối phù hợp với nhận định thu

được từ các nghiên cứu trên thế giới về vai trò của HBsAg trong đáp ứng điều trị và

tiên lượng bệnh viêm gan B mạn tính. Tuy nhiên, nhiều báo cáo cũng đã đề cập về

việc tạo ra một cách dư thừa lượng HBsAg trong huyết tương bệnh nhân viêm gan

B mạn tính làm giảm vai trò của yếu tố nồng độ HBsAg trong việc phản ánh nồng

độ cccDNA trong tế bào gan cũng như sự nhân lên của HBV [82], [96]. Việc trị liệu

các bệnh nhân viêm gan B mạn tính bằng các NAs mới có hoạt tính kháng virus cao

như entecavir hay tenofovir làm giảm nhanh nồng độ HBV DNA huyết tương, điều

này làm giảm vai trò về động học của HBV DNA đối với việc dự báo chuyển đảo

HBeAg trong quá trình điều trị.

Mặc dù các nghiên cứu trên thế giới gần đây đã đề cập đến vai trò của nồng

độ HBV pgRNA huyết tương trong dự báo chuyển đảo huyết thanh và đáp ứng

virus bền vững sau điều trị bằng NA [115], [18]. Việc giám sát quản lý nhiễm HBV

mạn tính ở các cơ sở y tế trong nước hiện nay chủ yếu theo các hướng dẫn của một

số hiệp hội về bệnh gan lớn trên thế giới (AASLD - Hội nghiên cứu bệnh gan Mỹ,

EASL - Hiệp hội nghiên cứu gan châu Âu, APASL - Hiệp hội nghiên cứu bệnh gan

Châu Á Thái Bình Dương), chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá về các dấu ấn mới

trong giám sát theo dõi và quản lý với các bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở Việt

Nam. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố về quy trình định

lượng tải lượng HBV pgRNA huyết tương cũng như vai trò của biến động tải lượng

HBV pgRNA trong đáp ứng điều trị cũng như tiên lượng sau điều trị trên bệnh nhân

viêm gan B mạn tính ở Việt Nam.

1.4. Tính mới và tính sáng tạo của đề tài

Mục tiêu điều trị của viêm gan B mạn tính là cải thiện chất lượng cuộc sống

và duy trì sự sống bằng cách ngăn chặn sự tiến triển của bệnh xơ gan, xơ gan mất

bù, bệnh gan giai đoạn cuối, ung thư biểu mô tế bào gan và tử vong. Đây là mục

tiêu có thể đạt được nếu sự sao chép của HBV bị ức chế và duy trì liên tục. Việc

giảm nồng độ HBV DNA kèm theo hoạt động mô học của viêm gan B mạn tính làm

giảm nguy cơ xơ gan và giảm nguy cơ HCC, đặc biệt trong những bệnh nhân xơ

gan [59]. Tuy nhiên, nhiễm HBV mạn tính không thể hoàn toàn bị loại trừ do sự tồn

tại bền vững của covalently closed circular DNA (cccDNA) trong nhân của tế bào

gan bị nhiễm HBV [21, 87]. Hơn nữa, bộ gen HBV được tích hợp vào hệ gen của

vật chủ và có thể phát sinh ung thư [20, 23, 83].

Các nghiên cứu trên thế giới và trong nước đánh giá vai trò của các dấu ấn

virus viêm gan B như HBV DNA, HBeAg, HBsAg đã có đóng góp tích cực nhất

định trong việc kiểm soát bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính. Tuy nhiên cho đến nay,

chưa có một mô hình nào có thể dự báo đáp ứng virus sớm trong điều trị, dự báo

đáp ứng virus bền vững sau kết thúc điều trị mang lại hiệu quả cao trong thực hành

lâm sàng [60], [18], [105].

Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay được cấp phép là Peg-IFN α-

2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside

(nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir,

Tenofovir [32], [63]. Sự ức chế dài hạn việc tái bản HBV bằng NAs làm giảm đánh

kể những biến chứng liên quan đến nhiễm HBV, tuy nhiên thời gian điều trị với các

NAs không được xác định và với hầu hết bệnh nhân phải điều trị suốt đời [63]. Ở một

số bệnh nhân được điều trị bằng NAs, sự chuyển đảo HBeAg huyết thanh có thể xảy

ra với sự biến mất của HBeAg và xuất hiện anti-HBe. Đến nay, chuyển đảo HBeAg

huyết thanh được công nhận là một dấu mốc quan trọng trong quá trình điều trị nhiễm

HBV mạn tính, là điều kiện tiên quyết cho sự chuyển đảo HBsAg huyết thanh, cả hai

đều đại diện cho sự thuyên giảm nhiễm HBV một cách ổn định và cho phép ngừng

điều trị [32], [18]. Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu trên thế giới và trong nước

vẫn chưa thiết lập được các công cụ hiệu quả nhằm dự báo sự chuyển đảo HBeAg

như một kết quả của quá trình điều trị với các NAs.

Sự suy giảm mạnh về nồng độ HBV DNA huyết tương ở các bệnh nhân viêm

gan B mạn tính khi được đơn trị liệu bằng NAs đã được nhiều nghiên cứu đề cập

[32], [111]. Tuy nhiên việc ức chế tổng hợp DNA không ảnh hưởng trực tiếp tới

nguồn cccDNA trong nhân tế bào gan bị nhiễm, do đó hầu như không loại bỏ hoàn

toàn được cccDNA trong thực hành lâm sàng [71] và khi ngừng điều trị, người ta lại

thấy sự phục hồi trở lại của HBV DNA trong huyết tương người bệnh. Một số

nghiên cứu cho thấy nồng độ HBsAg cũng là một yếu tố tiềm năng trong tiên lượng

đáp ứng điều trị và tiên lượng các biến chứng gặp phải trên bệnh nhân viêm gan B

mạn tính [44], [96], [24]. Tuy nhiên, việc HBsAg được tạo ra một cách dư thừa

trong máu ngoại vi nên HBsAg cũng chưa phản ánh chính xác cccDNA trong nhân

tế bào gan và điều này làm giảm vai trò của yếu tố nồng độ HBsAg trong các tiên

lượng về sự nhân lên của HBV.

Việt Nam nằm trong khu vực có tỉ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng vào

loại cao nhất trên thế giới [56] và nhiễm HBV mạn tính là một vấn đề y tế nặng nề

tại nước ta. Sự cấp thiết trong việc tìm ra hay thiết lập các công cụ theo dõi, kiểm

soát điều trị cũng như quản lý hạn chế sự lây nhiễm trong cộng đồng là rất rõ ràng

trong bối cảnh phổ biến của nhiễm HBV mạn tính và sự phức tạp, khó khăn trong

điều trị một cách triệt để các bệnh gan liên quan đến HBV. Hiện nay, chưa có một

nghiên cứu nào trong nước được thực hiện nhằm làm rõ hơn những vấn đề hết sức

tiềm năng về ý nghĩa lâm sàng của tải lượng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân

viêm gan B mạn tính. Các nghiên cứu trên thế giới về định lượng HBV pgRNA vẫn

còn tiến hành với số lượng bệnh nhân chưa nhiều. Chính vì vậy, cần thiết phải xây

dựng một quy trình định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao trên đối

tượng là các bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng các đồng đẳng

nucleoside ở nước ta.

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân viêm gan B mạn tính (CHB). Cỡ mẫu (n = 77) được xác định theo

phương pháp nghiên cứu lâm sàng, nhóm bệnh nhân này được sử dụng để đánh giá

quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA sau quá trình tối ưu và đánh giá nhằm

đánh giá quy trình trên mẫu bệnh nhân CHB. Đồng thời, so sánh với các quy trình

định lượng HBV pgRNA trên thế giới hiện nay. Nhóm chứng: 50 người khoẻ mạnh

để xây dựng panel độ đặc hiệu. Ngoài ra, sử dụng 5 mẫu bệnh nhân viêm gan C.

Quá trình tối ưu quy trình RT-qPCR sử dụng các mẫu chuẩn dương sẽ thiết kế ở

phần sau đây.

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu: Chẩn đoán nhiễm HBV mạn

tính: Bệnh nhân viêm gan vi rút B mạn tính được xác định theo tiêu chuẩn của Hiệp

hội gan mật Mỹ - 2018 [104]:

 HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti-HBc IgG (+).  HBV DNA ≥ 105 copy/mL ở nhóm HBeAg (+) và ≥104 copy/mL ở nhóm

HBeAg (-).

 ALT tăng liên tục hay từng đợt.

Tiêu chuẩn chọn nhóm chứng:

Nhóm chứng là những người khỏe mạnh bình thường, không có bệnh lý về

gan. Các đối tượng nghiên cứu thuộc nhóm chứng đều được khám và xét nghiệm

chức năng gan và các dấu ấn của virus viêm gan trước khi thu thập mẫu máu.

Tiêu chuẩn loại trừ:

Loại trừ những bệnh nhân ra khỏi nhóm bệnh nhân nghiên cứu khi có các

tình trạng sau:

+ Đồng nhiễm virus viêm gan khác hoặc HIV.

+ Bệnh nhân có tổn thương gan do nguyên nhân khác: rượu, do thuốc,

do hóa chất, do bệnh gan tự miễn...

+ Bệnh nhân đang trong giai đoạn thai kỳ và đang cho con bú.

+ Bệnh nhân mắc các bệnh kết hợp như đái tháo đường, viêm đường

mật...

+ Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.

2.1.2. Vật liệu, hóa chất

Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị

STT Thiết bị Hãng sản xuất

1 Máy đo nồng độ DNA Mỹ

2 Máy vortex Hàn Quốc

3 Máy ly tâm Hàn Quốc

4 Tủ an toàn sinh học cấp độ Hàn Quốc

5 Pipetman Đức, Mỹ

6 Khối ổn nhiệt có lắc Mỹ

7 Máy lắc Mỹ

8 Tủ lạnh (4oC, - 80oC) Hàn Quốc

9 Máy Realtime PCR Đức

Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu

TT Tên hóa chất Hãng sản xuất

1. Hóa chất dùng trong tách chiết RNA tổng

số

QIAamp MinElute Virus vacuum Kit QIAGEN

2. Hóa chất dùng trong phản ứng RT-qPCR

1 Quantitect probe master mix QIAGEN

QIAGEN 2 Enzyme RTase

IDT 3 Primers

IDT 4 Taqman probe

4 Nước khử deion DNA/RNAse Free Thermo Scientific

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 . Thiết kế nghiên cứu

Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen đích Thiết kế mồi, probe Thiết lập tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tối ưu quy trình RT- qPCR Thiết lập quy trình RT-qPCR

Thiết lập chứng dương, bộ mẫu chuẩn

Đánh giá quy trình

2.2.2. Thu thập, bảo quản mẫu

- Quy trình thu thập mẫu, lưu trữ bảo quản:

+ Quy trình thu thập bảo quản mẫu được áp dụng cả ở khu vực điều trị bệnh

nhân và phòng xét nghiệm.

+ Các mẫu máu ngoại vi được bảo quản lạnh 4°C - 8°C và chuyển đến phòng

xét nghiệm trong vòng 2 giờ kể từ khi lấy máu, được gán mã riêng biệt.

Quy trình kỹ thuật lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi: Mẫu máu tĩnh mạch

ngoại vi với thể tích 5 ml/người được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA.

Trong vòng 2 giờ sau khi lấy, mẫu máu được vận chuyển đến labo, tách huyết tương

bằng ly tâm 1500 g trong thời gian 10 phút và chuyển sang tube nhựa polypropylen.

Phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng cho mục đích phân tích gen bổ

sung khi cần thiết. Mẫu huyết tương và tế bào được bảo quản ở tủ âm -80°C đến khi

phân tích.

2.2.3. Tách chiết acid nucleic

RNA huyết tương được tách chiết bằng bộ kit QIAamp MinElute Virus

Vacuum Kit (QIAGEN) sử dụng quy trình tách máu và dịch cơ thể theo khuyến cáo

của nhà sản xuất, sau đó được xử lý bằng DNase I, RNase-free (Thermo Fisher

Scientific) để loại bỏ DNA trước khi tiến hành tách chiết RNA. Thể tích huyết

tương được sử dụng để tách chiết RNA là 500 µL và thể tích RNA tách chiết thu

được cuối cùng là 50 µL.

2.2.4. Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương

a) Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV-RNA

trong huyết tương bệnh nhân CHB.

Xác định được vùng bảo tồn là vùng gen S (kích thước khoảng 1200 nu, vùng

N-terminal là vùng bảo tồn hơn cả (đã chứng minh ở phần tổng quan), vùng này

được đánh dấu để thiết kế mồi, probe. Bước tiếp theo là đánh giá tính đa hình, đột

biến của vùng này để tìm ra vùng trình tự cụ thể cho thiết kế mồi/probe sử dụng

phần mềm Clustalx.

Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S

Sau đó, các trình tự thích hợp trên GenBank được thu thập để thiết kế mồi và

probe, đó là trình tự phổ biến nhất tại Việt Nam có tính đại diện, trình tự này phải

được công bố bởi một nhóm nghiên cứu uy tín, kết quả giải trình tự đáng tin cậy.

Lựa chọn vùng bảo thủ nhất thuộc đầu N-terminal gen S của trình tự đã lựa chọn để

thiết kế mồi sử dụng phần mềm Oligo Primer Analysis Software (Molecular

Biology Insights, Hoa Kỳ- http://www.oligo.net/index.html). Đây là phần mềm

chuyên dụng trong thiết kế các mồi/probe tối ưu dùng trong các kỹ thuật khuếch đại

gen.

Các ứng dụng BLAST, primer3 được sử dụng để đánh giá các tiêu chí có thể

gây ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và hiệu suất của quá trình RT-qPCR, bao gồm:

nhiệt độ gắn mồi, % GC, %AT, khả năng xảy ra bắt cặp nhầm và tạo dimer,vv.

Những điểm cần chú ý khi thiết kế mồi/probe:

Thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe cũng theo các quy luật

thiết kế mồi chung cho PCR. Trong real-time PCR dùng Taqman probe thì nên thiết kế mồi có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55oC - 60oC và thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của Taqman probe khoảng 5oC - 10oC. Để thiết kế Taqman probe, nên thiết kế

để không dài quá 30 nu, tỷ lệ G-C trong probe khoảng 30-80 % với C nhiều hơn G,

vị trí bắt cặp của đầu 5’ của Taqman probe chỉ 2-5 nu cách vị trí 3’ của mồi bắt cặp

trên cùng sợi đích, và rất quan trọng là đầu 5’ gắn reporter không phải là G vì G có

thể là quencher cho rất nhiều reporter. Khi thiết kế mồi cho real-time PCR dùng

Taqman probe thì cũng nên lưu ý để chiều dài sản phẩm khếch đại trong khoảng 75-

150 nu, không nên quá 150 nu để hiệu quả PCR có thể đạt được tối hảo. Tuy nhiên

trên thực tế cũng còn tùy thuộc vào trình tự gen đích có cho phép chúng ta chọn

được mồi đạt được tối ưu để có sản phẩm khuếch đại đạt như vậy hay không.

b) Đánh giá trình tự mồi và probe thông qua phản ứng RT-qPCR

Khả năng bắt cặp đặc hiệu và khuếch đại gen đích của các trình tự mồi và

probe sau khi thiết kế được đánh giá thông qua phản ứng realtime RT. Thành phần

phản ứng RT-qPCR đánh giá khả năng khuếch đại của các cặp mồi và probe đặc

hiệu HBV pgRNA được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCR

STT Thành phần Thể tích (µl)

Đệm RT-PCR (2X) 1 10

Mồi xuôi (10µM) 2 0,5

Mồi ngược (10µM) 3 0,5

Probe (10µM) 4 0,2

5 Nước đã khử ion DNA/RNase free 3,78

Khuôn RNA 6 5

Enzyme RTase 7 0,02

20 Tổng

Bảng 4: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR

T.gian Steps T° đ.vị

50 phút 10 Hold

95 phút 15 Biến tính

Biến tính 94 giây 15 Khuếch đại

N° chu kỳ: 45 Gắn mồi 60 giây 30

Kéo dài 72 giây 30

25 ∞ Lưu mẫu trên máy

2.2.5. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA

a) Nghiên cứu thiết lập chứng dương RNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm

được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh.

Chức năng cơ bản của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất

cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp

tạo ra các DNA của virion [75]. Trong nghiên cứu này, RNA của HBV được tổng

hợp in-vitro từ DNA tổng hợp nhân tạo có trình tự giống với pgRNA được chèn

trong plasmid PJET1.2. Plasmid tái tổ hợp được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn

XhoI từ đó phiên mã RNA in-vitro tạo chứng dương và tạo bộ mẫu chuẩn HBV

pgRNA.

Mẫu chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh sử dụng bộ

kit QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit.

b) Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp

in-vitro với dãy nồng độ xác định. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn

trước khi hoàn thiện.

Mẫu chứng dương pgRNA được tổng hợp qua quá trình phiên mã in-vitro

được tinh sạch sử dụng Liti Clorua, sau đó tiến hành đo nồng độ và đánh giá độ tinh

sạch trên hệ thống máy Nanodrop, Thermo Scientific kiểm tra độ tinh sạch, tỉ lệ

260/280, 260/230 thỏa mãn các thông số yêu cầu đối với mẫu RNA. pgRNA in-

vitro sau tinh sạch với nồng độ đã xác định được tính toán, quy đổi đơn vị từ ng/µL

sang copy/µL để pha loãng tới các dải nồng độ khác nhau hơn kém nhau 10 lần tạo

bộ mẫu chuẩn cho quy trình định lượng HBV pgRNA.

Công thức quy đổi:

x 10-9 x 6,022 x 1023 (copy/µL) Số bản copy =

c) Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn, panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản

ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA.

Để hình thành panel độ nhạy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành xây dựng và

đánh giá nồng độ mẫu chuẩn, sau đó pha loãng và chia nhỏ thành các nồng độ cách

nhau 10 lần. Tiến hành đánh giá trên phản ứng RT-qPCR đã tối ưu. Với mỗi nồng

độ mẫu chuẩn trong dải nồng độ trên được lặp lại mỗi nồng độ hai lần, với những nồng độ thấp thực hiện 3 lần lặp lại (với các nồng độ 102, 101, 100 copy/µL)

Các mẫu chuẩn với nồng độ xác định trong bộ panel được chia nhỏ vừa đủ

cho hai đến ba lần sử dụng để đảm bảo chất lượng, tránh rã đông mẫu chuẩn quá

nhiều lần có thể ảnh hưởng đến nồng độ cũng như ảnh hưởng đến chất lượng của

đường chuẩn. Các mẫu chuẩn khi thực hiện mix phản ứng phải được bảo quản hoàn

toàn trên đá, và phải được bảo quản đúng điều kiện quy định sau khi sử dụng xong.

Thiết lập panel độ đặc hiệu: Tiến hành tách chiết các mẫu thuộc nhóm chứng

là những người tham gia khỏe mạnh. Sau đó tiến hành đánh giá các mẫu đã tách

chiết trên quy trình RT-qPCR sử dụng cặp mồi và probe đặc hiệu với HBV pgRNA

để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng. Đồng thời cũng đánh giá trên một số tác

nhân khác gây bệnh gan không phải HBV như virus viêm gan C HCV.

d) Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và

tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR.

Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược:

Nhiệt độ bước phiên mã ngược sẽ phụ thuộc vào hai yếu tố: mồi ngược và

enzyme có hoạt tính phiên mã ngược. Theo khuyến cáo của bộ kit cung cấp enzyme

phiên mã ngược viết tắt là RTase, nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động là từ 45

- 50°C trong khoảng thời gian 10 phút. Vì vậy, nhóm nghiên cứu quyết định lựa

chọn hai nhiệt độ là 45 và 50°C với thời gian là 10 phút để đánh giá ở nhiệt độ nào

tối ưu cho phản ứng phiên mã ngược. Đồng thời nhiệt độ 45 - 50°C là nhiệt độ thấp

hơn nhiệt độ gắn mồi bình thường của một phản ứng Realtime PCR sẽ giúp mồi

ngược bắt cặp với RNA dễ dàng hơn, tuy quá trình có thể gây ra sản phẩm phụ do

có khả năng mồi tự bắt cặp.

Tối ưu quy trình realtime PCR sử dụng các mẫu chuẩn dương HBV pgRNA

làm khuôn. Quy trình tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược được thực hiện với

thành phần phản ứng và chu trình như sau:

Bảng 5: Thành phần phản ứng RT-qPCR

STT Thành phần Thể tích (µl)

10 Đệm RT-PCR (2X) 1

0,5 Mồi xuôi (10µM) 2

0,5 Mồi ngược (10µM) 3

0,2 Probe (10µM) 4

Nước đã khử ion DNA/RNase free 3,78 5

5 Khuôn RNA 6

0,02 Enzyme RTase 7

20 Tổng

Bảng 6: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR với hai nhiệt độ khác

nhau ở bước phiên mã ngược

T° T.gian đ.vị Steps

45 hoặc 50 phút 10 Hold

phút 15 95 Biến tính

giây 15 94 Biến tính Khuếch đại

giây 30 63 N° chu kỳ: 45 Gắn mồi

giây 30 72 Kéo dài

∞ 25 Lưu mẫu trên máy

Đặc biệt, trong quá trình thiết kế thí nghiệm có sử dụng một số mẫu không

bổ sung enzyme RTase để đảm bảo không có sự nhiễm với DNA. Ngoài ra, ở bước

“Kéo dài” trong chu trình “Khuếch đại” có cài đặt kênh thu nhận tín hiệu Green do

sử dụng probe gắn huỳnh quang loại FAM trong quá trình mix thành phần phản

ứng.

Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược

Sau khi lựa chọn được nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho bước phiên mã ngược,

tiếp tục tiến hành tối ưu thời gian phản ứng phiên mã ngược. Với thời gian ban đầu

là 10 phút theo như gợi ý của hướng dẫn sử dụng, nhóm nghiên cứu đã quyết định

lựa chọn hai mốc thời gian cùng với 10 phút là 20 phút và 40 phút.

Quá trình tối ưu thời gian phiên mã ngược sử dụng các mẫu chuẩn dương

giống với bước tối ưu nhiệt độ của bước phiên mã ngược. Thực hiện quy trình định

lượng với duy nhất yếu tố thời gian của bước phiên mã ngược thay đổi lên là 20 và

40 phút. Sau đó so sánh với kết quả thời gian 10 phút để tìm ra thời gian tối ưu cho

bước phiên mã ngược.

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Nhiệt độ gắn mồi là một yếu tố quan trọng trong phản ứng khuếch đại gen,

không chỉ đối với riêng Realtime PCR hay như ở nghiên cứu này là RT-qPCR.

Nhiệt độ gắn mồi phù hợp giúp mồi hoạt động hiệu quả hơn, đặc hiệu hơn, đặc biệt

là trong các phản ứng Realtime có sử dụng chất phát tín hiệu huỳnh quang là

TaqMan probe.

Nhiệt độ gắn mồi được nhóm nghiên cứu lựa chọn để tối ưu là nhiệt độ 57°C

và 63°C, nhiệt độ gắn mồi thường sử dụng cho RT-qPCR dùng Taqman probe.

Tối ưu thời gian luân nhiệt

Chu trình luân nhiệt (bước Cycling) của một phản ứng Realtime PCR sử

dụng TaqMan probe thường có ba giai đoạn nhiệt độ là: biến tính ở 94 - 95°C trong

khoảng thời gian 15 - 30 giây, gắn mồi ở 60 - 63°C trong khoảng thời gian 30 giây

và kéo dài ở 72°C trong khoảng thời gian từ 30 - 60 giây và đây là lúc máy realtime

tiến hành đo tín hiệu huỳnh quang. Chu trình luân nhiệt này sẽ kéo dài khoảng 40 -

45 chu kỳ, dài hơn ở các quy trình PCR thường có số chu kỳ vào khoảng 30 - 35

chu kỳ, thậm chí ngắn hơn.

Các giai đoạn nhiệt độ cũng như thời gian ở chu trình này được trải dài khá

rộng, tuy nhiên đối với phản ứng RT-qPCR cũng như các phản ứng thực hiện trên

máy Realtime PCR thì quan trọng nhất là thời gian của bước gắn mồi, trong khoảng

thời gian từ 15, 20 đến 30 giây.

Để tối ưu thời gian gắn mồi, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát và so sánh

kết quả với hai thời gian gắn mồi là 15 và 30 giây để có thể tiến hành trên hai máy

để giảm bớt những sai số có thể xảy ra gây sự khác biệt trong kết quả cũng như

không lựa chọn được điều kiện tối ưu.

e) Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA

polymerase, nồng độ primer và probe. Thành phần phản ứng bao gồm cả

dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm.

Khác với phản ứng PCR, vì realtime PCR, đặc biệt là các phản ứng realtime

PCR có TaqMan probe là các phản ứng có liên quan đến chất phát và tín hiệu huỳnh

quang. Do vậy, các buffer sử dụng trong quá trình Realtime PCR đa phần không cần

bổ sung những thành phần như Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease,

dNTP hay MgCl2 mà thường hầu như đã có đầy đủ sẵn trong Buffer Realtime PCR.

Ngoài ra các buffer này còn cho rõ là buffer loại bao nhiêu X để có thể tùy theo

từng ứng dụng có thể tích cuối khác nhau để lựa chọn sử dụng buffer cho hợp lý, ở

đây nồng độ Buffer được sử dụng là Quantitect Master mix 2X. Vì vậy với phản

ứng Realtime PCR thường chỉ có các thành phần là: Buffer, Mồi, Probe và Nước đã

khử ion DNA/RNase free. Ngoài ra có thể thêm một số hóa chất phụ gia như dUTP,

UNG để ngăn cản quá trình ngoại nhiễm xảy ra gây ảnh hưởng đến phản ứng.

Tối ưu nồng độ mồi

Khi tối ưu các thành phần của quá trình RT-qPCR, nhóm nghiên cứu đã tiến

hành khảo sát trên một số các thành phần chính như: nồng độ mồi, nồng độ probe

cũng như các chất phụ gia khác nếu có.

Đầu tiên nhóm nghiên cứu tiến hành tối ưu nồng độ mồi. Với nồng độ mồi

của phản ứng Realtime PCR thường khảo sát trên một dải nồng độ mồi từ 0,05 đến

1 µM, sau đó dựa vào Ct value và hiệu suất khuếch đại sẽ chọn ra nồng độ mồi

thích hợp cho phản ứng và tiếp tục tối ưu với các thành phần phản ứng khác.

Tối ưu nồng độ probe

Tiếp theo, nhóm nghiên cứu tiếp tục tối ưu thành phần phản ứng vô cùng

quan trọng trong phản ứng định lượng RT-qPCR, đó là nồng độ probe. Nồng độ

probe sẽ được thực hiện tối ưu dựa theo nồng độ mồi đã tối ưu ở trên là 0,5 µM. Hai

nồng độ probe được nhóm nghiên cứu lựa chọn để đánh giá đó là nồng độ 0,1 và 0,2

µM.

Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR

Ưu điểm của phản ứng RT-qPCR Onestep là quá trình tạo cDNA ở trong

cùng một ống phản ứng với quá trình khuếch đại cho nên tránh việc mở nắp ống để

mix phản ứng bước hai và giảm nguy cơ gây nhiễm, đồng thời đơn giản các bước

thực hiện quy trình.

Một trong số các nguồn dễ gây nhiễm nhất cho PCR là sản phẩm PCR của

chính những lần khuếch đại trước nên có thể sử dụng enzyme AmpErase uracil N-

glycolase (UNG) để phá hủy các sản phẩm này bằng cơ chế enzyme và hóa học

nhưng không phá hủy ADN tự nhiên (khuôn mẫu hay đoạn mồi). Hơn nữa, Taq

ADN polymerase nhận dUTP là cơ chất, do vậy có thể sử dụng UNG để tránh

nhiễm. UNG xúc tác quá trình loại bỏ uracil khỏi ADN sợi đơn hoặc kép được tổng

hợp từ dUTP – một trong 3 loại nucleotide của PCR. Dưới tác dụng của UNG, các

vị trí kiềm được hình thành và trong điều kiện nhiệt độ cao, pH kiềm, các vị trí kiềm

này sẽ bị phân cắt.

Tuy nhiên, đặc tính của UNG là cắt đứt liên kết giữa RNA và cDNA (theo

hướng dẫn sử dụng trên trang web của hóa chất này), và thực tế việc đánh giá cũng

đã cho thấy kết quả tương tự. Các mẫu có bổ sung UNG đều cho kết quả âm tính

khi trong khi không bổ sung UNG cho kết quả dương tính, kể cả mẫu chứng dương.

2.2.6. Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA

Ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng:

Sau khi đã tối ưu thành phần phản ứng (buffer, nồng độ mồi, nồng độ probe)

và chu trình phản ứng (nhiệt độ phiên mã ngược, nhiệt độ gắn mồi), tiếp tục tiến hành đánh giá quy trình trên dải nồng độ từ 1,25 – 2,5 - 5 - 101 đến 104 copy/pư để

xác định ngưỡng phát hiện và ngưỡng định lượng của quy trình định lượng tải

lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. Với mỗi nồng độ mẫu

chuẩn trong dải nồng độ trên được lặp lại mỗi nồng độ hai lần, với những nồng độ

thấp nên cân nhắc thực hiện 3 lần lặp lại.

Ngưỡng phát hiện được xác định là nồng độ thấp nhất mà tại đó trên 95%

tổng số lần chạy cho tín hiệu. Ngưỡng định lượng được xác định là nồng độ thấp

nhất mà tại đó 100% tổng số lần chạy cho tín hiệu.

Độ lặp lại, độ chính xác của quy trình RT-qPCR

Độ lặp lại của quy trình được đánh giá qua giá trị deltaCt giữa các lần lặp lại

ở các nồng độ khác nhau. DeltaCt càng nhỏ độ lặp lại của quy trình càng tốt. Độ

chính xác của quy trình được phản ánh qua giá trị CV (Hệ số biến thên), CV càng

nhỏ độ chính xác của quy trình càng cao (CV<= 0,05).

Tính ổn định của bộ mẫu chuẩn:

Sau khi xây dựng đường chuẩn, cần tiến hành đánh giá chất lượng, trong đó

có việc đánh giá tính ổn định của bộ mẫu chuẩn vừa thiết lập để đảm bảo chất lượng

và độ tin cậy cho kết quả xét nghiệm. Quy trình đánh giá độ ổn định của bộ mẫu

chuẩn sẽ được thực hiện trên các mốc thời gian lần lượt là: 2 tuần, 1 tháng, 2 tháng

và 3 tháng.

Bộ mẫu chuẩn được pha loãng từ stock và chạy các nồng độ từ 108 đến 101

copyphản ứng, sau đó được chia thành các ống nhỏ đánh dấu khoảng thời gian lần

lượt là 2 tuần, 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng kể từ ngày pha bộ mẫu chuẩn. Sau khi

đến khoảng thời gian đó sẽ tiến hành đánh giá lần lượt các nồng độ mẫu chuẩn

thuộc bộ/nhóm thời gian đã đánh dấu nhằm đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn.

Các kết quả chạy đánh giá độ ổn định sau hai tuần, một tháng, hai tháng, ba tháng sẽ

được liệt kê thành bảng đối chiếu so sánh dựa trên giá trị Ct.

2.2.7. Phân tích, xử lý số liệu

- Nồng độ của HBV pgRNA huyết tương được tính theo đơn vị copy/ml huyết tương.

- Nồng động của HBV pgRNA trong huyết tương (đơn vị là copy/ml huyết

tương) được tính toán bằng công thức sau:

C=Q x (VRNA/VPCR) x (1/Vext)

Trong đó, C là nồng độ của trình tự đích cần tính (đơn vị là copy/ml huyết

tương), Q là số copy trình tự đích xác định được từ phản ứng Realtime PCR định

lượng, VRNA tổng thể tích RNA thu được từ quá trình tách chiết (50 µL), VPCR là thể

tích RNA tách chiết dùng cho mỗi phản ứng PCR (5 µL) và Vext là thể tích huyết

tương sử dụng để tách chiết (đơn vị là ml).

- Phân tích thống kê: Số liệu thu được sẽ được xử lí bằng phương pháp

thống kê y sinh học phù hợp để xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu của dấu ấn sinh

học HBV pgRNA huyết tương đối với bệnh nhân viêm gan B mạn tính trên đối

tượng người Việt Nam.

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương

bệnh nhân CHB.

3.1.1. Nghiên cứu thiết lập chứng dương RNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm

được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh.

Chứng dương RNA là trình tự pgRNA phiên mã từ khuôn là trình tự DNA

sợi âm trên ngân hàng gen GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/) với

mã số hiệu là MF674459.1, genotype B, subtype B4 là trình tự đại diện phổ biến

nhất ở Việt Nam. Trình tự toàn bộ hệ gen HBV DNA đã được công bố trên ngân

hàng gen GenBank.

Trình tự DNA được tổng hợp nhân tạo và được đưa vào trong plasmid

pJET1.2. Plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA đích được mở vòng bằng enzyme

cắt giới hạn XhoI và làm khuôn cho quá trình tổng hợp RNA in-vitro, để tạo chứng

dương pgRNA của HBV cho quy trình RT-qPCR.

Sau khi tổng hợp RNA in-vitro, pgRNA chứng dương tinh sạch có nồng độ

15,59 ng/µL, các chỉ số 260/280: 1,67; 260/230: 1,85. Như vậy chứng dương có

nồng độ cao và độ tinh sạch tốt được sử dụng làm mẫu chuẩn dương cho quy trình

RT-qPCR định lượng HBV pgRNA, đồng thời RNA in-vitro được pha loãng tới các

dải nồng độ để tạo bộ mẫu chuẩn HBV pgRNA phục vụ cho việc xây dựng đường

chuẩn và panel độ nhạy.

Mẫu chứng âm được tách chiết thành công từ huyết tương người khỏe mạnh có

nồng độ 7,6 ng/µL, độ tinh sạch đảm bảo.

3.1.2. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng

hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn

trước khi hoàn thiện.

 Tính toán số bản copy của mẫu chuẩn:

+ Nồng độ stock: 15,59 ng/µL

x 10-9 x 6,022 x 1023 =2,69 x 1010 (copy/µl) + Số bản copy =

Vì sử dụng 6 µL cho một phản ứng nên số bản sao trong 1 phản ứng là: 1,61

x 1011 (copy/phản ứng)

Sau khi tính toán xong ghi lại nồng độ và ghi trên chính ống stock để thuận

tiện trong việc pha loãng sau này cũng như thu thập số liệu cho nghiên cứu.

Từ nồng độ gốc, mẫu chuẩn được pha loãng tới các dải nồng độ xác định

cách nhau 10 lần tạo bộ mẫu chuẩn. Kết quả thu được bộ mẫu chuẩn bao gồm các mẫu chuẩn có nồng độ như sau: 1,61 x 1011(nồng độ stock), 1010, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 (copy/pư). Ký hiệu: S10, S9, S8, S7, S6, S5, S4, S3, S2,

S1, S0.

3.1.3. Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV

pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.

Căn cứ vào độ ổn định và tính đa hình, đột biến, vùng gen được lựa chọn

thiết kế mồi và probe cho quy trình định lượng HBV pgRNA là vùng gen S.

 Kết quả lựa chọn cặp mồi/probe:

Sử dụng công cụ thiết kế mồi và các thông tin liên quan đến đoạn gen của

HBV pgRNA, nhóm nghiên cứu đã thiết kế một số cặp mồi/TaqMan probe có khả

năng khuếch đại đặc hiệu trình tự gen đích quan tâm. Ba cặp mồi/probe được kí

hiệu lần lượt là: 482/198/361, 482/585/361, và 482/223/361. Thông qua phản ứng

RT-qPCR và đánh giá trên mẫu chuẩn dương HBV pgRNA S4 và S5, nhóm nghiên

cứu tiến hành đánh giá nhằm lựa chọn ra cặp mồi/probe có khả năng khuếch đại tốt

nhất trình tự quan tâm.

Kết quả của phản ứng RT-qPCR được trình bày ở hình sau:

Chú thích hình: Các cặp mồi được kí hiệu số hiệu lần lượt là 198+, 223+, 585+. Hai mẫu

chuẩn S5, S4 được lựa chọn để đánh giá với kí hiệu tương ứng là 12 và 34. Các mẫu có chữ “AM”

là chứng âm của phản ứng

Hình 6: Kết quả phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe.

Sử dụng 2 mẫu chuẩn với nồng độ trung bình được lựa chọn trong bộ mẫu chuẩn: S4 (104), S5 (105). Mỗi mẫu chuẩn được chia thành các ống nhỏ; 2 ống mẫu

chuẩn tương ứng của S5, S4 ký hiệu là 12 và 34 được sử dụng cho quá trình tối ưu.

Như kết quả Hình 5, các cặp mồi và probe được thiết kế đều có khả năng

khuếch đại trình tự đích quan tâm (HBV pgRNA), ngoài ra các cặp mồi và probe

đều cho thấy tính đặc hiệu cao khi các chứng âm đều không cho thấy tín hiệu

khuếch đại. Tuy nhiên những cặp mồi và probe này có điểm khác biệt rất lớn, đó

chính là hiệu suất khuếch đại khác nhau. Theo như kết quả của phản ứng, cặp mồi

có ký hiệu 482/223/361 (là cặp mồi và probe có trình tự đã được trình bày ở trên)

cho thấy tiềm năng là có tín hiệu khuếch đại tốt nhất trong cả ba cặp mồi và probe.

Tín hiệu huỳnh quang cũng như Ct được thể hiện trên bảng kết quả đều chỉ ra cặp

mồi và probe với kí hiệu 223 chính là cặp mồi và probe được lựa chọn cho quy trình

định lượng tải lượng HBV pgRNA bằng phương pháp RT-qPCR.

Sau đó nhóm nghiên cứu tiếp tục khảo sát trên một số mẫu bệnh nhân CHB

đã tách chiết và các mẫu của người khỏe mạnh tham gia nghiên cứu, các kết quả

đều chỉ ra rằng cặp mồi và probe kí hiệu 482/223/361 có tín hiệu khuếch đại tốt

nhất, và nhóm nghiên cứu quyết định lựa chọn cặp mồi và probe này cho những quy

trình tối ưu tiếp theo.

Sau quá trình thử nghiệm và đánh giá bước đầu để tìm ra cặp mồi/probe có

khả năng khuếch đại hiệu quả và đặc hiệu HBV pgRNA, nhóm nghiên cứu đã xác

định cặp mồi/probe tối ưu cho quy trình RT-qPCR.

Trình tự mồi phiên mã ngược đặc hiệu của HBV là: 5’ -

GACAAACGGGCAACATACCT - 3’ ([nt] 476 – 457).

Trình tự forward primer là: 5’ - ATGTGTCTGCGGCGTTTTAT - 3’ ([nt]

377 – 396).

Trình tự probe là : 5’ - FAM – ATCCTGCTGCTATGCCTCAT - BHQ1 - 3’

([nt] 410 – 429).

Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR

3.1.4. Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-

qPCR đo tải lượng HBV pgRNA.

Mẫu chuẩn RNA được pha loãng xuống các dải nồng độ xác định để tạo

panel độ nhạy.

Pha loãng từ nồng độ 1011 xuống đến nồng độ 100:

Pha loãng xuống 1010: 10µL 1011 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 109: 10µL 1010 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 108: 10µL 109 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 107: 10µL 108 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 106: 10µL 107 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 105: 10µL 106 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 104: 10µL 105 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 103: 10µL 104 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 102: 10µL 103 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 101: 10µL 102 + 90µL H2O

Pha loãng xuống 100: 10µL 101 + 90µL H2O

Hình 8: Panel độ nhạy

Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy chạy đánh giá bằng phản ứng RT-qPCR

trên hệ thống Rotor GenQ:

101

Hình 9: Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy.

Hình 10: Kết quả dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy.

Trong quá trình thiết lập đường chuẩn có một giá trị thông số là hệ số tương quan R2 cho thấy độ tuyến tính của quá trình khuếch đại. Thông số R2 đạt tiêu

chuẩn lớn hơn 0,99, cho thấy quy trình realtime PCR có độ tuyến tính tốt. Bên cạnh

đó, hiệu quả PCR hay E% (PCR efficiency) của quy trình đạt được là 0,97, cho thấy

khả năng khuếch đại tốt của cặp mồi cũng như các mẫu chuẩn thiết kế.

Để thiết lập bộ panel độ đặc hiệu, nghiên cứu sử dụng 50 mẫu chứng khỏe

mạnh của người tham gia nghiên cứu, trong đó tiền sử chưa từng mắc các bệnh liên

quan đến HBV hay những vấn đề về gan khác, cũng không có tiền sử sử dụng rượu

bia hay các chất kích thích khác.

Bên cạnh đó có kiểm tra đánh giá định lượng trên các mẫu virus HCV là một

virus viêm gan C. Kết quả đánh giá trên bộ panel độ đặc hiệu cho thấy độ đặc hiệu

của phản ứng là 100%.

HBV+: mẫu chứng dương HBV, NTC: mẫu chứng âm, HCV+: mẫu đối chứng HCV, 88, 75, 85,

54, 62, 43, 38, 66, 48, 57, 44, 12: mẫu chứng âm người khỏe mạnh, IC+: chứng dương nội chuẩn,

IC 88, IC75, IC 54: chứng nội chuẩn trong các mẫu 88, 75, 54, IC-: chứng âm nội chuẩn.

Hình 11: Kết quả bộ panel độ đặc hiệu

3.2. Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết

tương bệnh nhân CHB.

3.2.1. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước

và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR.

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi bước phiên mã ngược:

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở 45℃ trong vòng 10

phút sẽ được trình bày dưới đây:

Hình 12: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene

45.1 và 45.2: hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 45°C trong

khoảng thời gian 10 phút. 45 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và 45 NTC là mẫu chứng âm

của phản ứng này

với nhiệt độ 45℃.

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong

vòng 10 phút sẽ được trình bày dưới đây:

Hình 13: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene

50.1 và 50.2 là hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 với thứ tự các mẫu giống như mẫu 45.1 và

45.2 và được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong khoảng thời gian 10 phút. 50 E- là mẫu không

bổ sung enzyme RTase và 50 NTC là mẫu chứng âm của phản ứng này.

với nhiệt độ 50°C.

Như vậy, theo như kết quả so sánh với hai nhiệt độ ở bước phiên mã ngược

khác nhau, nhóm nghiên cứu nhận thấy Ct value ở nhiệt độ bước phiên mã ngược

50°C sớm hơn giá trị Ct ở nhiệt độ 45°C khoảng 1-2 chu kỳ. Hơn nữa, nếu nhìn vào

chu kỳ khuếch đại, tín hiệu khuếch đại ở nhiệt độ 50°C cho thấy hiệu suất khuếch

đại tốt hơn, đường tín hiệu cao hơn ở nhiệt độ 45°C. Không chỉ ở hai mẫu này mà

khảo sát trên một số mẫu bệnh nhân CHB cũng cho thấy kết quả như vậy. Bên cạnh

đó, mẫu chứng âm enzyme không cho thấy phản ứng không có lẫn HBV DNA, và

như vậy quá trình tách chiết và xử lý sau tách chiết đã loại hết HBV DNA, điều đó

giúp quá trình định lượng không bị ảnh hưởng. Mẫu chứng âm nước cũng không có

tín hiệu khuếch đại, chứng tỏ phản ứng có độ đặc hiệu tốt.

Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho bước phiên mã ngược RNA của quy trình định

lượng là nhiệt độ 50°C.

Tối ưu thời gian bước phiên mã ngược

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong

vòng 10 phút thể hiện qua hình 13:

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong

vòng 20 phút như sau:

T20 M2 và T20M1 là hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong

khoảng thời gian 20 phút. T20 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và T20 NTC là mẫu chứng

âm của phản ứng này.

Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút.

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong

vòng 40 phút như sau:

T40 M1 và T40 M2 là hai mẫu chuẩn dương S5 và S4 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong

khoảng thời gian 40 phút. T20 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và T20 NTC là mẫu chứng

âm của phản ứng này.

Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút.

Với ba hình kết quả hình 13, hình 14, hình 15 tương ứng với từng thời gian

phiên mã ngược lần lượt là 10; 20 và 40 phút, nhóm nghiên cứu nhận thấy Ct ở hai

mẫu M1 và M2 đều giảm dần khi tăng thời gian phiên mã ngược. Vì vậy, 10 phút

chính là khoảng thời gian vừa đủ để phản ứng phiên mã ngược diễn ra, việc tăng

thời gian là không cần thiết và có khả năng làm giảm độ nhạy của phản ứng.

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi qPCR

Kết quả đánh giá nhiệt độ gắn mồi được thể hiện ở hình dưới đây:

T1, T2, T6: là các mẫu chuẩn dương RNA S4

Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C.

T1, T2, T6: là các mẫu chuẩn dương RNA S4, AM: mẫu chứng âm

Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C.

Sau khi khảo sát trên mẫu chuẩn dương S4 nhóm nghiên cứu nhận thấy nhiệt

độ gắn mồi 63°C là nhiệt độ tối ưu cho quá trình RT-qPCR. Các giá trị Ct của các

tube S5 ở nhiệt độ 63°C đều sớm hơn nhiệt độ 57°C từ 1 - 2 chu kì. Hơn hết, nhiệt

độ gắn mồi cao hơn giúp phản ứng PCR đặc hiệu hơn.

Tối ưu thời gian gắn mồi:

Sau đây là kết quả của quá trình tối ưu thời gian gắn mồi trong chu trình luân nhiệt:

T15: Mẫu chuẩn dương S4 với thời gian gắn mồi 15 giây, NTC: mẫu chứng âm

Hình 18: Kết quả ở thời gian gắn mồi 15 giây.

T30: Mẫu chuẩn dương S4 với thời gian gắn mồi 30 giây, NTC: mẫu chứng âm

Hình 19: Kết quả ở thời gian gắn mồi 30 giây.

Theo như kết quả so sánh giữa hai thời gian gắn mồi thì với cùng một mẫu, ở

thời gian kéo dài là 30 giây cho giá trị Ct sớm hơn 2 chu kỳ, tức là lượng sản phẩm

gấp 4 lần, so với thời gian kéo dài 15 giây (29,16 so với 31,71). Như vậy, thời gian

gắn mồi được lựa chọn trong chu trình luân nhiệt là 30 giây.

3.2.2. Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme

DNA polymerase, nồng độ mồi và probe. Thành phần phản ứng bao gồm cả

dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm.

Tối ưu nồng độ primer:

Kết quả tối ưu nồng độ mồi được trình bày ở hình sau:

RNA HBV+: mẫu chứng dương HBV RNA, 1E+: mẫu chứng dương nồng độ mồi 1 µM, 0,5E+,

0,2 E+; 0,1 E+1; 0,1E+2; 0,05E+1; 0,05E+2 lần lượt là các mẫu chứng dương ở các dải nồng độ

mồi 0,5; 0,2;0,1; 0,05;-0: mẫu chứng âm; 0,05-: mẫu chứng âm không enzyme nồng độ mồi 0,05.

Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mồi.

Như vậy, theo như kết quả RT-qPCR và so sánh dựa trên giá trị Ct, nồng độ

mồi 1 và 0,5 µM đều cho giá trị Ct khoảng chu kỳ thứ 29, tuy nhiên nhóm nghiên

cứu quyết định lựa chọn nồng độ mồi là 0,5 µM vì sử 1 µM là nồng độ mồi khá cao

và có thể ảnh hưởng đến quá trình probe gắn vào trình tự đích do cạnh tranh với mồi

trong thành phần phản ứng. Nhất là có nhiệt độ ủ khoảng 50°C ở thời gian đầu càng

tạo điều kiện cho mồi gắn vào trước probe.

Tối ưu nồng độ probe:

Theo như kết quả Realtime ở hình 19 và hình 20, nồng độ probe tạo nên sự

khác biệt rất lớn trong quy trình định lượng trên cùng một chứng dương. Và do Ct

value lên sớm hơn khoảng 3 chu kỳ, nồng độ probe 0,2 µM đã được lựa chọn là

nồng độ tối ưu cho quy trình định lượng HBV pgRNA.

P 0,1: Mẫu chứng dương nồng độ probe 0,1, NTC: mẫu chứng âm

Hình 21: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,2 µM

Hình 22: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,1 µM

P 0,1: Mẫu chứng dương nồng độ probe 0,1; NTC: mẫu chứng âm

3.2.3. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA

Sau quá trình tối ưu các thành phần của phản ứng RT-qPCR, nhóm nghiên

cứu đã xây dựng thành công bảng thành phần tối ưu của phản ứng RT-qPCR.

Bảng 7: Thành phần tối ưu của một phản ứng RT-qPCR

STT Thành phần Thể tích (µl)

Đệm RT-PCR (2X) 1 10

Mồi xuôi (10µM) 2 1

Mồi ngược (10µM) 3 1

Probe (10µM) 4 0,4

5 Nước đã khử ion DNA/RNase free 1,58

Enzyme RTase 6 0,02

RNA template 7 6

Tổng 20

Sau khi thực hiện quá trình tối ưu các điều kiện trong chu trình nhiệt của

phản ứng RT-qPCR ở rất nhiều các khía cạnh như: thời gian cũng như nhiệt độ,

nhóm nghiên cứu xin đưa ra bảng tổng kết chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng định

lượng tải lượng HBV pgRNA bằng phương pháp RT-qPCR.

Bảng 8: Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng RT-qPCR

Steps T° T.gian đ.vị

50 10 phút Hold

95 15 phút Biến tính

Biến tính 94 15 giây Khuếch đại

N° chu kỳ: 45 Gắn mồi 63 30 giây

Kéo dài 72 30 giây

25 ∞ Lưu mẫu trên máy

3.3. Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR.

3.3.1. Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét nghiệm.

Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR

đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.

Ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng:

Nhóm nghiên cứu thực hiện đánh giá quy trình RT-qPCR đã được tối ưu dựa

vào bộ mẫu chuẩn đã được thiết lập. Trong một lần chạy, các mẫu nồng độ được lặp

lại ba lần. Tất cả nồng độ đều được thực hiện đánh giá trong 10 lần chạy và ghi

chép lại kết quả, tổng hợp số lần chạy cho tín hiệu khuếch đại có ý nghĩa chia tỉ lệ

với tổng số phản ứng để xác định ngưỡng định lượng và ngưỡng phát hiện của quy

trình định lượng HBV pgRNA.

Bảng 9: Kết quả đánh giá quy trình định lượng trên dải nồng độ 104 –

1,25 copy/phản ứng trong 10 lần chạy

Nồng độ Số lần phát hiện/Tổng số phản Tỉ lệ

(copy/phản ứng) ứng

100 % 30/30

97 % 29/30

37 % 11/30

104 103 102 101 5 2,5 1,25 0 % 0/30

Dựa trên kết quả quá trình đánh giá các mẫu nồng độ thấp 102, 101, và các mẫu pha loãng 2 lần, 4 lần, 8 lần của nồng độ 101 trên phản ứng (Bảng 9), nhóm nghiên cứu nhận thấy ngưỡng định lượng của phản ứng là 101 copy/phản ứng (30/30

lần chạy lặp lại đều cho tín hiệu, tương ứng với tỉ lệ 100%), và mẫu pha loãng 2 lần của mẫu 101 copy/ phản ứng (tức là 5 copy/phản ứng) là ngưỡng phát hiện (29/30

lần lặp lại đều cho tín hiệu, đạt tỉ lệ 97%). Khả năng khuếch đại tốt của cặp mồi

cũng như các mẫu chuẩn thiết kế đều đạt chất lượng ổn định trong các lần chạy khác

nhau. Độ đặc hiệu được thể hiện qua chứng không có mẫu chuẩn (chứng âm) đạt tỉ

lệ 100%, chứng tỏ độ đặc hiệu của quy trình tốt, có tính ổn định cao.

Khi nhân với hệ số cô đặc của quá trình tách chiết là 10, thì ngưỡng phát

hiện của phản ứng RT-qPCR là 80 copy/mL huyết tương, ngưỡng định lượng là 160

copy/mL huyết tương.

Đô chính xác, độ lặp lại của quy trình:

Để xác định các thông số về chất lượng của phản ứng Realtime PCR được

nhóm thiết lập, các sản phẩm gồm chứng dương, chứng âm và bộ mẫu chuẩn với dải

nồng độ xác định được thiết lập với mẫu chuẩn là chứng dương pgRNA HBV được

tạo ra qua quá trình tổng hợp RNA in-vitro dựa trên trình tự HBV DNA ở Việt

Nam. Kết quả chạy đánh giá quy trình RT-PCR được trình bày ở hình sau:

108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100: dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm.

Hình 23: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn

Bảng 10: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn

Tên Nồng độ Loại Ct mẫu (copy/ml)

Mẫu chuẩn 13,92 1,600,000,000 S8

Mẫu chuẩn 14,22 1,600,000,000 S8

Mẫu chuẩn 17,94 160,000,000 S7

Mẫu chuẩn 17,82 160,000,000 S7

Mẫu chuẩn 21,47 16,000,000 S6

16,000,000 Mẫu chuẩn 21,47 S6

1,600,000 Mẫu chuẩn 24,41 S5

160,000 Mẫu chuẩn 28,68 S4

160,000 Mẫu chuẩn 30,55 S4

16,000 Mẫu chuẩn 32,82 S3

16,000 Mẫu chuẩn 32,39 S3

16,000 Mẫu chuẩn 32,01 S3

1,600 Mẫu chuẩn 36,09 S2

1,600 Mẫu chuẩn 35,24 S2

1,600 Mẫu chuẩn 35,33 S2

160 Mẫu chuẩn 39,31 S1

160 Mẫu chuẩn 37,36 S1

160 Mẫu chuẩn 38,27 S1

Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua các chỉ số SD, CV, độ lệch phép đo

(ME)

Chu kỳ Tải lượng RNA-HBV Ghi Mẫu chuẩn (Log10 copie/ml) chú phát hiện (Ct)

CV SD CV SD %ME

108 copy/phản ứng 0,01 0,21 0,02 0,23 0,28

107 copy/phản ứng 0,01 0,08 0,01 0,15 0,63

106 copy/phản ứng 0,01 0,00 0,03 0,02 1,22

105 copy/phản ứng 0,01 0,00 0,02 0,01 2,01

104 copy/phản ứng 0,01 1,32 0,02 0,16 0,75

103 copy/phản ứng 0,01 0,41 0,01 0,28 0,43

102 copy/phản ứng 0,01 0,46 0,01 0,19 1,51

101 copy/phản ứng 0,01 0,97 0,03 0,87 2,33

Kết quả trên hình 23 và bảng 10, 11 cho thấy quy trình RT-qPCR định lượng

HBV pgRNA có độ chính xác cao (CV<= 0,03), độ lặp lại tốt (deltaCt<0,5). Quy

trình tiếp tục được đánh giá trên mẫu bệnh nhân CHB trước khi được đưa vào sử

dụng.

3.3.2. Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo

tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.

Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn trên quy trình định lượng RT-qPCR dựa trên

bộ mẫu chuẩn sau 2 tuần, 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng được trình bày theo kết quả

hình ảnh RT-qPCR.

Hình 24: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tuần.

108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 (copy/pư): dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm.

108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100(copy/pư): dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng

âm.

Hình 25: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau một tháng.

108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 (copy/pư): dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm.

Hình 26: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tháng.

108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 (copy/pư): dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm.

Hình 27: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau ba tháng.

Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR

Hai tuần Một tháng Hai tháng Ba tháng

Mẫu 1 (Ct) 13,58 14,41 14,22 14,10

Mẫu 2 (Ct) 17,11 18,08 17,82 17,37

Mẫu 3 (Ct) 20,24 21,45 21,47 20,22

Mẫu 4 (Ct) 23,69 24,51 24,41 23,75

Mẫu 5 (Ct) 26,75 28,72 28,68 26,85

Mẫu 6 (Ct) 30,46 32,03 32,10 30,34

Mẫu 7 (Ct) 33,57 35,26 35,33 33,68

Mẫu 8 (Ct) 37,81 38,20 38,37 37,72

Từ những kết quả đánh giá quy trình định lượng RT-PCR dựa trên bộ mẫu

chuẩn sau hai tuần, một tháng, hai tháng, ba tháng, nhóm nghiên cứu nhận thấy bộ mẫu chuẩn ổn định, vẫn có khả năng khuếch đại các mẫu trong dải tuyến tính từ 108 - 101 copy/pư với sự khác biệt không lớn về giá trị Ct value. Các mẫu nồng độ thấp

vẫn không có sự thay đổi nhiều và các mẫu vẫn cho thấy có độ tuyến tính tốt. Các

thông số của lần chạy tốt, bộ mẫu chuẩn ổn định trong các khoảng thời gian đánh

giá.

Tiếp tục đánh giá bộ mẫu chuẩn trong thời gian tới nhằm đảm bảo chất lượng

của quy trình định lượng, đặc biệt là khi có bất kì sự thay đổi nào trong quy trình

định lượng như thay đổi vị trí đặt máy Realtime PCR, cập nhật chương trình hay

phần mềm của máy tính phân tích kết quả, hay thay đổi hóa chất sinh phẩm mới, lô

sinh phẩm mới trong quy trình phân tích mẫu.

3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB.

Bảng 13: Nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn

tính ở nhóm HBeAg dương tính và âm tính.

HBV RNA(+) n(%)

HBV RNA HBeAg

HBV RNA(- ) n(%)

Giá trị trung bình (log10 copies/mL) 5,21 ± 1,97

21/63 (33,33%)

≥ 5log10 copies/mL 23 (36,51%)

˂ 5log10 copies/mL 19 (30,16%)

1,80 ± 1,42

7/14 (50,00%) 28/77 (36,36%)

7 (50,00%) 4,72 ± 2,24

Dương tính (n= 63) Âm tính (n= 14) Chung (n= 77) P

0 (0,00%) 49/77 (63,64%) 0,241 > 0,05

(1)

0,000

(2)

1)Kiểm định theo thuật toán thống kế Chi-square (2 )Kiểm định theo thuật toán thống kế

One –Way ANOVA

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy HBV pgRNA định lượng được ở 49 trong

số 77 bệnh nhân CHB (63,64%) ở nồng độ trung bình là 4,72 ± 2,24 log10 copy/ml.

Kết quả này của chúng tôi tương đương với kết luận trong nghiên cứu của nhóm tác

giả Florian van Bommel về nồng độ HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân CHB,

nghiên cứu trên 62 bệnh nhân CHB cho thấy nồng độ HBV pgRNA trung bình là

5,2 ± 1,6 log10 IU/mL (tương đương 5,9 ± 2,3 log10 copy/mL) [110]. Tương tự,

nghiên cứu của Jie Wang (2016) xác định được nồng độ HBV pgRNA huyết tương

trung bình là 6,31 (5,10–8,02) log10 copy/ml [114]. Tác giả Yi-Wen Huang (2015)

nghiên cứu trên 52 bệnh nhân CHB trước khi điều trị bằng lamivudin thấy HBV

pgRNA định lượng được ở 21/52 (40,38%) bệnh nhân với nồng độ trung bình 5,2

log10 copy/ml (ngưỡng phát hiện dưới của xét nghiệm sử dụng là 2,2 log10 copy/mL)

[42]. Kết quả chúng tôi cho thấy tỷ lệ bệnh nhân định lượng được HBV pgRNA

huyết tương thấp hơn so với nghiên cứu của tác giả Yi-Wen Huang. Điều này là do

sự khác biệt về thiết kế của xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu giữa hai nghiên

cứu với vùng gen tương ứng sử dụng cho thiết kế mồi đặc hiệu khác nhau. Đồng

thời, hai nghiên cứu tiến hành trên hai nhóm đối tượng khác nhau về nhiều đặc điểm

như địa lý, dân tộc... Tác giả Jing Wang (2017) ghi nhận nồng độ HBV pgRNA

huyết tương trung bình ở 35 bệnh nhân CHB là 3,02 log10 copy/mL. Kết quả này

tương đối thấp so với kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng như các nghiên cứu

khác do đối tượng nghiên cứu của tác giả là các bệnh nhân đã được điều trị bằng

entecavir trong thời gian 1-10 năm [45]. Nguyên nhân là do các thuốc NA ức chế sự

tổng hợp ADN virus nhưng không hoặc rất ít có tác dụng lên quá trình tổng hợp

pgRNA từ khuôn cccDNA, do đó nó vẫn được tiếp tục sản xuất và tiết ra huyết

tương. Trong quá trình điều trị, nồng độ HBV RNA huyết tương giảm chậm hơn rất

nhiều so với HBV DNA và có thể định lượng được kể cả khi nồng độ HBV DNA

huyết tương đã đạt dưới ngưỡng phát hiện. Nồng độ HBV pgRNA huyết tương

giảm rõ rệt thường được thấy ở các bệnh nhân được điều trị bằng NA liên tục từ 1

năm trở lên. Trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu của tác giả Jing Wang, việc điều trị

trong thời gian dài là một nguyên nhân cơ bản làm nồng độ HBV pgRNA huyết

tương định lượng được thấp hơn nhiều so với nghiên cứu của chúng tôi (trên các

bệnh nhân chưa điều trị kháng virus).

Trong nghiên cứu của chúng tôi, giá trị trung bình nồng độ HBV pgRNA

trên phân nhóm CHB có HBeAg (+) cao hơn so với phân nhóm CHB có HBeAg (-)

(5,21 ± 1,97 log10 copy/mL so với 1,80 ± 1,42 log10 copy/mL), sự khác biệt này có ý

nghĩa thống kê (p <0,05).Cho đến nay, các nghiên cứu chủ yếu đánh giá trên nhóm

đối tượng CHB có HBeAg (+), trong khi đó, việc đánh giá HBV pgRNA huyết

tương ở nhóm bệnh nhân HBeAg(-) vẫn còn hạn chế. Nghiên cứu của Florian van

Bommel (2015) cũng nhận thấy có sự khác biệt tương tự về nồng độ HBV pgRNA

giữa hai nhóm bệnh nhân CHB, HBeAg (+), HBeAg (-) là 4,9 ±1,3 log10 IU/mL (5,6

± 2,0 log10 copy/mL) so với 4,3 ± 1,4 log10IU/mL (5,0 ± 2,1 log10 copy/mL) [110].

Tuy nhiên sự khác biệt trong nghiên cứu của Florian van Bommel không có ý nghĩa

thống kê (p >0,05). M.J. van Campenhout tiến hành nghiên cứu trên 274 bệnh nhân

CHB có HBeAg (+) ghi nhận nồng độ HBV pgRNA trung bình là 6,5 ± 1,2

log10IU/l (7,2 ± 1,9 log10 copies/mL) [66]. Tương tự, nồng độ HBV pgRNA huyết

tương được xác định trong một nghiên cứu của khác của M.J. van Campenhout với

sự tham gia của 175 bệnh nhân CHB, HBeAg (+) là 6,1 ± 1,1 log10IU/l (6,8 ± 1,8

log10 copy/mL) [67]. Như vậy, quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA tương

đương với các quy trình định lượng HBV pgRNA trên thế giới hiện nay. Tuy nhiên,

để khẳng định độ nhạy vượt trội của quy trình cần thiết phải đánh giá trên số lượng

mẫu nhiều hơn, đó là hướng nghiên cứu tiếp theo mà nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành.

KẾT LUẬN

1) Thiết kế thành công chứng dương HBV pgRNA in-vitro.

2) Xây dựng và tối ưu thành công quy trình RT-qPCR định lượng HBV

pgRNA:

- Thiết kế thành công bộ mồi, probe đặc hiệu cho HBV pgRNA.

- Tối ưu thành công quy trình RT-qPCR định lượng về thành phần phản ứng

và điều kiện phản ứng.

- Ngưỡng phát hiện của quy trình là 80 copy/ml, ngưỡng định lượng của

quy trình là 160 copy/ml huyết tương, độ đặc hiệu 100%

3) Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA có độ chính xác, độ lặp lại

tốt; bộ mẫu chuẩn ổn định trong 3 tháng đánh giá.

4) Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA tương đương với các quy

trình định lượng HBV pgRNA trên thế giới.

KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA trên bệnh nhân

viêm gan B mạn tính với cỡ mẫu lớn hơn, đối tượng nghiên cứu mở rộng

hơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt:

1. Trần Ngọc Ánh, 2012, Nồng độ HBsAg, HBV-DNA ở bệnh nhân viêm gan B

mạn tính. Tạp chí Nghiên cứu Y học. 2: p. 1-6.

Bùi Đại, 2002, Viêm gan virus B và D. 2.

Lê Đăng Hà, Đào Đình Đức, Nguyễn Đức Hiền, Trịnh Thị Minh Liên, 1997, 3.

Dịch tễ học viêm gan virút B ở Việt Nam. Tạp chí Y học thực hành. 9: p. 1-3.

4. Võ Triều Lý, Phạm Thị Lệ Hoa, Nguyễn Thị Cẩm Hường, 2015, Giá trị của

HBsAg định lượng để phân biệt người mang HBV không hoạt tính và viêm

gan siêu vi B mạn tái hoạt, Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh. 19: p. 330-335.

5. Phạm Hoàng Phiệt, Nguyễn Phương Thảo, 2010, Khảo sát mối tương quan

giữa lượng HBsAg với một số kết quả về virus học và lâm sàng trên bệnh

nhân viêm gan B mạn tính hoạt động chưa điều trị đặc hiệu. 13: p. 5-13.

6. Hoàng Tiến Tuyên, Nguyễn Hữu Quyền, Nguyễn Văn Diễn, 2017, Tìm hiểu

mối tương quan giữa hàm lượng HBsAg với tải lượng virut và hoạt độ ALT ở

bệnh nhân viêm gan virut B mạn tính, Tạp chí Y Dược học Quân sự. 2: p.

126-131.

Tài liệu Tiếng Anh:

7. L. Allweiss and M. Dandri, 2017, The Role of cccDNA in HBV Maintenance,

Viruses. 9(6).

8. N. M. Araujo, 2015, Hepatitis B virus intergenotypic recombinants

worldwide: An overview, Infect Genet Evol. 36: p. 500-510.

9. R. Bartenschlager and H. Schaller, 1988, The amino-terminal domain of the

hepadnaviral P-gene encodes the terminal protein (genome-linked protein)

believed to prime reverse transcription, EMBO J. 7(13): p. 4185-92.

10. R. Bartenschlager, M. Junker-Niepmann and H. Schaller, 1990, The P gene

product of hepatitis B virus is required as a structural component for

genomic RNA encapsidation, J Virol. 64(11): p. 5324-32.

11. T. F. Baumert, L. Meredith, Y. Ni, D. J. Felmlee, J. A. McKeating and S.

Urban, 2014, Entry of hepatitis B and C viruses - recent progress and future

impact, Curr Opin Virol. 4: p. 58-65.

12. R. P. Beasley, 1988, Hepatitis B virus. The major etiology of hepatocellular

carcinoma, Cancer. 61(10): p. 1942-56.

13. L. Belloni, T. Pollicino, F. De Nicola, F. Guerrieri, G. Raffa, M. Fanciulli, et

al., 2009, Nuclear HBx binds the HBV minichromosome and modifies the

epigenetic regulation of cccDNA function, Proc Natl Acad Sci U S A.

106(47): p. 19975-9.

14. F. Bernard, G. Raymond, B. Willems and J. P. Villeneuve, 1997,

Quantitative assessment of serum hepatitis B e antigen, IgM hepatitis B core

antibody and HBV DNA in monitoring the response to treatment in patients

with chronic hepatitis B, J Viral Hepat. 4(4): p. 265-72.

15. A. Bertoletti and A. J. Gehring, 2013, Immune therapeutic strategies in

chronic hepatitis B virus infection: virus or inflammation control?, PLoS

Pathog. 9(12): p. e1003784.

16. F. Birnbaum and M. Nassal, 1990, Hepatitis B virus nucleocapsid assembly:

primary structure requirements in the core protein, J Virol. 64(7): p. 3319-

30.

17. T. M. Block, H. Guo and J. T. Guo, 2007, Molecular virology of hepatitis B

virus for clinicians, Clin Liver Dis. 11(4): p. 685-706, vii.

18. Florian Bömmel, Anne Bartens, Alena Mysickova, Jörg Hofmann, Detlev H

Krüger, Thomas Berg, et al., 2015, Serum hepatitis B virus RNA levels as an

early predictor of hepatitis B envelope antigen seroconversion during

treatment with polymerase inhibitors, Hepatology. 61(1): p. 66-76.

19. S. Bonhoeffer and P. Sniegowski, 2002, Virus evolution: the importance of

being erroneous, Nature. 420(6914): p. 367, 369.

20. R. Bonilla Guerrero and L. R. Roberts, 2005, The role of hepatitis B virus

integrations in the pathogenesis of human hepatocellular carcinoma, J

Hepatol. 42(5): p. 760-77.

21. C. Brechot, M. Hadchouel, J. Scotto, M. Fonck, F. Potet, G. N. Vyas, et al.,

1981, State of hepatitis B virus DNA in hepatocytes of patients with hepatitis

B surface antigen-positive and -negative liver diseases, Proc Natl Acad Sci

U S A. 78(6): p. 3906-10.

22. C. Brechot, D. Kremsdorf, P. Paterlini and V. Thiers, 1991, Hepatitis B virus

DNA in HBsAg-negative patients. Molecular characterization and clinical

implications, J Hepatol. 13 Suppl 4: p. S49-55.

23. C. Brechot, 2004, Pathogenesis of hepatitis B virus-related hepatocellular

carcinoma: old and new paradigms, Gastroenterology. 127(5 Suppl 1): p.

S56-61.

24. M. R. Brunetto, 2010, A new role for an old marker, HBsAg, J Hepatol.

52(4): p. 475-7.

25. V. Bruss, 2004, Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid, Virus

Res. 106(2): p. 199-209.

26. C. J. Chu, M. Hussain and A. S. Lok, 2002, Quantitative serum HBV DNA

levels during different stages of chronic hepatitis B infection, Hepatology.

36(6): p. 1408-15.

27. Jacobson I Colucci G, Lalatta F, Vernance S, Waksal SD, Weksler ME,

1986, Detection of hepatitis B virus DNA, RNA and surface antigen in

mononuclear cells from patients with type B hepatitis, Clin Res.

28. D. S. Dane, C. H. Cameron and M. Briggs, 1970, Virus-like particles in

serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis, Lancet.

1(7649): p. 695-8.

29. S. Datta, 2008, An overview of molecular epidemiology of hepatitis B virus

(HBV) in India, Virol J. 5: p. 156.

30. E. C. Doo and M. G. Ghany, 2010, Hepatitis B virology for clinicians, Clin

Liver Dis. 14(3): p. 397-408.

31. C. Dunn, D. Peppa, P. Khanna, G. Nebbia, M. Jones, N. Brendish, et al.,

2009, Temporal analysis of early immune responses in patients with acute

hepatitis B virus infection, Gastroenterology. 137(4): p. 1289-300.

32. Liver European Association For The Study Of The, 2012, EASL clinical

practice guidelines: Management of chronic hepatitis B virus infection, J

Hepatol. 57(1): p. 167-85.

33. S. Ezzikouri, M. Ozawa, M. Kohara, N. Elmdaghri, S. Benjelloun and K.

Tsukiyama-Kohara, 2014, Recent insights into hepatitis B virus-host

interactions, J Med Virol. 86(6): p. 925-32.

34. D. Ganem and A. M. Prince, 2004, Hepatitis B virus infection--natural

history and clinical consequences, N Engl J Med. 350(11): p. 1118-29.

35. W. H. Gerlich, 2013, Medical virology of hepatitis B: how it began and

where we are now, Virol J. 10: p. 239.

36. J. R. Gu, Y. C. Chen, H. Q. Jiang, Y. L. Zhang, S. M. Wu, W. L. Jiang, et al.,

1985, State of hepatitis B virus DNA in leucocytes of hepatitis B patients, J

Med Virol. 17(1): p. 73-81.

37. S. Gunther, 2006, Genetic variation in HBV infection: genotypes and

mutants, J Clin Virol. 36 Suppl 1: p. S3-S11.

38. Pasquinelli C Hadchouel M, Fournier JG, 1988, Detection of mononuclear

cells expressing hepatitis B virus in peripheral blood from HBsAg positive

and negative patients by situ hybridization: p. 27–123.

39. T. Hatakeyama, C. Noguchi, N. Hiraga, N. Mori, M. Tsuge, M. Imamura, et

al., 2007, Serum HBV RNA is a predictor of early emergence of the YMDD

mutant in patients treated with lamivudine, Hepatology. 45(5): p. 1179-86.

40. R. A. Heijtink, J. Kruining, P. Honkoop, M. C. Kuhns, W. C. Hop, A. D.

Osterhaus, et al., 1997, Serum HBeAg quantitation during antiviral therapy

for chronic hepatitis B, J Med Virol. 53(3): p. 282-7.

41. Y. W. Huang, K. Chayama, M. Tsuge, S. Takahashi, T. Hatakeyama, H.

Abe, et al., 2010, Differential effects of interferon and lamivudine on serum

HBV RNA inhibition in patients with chronic hepatitis B, Antivir Ther. 15(2):

p. 177-84.

42. Y. W. Huang, S. Takahashi, M. Tsuge, C. L. Chen, T. C. Wang, H. Abe, et

al., 2015, On-treatment low serum HBV RNA level predicts initial virological

response in chronic hepatitis B patients receiving nucleoside analogue

therapy, Antivir Ther. 20(4): p. 369-75.

43. L. Jansen, N. A. Kootstra, K. A. van Dort, R. B. Takkenberg, H. W. Reesink

and H. L. Zaaijer, 2016, Hepatitis B Virus Pregenomic RNA Is Present in

Virions in Plasma and Is Associated With a Response to Pegylated Interferon

Alfa-2a and Nucleos(t)ide Analogues, J Infect Dis. 213(2): p. 224-32.

44. Jerzy Jaroszewicz, Beatriz Calle Serrano, Karsten Wursthorn, Katja

Deterding, Jerome Schlue, Regina Raupach, et al., 2010, Hepatitis B surface

antigen (HBsAg) levels in the natural history of hepatitis B virus (HBV)-

infection: a European perspective, Journal of hepatology. 52(4): p. 514-522.

45. Yiqi Yu Jing Wang, Guojun Li, et al., , 2017, Relationship between serum

HBV RNA levels and intrahepatic viral as well as histologic activity markers

in entecavir-treated patients, Journal of Hepatology.

46. Venetia Saunders John Carter, Viriology - Principles and Applications. 2007.

47. M. Kann, A. Schmitz and B. Rabe, 2007, Intracellular transport of hepatitis

B virus, World J Gastroenterol. 13(1): p. 39-47.

48. P. M. Kaplan, R. L. Greenman, J. L. Gerin, R. H. Purcell and W. S.

Robinson, 1973, DNA polymerase associated with human hepatitis B

antigen, J Virol. 12(5): p. 995-1005.

49. P. Karayiannis, 2017, Hepatitis B virus: virology, molecular biology, life

cycle and intrahepatic spread, Hepatol Int. 11(6): p. 500-508.

50. M. Karimova, N. Beschorner, W. Dammermann, J. Chemnitz, D.

Indenbirken, J. H. Bockmann, et al., 2015, CRISPR/Cas9 nickase-mediated

disruption of hepatitis B virus open reading frame S and X, Sci Rep. 5: p.

13734.

51. A. Kay and F. Zoulim, 2007, Hepatitis B virus genetic variability and

evolution, Virus Res. 127(2): p. 164-76.

52. K. Kidd-Ljunggren, Y. Miyakawa and A. H. Kidd, 2002, Genetic variability

in hepatitis B viruses, J Gen Virol. 83(Pt 6): p. 1267-80.

53. S. Kim, J. Lee and W. S. Ryu, 2009, Four conserved cysteine residues of the

hepatitis B virus polymerase are critical for RNA pregenome encapsidation,

J Virol. 83(16): p. 8032-40.

54. A. Kramvis, 2014, Genotypes and genetic variability of hepatitis B virus,

Intervirology. 57(3-4): p. 141-50.

55. J. P. Lamelin and C. Trepo, 1990, The hepatitis B virus and the peripheral

blood mononuclear cells: a brief review, J Hepatol. 10(1): p. 120-4.

56. Daniel Lavanchy and Mark Kane, Global epidemiology of hepatitis B virus

infection, in Hepatitis B Virus in Human Diseases. 2016, Springer. p. 187-

203.

57. H. C. Li, E. Y. Huang, P. Y. Su, S. Y. Wu, C. C. Yang, Y. S. Lin, et al.,

2010, Nuclear export and import of human hepatitis B virus capsid protein

and particles, PLoS Pathog. 6(10): p. e1001162.

58. T. J. Liang, 2009, Hepatitis B: the virus and disease, Hepatology. 49(5

Suppl): p. S13-21.

59. Y. F. Liaw, J. J. Sung, W. C. Chow, G. Farrell, C. Z. Lee, H. Yuen, et al.,

2004, Lamivudine for patients with chronic hepatitis B and advanced liver

disease, N Engl J Med. 351(15): p. 1521-31.

60. Yun-Fan Liaw and Chia-Ming Chu, 2009, Hepatitis B virus infection, The

Lancet. 373(9663): p. 582-592.

61. S. Locarnini, M. Littlejohn, M. N. Aziz and L. Yuen, 2013, Possible origins

and evolution of the hepatitis B virus (HBV), Semin Cancer Biol. 23(6 Pt B):

p. 561-75.

62. A. S. Lok, E. J. Heathcote and J. H. Hoofnagle, 2001, Management of

hepatitis B: 2000--summary of a workshop, Gastroenterology. 120(7): p.

1828-53.

63. A. S. Lok and B. J. McMahon, 2009, Chronic hepatitis B: update 2009,

Hepatology. 50(3): p. 661-2.

64. J. Lucifora, S. Arzberger, D. Durantel, L. Belloni, M. Strubin, M. Levrero, et

al., 2011, Hepatitis B virus X protein is essential to initiate and maintain

virus replication after infection, J Hepatol. 55(5): p. 996-1003.

65. L. Ludgate, X. Ning, D. H. Nguyen, C. Adams, L. Mentzer and J. Hu, 2012,

Cyclin-dependent kinase 2 phosphorylates s/t-p sites in the hepadnavirus

core protein C-terminal domain and is incorporated into viral capsids, J

Virol. 86(22): p. 12237-50.

66. M.J. van Campenhout, F. van Bömmel, M. Grossmann, J. Fischer, D.

Deichsel, A. Boonstra, et al., 2017, Serum hepatitis B virus RNA level is

associated with hepatitis B virus genotype and BCP mutations in untreated

patients with HBeAg positive chronic hepatitis B, Journal of Hepatology. 66:

p. S253-S254.

67. Margo van Campenhout, Florian van Bömmel, Willem Pieter Brouwer, Qing

Xie, Qin Zhang, Adrian Streinu Cercel, et al., 2017, Serum HBV RNA level

predicts response to peginterferon add-on therapy for HBeAg-positive

chronic hepatitis B, Hepatology. 66(1): p. 97A-98A.

68. A. Mason, B. Yoffe, C. Noonan, M. Mearns, C. Campbell, A. Kelley, et al.,

1992, Hepatitis B virus DNA in peripheral-blood mononuclear cells in

chronic hepatitis B after HBsAg clearance, Hepatology. 16(1): p. 36-41.

69. W. S. Mason, G. Seal and J. Summers, 1980, Virus of Pekin ducks with

structural and biological relatedness to human hepatitis B virus, J Virol.

36(3): p. 829-36.

70. J. E. Maynard, 1990, Hepatitis B: global importance and need for control,

Vaccine. 8 Suppl: p. S18-20; discussion S21-3.

71. Brian J McMahon, 2009, The natural history of chronic hepatitis B virus

infection, Hepatology. 49(S5).

72. Yatsuhashi H Mei SD, Parquet MC, Hamada R, Fujino T, Matsumoto T,

Inoue O, Koga M, Yano M., 2000, Detection of HBV RNA in peripheral

blood mononuclear cells in patients with and without HBsAg by reverse

transcription polymerase chain reaction., Hepatol Res. 18: p. 19-28.

73. M. Melegari, S. K. Wolf and R. J. Schneider, 2005, Hepatitis B virus DNA

replication is coordinated by core protein serine phosphorylation and HBx

expression, J Virol. 79(15): p. 9810-20.

74. M. Mizokami, E. Orito, K. Ohba, K. Ikeo, J. Y. Lau and T. Gojobori, 1997,

Constrained evolution with respect to gene overlap of hepatitis B virus, J

Mol Evol. 44 Suppl 1: p. S83-90.

75. M. Nassal, 2015, HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle

for a cure of chronic hepatitis B, Gut. 64(12): p. 1972-84.

76. H. Okamoto, M. Imai, M. Kametani, T. Nakamura and M. Mayumi, 1987,

Genomic heterogeneity of hepatitis B virus in a 54-year-old woman who

contracted the infection through materno-fetal transmission, Jpn J Exp Med.

57(4): p. 231-6.

77. E. Orito, M. Mizokami, Y. Ina, E. N. Moriyama, N. Kameshima, M.

Yamamoto, et al., 1989, Host-independent evolution and a genetic

classification of the hepadnavirus family based on nucleotide sequences,

Proc Natl Acad Sci U S A. 86(18): p. 7059-62.

78. J. J. Ott, G. A. Stevens, J. Groeger and S. T. Wiersma, 2012, Global

epidemiology of hepatitis B virus infection: new estimates of age-specific

HBsAg seroprevalence and endemicity, Vaccine. 30(12): p. 2212-9.

79. D. M. Parkin, P. Pisani and J. Ferlay, 1999, Estimates of the worldwide

incidence of 25 major cancers in 1990, Int J Cancer. 80(6): p. 827-41.

80. J. M. Pawlotsky, 2002, Molecular diagnosis of viral hepatitis,

Gastroenterology. 122(6): p. 1554-68.

81. D. H. Perlman, E. A. Berg, B. O'Connor P, C. E. Costello and J. Hu, 2005,

Reverse transcription-associated dephosphorylation of hepadnavirus

nucleocapsids, Proc Natl Acad Sci U S A. 102(25): p. 9020-5.

82. Teerha Piratvisuth, Patrick Marcellin, Matei Popescu, Hans-Peter Kapprell,

Vivien Rothe and Zhi-Meng Lu, 2013, Hepatitis B surface antigen:

association with sustained response to peginterferon alfa-2a in hepatitis B e

antigen-positive patients, Hepatology international. 7(2): p. 429-436.

83. T. Pollicino, C. Saitta and G. Raimondo, 2011, Hepatocellular carcinoma:

the point of view of the hepatitis B virus, Carcinogenesis. 32(8): p. 1122-32.

84. M. R. Pourkarim, S. Amini-Bavil-Olyaee, F. Kurbanov, M. Van Ranst and F.

Tacke, 2014, Molecular identification of hepatitis B virus

genotypes/subgenotypes: revised classification hurdles and updated

resolutions, World J Gastroenterol. 20(23): p. 7152-68.

85. R. Prange, R. Nagel and R. E. Streeck, 1992, Deletions in the hepatitis B

virus small envelope protein: effect on assembly and secretion of surface

antigen particles, J Virol. 66(10): p. 5832-41.

86. G. Radziwill, W. Tucker and H. Schaller, 1990, Mutational analysis of the

hepatitis B virus P gene product: domain structure and RNase H activity, J

Virol. 64(2): p. 613-20.

87. G. Raimondo, J. P. Allain, M. R. Brunetto, M. A. Buendia, D. S. Chen, M.

Colombo, et al., 2008, Statements from the Taormina expert meeting on

occult hepatitis B virus infection, J Hepatol. 49(4): p. 652-7.

88. B. Rehermann, C. Ferrari, C. Pasquinelli and F. V. Chisari, 1996, The

hepatitis B virus persists for decades after patients' recovery from acute viral

hepatitis despite active maintenance of a cytotoxic T-lymphocyte response,

Nat Med. 2(10): p. 1104-8.

89. A. Rodella, C. Galli, L. Terlenghi, F. Perandin, C. Bonfanti and N. Manca,

2006, Quantitative analysis of HBsAg, IgM anti-HBc and anti-HBc avidity in

acute and chronic hepatitis B, J Clin Virol. 37(3): p. 206-12.

90. A. Rokuhara, A. Matsumoto, E. Tanaka, T. Umemura, K. Yoshizawa, T.

Kimura, et al., 2006, Hepatitis B virus RNA is measurable in serum and can

be a new marker for monitoring lamivudine therapy, J Gastroenterol. 41(8):

p. 785-90.

91. S. J. Scaglione and A. S. Lok, 2012, Effectiveness of hepatitis B treatment in

clinical practice, Gastroenterology. 142(6): p. 1360-1368 e1.

92. S. Schadler and E. Hildt, 2009, HBV life cycle: entry and morphogenesis,

Viruses. 1(2): p. 185-209.

93. A. Schweitzer, J. Horn, R. T. Mikolajczyk, G. Krause and J. J. Ott, 2015,

Estimations of worldwide prevalence of chronic hepatitis B virus infection: a

systematic review of data published between 1965 and 2013, Lancet.

386(10003): p. 1546-55.

94. C. Seeger and J. A. Sohn, 2014, Targeting Hepatitis B Virus With

CRISPR/Cas9, Mol Ther Nucleic Acids. 3: p. e216.

95. C. Seeger and W. S. Mason, 2015, Molecular biology of hepatitis B virus

infection, Virology. 479-480: p. 672-86.

96. MJ Sonneveld, Roeland Zoutendijk and HLA Janssen, 2011, Hepatitis B

surface antigen monitoring and management of chronic hepatitis B, Journal

of viral hepatitis. 18(7): p. 449-457.

97. C. E. Stevens, R. P. Beasley, J. Tsui and W. C. Lee, 1975, Vertical

transmission of hepatitis B antigen in Taiwan, N Engl J Med. 292(15): p.

771-4.

98. T. S. Su, C. J. Lai, J. L. Huang, L. H. Lin, Y. K. Yauk, C. M. Chang, et al.,

1989, Hepatitis B virus transcript produced by RNA splicing, J Virol. 63(9):

p. 4011-8.

99. J. Summers and W. S. Mason, 1982, Replication of the genome of a hepatitis

B--like virus by reverse transcription of an RNA intermediate, Cell. 29(2): p.

403-15.

100. W. S. Tan and K. L. Ho, 2014, Phage display creates innovative applications

to combat hepatitis B virus, World J Gastroenterol. 20(33): p. 11650-70.

101. N. C. Tassopoulos, G. J. Papaevangelou, M. H. Sjogren, A. Roumeliotou-

Karayannis, J. L. Gerin and R. H. Purcell, 1987, Natural history of acute

hepatitis B surface antigen-positive hepatitis in Greek adults,

Gastroenterology. 92(6): p. 1844-50.

102. K. Tatematsu, Y. Tanaka, F. Kurbanov, F. Sugauchi, S. Mano, T. Maeshiro,

et al., 2009, A genetic variant of hepatitis B virus divergent from known

human and ape genotypes isolated from a Japanese patient and provisionally

assigned to new genotype J, J Virol. 83(20): p. 10538-47.

103. J. E. Tavis, X. Cheng, Y. Hu, M. Totten, F. Cao, E. Michailidis, et al., 2013,

The hepatitis B virus ribonuclease H is sensitive to inhibitors of the human

immunodeficiency virus ribonuclease H and integrase enzymes, PLoS

Pathog. 9(1): p. e1003125.

104. N. A. Terrault, A. S. F. Lok, B. J. McMahon, K. M. Chang, J. P. Hwang, M.

M. Jonas, et al., 2018, Update on Prevention, Diagnosis, and Treatment of

Chronic Hepatitis B: AASLD 2018 Hepatitis B Guidance, Clin Liver Dis

(Hoboken). 12(1): p. 33-34.

105. Norah A Terrault, Natalie H Bzowej, Kyong‐ Mi Chang, Jessica P Hwang,

Maureen M Jonas and M Hassan Murad, 2016, AASLD guidelines for

treatment of chronic hepatitis B, Hepatology. 63(1): p. 261-283.

106. và cộng sự. Trần Thị Thùy Trinh, 2008, New complex recombinant genotype

of hepatitis B virus identified in Vietnam, J Virol. 82(11): p. 5657-63.

107. T. C. Tseng and J. H. Kao, 2013, Clinical utility of quantitative HBsAg in

natural history and nucleos(t)ide analogue treatment of chronic hepatitis B:

new trick of old dog, J Gastroenterol. 48(1): p. 13-21.

108. M. Tsuge, N. Hiraga, H. Takaishi, C. Noguchi, H. Oga, M. Imamura, et al.,

2005, Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetically

engineered hepatitis B virus, Hepatology. 42(5): p. 1046-54.

109. P. Uhl, G. Fricker, U. Haberkorn and W. Mier, 2014, Current status in the

therapy of liver diseases, Int J Mol Sci. 15(5): p. 7500-12.

110. F. van Bommel, A. Bartens, A. Mysickova, J. Hofmann, D. H. Kruger, T.

Berg, et al., 2015, Serum hepatitis B virus RNA levels as an early predictor

of hepatitis B envelope antigen seroconversion during treatment with

polymerase inhibitors, Hepatology. 61(1): p. 66-76.

111. Mauro Viganò, Massimo Puoti and Pietro Lampertico, Nucleos (t) ide

Analogue Based Therapy and Management of Patients, in Hepatitis B Virus

in Human Diseases. 2016, Springer. p. 339-359.

112. H. P. Wang and C. E. Rogler, 1991, Topoisomerase I-mediated integration of

hepadnavirus DNA in vitro, J Virol. 65(5): p. 2381-92.

113. J. Wang, A. S. Lee and J. H. Ou, 1991, Proteolytic conversion of hepatitis B

virus e antigen precursor to end product occurs in a postendoplasmic

reticulum compartment, J Virol. 65(9): p. 5080-3.

114. J. Wang, T. Shen, X. Huang, G. R. Kumar, X. Chen, Z. Zeng, et al., 2016,

Serum hepatitis B virus RNA is encapsidated pregenome RNA that may be

associated with persistence of viral infection and rebound, J Hepatol. 65(4):

p. 700-10.

115. Jie Wang, Tao Shen, Xiangbo Huang, G Renuka Kumar, Xiangmei Chen,

Zhenzhen Zeng, et al., 2016, Serum hepatitis B virus RNA is encapsidated

pregenome RNA that may be associated with persistence of viral infection

and rebound, Journal of hepatology.

116. Y. X. Wang, C. Luo, D. Zhao, J. Beck and M. Nassal, 2012, Extensive

mutagenesis of the conserved box E motif in duck hepatitis B virus P protein

reveals multiple functions in replication and a common structure with the

primer grip in HIV-1 reverse transcriptase, J Virol. 86(12): p. 6394-407.

117. A. Wasley, S. Grytdal, K. Gallagher, Control Centers for Disease and

Prevention, 2008, Surveillance for acute viral hepatitis--United States, 2006,

MMWR Surveill Summ. 57(2): p. 1-24.

118. K. Watashi, S. Urban, W. Li and T. Wakita, 2014, NTCP and beyond:

opening the door to unveil hepatitis B virus entry, Int J Mol Sci. 15(2): p.

2892-905.

119. M. Weber, V. Bronsema, H. Bartos, A. Bosserhoff, R. Bartenschlager and H.

Schaller, 1994, Hepadnavirus P protein utilizes a tyrosine residue in the TP

domain to prime reverse transcription, J Virol. 68(5): p. 2994-9.

120. J. Weiss, H. Wu, B. Farrenkopf, T. Schultz, G. Song, S. Shah, et al., 2004,

Real time TaqMan PCR detection and quantitation of HBV genotypes A-G

with the use of an internal quantitation standard, J Clin Virol. 30(1): p. 86-

93.

121. K. Wursthorn, M. Lutgehetmann, M. Dandri, T. Volz, P. Buggisch, B.

Zollner, et al., 2006, Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong

cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B,

Hepatology. 44(3): p. 675-84.

122. Y. Xiong and T. H. Eickbush, 1990, Origin and evolution of retroelements

based upon their reverse transcriptase sequences, EMBO J. 9(10): p. 3353-

62.

123. B. Yoffe, C. A. Noonan, J. L. Melnick and F. B. Hollinger, 1986, Hepatitis B

virus DNA in mononuclear cells and analysis of cell subsets for the presence

of replicative intermediates of viral DNA, J Infect Dis. 153(3): p. 471-7.

124. Q. Zhang and G. Cao, 2011, Genotypes, mutations, and viral load of

hepatitis B virus and the risk of hepatocellular carcinoma: HBV properties

and hepatocarcinogenesis, Hepat Mon. 11(2): p. 86-91.

125. Q. Zhang, W. Qi, X. Wang, Y. Zhang, Y. Xu, S. Qin, et al., 2016,

Epidemiology of Hepatitis B and Hepatitis C Infections and Benefits of

Programs for Hepatitis Prevention in Northeastern China: A Cross-

Sectional Study, Clin Infect Dis. 62(3): p. 305-12.

126. W. Zhang, H. J. Hacker, M. Tokus, T. Bock and C. H. Schroder, 2003,

Patterns of circulating hepatitis B virus serum nucleic acids during

lamivudine therapy, J Med Virol. 71(1): p. 24-30.

127. X. Zhang, J. Hou and M. Lu, 2013, Regulation of hepatitis B virus

replication by epigenetic mechanisms and microRNAs, Front Genet. 4: p.

202.

128. Z. Zhang, N. Torii, Z. Hu, J. Jacob and T. J. Liang, 2001, X-deficient

woodchuck hepatitis virus mutants behave like attenuated viruses and induce

protective immunity in vivo, J Clin Invest. 108(10): p. 1523-31.

129. F. Zoulim and C. Seeger, 1994, Reverse transcription in hepatitis B viruses

is primed by a tyrosine residue of the polymerase, J Virol. 68(1): p. 6-13.

130. Arie J. Zuckerman, 1996, Medical Microbiology, 4th edition, University of

Texas Medical Branch at Galveston. Chapter 70.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng HBV-RNA huyết tương ở bệnh nhân viên gan B mạn tính

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

TRIỆU THỊ NGUYỆT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Triệu Thị Nguyệt

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU

Chương 1 - TỔNG QUAN

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

101

3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB.

HBV RNA(+) n(%)

HBV RNA HBeAg

HBV RNA(- ) n(%)

Giá trị trung bình (log10 copies/mL) 5,21 ± 1,97

21/63 (33,33%)

≥ 5log10 copies/mL 23 (36,51%)

˂ 5log10 copies/mL 19 (30,16%)

1,80 ± 1,42

7/14 (50,00%) 28/77 (36,36%)

7 (50,00%) 4,72 ± 2,24

Dương tính (n= 63) Âm tính (n= 14) Chung (n= 77) P

0 (0,00%) 49/77 (63,64%) 0,241 > 0,05

0,000

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 1 - Mở đầu

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 2 - Đặc điểm hình thái và cấu tạo tế bào vi sinh vật

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 3 - Phân loại và định danh vi sinh vật

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 4 - Các đặc tính sinh trưởng của vi khuẩn và chất kháng sinh

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 5 - Di truyền vi khuẩn

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 6 - Miễn dịch trong nhiễm khuẩn và khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 7 - Tụ cầu và liên cầu khuẩn

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 8 - Trực khuẩn lao và trực khuẩn phong

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 9 - Salmonella và E. coli

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 10 - Virus gây bệnh Rubella và viêm gan B

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ