zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Y Tế - Sức Khoẻ

» Y khoa - Dược

Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời tính chất xâm nhiễm Epstein-Barr virus và tính chất methyl hóa vượt mức trên gene ức chế khối u ở bệnh nhân ung thư vòm họng Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Báo xấu

28
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai nguyên nhân chủ yếu gây nên ung thư vòm họng (UTVH). Mục tiêu chính của nghiên cứu này là xây dựng một kỹ thuật chẩn đoán sớm UTVH dựa trên việc phát hiện đồng thời sự xâm nhiễm của EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời tính chất xâm nhiễm Epstein-Barr virus và tính chất methyl hóa vượt mức trên gene ức chế khối u ở bệnh nhân ung thư vòm họng Việt Nam

Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI TÍNH CHẤT XÂM NHIỄM EPSTEIN-BARR VIRUS VÀ TÍNH CHẤT METHYL HÓA VƯỢT MỨC TRÊN GENE ỨC CHẾ KHỐI U Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG VIỆT NAM Phan Thị Hiếu Nghĩa*, Bùi Thị Nhã Phương, Nguyễn Văn Yên, Lâm Hồng Ngọc Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh * Tác giả liên hệ: hieunghia189@gmail.com TÓM TẮT Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai nguyên nhân chủ yếu gây nên ung thư vòm họng (UTVH). Mục tiêu chính của nghiên cứu này là xây dựng một kỹ thuật chẩn đoán sớm UTVH dựa trên việc phát hiện đồng thời sự xâm nhiễm của EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng cơ sở dữ liệu cho thực nghiệm phát hiện sớm UTVH dựa trên hai yếu tố xâm nhiễm EBV và methyl hóa vượt mức trên các gene ức chế khối u bằng kỹ thuật PCR và MSP với các cặp mồi được đánh giá tốt về mặt lý thuyết. Về mặt thực nghiệm, chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình phát hiện các gene EBNA1, EBNA2, LMP1, LMP2 của EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của các gene ức chế khối u E- cadherin và Blu trên các mẫu bệnh phẩm. Sự hiện diện các gene mục tiêu của EBV và tính chất methyl hóa của các gene E-cadherin và Blu có mối tương quan có ý nghĩa với sự hình thành và phát triển khối u vòm họng (p
Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học cao nhất khu vực Đông Nam Á (Mahdavifar mục tiêu thiết lập cơ sở dữ liệu, xây dựng et al., 2016). Cụ thể, theo thống kê của quy trình phát hiện đồng thời EBV và tính Globocan vào năm 2012, tỷ lệ mắc bệnh chất methyl hóa trên các gene ức chế khối u UTVH là 3,9% và tỷ lệ tử vong do UTVH là E-cadherin, Blu trên bệnh UTVH; đánh giá 3,0%. Các phương pháp chẩn đoán UTVH mối tương quan giữa tính chất nhiễm EBV và hiện nay chủ yếu dựa vào các triệu chứng methyl hóa trên các gene E-cadherin và Blu lâm sàng, nội soi vòm họng, xét nghiệm mô trong quá trình hình thành bệnh UTVH; từ bệnh học, chẩn đoán huyết thanh EBV… Tuy đó, hướng đến xây dựng một kỹ thuật chẩn nhiên, khi phát hiện UTVH bằng các phương đoán sớm UTVH. pháp này thì khối u vòm họng đã phát triển đến một mức độ nhất định. Do đó, việc xây VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP dựng một phương pháp tiên lượng, chẩn đoán Thu nhận mẫu sớm UTVH là một yêu cầu cấp thiết nhằm Tổng số 50 mẫu gồm 36 mẫu mô sinh thiết tầm soát UTVH, đưa ra những biện pháp UTVH và 14 mẫu dịch phết lành do Bệnh điều trị kịp thời, nâng cao hiệu quả điều trị và viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh cung tỷ lệ sống sót ở bệnh nhân UTVH. cấp năm 2015. Các mẫu này được bảo quản Epstein-Barr virus (EBV) và sự methyl hóa trong dung dịch PBS ở -20oC. vượt mức trên các gene ức chế khối u là hai Tách chiết DNA, biến đổi bisulfite, phản nguyên quan trọng gây bệnh UTVH (Chu et ứng PCR, MSP al., 2008; Thompson et al., 2004; Tsao et al., DNA được tách chiết bằng phương pháp 2014). EBV xâm nhiễm, tồn tại, nhân lên và Phenol/Chloroform theo quy trình tách chiết gây bệnh cho tế bào chủ nhờ vào sự hoạt của Chomczynski và Sacchi (1987) có thay động của các gene thuộc họ EBNAs (EBNA1, đổi chỉ số pH của phenol từ 4 thành 8. DNA EBNA2, EBNA3), LMPs (LMP1, LMP2), … sau tách chiết được chia làm 2 phần: 1 phần (Chou et al., 2008; Korcum et al., 2006). Bên dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR cạnh đó, theo nghiên cứu của Tsai và cộng sự khuếch đại các gene mục tiêu của EBV, phần (2002), EBV còn có khả năng gây ung thư còn lại sẽ được xử lý bằng bộ kit biến đổi gián tiếp qua bất hoạt sự hoạt động một số bisulfite MethylEdge® của hãng Promega, rồi gene ức chế khối u của tế bào chủ. Cụ thể, tiến hành phản ứng MSP để khảo sát sự trong nghiên cứu này, protein LMP1 của methyl hóa của các gene ức chế khối u. Sản EBV được chứng minh có chức năng hoạt phẩm PCR, MSP được điện di trên gel hóa de novo methyltransferase dẫn đến sự agarose 1,5%. methyl hóa vượt mức trên vùng promoter của Phân tích kết quả thực nghiệm Ecadherin, từ đó ức chế biểu hiện gene này. Tần số phát hiện các gene EBNA1, EBNA2, Trong các gene ức chế khối u, Ecadherin và LMP1, LMP2 và tần số methyl, unmethyl hóa Blu được chú ý đến bởi đây là các gene có các gene E-cadherin, Blu được tính toán và chức năng điều tiết các quá trình sinh học cơ so sánh bằng phương pháp kiểm định Chi bản của tế bào như sự di chuyển, tăng sinh, bình phương (Chi-square test). Sự khác biệt biệt hóa, chết theo chương trình tế bào về tần số các gene giữa các nhóm được xem (apoptosis) và đóng vai trò quan trọng trong là có ý nghĩa với p ≤ 0,05. Bên cạnh đó, các việc ức chế sự tăng sinh của tế bào khối u ác giá trị tỷ suất chênh (OR), nguy cơ (RR)… tính. Sự methyl hóa bất thường trên các gene cũng được tính toán bằng phần mềm ức chế khối u E-cadherin, Blu đã được chứng Medcalc®version 16. minh là nguyên nhân hình thành, phát triển và di căn tế bào UTVH (Bossche et al., 2012; KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hutajulu et al., 2011; Richards et al., 2006; Khảo sát sự hiện diện các gene EBNA1, Zhang et al. 2012). Do đó, việc kết hợp phát EBNA2, LMP1, LMP2 của EBV hiện sự xâm nhiễm của EBV và tính chất Kết quả điện di sản phẩm PCR cho các băng methyl hóa trên các gene ức chế khối u có ý sáng rõ với kích thước 269 bp, 219 bp, 104 nghĩa ứng dụng phát triển thành một dấu bp và 69 bp, tương ứng lần lượt với gene chứng sinh học nhằm tiên lượng cho bệnh EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2 (hình 1). UTVH. Nghiên cứu này được thực hiện với 95
Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gene của EBV trên mẫu mô UTVH Ghi chú: L: thang chuẩn, N: chứng âm, 1 - 10: mẫu mô sinh thiết UTVH. Bảng 1. Kết quả phân tích thống kê các gene EBNA1, EBNA2, LMP1, LMP2 EBNA1 EBNA2 LMP1 LMP2 PI ≥ 0,25 AUC 0,91 0,93 0,83 0,83 0,92 K 0,77 0,78 0,53 0,53 0,81 Se 88,9% 86,1% 66,7% 66,7% 91,7% Sp 92,9% 100,0% 100,0% 100,0% 92,9% OR 104,0 166,1 56,8 56,8 143,0 p 0,0001 0,0007 0,0063 0,0063 < 0,0001 RR 12,4 25,5 19,9 19,9 12,8 p 0,0090 0,0199 0,0322 0,0322 0,0082 Ghi chú: PI ≥ 0,25: ít nhất 1 trong 4 gene EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2 được phát hiện. Giá trị AUC (Accuracy) thể hiện độ chính phát hiện được nâng lên là 91,7%, do đó làm xác của phương pháp. Giá trị K (kappa) thể tăng độ nhạy so với trường hợp phát hiện đơn hiện độ phù hợp của phương pháp chẩn đoán gene. Sự hiện diện 1 trong các gene của EBV lâm sàng và phương pháp chẩn đoán phân tử. có mối tương quan có ý nghĩa với UTVH Se (Sensitivity): độ nhạy. Sp (Specificity): độ (p
Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Kích thước sản phầm của E-cadherin là 204 phương pháp giải trình tự và được phân tích bp đối với mồi methyl và 211 bp đối với mồi bằng phần mềm Bioedit. Kết quả phân tích unmethyl. cho thấy đoạn trình tự khuếch đại trên gene Đối với Blu, kích thước sản phẩm lần lượt là E-cadherin có 19 vị trí CG, trong đó có 7 vị 231 bp và 235 bp đối với cặp mồi methyl và trí CG bị methyl hóa, 12 vị trí CG không bị unmethyl. methyl hóa. Đoạn trình tự khuếch đại trên Tần số methyl hóa của gene E-cadherin trên gene Blu có 12 vị trí CG và cả 12 vị trí CG mẫu bệnh là 97,2%, trên mẫu lành là 42,9%. này đều bị methyl hóa. Do đó, chúng tôi kết Đối với gene Blu, tần số methyl hóa trên mẫu luận rằng trình tự promoter trên gene E- bệnh là 100%, trên mẫu lành là 64,3% (hình cadherin methyl hóa không hoàn toàn, trình 2). tự promoter trên gene Blu bị methyl hóa hoàn Trạng thái methyl hóa được xác định bằng toàn (kết quả không trình bày). Bảng 2. Kết quả phân tích thống kê trường hợp methyl trên gene E-cadherin và Blu E-cadherin Blu MI ≥ 0,5 AUC 0,77 0,68 0,64 0,61 0,44 0,37 Se 97,2% 100,0% 100,0% Sp 57,1% 35,7% 28,6% OR 46,7 42,3 31,3 p 0,0008 0,0139 0,0245 RR 2,3 1,6 1,4 p 0,0082 0,0248 0,0437 Ghi chú: MI ≥ 0,5: có sự methyl hóa trên ít nhất 1 trong 2 gene E-cadherin và Blu. Sự kết hợp xác định tính chất methyl hóa trên hiệu của phương pháp chẩn đoán UTVH dựa gene E-cadherin, Blu cho tần số methyl hóa trên xác định tính chất methyl hóa ở trường là 100% và unmethyl hóa là 94,4% trên mẫu hợp đa gene thấp hơn so với trường hợp đơn bệnh, cao hơn tần số methyl hóa của từng gene, nhưng độ nhạy của phương pháp chẩn gene. Tính chất methyl hóa của các gene E- đoán dựa trên đa gene được nâng lên mức cadherin và Blu có mối tương quan có ý cao nhất (Se = 100%). nghĩa với UTVH (p
Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Kết quả phân tích thống kê đồng thời giá trị phép phát hiện đồng thời các dấu hiệu DNA PI và MI cho tần số phát hiện là 100% trên của EBV và tính chất methyl hóa trên hai mẫu bệnh và 78,6% trên mẫu lành. Kết quả gene ức chế khối u một cách nhanh chóng này cho thấy giữa sự hiện diện các gene mục với độ chính xác cao trên nhiều loại mẫu, kể tiêu của EBV, tính chất methyl hóa của các cả xâm lấn và không xâm lấn. Do đó, phương gene E-cadherin, Blu với UTVH có mối liên pháp xác định đồng thời tính chất xâm nhiễm hệ chặt chẽ với nhau (p < 0,05). Dù được tiến EBV và methyl hóa trên gene ức chế khối u hành trên cỡ mẫu nhỏ nhưng nghiên cứu đã có thể được ứng dụng trong sàng lọc, chẩn xây dựng được một kỹ thuật chẩn đoán đạt đoán sớm UTVH và lựa chọn những liệu được độ nhạy cao (Se = 100%). Độ chính xác phát trị liệu phù hợp đối với những bệnh AUC ở mức tương đối (AUC = 0,61), do đó nhân mắc UTVH. chúng tôi đề nghị tăng cỡ mẫu nhằm tăng độ tin cậy của dữ liệu. Giá trị độ đặc hiệu Sp = KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 21,4% cho thấy trong nhiều nguyên nhân dẫn Xây dựng thành công quy trình phát hiện đến UTVH, yếu tố nhiễm EBV và tính chất đồng thời yếu tố nhiễm EBV và tính chất methyl hóa vượt mức trên gene ức chế khối u methyl hóa trên các gene ức chế khối u ở E-cadherin và Blu đóng góp 21,4% trong quá bệnh nhân UTVH Việt Nam. Sự hiện diện trình hình thành bệnh ở các mẫu bệnh khảo các gene mục tiêu của EBV và tính chất sát. Bên cạnh đó, chỉ số thuộc khoảng mức methyl hóa của các gene E-cadherin và Blu độ phù hợp nhẹ ( 0,28) cho thấy về có mối tương quan với sự hình thành và phát mặt thực nghiệm, việc sử dụng tính chất triển khối u vòm họng (p < 0,05). Việc xác nhiễm EBV và methyl hóa trên gene E- định đồng thời sự hiện diện của một trong cadherin và Blu trong chẩn đoán ở mức hỗ các gene EBNA1, EBNA2, LMP1 và LMP2 trợ tương đối. Điều này cũng phù hợp về mặt và tính chất methyl hóa của một trong hai lý thuyết khi hiện nay chưa có nhiều công bố gene E-cadherin và Blu là một dấu chứng về mối tương quan giữa 2 yếu tố nhiễm EBV sinh học tiềm năng cho việc chẩn đoán sớm và tính chất methyl hóa trên gene E-cadherin UTVH ở người bệnh Việt Nam. Nhằm hướng và Blu trong UTVH. Dù vậy, sự xâm nhiễm tới việc xây dựng một phương pháp chẩn của EBV và tính chất methyl hóa trên các đoán không xâm lấn, nghiên cứu tiếp theo sẽ gene ức chế khối u này đều có ý nghĩa trong được tiến hành trên các mẫu không xâm lấn quá trình hình thành UTVH và hỗ trợ chẩn như dịch phết vòm họng; hoặc trên các mẫu đoán trong lâm sàng. bệnh phẩm ít xâm lấn như mẫu máu toàn Phương pháp phát hiện đồng thời sự hiện phần hay huyết thanh. Bên cạnh đó, mở rộng diện một trong bốn gene EBNA1, EBNA2, cỡ mẫu thí nghiệm để tăng độ tin cậy của dữ LMP1, LMP2 và tính chất methyl hóa trên liệu. một trong hai gene E-cadherin và Blu cho tần Lời cảm ơn số phát hiện, độ nhạy cao hơn so với trường Nhóm tác giả chân thành cảm ơn ThS. Lao hợp phát hiện đơn gene. Bên cạnh đó, Đức Thuận đã tận tình hướng dẫn, góp ý và phương pháp sử dụng trong nghiên cứu là chỉnh sửa đề tài. Cảm ơn trường Đại học Mở PCR và MSP, đây là phương pháp có tính an TP. HCM đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện toàn, không tổn hại đến bệnh nhân và dễ thực cho việc thực hiện đề tài. hiện. Ngoài ra, phương pháp này còn cho TÀI LIỆU THAM KHẢO BOSSCHE, V. J., MALISSEN, B., MANTOVANI, A., BAETSELIER, P. D., GINDERACHTER, J. A. V. (2012). Regulation and function of the E-cadherin/catenin complex in cells of the monocyte- macrophage lineage and DCs, Blood, 119(7), 1623- 1633. MAHDAVIFAR, N., GHONCHEH, M., MOHAMMADIAN-HAFSHEJANI, A., KHOSRAVI, B., SALEHINIYA, H. (2016). Epidemiology and Inequality in the Incidence and Mortality of Nasopharynx Cancer in Asia, Osong Public Health Res Perspect, 7(6), 360 - 372. 98
Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học TSAO, S. W., YIP, Y. L., TSANG, C. M., PANG, P. S., LAU, V. M., ZHANG, G., LO, K. W. (2014). Etiological factors of nasopharyngeal carcinoma, Oraloncology, 50(5), 330- 338. ZHANG, X., LIU, H., LI, B., HUANG, P., SHAO, J. AND HE, Z. (2012). Tumor suppressor BLU inhibits proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells by regulation of cell cycle, c-Jun N-terminal kinase and the cyclin D1 promoter, BMC Cancer, 12, 267. 99

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.