Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch của viên nang cứng kaviran trên chuột nhắt trắng bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA<br /> VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG<br /> BỊ SUY GIẢM MIỄN DỊCH DO CHIẾU TIA XẠ<br /> Nguyễn Trọng Điệp*; Nguyễn Tùng Linh*; Nguyễn Văn Long*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của viên nang cứng kaviran trên chuột<br /> nhắt trắng bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ. Phương pháp: chia chuột nhắt trắng làm 5 lô:<br /> lô chứng sinh học, lô chứng chiếu xạ, lô chiếu xạ uống levamisol, lô chiếu xạ uống kaviran liều<br /> 0,72 g/kg và 2,16 g/kg. Chuột được chiếu xạ toàn thân liều 1 Gy/ lần trong 6 ngày liên tục. Các nhóm<br /> chuột được uống thuốc nghiên cứu trong 6 ngày chiếu xạ và 7 ngày sau chiếu xạ. Kết quả:<br /> kaviran liều 0,72 g/kg và 2,16 g/kg có tác dụng làm tăng trọng lượng lách và ức tương đối, tăng<br /> số lượng bạch cầu tổng, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, tăng phục hồi của các tế bào<br /> trong hạch, lách, tuyến ức và tủy xương so với nhóm chứng chiếu xạ. Kaviran có tác dụng tương<br /> đương với levamisol. Kết luận: kaviran liều 0,72 g/kg và 2,16 g/kg có tác dụng tăng cường miễn<br /> dịch trên chuột nhắt trắng bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ.<br /> * Từ khóa: Kaviran; Tăng cường miễn dịch; Chiếu xạ; Chuột nhắt trắng.<br /> <br /> Immunostimulating Effect of Kaviran Hard Capsule on Radiation<br /> Induced Immunodeficient Mice<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate the immunostimulating effects of kaviran hard capsule on radiation<br /> induced immunocompromised mice. Methods: The mice were divided into 5 groups: Control group,<br /> irradiation only group, irradiation group treated with levamisol, irradiation group treated with<br /> kaviran at a dosage of 0.72 g/kg and 2.16 g/kg. Mice were irradiated at a dosage of 1 Gy/time,<br /> for 6 consecutive days. Mouse groups were orally administrated with drugs at 6 days of<br /> radiation and 7 days after irradiation. Results: Kaviran at a dosage of 0.72 g/kg and 2.16 g/kg<br /> has been found to increase relative spleen and thymus weight, increase the total number of<br /> white blood cells, lymphocytes, monocytes, increase the recovery of cells in lymph nodes,<br /> spleen, thymus and bone marrow as compared to radiation group without drug administration.<br /> The effects of kaviran were equivalent to that of levamisol. Conclusion: Kaviran dose 0.72 g/kg<br /> and 2.16 g/kg have immune enhancing effects on immunocompromised mice induced by irradiation.<br /> * Key words: Kaviran; Immunosimualted effect; Radiation; Mice.<br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Trọng Điệp (diepvmmu@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 01/09/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 12/09/2016<br /> <br /> 117<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Viên nang cứng kaviran do Học viện<br /> Quân y sản xuất, đạt tiêu chuẩn cơ sở,<br /> thành phần hoạt chất gồm bột cao khô<br /> sâm Ngọc Linh sinh khối (60 mg), bột cao<br /> khô quả Nhàu (180 mg) và bột cao khô<br /> Cúc hoa vàng (180 mg). Chế phẩm được<br /> đóng nang cứng số 0, ép vỉ nhôm/nhôm.<br /> Các nghiên cứu gần đây cho thấy, sâm<br /> Ngọc Linh sinh khối (NLSK), quả Nhàu và<br /> Cúc hoa vàng (CHV) có tác dụng tăng<br /> cường miễn dịch, ức chế sự phát triển<br /> của khối u, chống gốc tự do, bảo vệ gan,<br /> chống viêm… [1, 3, 5]. Tuy nhiên, hiện nay<br /> chưa có chế phẩm thuốc nào bào chế<br /> phối hợp ba dược liệu này. Đồng thời,<br /> quá trình chiết xuất và bào chế có thể làm<br /> thay đổi thành phần hoạt chất và tác dụng<br /> so với dược liệu ban dầu. Do vậy, sau khi<br /> nghiên cứu xây đựng công thức viên, cần<br /> phải đánh giá tính an toàn cũng như tác<br /> dụng của chế phẩm. Trong bài báo này,<br /> chúng tôi công bố kết quả nghiên cứu tác<br /> dụng tăng cường miễn dịch của viên nang<br /> cứng kaviran trên chuột nhắt trắng bị suy<br /> giảm miễn dịch do chiếu tia xạ.<br /> NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu, thiết bị và động vật<br /> nghiên cứu.<br /> - Thuốc nghiên cứu: viên nang cứng<br /> kaviran do Học viện Quân y nghiên cứu<br /> và sản xuất đạt tiêu chuẩn cơ sở.<br /> - Hóa chất: levamisol dạng bột trắng,<br /> hàm lượng 98,6% do Phòng Hóa lý I,<br /> Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương Bộ Y tế cung cấp.<br /> 118<br /> <br /> - Thiết bị: máy xét nghiệm sinh hoá tự<br /> động Chemix 180 và máy xét nghiệm huyết<br /> học tự động XE2100 (Hãng Sysmex).<br /> - Động vật nghiên cứu: chuột nhắt trắng<br /> do Ban Cung cấp Động vật Thí nghiệm,<br /> Học viện Quân y cung cấp, không phân<br /> biệt giống, khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí<br /> nghiệm, cân nặng 20,0 ± 2,0 g. Chuột được<br /> nuôi trong phòng thí nghiệm, ánh sáng<br /> tự nhiên, uống nước và ăn thức ăn được<br /> nấu chín, bảo đảm theo nhu cầu.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Phân lô: động vật được chia thành<br /> 5 lô:<br /> - Lô 1 (chứng sinh học: 15 con): chuột<br /> không bị tác động gì.<br /> - Lô 2 (chứng chiếu xạ: 10 con): gây suy<br /> giảm miễn dịch (SGMD) bằng chiếu xạ<br /> toàn thân và uống NaCl 0,9% (0,1 ml/10 g<br /> thể trọng).<br /> - Lô 3 (chiếu xạ + uống levamisol: 10<br /> con): gây SGMD bằng chiếu xạ và uống<br /> levamisol liều 50 mg/kg TLCT/24 giờ.<br /> - Lô 4 (chiếu xạ + uống kaviran liều 1:<br /> 10 con): gây SGMD bằng chiếu xạ và<br /> uống kaviran liều 0,72 g/kg TLCT/24 giờ<br /> (tương đương liều dự kiến lâm sàng).<br /> - Lô 5 (chiếu xạ + uống kaviran liều 2:<br /> 10 con): gây SGMD bằng chiếu xạ và<br /> uống kaviran liều 2,16 g/kg TLCT/24 giờ<br /> (gấp 3 lần liều 1).<br /> * Phương pháp chiếu xạ:<br /> Dùng nguồn chiếu Cobalt 60 tại Khoa<br /> Y học Hạt nhân, Bệnh viện Quân y 103.<br /> Đặt chuột nhắt trắng trong các hộp gỗ<br /> hình trụ đường kính 20 cm, chia 10 ngăn<br /> (10 chuột/lần chiếu) và chiếu xạ toàn thân<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016<br /> liều 1 Gy/lần vào 8 giờ sáng hàng ngày,<br /> trong 6 ngày liên tục, tổng liều 6 Gy.<br /> * Liều và cách cho uống:<br /> Chuột ở các lô 2, 3, 4, 5 uống nước<br /> muối sinh lý hoặc thuốc nghiên cứu trong<br /> 6 ngày chiếu xạ (1 giờ trước chiếu xạ) và<br /> trong 7 ngày tiếp theo. Thể tích mỗi lần<br /> uống 0,1 ml/10 g thể trọng.<br /> * Chỉ tiêu đánh giá:<br /> Ngày thứ 14, giết chuột, lấy máu làm<br /> xét nghiệm huyết học. Phẫu thuật lấy<br /> hạch, lách, tuyến ức và đầu xương đùi để<br /> làm giải phẫu bệnh lý. Các chỉ tiêu đánh<br /> giá: trọng lượng lách và tuyến ức tương<br /> đối (là khối lượng lách hoặc tuyến ức<br /> <br /> [mg] tương ứng với 1 g thể trọng chuột);<br /> số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu ở<br /> máu ngoại vi thực hiện theo phương pháp<br /> xét nghiệm thường quy; làm giải phẫu<br /> bệnh vi thể lách, ức, hạch và đầu xương<br /> đùi để quan sát về mô bệnh học.<br /> * Xử lý số liệu:<br /> Các dữ liệu được phân tích bằng phần<br /> mềm Microsoft excel 2007. Sự khác biệt<br /> giá trị trung bình giữa các mẫu sử dụng<br /> Duncan’s Multiple Range test bằng phần<br /> mềm SAS (α = 0,05), biểu diễn theo X ± SD,<br /> quy ước: giá trị trong cùng cột có cùng<br /> ký tự (biểu thị theo a, b, c, d) khác biệt<br /> không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Ảnh hưởng của kaviran lên trọng lượng lách và ức tương đối.<br /> Bảng 1: Ảnh hưởng của kaviran lên trọng lượng ức tương đối và trọng lượng lách<br /> tương đối chuột nhắt trắng.<br /> Lô nghiên cứu<br /> <br /> Trọng lượng ức<br /> tương đối (mg/g)<br /> <br /> Trọng lượng lách<br /> tương đối (mg/g)<br /> <br /> Lô 1: chứng sinh học<br /> <br /> 3,74 ± 0,621<br /> <br /> a<br /> <br /> 6,14 ± 0,908<br /> <br /> a<br /> <br /> Lô 2: chứng chiếu xạ<br /> <br /> 2,07 ± 0,443<br /> <br /> c<br /> <br /> 2,69 ± 0,495<br /> <br /> c<br /> <br /> Lô 3: chiếu xạ + levamisol<br /> <br /> 2,63 ± 0,554<br /> <br /> b<br /> <br /> 3,37 ± 0,647<br /> <br /> b<br /> <br /> Lô 4: chiếu xạ + kaviran, liều 0,72 g/kg<br /> <br /> 2,97 ± 0,661<br /> <br /> b<br /> <br /> 3,61 ± 0,820<br /> <br /> b<br /> <br /> Lô 5: chiếu xạ + kaviran, liều 2,16 g/kg<br /> <br /> 2,65 ± 0,540<br /> <br /> b<br /> <br /> 3,44 ± 0,791<br /> <br /> b<br /> <br /> Trọng lượng ức tương đối và lách tương đối ở các lô chuột chiếu xạ đều giảm rõ<br /> rệt so với lô chứng sinh học (p < 0,05). Ở lô chuột uống levamisol và kaviran (liều<br /> 0,72 và 2,16 g/kg) đều làm tăng rõ rệt trọng lượng ức tương đối và trọng lượng lách<br /> tương đối so với lô chứng chiếu xạ (p < 0,05). Trọng lượng ức tương đối và trọng<br /> lượng lách tương đối của chuột ở lô uống kaviran (cả hai mức liều) có xu hướng<br /> tăng so với lô chuột uống levamisol, nhưng chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).<br /> 119<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016<br /> 2. Ảnh hưởng của kaviran lên số lượng và công thức bạch cầu.<br /> Bảng 2: Ảnh hưởng của kaviran lên số lượng và công thức bạch cầu ở các lô chuột<br /> nghiên cứu.<br /> 9<br /> <br /> Lô chuột<br /> <br /> Số lượng bạch cầu tổng và các bạch cầu thành phần (10 /L)<br /> Bạch cầu<br /> <br /> Bạch cầu lympho<br /> 3,497 ± 0,628<br /> <br /> a<br /> <br /> 1,470 ± 0,263<br /> <br /> Bạch cầu đơn nhân<br /> <br /> Bạch cầu hạt<br /> <br /> Lô 1<br /> <br /> 4,107 ± 0,724<br /> <br /> a<br /> <br /> Lô 2<br /> <br /> 1,875 ± 0,354<br /> <br /> c<br /> <br /> Lô 3<br /> <br /> 2,538 ± 0,652<br /> <br /> bc<br /> <br /> 1,982 ± 0,495<br /> <br /> bc<br /> <br /> Lô 4<br /> <br /> 2,900 ± 1,068<br /> <br /> b<br /> <br /> 2,287 ± 0,917<br /> <br /> b<br /> <br /> 0,278 ± 0,083<br /> <br /> ab<br /> <br /> 0,196 ± 0,077<br /> <br /> b<br /> <br /> Lô 5<br /> <br /> 2,588 ± 0,579<br /> <br /> bc<br /> <br /> 2,113 ± 0,455<br /> <br /> b<br /> <br /> 0,275 ± 0,086<br /> <br /> ab<br /> <br /> 0,230 ± 0,050<br /> <br /> b<br /> <br /> Số lượng bạch cầu tổng ở máu ngoại<br /> vi của các lô chuột chiếu xạ giảm rõ rệt so<br /> với lô chứng sinh học (p < 0,05). Trong<br /> đó, lô 2 (chứng chiếu xạ) có số lượng<br /> bạch cầu giảm mạnh nhất. Lô 3 (chiếu xạ<br /> + uống levamisol), lô 4 (chiếu xạ + uống<br /> kaviran liều 0,72 g/kg) và lô 5 (chiếu xạ +<br /> uống kaviran liều 2,16 g/kg) có số lượng<br /> bạch cầu tương đương nhau và đều cao<br /> hơn so với lô chứng chiếu xạ (lô 2),<br /> nhưng chỉ có lô 4 tăng có ý nghĩa thống<br /> kê (p < 0,05). Bạch cầu lympho có xu<br /> hướng thay đổi giống như bạch cầu tổng.<br /> Nghĩa là, giảm rõ rệt ở lô chứng chiếu xạ<br /> (lô 2) và tăng lên ở các lô chiếu xạ dùng<br /> <br /> 0,249 ± 0,065<br /> <br /> b<br /> <br /> 0,365 ± 0,053<br /> <br /> a<br /> <br /> c<br /> <br /> 0,187 ± 0,054<br /> <br /> b<br /> <br /> 0,189 ± 0,078<br /> <br /> b<br /> <br /> 0,375 ± 0,170<br /> <br /> a<br /> <br /> 0,210 ± 0,073<br /> <br /> b<br /> <br /> thuốc đối chiếu (lô 3) hoặc thuốc nghiên<br /> cứu (lô 4 và 5), tuy nhiên chỉ có lô 4 và lô<br /> 5 tăng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).<br /> Số lượng bạch cầu hạt (GRAN) ở lô<br /> chứng chiếu xạ giảm rõ rệt so với lô<br /> chứng sinh học (p < 0,05) và tăng lên ở<br /> các lô chuột uống levamisol hoặc kaviran<br /> (liều 1 và 2), nhưng mức tăng so với lô 2<br /> không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).<br /> So với lô chứng sinh học (lô 1), số lượng<br /> bạch cầu đơn nhân (MID) giảm ở lô chứng<br /> chiếu xạ (lô 2), nhưng tăng lên ở các lô<br /> chiếu xạ dùng thuốc (lô 3, 4 và 5), tuy<br /> nhiên chỉ có lô 3 tăng có ý nghĩa thống kê<br /> khi so sánh với lô 1 và lô 2 (p < 0,05).<br /> <br /> 3. Ảnh hưởng của kaviran lên các cơ quan miễn dịch.<br /> * Mô bệnh học của lô 1 (chứng sinh học):<br /> <br /> Lách<br /> <br /> Tuyến ức<br /> <br /> Hạch<br /> <br /> Hình 1: Hình ảnh mô bệnh học của lô chứng sinh học.<br /> 120<br /> <br /> Tủy xương<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016<br /> - Lách: cấu trúc bình thường, vùng tuỷ<br /> trắng và tuỷ đỏ rõ. Tuỷ trắng có các nang<br /> lympho, trung tâm có động mạch bút lông,<br /> bao xung quanh là lưới tế bào võng. Tuỷ<br /> đỏ gồm thừng lách xen kẽ với các xoang<br /> tĩnh mạch được lót bởi lớp tế bào nội mô.<br /> Thừng lách có tế bào lympho, tế bào<br /> võng, mẫu tiểu cầu và tế bào máu khác.<br /> - Tuyến ức: các tiểu thuỳ tuyến ức<br /> gồm vùng vỏ và vùng tuỷ. Vùng vỏ gồm<br /> nhiều tế bào dạng lympho và tế bào võng<br /> nên sẫm màu. Vùng tuỷ sáng màu do mật<br /> độ tế bào dạng lympho ít hơn.<br /> <br /> - Hạch: to, rõ cấu trúc hạch gồm vùng<br /> vỏ và vùng tuỷ. Vùng vỏ có các nang lympho<br /> và xoang quanh nang. Nang lympho với<br /> tâm mầm sáng (trung tâm sinh sản).<br /> Vùng tuỷ các dây nang và hang bạch<br /> huyết với tế bào lympho, tương bào và<br /> đại thực bào.<br /> - Tủy xương: gồm xương và các hốc<br /> tuỷ, trong đó có nhiều dòng tế bào máu,<br /> tế bào dòng hồng cầu, bạch cầu hạt,<br /> dòng lympho bào, dòng monocyt, dòng<br /> tiểu cầu với nhiều mẫu tiểu cầu.<br /> <br /> * Mô bệnh học của lô 2 (chứng chiếu xạ):<br /> <br /> Lách<br /> <br /> Tuyến ức<br /> <br /> Hạch<br /> <br /> Tủy xương<br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh mô bệnh học của lô chứng chiếu xạ.<br /> - Lách: cấu trúc lách thay đổi, vùng tuỷ trắng với các nang lympho giảm mạnh,<br /> có chỗ chỉ thấy hình nang với đám nhỏ tế bào lympho quây xung quanh động mạch<br /> bút lông. Vùng tuỷ đỏ giãn rộng với các xoang mạch xung huyết giãn rộng, không thấy<br /> các mẫu tiểu cầu.<br /> - Tuyến ức: vẫn rõ vùng vỏ và vùng tủy, tuy nhiên vùng tủy giãn rộng, số lượng tế bào<br /> giảm, mạch máu xung huyết.<br /> - Hạch: nhỏ lại, cấu trúc hạch thay đổi, các nang lympho không còn rõ cấu trúc,<br /> số lượng tế bào trong nang giảm rõ, tế bào lympho trưởng thành ít, không có<br /> hình ảnh tăng sinh của tế bào lympho non, rải rác có một số tế bào có nhân lớn,<br /> nhiều múi.<br /> - Tủy xương: hình ảnh hốc tuỷ rộng, có nhiều hồng cầu, các dòng tế bào giảm<br /> nhiều: dòng bạch cầu hạt và ái toan, không thấy mẫu tiểu cầu, xuất hiện nhiều tế bào<br /> võng và tế bào mỡ.<br /> 121<br /> <br />