Nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của các cao chiết cồn từ hai loài thạch tùng thuộc họ lycopodiaceae trên chuột nhắt trắng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN SUY GIẢM TRÍ NHỚ<br /> CỦA CÁC CAO CHIẾT CỒN TỪ HAI LOÀI THẠCH TÙNG<br /> THUỘC HỌ LYCOPODIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG<br /> Nguyễn Duy Tài, Nguyễn Ngọc Chương**, Nguyễn Thị Sơn**, Trần Công Luận***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mờ đầu: Mục tiêu của đề tài này là khảo sát tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của các cao chiết cồn từ<br /> Thạch tùng răng và Râu rồng trên chuột nhắt trắng.<br /> Phương pháp nghiên cứu: dịch chiết cồn của 2 dược liệu được đánh giá tác động cải thiện trí nhớ trên<br /> chuột swiss albino được gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin với mô hình Ma trận tám nhánh và Mê<br /> cung bơi.<br /> Kết quả: Cao chiết cồn của Thạch tùng răng (liều 0,533 g/kg) và Râu rồng (liều 0,171 g/kg) giúp cải thiện<br /> tình trạng suy giảm trí nhớ trên chuột thực nghiệm. LD50 của cao Thạch tùng răng là 5,33g/kg, của cao Râu rồng<br /> là 1,71 g/kg.<br /> Kết luận: Cao chiết cồn từ Thạch tùng răng và Râu rồng có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ trên chuột<br /> nhắt trắng.<br /> Từ khóa: Thạch tùng răng, Râu rồng, suy giảm trí nhớ<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON ANTI-AMNESIC EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF HUPERZIA SERRATA<br /> AND HUPERZIA SQUARROSA ON INDUCED MEMORY IMPAIRMENT IN MICE<br /> Nguyen Duy Tai, Nguyen Ngoc Chuong, Nguyen Thi Son, Tran Cong Luan<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 243 - 248<br /> Background - Objectives: The aim of this work was to study recovery effect on memory and learning of<br /> ethanolic extracts of Huperzia serrata and Huperzia squarrosa in mice.<br /> Methods: Ethanolic extracts of these medicinal plants was evaluated for in vivo anti-amnesic activity<br /> in memory indeficient Swiss albino mice induced by scopolamine with Arms radical maze and Morris water<br /> maze tests.<br /> Results: Ethanolic extracts of Huperzia serrata (0.533 g/kg) and Huperzia squarrosa (0.171 g/kg) help to<br /> recover cognitive impairment in mice. LD50 of oral administration of Huperzia serrata and Huperzia squarrosa<br /> was respectively 5.33g/kg and 1.71 g/kg.<br /> Conclusion: Ethanolic extracts of Huperzia serrata and Huperzia squarrosa exert recovery effects on<br /> impairment in mice memory and learning.<br /> Key words: Huperzia serrata, Huperzia squarrosa, cognitive impairment.<br /> xuất hiện của các rối loạn về bộ nhớ tăng theo<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> tuổi: 65-69 tuổi tỷ lệ là 1,5%; > 85 tuổi tỷ lệ là<br /> Thuật ngữ mất trí nhớ bao gồm hai thể: suy<br /> 35% và > 95 tuổi tỷ lệ là 60%. Năm 2010 tỷ lệ<br /> giảm trí nhớ và mất trí nhớ. Tỷ lệ người dân<br /> người bị suy giảm trí nhớ là 35,6 triệu và dự<br /> *Trường Cao Đẳng Y Tế Đồng Nai,<br /> **Khoa Y Học Cổ Truyền – ĐH Y Dược Tp.HCM,<br /> ***Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM<br /> Tác giả liên lạc: BS Nguyễn Duy Tài<br /> ĐT: 0933100220<br /> Email: duytainguyen84@yahoo.com.vn<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> 243<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> đoán đến năm 2050 có 115.400.000 người bị suy<br /> giảm trí nhớ(8). Mặt khác, cho đến nay, chưa có<br /> phương pháp chữa lành suy giảm trí nhớ. Tuy<br /> nhiên, phát hiện và điều trị bệnh sớm bằng các<br /> thuốc ức chế men acetylcholinesterase như<br /> donepezil (Aricept), rivastigmin (Exelon),<br /> galantamin (Reminyl)…, các thuốc chống oxy<br /> hóa như vitamin E, ginko biloba… có thể làm<br /> chậm diễn tiến của triệu chứng bệnh(9).<br /> <br /> Hóa chất<br /> <br /> Do đó việc tìm ra một phương thuốc để điều<br /> trị bệnh này đang là mục tiêu của rất nhiều nhà<br /> nghiên cứu. Một lĩnh vực đang thu hút các nhà<br /> khoa học hiện nay đó là việc ứng dụng nghiên<br /> cứu thảo dược trong điều trị bệnh. Huperzin là<br /> hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây Thạch<br /> tùng răng bởi các nhà khoa học Trung Quốc vào<br /> năm<br /> 1986<br /> có<br /> tác<br /> dụng<br /> ức<br /> chế<br /> acetylcholinesterase. Đến năm 1996, Huperzin A<br /> được sử dụng như là thuốc ở Trung Quốc và<br /> được bán trên thị trường tại Mỹ dưới dạng thực<br /> phẩm bổ sung vào năm 1999.<br /> <br /> Độc tính cấp(3)<br /> - Chuẩn bị chuột thí nghiệm:<br /> <br /> Kế thừa những kết quả nghiên cứu trên, với<br /> mong muốn tìm kiếm thuốc từ thảo dược tại Việt<br /> Nam có tác dụng cải thiện sự suy giảm trí nhớ,<br /> đề tài nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí<br /> nhớ của cao chiết cồn từ hai loài Thạch tùng<br /> thuộc họ Lycopodiaceae trên chuột nhắt trắng<br /> được hình thành.<br /> <br /> Lô chứng: cho mỗi con chuột uống nước cất<br /> với liều 0,2 ml/ 10 g chuột.<br /> <br /> NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Nguyên liệu<br /> Thạch tùng răng (Huperzia serrata), Râu rồng<br /> (Huperzia squarrosa), được thu hái ở tỉnh Lâm<br /> Đồng và định danh, lưu mẫu ở Bộ môn Tài<br /> nguyên dược liệu thuộc Trung tâm Sâm và Dược<br /> liệu thành phố Hồ Chí Minh-Viện Dược Liệu.<br /> Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng,<br /> chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng<br /> trung bình 20 ± 2 g, được cung cấp bởi viện<br /> Pasteur TP.HCM và được để ổn định một tuần<br /> trước khi thử nghiệm, mỗi chuột uống 0,2 ml/10g<br /> thể trọng.<br /> <br /> 244<br /> <br /> Dung môi chiết: cồn 96%.<br /> Thuốc làm giảm trí nhớ: scopolamine HBr<br /> mua từ hãng Sigma.<br /> Các hóa chất cần thiết cho tách chiết và phân<br /> tích được mua từ công ty Sigma (Mỹ) và một số<br /> công ty khác.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> + Để chuột nhịn đói 12 giờ trước khi cho<br /> uống thuốc.<br /> + Cách chia lô chuột: chia chuột thí nghiệm<br /> làm nhiều lô, mỗi lô 6 con.<br /> - Đường dùng thuốc, thể tích nước thuốc cho<br /> uống:<br /> + Đường dùng thuốc: đường uống.<br /> + Thể tích nước thuốc cho uống: 0,2 ml/10 g<br /> chuột, trong đó:<br /> <br /> Lô thử: cho mỗi chuột uống thuốc với liều 0,2<br /> ml nước thuốc/10 g chuột.<br /> - Thử nghiệm thực hiện qua 2 giai đoạn:<br /> + Giai đoạn thăm dò: khởi đầu từ liều cao<br /> nhất để nước thuốc có thể bơm được qua kim<br /> cho uống. Xác định liều LD0 (liều tối đa không<br /> gây chết) và liều LD100 (liều tối thiểu gây chết<br /> 100%).<br /> + Giai đoạn xác định: chuột được chia lô và<br /> cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0<br /> và LD100, khoảng cách liều giữa các lô bằng nhau.<br /> - Các chỉ tiêu đánh giá kết quả:<br /> + Theo dõi các biểu hiện về hành vi của<br /> chuột trong vòng 72 giờ đầu sau khi dùng thuốc<br /> và trong một tuần tiếp theo. Ghi chép các biểu<br /> hiện trong thời gian đó. Ghi giờ cho chuột uống<br /> thuốc, giờ xuất hiện các triệu chứng khác<br /> thường. Ghi nhận số chuột chết trong từng lô.<br /> Quan sát đại thể (quan sát tim, gan, thận, ruột)<br /> ngay sau khi chết đối với chuột bị chết và sau khi<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> kết thúc thử nghiệm đối với chuột còn sống.<br /> + Tính LD50 bằng phương pháp BehrensKarber.<br /> <br /> LD50 =<br /> <br /> LD100 -<br /> <br /> ∑ad<br /> n<br /> <br /> Trong đó:<br /> LD50 : liều chết 50% số chuột thí nghiệm.<br /> LD100: liều nhỏ nhất gây chết 100% số chuột<br /> thí nghiệm.<br /> a: số chuột chết trung bình 2 liều kế tiếp.<br /> d: hiệu hai liều kế tiếp.<br /> n: số trung bình chuột dùng ở mỗi liều.<br /> <br /> Khảo sát tác dụng cải thiện sự suy giảm trí<br /> nhớ của cao Thạch tùng răng và Râu rồng<br /> Chuột được chia thành hai nhóm:<br /> + Nhóm 1: là nhóm chuột bị gây suy giảm trí<br /> nhớ và được chia thành 6 lô, mỗi lô 15 con:<br /> Lô chứng sinh lý: cho uống nước cất.<br /> Lô bệnh lý: được gây bệnh bằng scopolamin<br /> và cho uống nước cất (15 con).<br /> Lô T1-1: được uống scopolamin liều 1 mg/kg<br /> và cao Thạch tùng răng liều 0,533 g/kg.<br /> Lô T1-2: được uống scopolamin liều 1 mg/kg<br /> và cao Thạch tùng răng liều 0,266 g/kg.<br /> Lô T2-1: được uống scopolamin liều 1 mg/kg<br /> và cao Râu rồng liều 0,171 g/kg.<br /> Lô T2-2: được uống scopolamin liều 1 mg/kg<br /> và cao Râu rồng liều 0,085 g/kg.<br /> + Nhóm 2: là nhóm chuột không bị gây suy<br /> giảm trí nhớ và được chia thành 2 lô:<br /> Lô T1’-1: cho uống cao Thạch tùng răng liều<br /> 0,533 g/kg.<br /> Lô T2’-1: cho uống cao Râu rồng liều 0,171<br /> g/kg.<br /> <br /> Khảo sát trí nhớ nhận diện không gian - Mô<br /> hình mê cung bơi:<br /> Đánh giá khả năng học tập, nhận thức và sự<br /> hình thành trí nhớ của chuột qua các tiêu chí:<br /> thời gian tiềm thời chuột tìm đến chân đế, thời<br /> gian chuột ở vùng ¼ của diện tích bể bơi nơi đặt<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> chân đế.<br /> Cấu tạo Mê cung bơi:<br /> Đường kính 1 m, chiều cao 60 cm. Lượng<br /> nước trong mê cung bơi duy trì ở mức 46 cm,<br /> nhiệt độ của nước khoảng 30 0C trong suốt quá<br /> trình thí nghiệm.<br /> Mê cung bơi được đặt trong phòng có đặt<br /> sẵn các hình ảnh để định hướng không gian cho<br /> chuột trong quá trình học tập.<br /> Vị trí của các hình ảnh này không được thay<br /> đổi trong suốt quá trình chuột học tập. Một phao<br /> có đường kính 10 cm làm bằng nhựa được đặt<br /> tại một phần tư của mê cung bơi.<br /> Tiến hành thí nghiệm: chuột được huấn<br /> luyện và thử nghiệm trong 6 ngày.<br /> Ngày 1: tiến hành với 3 thử nghiệm, mỗi thử<br /> nghiệm là một vị trí bắt đầu bơi của chuột (thành<br /> của bể bơi có đánh dấu 4 điểm với khoảng cách<br /> các điểm đều nhau, để chuột bắt đầu bơi tại 3<br /> điểm đánh dấu không trùng với diện tích ¼ của<br /> bể bơi nơi đặt chân đế - vùng có phao). Trong<br /> mỗi thử nghiệm, cho chuột bơi trong 120 giây để<br /> tìm chân đế nổi trên mặt nước. Sau khi kết thúc<br /> thử nghiệm, chuột được lau khô, sau đó trả về<br /> chuồng nuôi. Nếu kết thúc 120 giây mà chuột<br /> không tìm thấy chân đế thì hướng dẫn chuột tìm<br /> đến chân đế và cho phép chuột đứng đó trong 15<br /> giây để quan sát xung quanh trước khi đỡ chuột<br /> ra khỏi bể nước.<br /> Ngày 2 - 5: mỗi ngày tiến hành với 3 thử<br /> nghiệm tương tự ngày 1, nhưng chân đế bị ẩn<br /> dưới mặt nước (mực nước trong bể cao hơn chân<br /> đế 0,5 cm). Kết thúc mỗi thử nghiệm ghi lại thời<br /> gian tiềm thời chuột tìm đến chân đế.<br /> Ngày 6: tiến hành thử nghiệm như ngày 2 –<br /> 5, nhưng chân đế được lấy ra khỏi hồ nước. Cho<br /> chuột bơi trong hồ với thời gian 60 giây. Kết thúc<br /> thử nghiệm, ghi lại thời gian chuột bơi trong<br /> diện tích ¼ của bể bơi nơi đặt chân đế.<br /> <br /> Khảo sát trí nhớ nhận diện không gian – mô<br /> hình ma trận 8 nhánh:<br /> Đánh giá khả năng học tập, nhận thức và sự<br /> <br /> 245<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> hình thành trí nhớ của chuột qua các tiêu chí:<br /> thời gian tiềm thời chuột đi vào cửa có đặt mồi,<br /> số lần chuột đi vào cửa có đặt mồi.<br /> Trước khi tiến hành thí nghiệm, chuột được<br /> giảm khẩu phần ăn sao cho trọng lượng chỉ bằng<br /> 85% - 90% trọng lượng ban đầu.<br /> Thí nghiệm: chuột được huấn luyện và thử<br /> nghiệm trong 7 ngày.<br /> Giai đoạn làm quen: chuột được làm quen<br /> với ma trận trong 2 ngày.<br /> Ngày 1 : 5 chuột được đặt vào trụ trung tâm<br /> của ma trận tám nhánh, các mẫu thức ăn được<br /> đặt ở tất cả các cánh tay và được trải đều đến lối<br /> vào ma trận, cho phép chuột khám phá ma trận<br /> tám nhánh cho đến khi hết thức ăn hoặc đã 10<br /> phút trôi qua.<br /> Ngày thứ 2, tiến hành tương tự ngày 1<br /> nhưng thức ăn chỉ được đặt trong lọ cuối mỗi<br /> cánh tay.<br /> <br /> - Hàm lượng chất chiết: dùng phương pháp<br /> chiết nóng với nước<br /> Bảng 1: Hàm lượng chất chiết của Thạch tùng răng<br /> và Râu rồng.<br /> Lần 1<br /> Thạch tùng răng (%) 23,09<br /> Râu rồng (%)<br /> 4,95<br /> <br /> Lần 2<br /> 23,16<br /> 5,00<br /> <br /> Lần 3 Trung bình<br /> 23,24<br /> 23,16<br /> 4,96<br /> 4,97<br /> <br /> + Nhận xét: Hàm lượng chất chiết của Thạch<br /> tùng răng cao hơn Râu rồng.<br /> - Quy ra liều Dược liệu:<br /> + Thạch tùng răng:<br /> Hàm lượng chất chiết là 23,16%; LD50 là 5,33<br /> g/kg. Lượng dược liệu là: 23,01 g/kg.<br /> + Râu rồng:<br /> Hàm lượng chất chiết là 4,97%; LD50 là 1,71<br /> g/kg. Lượng dược liệu là: 34,41 g/kg.<br /> <br /> Mô hình cải thiện suy giảm trí nhớ<br /> <br /> Giai đoạn huấn luyện: chuột được huấn<br /> luyện trong 4 ngày liên tục. Trong giai đoạn này,<br /> chỉ có 4 cánh tay (chọn cánh tay số 1, 3, 5, 7) được<br /> đặt mồi (như ngày 2) và trình tự này không thay<br /> đổi suốt thời gian huấn luyện. 01 chuột được đặt<br /> vào trụ trung tâm, sau 10 giây, tất cả các cửa tự<br /> động mở, cho phép chuột tìm đến cánh cửa có<br /> thức ăn. Thử nghiệm kết thúc khi chuột đã tìm<br /> được 4 cánh tay đặt mồi hoặc 10 phút.<br /> <br /> Mô hình Mê cung bơi:<br /> <br /> Giai đoạn kiểm tra: ngày thứ 7, tiến hành<br /> tương tự giai đoạn huấn luyện. Các thông số:<br /> thời gian tiềm thời chuột đi vào cả 4 cửa có đặt<br /> mồi, số lần chuột đi vào cửa không đặt mồi.<br /> <br /> (*) p< 0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bình<br /> thường. (#) p< 0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô<br /> bệnh lý.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> chuột tìm đến chân đế, cao Thạch tùng răng<br /> <br /> Độc tính cấp:<br /> <br /> với liều 0,533 g/kg và cao Râu rồng với liều<br /> <br /> LD50 của cao Thạch tùng răng là 5,33 g/kg.<br /> LD50 của cao Râu rồng là 1,71 g/kg.<br /> Biểu hiện của chuột đã chết trong thử<br /> nghiệm độc tính cấp: sau khi dùng các liều thử<br /> nghiệm, chuột có các biệu hiện: quẫy mạnh đuôi,<br /> lắc đầu liên tục, sùi bọt mép, mắt đứng tròng, tứ<br /> chi cứng đờ và tử vong.<br /> <br /> 246<br /> <br /> - Nhóm 1: là nhóm chuột bị gây suy giảm trí<br /> nhớ<br /> + Tiềm thời chuột tìm đến chân đế:<br /> Bảng 2: Tiềm thời chuột tìm đến chân đế (giây).<br /> Chứng Bệnh lý T1-1<br /> T1-2<br /> T2-1<br /> T2-2<br /> sinh lý<br /> 59,1±4,4# 90,1±6,3 28,5±2,69 45,8±5,7 27,6±1,1 41,2±2,5<br /> #<br /> 9#<br /> 2<br /> *,#<br /> *,#<br /> <br /> + Kết quả (bảng 2): với mô hình tiềm thời<br /> <br /> 0,171 g/kg đều có tác dụng cải thiện trí nhớ<br /> trên mô hình chuột bị suy giảm trí nhớ và<br /> chuột bình thường. Tuy nhiên, đối với liều cao<br /> Thạch tùng răng liều 0,266 g/kg và Râu rồng<br /> liều 0,085 g/kg chỉ có tác dụng cải thiện trí nhớ<br /> trên chuột bệnh lý.<br /> + Thời gian chuột bơi trong vùng có phao.<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> Bảng 3: Thời gian chuột bơi trong vùng có phao<br /> (giây).<br /> Chứng Bệnh lý T1-1<br /> T1-2<br /> T2-1<br /> T2-2<br /> sinh lý<br /> 18±0,83# 41,2±2,8 15,1±0,8 19,42±0,7 14,8±0,6 16,5±0,9<br /> 6<br /> 8#<br /> 3#<br /> 1#<br /> 1#<br /> <br /> (*) p