VI N HÀN LÂM KHOA H C VÀ CÔNG NGH VI T NAM
VI N CÔNG NGH SINH H C
LÊ TH TH Y
NGHIÊN C U T O KHÁNG NGUYÊN TÁI T H P
C A VIRUS GÂY B NH CÚM A/H7N9 B NG PH NG PHÁP ƯƠ
BI U HI N T M TH I TRONG CÂY THU C LÁ
(Nicotiana benthamiana) THÔNG QUA VI KHU N Agrobacterium tumefaciens
Chuyên ngành: Sinh lý th c v t
Mã s : 9 42 01 12
LU N ÁN TI N S SINH H C
Hà N i, 2019
Công trình đc hoàn thành t i ượ Vi n Công ngh sinh h c
Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam
Ng i h ng d n khoa h c: ườ ướ
1. PGS.TS Ph m Bích Ng c
2. PGS.TS Chu Hoàng Hà
Ph n bi n 1:
Ph n bi n 2:
Ph n bi n 3:
Lu n án đc b o v t i ượ H i đng ch m lu n án Ti n sĩ phiên chính th c h p t i: ế
Vi n Công ngh sinh h c
Vào h i gi ngày tháng năm 2019
Có th tìm hi u lu n án t i:
- Th vi n Qu c Gia Vi t Namư
- Trang web: http: luanvan.moet.gov.vn
- Vi n Công ngh sinh h c
M ĐU
1. Tính c p thi t c a đ tài ế
Cúm A/H7N9 là ch ng virus cúm gia c m m i đc phát hi n t i Trung Qu c vào năm ượ
2013. Virus cúm A/H7N9 gây ra là b nh truy n nhi m c p tính có t c đ lây lan nhanh v i t l
gây ch t cao trong đàn gia c m b b nh. Virus cúm A/H7N9 là m t phân type trong nhóm virusế
cúm A thu c h Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên
b m t capsid c a h t virus mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ng mi n d ch.
Kháng nguyên HA có 16 type (ký hi u t H1 đn H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hi u ế
t N1 đn N9). Kháng nguyên HA đc mã hóa b i phân đo n 4 c a h gen virus cúm A, có ế ượ
đc tính k t h p v i th th đc hi u trên b m t màng c a t bào nhi m. HA có kh năng đt ế ế
bi n trong gen t o nên s khác bi t làm thay đi tính kháng nguyên, đc bi t là đi m c t c aế
enzym protease v trí có s glycosyl hóa đã đc xác đnh bao g m Asn30, Asn46, Asn249 trên ượ
ti u ph n HA 1 và Asn421, Asn493 trên ti u ph n HA 2. C 5 v trí này đu có tính b o th cao
trên kháng nguyên H7 c a các ch ng virus H7N9 gây b nh trên ng i và gia c m ườ chu i n i gi a
HA1 và HA), ho c tái t h p bi n ch ng làm thay đi kháng nguyên b m t d n đn s thay ế ế
đi t ng quan đáp ng mi n d ch. Kháng nguyên NA do phân đo n 6 mã hóa, đây là m t ươ
protein b m t làm nhi m v enzym phân gi i th th t bào và c t liên k t glycosid c a phân ế ế
t acid sialic (N-acetylneuramic acid) gi i phóng virus trong quá trình lây nhi m. Kháng nguyên
NA do phân đo n 6 mã hóa, đây là m t protein b m t làm nhi m v enzym phân gi i th th
t bào và c t liên k t glycosid c a phân t acid sialic (N-acetylneuramic acid) gi i phóng virusế ế
trong quá trình lây nhi m.
Trong đt d ch cúm đu tiên t ngày 31/03/2013 có ba tr ng h p nhi m virus cúm gia ườ
c m A/H7N9 trên ng i đc phát hi n và công b t i Th ng H i và An Huy, Trung Qu c. ườ ượ ượ
Ch trong m t th i gian ng n, tính đn ngày 09/06/2013 lo i virus nguy hi m này đã lây lan ra ế
11 t nh thành c a Trung Qu c, gây ra 131 tr ng h p nhi m b nh, đa ph n b suy hô h p ườ
n ng, trong đó 39 ng i đã t vong (WHO, 2013). Trong đt d ch cúm A/ ườ H7N9 th 5 trên
ng i t i Trung Qu c ườ di n ra t 19/1/2017 đn 14/ ế 2/2017 đã khi n 36 ng i ch t trên t ng sế ườ ế
304 ng i m c b nh ườ (WHO, 2017). T ch c Y t Th gi i (WHO) nh n đnh đây là m t t l ế ế
cao b t th ng cho m t s lây nhi m m i và xác đnh H7N9 là ch ng virus r t nguy hi m đi ườ
v i con ng i. ườ
Các nghiên c u v h gen, xác đnh các vùng bi n đi c a virus cúm A/H7N9 đã cho th y virus ế
A/H7N9 t ra thích ng nhanh h n và có đc l c cao h n v i t bào c a loài có vú (ng i, heo, ...) so ơ ơ ế ườ
v i các ch ng virus cúm gia c m khác. Cho đn nay ch a có b ng ch ng nào v vi c virus cúm ế ư
A/H7N9 lây truy n t ng i sang ng i - y u t c b n đ A/H7N9 có th bi n chuy n thành m t ườ ườ ế ơ ế
đi d ch cúm. Tuy nhiên, vì s lan truy n gi a ng i và ng i đã t ng x y ra v i virus H7 (d ch ườ ườ
H7N7 Hà Lan năm 2003) nên cũng c n ph i c nh giác v kh năng lây truy n ng i-ng i c a ườ ườ
virus H7N9 hi n nay.
Vi t Nam ch a ghi nh n tr ng h p cúm A/H7N9 trên ng i cũng nh trên gia c m; ư ườ ườ ư
tuy nhiên, nguy c xâm nh p, lan truy n và gây bùng phát d ch r t cao do Vi t Nam có đngơ ườ
biên gi i tr i dài v i Trung Qu c. V n đ c p bách hi n nay ngoài vi c tri n khai các bi n
pháp phòng b nh ch đng nh s dung trang thiêt bi cho viêc giám sát nh máy đo thân nhiêt ư ư) * * * ư *
t xa, các hê thông xét nghiêm xác đinh virus… c n thi t nghiên c u ch đng s n xu t vacxin ư * * * ế
phòng b nh.
Trong nh ng năm g n đây m t h ng m i đã đc ng d ng đ phát tri n cac loai vacxin ướ ượ *
cúm khac nhau, trong đó có h ng nghiên c u t o vacxin th c v t. H th ng bi u hi n th c v tướ
r t h u d ng vì vacxin đc t o ra h a h n s có giá thành th p h n t 10-20 l n so v i ph ng ượ ơ ươ
pháp truy n th ng. Tuy nhiên, protein tái t h p đc tích lu trong cây tr ng chuy n gen l i không ượ
cao và thi u m t ph ng th c tinh s ch protein tái t h p hi u qu . Đ kh c ph c nh c đi mế ươ ượ
1
này, hi n nay h th ng bi u hi n t m th i là ph ng pháp h u ích đ s n xu t kháng nguyên tái t ươ
h p th c v t. Ph ng pháp này có u đi m nhanh, hàm l ng protein tái t h p cao, không b nh ươ ư ượ
h ng b i v trí g n gen đích trong t bào th c v t và có th ti n hành bi u hi n trong các mô đã bi tưở ế ế
hóa hoàn toàn nh lá.ư
Nh n th y vi c nghiên c u bi u hi n các kháng nguyên c a virus cúm A/H7N9 trong t bào ế
th c v t là r t c p thi t. H n n a mô hình s n xu t kháng nguyên tái t h p b ng ph ng pháp ế ơ ươ
bi u hi n t m th i th c v t có th s n xu t vacxin v i s l ng l n và nhanh chóng (1-2 tháng) ượ
đáp ng k p th i khi d ch b nh x y ra. Vi c k t h p kháng nguyên tái t h p v i v t li u nano ế
(ND) nh m s n xu t vacxin d ng nh virus nh m tăng c ng ho t tính kháng nguyên. ư ườ V i c s ơ
khoa h c và ng d ng nh trên, chúng tôi đã l a ch n đ tài “ Nghiên c u t o kháng nguyên tái t ư
h p c a virus gây b nh cúm A/H7N9 b ng ph ng pháp bi u hi n t m th i trong cây thu c lá ươ
(Nicotiana benthamiana.) thông qua vi khu n Agrobacterium”.
2. M c tiêu nghiên c u
Bi u hi n và xác đnh đc đc đi m c u trúc c a kháng nguyên HA trimeric và ph c h ượ
kháng nguyên HA trimeric:ND
Đánh giá đc ho t tính sinh h c, kh năng kích thích đáp ng mi n d ch trên đng v tượ
thí nghi m c a kháng nguyên tái t h p HA trimeric và ph c h HA trimeric:ND
3. N i dung nghiên c u
(1):Thu th p thông tin, t ng h p gen mã hóa kháng nguyên và thi t k vector bi u hi nế ế
mang gen mã hóa kháng nguyên HA; (2) :Nghiên c u bi u hi n và tinh s ch kháng nguyên HA
c a virus H7N9 thu c lá ;(3): Nghiên c u t o ph c h và kh năng gây ng ng k t h ng c uư ế
c a kháng nguyên HA và HA trimeric:ND (1:12); (4): Nghiên c u kh năng kích thích đáp ng
mi n d ch c a kháng nguyên HA và ph c h kháng nguyên HA trimeric:ND trên đng v t thí
nghi m.
4. Đóng góp m i c a lu n án
-Đã thi t k thành công 4 c u trúc vector bi u hi n pCB301/HA mono_ELP pCB301/HAế ế
trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc mang gen HA đc t ng h pượ
nhân t o t gen HA c a ch ng virus cúm H7N9 và t o ch ng Agrobacterium mang vector t ngươ
ng.
- Bi u hi n và tinh s ch thành công protein HA tái t h p pCB301/HA mono_ELP,
pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc trong cây
thu c lá b ng ph ng pháp mITC và IMAC. ươ
- Đã xác đnh đc c u trúc trimeric c a kháng nguyên HA và kh năng gây ng ng k t ượ ư ế
h ng c u c a protein HA v i hi u giá ng ng k t c a HA trimeric_ELP và HA trimeric b ng 2 ư ế
HAU, HA trimeric:ND (1:12) b ng 1024 HAU v i l ng 5 μg t i gi ng đu tiên. ượ ế
- Các kháng nguyên HA d ng HA trimeric và HAtrimeric:ND (1:12) đu gây đáp ng mi n
d ch chu t trong đó HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ng mi n d ch m nh h n HA trimeric. ơ
5. Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a lu n án
5.1. Ý nghĩa khoa h c
Lu n án cung c p c s khoa h c quan tr ng trong vi c thi t k các c u trúc vector chuy n ơ ế ế
gen mang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc mã hóa cho các
kháng nguyên HA tái t h p; bi u hi n kháng nguyên tái t h p trên cây thu c lá b ng ph ng pháp ươ
bi u hi n t m th i ; tách chi t, tinh s ch và đánh giá kh năng kích thích đáp ng mi n d ch d ch thế
c a các kháng nguyên tái t h p này trên đng v t thí nghi m. K t qu đ tài lu n án là b ng ế
ch ng khoa h c v ti m năng c a vi c s n xu t, phát tri n vacxin ti u đn v phòng virus cúm ơ
trong th c v t.
5.2. Ý nghĩa th c ti n
2