ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
VƯƠNG BẢO THY
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME TIÊU HÓA
TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA
(PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)
Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã số: 62540201
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT
Tp. Hồ Chí Minh, 2014
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa
– ĐHQG-HCM
Người hướng dẫn khoa học 1: TS. TRẦN BÍCH LAM
Người hướng dẫn khoa học 2: GS.TSKH.VS. LƯU DUẨN
Phản biện độc lập 1: GS. TS. ĐẶNG THỊ THU
Phản biện độc lập 2: PGS. TS. TRANG SỸ TRUNG
Phản biện 1: GS. TS. TRẦN THỊ LUYẾN
Phản biện 2: PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
Phản biện 3: PGS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại
………………………………………………………………..
………………………………………………………………..
Vào lúc giờ ngày tháng năm 2014
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM
- Thư viện Trường Đại học Bách Khoa –ĐHQG-HCM
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ [1]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Preparation, purification and properties of lipase from hepatopancreas of Tra (Pangasius hypophthalmus) catfish”, Tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, tập 14, K3, trang 5-11, 2011
[2]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Properties of digestive enzymes from visceral organs of Tra (Pangasius hypophthalmus) catfish”, Tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, tập 14, K4, trang 34-43, 2011
[3]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Purification and characterization of proteases from hepatopancreas of Tra (Pangasius hypophthalmus) catfish”, Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ, Bộ Khoa Học và Công Nghệ, tập 49, 5A, trang 290-297, 2011
[4]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Thông số động học và tính chất của protease tinh sạch từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus)”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, kỳ 1 tháng 12/2013, trang 60-63, 2013 [5]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Tính chất động học và đặc điểm thủy phân của lipase tinh sạch từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus)”, Tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, tập 16, K4, trang 85-91, 2013
[6]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Nghiên cứu tách lấy pancreatin từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus)”, Tạp chí Phân tích Hóa Lý và Sinh học, Hội Khoa học Kỹ thuật Phân tích Hoá lý và Sinh học VN, tập 18 (4), trang 178-186, 2013
[7]. Vương Bảo Thy, Phan Trung Thành, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Nghiên cứu thu nhận enzym lipase từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus) bằng phương pháp lọc màng membrane”, Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ, Bộ Khoa Học và Công Nghệ, tập 51 (5C), trang 21-25, 2013
[8]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme từ gan và tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus) bằng phương pháp kết tủa”, Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ, Bộ Khoa Học và Công Nghệ, tập 52 (5C), trang , 2014
1
MỞ ĐẦU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Nghiên cứu enzyme tiêu hóa của các loài cá được đặc biệt quan tâm
trong vài thập kỷ vừa qua. Do cá sống trong môi trường nhiệt độ thấp nên
để duy trì sự sống, chúng cần phải có hệ enzyme tương đối mạnh.
Trong các enzyme nội tạng cá, lipase ngày càng được quan tâm do có
khả năng ứng dụng cao trong y học và công nghệ thực phẩm. Một số lipase
từ nội tạng cá đã được thế giới nghiên cứu như lipase cá mập, cá mòi, cá hồi,
cá tráp, cá ngừ vây xanh, cá đối, cá rô, Riêng lipase cá tra (Pangasius
hypophthalmus), hiện nay chưa có nghiên cứu nào được công bố. Trong khi
đó, về lý thuyết, ở cá tra có mô mỡ rất phát triển so với các loại cá da trơn
khác, như vậy ở loài cá này enzyme lipase phải đóng vai trò quan trọng
trong quá trình trao đổi chất. Vì vậy việc thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu
tính chất của lipase gan tụy cá tra có giá trị khoa học và cần đặc biệt quan
tâm. So với lipase thì protease nội tạng cá đã được nghiên cứu ở nhiều loài
như protease cá mòi, cá hồi trứng, cá hồi bạc, cá trồng, cá thu. Tuy nhiên,
về cá da trơn ở Việt Nam cho đến nay ngoài một số khảo sát chung về
protease nội tạng chưa có công bố nào phân tích riêng tính chất protease gan
tụy cá tra.
Theo dự báo của VASEP (Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản
Việt Nam) đến năm 2015 sản lượng cá tra nguyên liệu khoảng 1,8 triệu tấn
thì riêng phần nội tạng ước tính khoảng 100.000 tấn, đây là nguồn nguyên
liệu dồi dào, nhiều tiềm năng để thu nhận các chế phẩm enzyme tiêu hóa
ứng dụng trong y học, công nghệ thực phẩm.
Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra
(Pangasius hypophthalmus)” nhằm góp phần giải quyết các vấn đề trên.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định đặc tính phân bố, phân lập và xác định tính chất của các
enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus).
2 Xác định phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ nguồn
nội tạng cá tra sẵn có để đưa vào ứng dụng.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là các enzyme tiêu hóa có trong cơ
quan nội tạng của cá tra (Pangasius hypophthalmus) nhưng chủ yếu tập
trung vào enzyme lipase và protease.
Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu của luận án là nghiên cứu đặc điểm phân bố của
các enzyme protease, lipase và amylase trong các cơ quan nội tạng; thu
nhận, tinh sạch và xác định tính chất của lipase và protease từ nội tạng của cá tra (Pangasius hypophthalmus).
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu để thực hiện luận án là phương pháp nghiên
cứu thực nghiệm khoa học kết hợp với phương pháp phân tích lý thuyết và
tổng hợp tài liệu.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong các cơ quan nội tạng cá tra
2. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra
3. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra
4. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra
5. Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme tiêu hóa
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
Ý nghĩa khoa học
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống,
phân tích chuyên sâu về hệ enzyme protease, lipase từ gan tụy cá tra
(Pangasius hypophthalmus), đóng góp những dẫn liệu khoa học quan trọng
về hệ enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra.
3 Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease và lipase
từ gan tụy cá tra; đưa ra điều kiện trích ly và phương pháp thu nhận chế
phẩm enzyme gan tụy cá tra bằng phương pháp kết tủa và phương pháp lọc
màng; đề xuất phương pháp tinh sạch protease và lipase từ gan tụy cá tra.
Ý nghĩa thực tiễn
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu thu nhận, tinh sạch các
enzyme tiêu hóa từ nguồn phế liệu nội tạng của ngành chế biến cá tra
(Pangasius hypophthalmus), góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các
chế phẩm enzyme nói chung và protease, lipase nói riêng. Chế phẩm
enzyme từ nội tạng cá tra có thể ứng dụng có hiệu quả cao trong sản xuất
pepton, hỗ trợ tiêu hóa. Kết quả nghiên cứu là giải pháp thiết thực từ thực tế
sản xuất của ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm có giá trị gia tăng từ nguồn
phế liệu cá, góp phần phát triển bền vững công nghiệp cá tra của Việt Nam.
BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 120 trang bao gồm: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng
quan 28 trang; Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 14
trang; Chương 3: Kết quả và bàn luận 73 trang; Kết luận và kiến nghị 2
trang, 150 tài liệu tham khảo. Trong luận án có 24 bảng, 62 hình và đồ thị.
CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN
1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá Hiện nay, các nghiên cứu về hệ tiêu hóa của các loài cá nói chung và cá da trơn nói riêng chủ yếu tập trung vào việc khảo sát thói quen về ăn uống
của chúng. Ngoại trừ enzym pepsin từ dạ dày cá đã được nhiều tác giả trên
thế giới nghiên cứu thu nhận, tinh sạch, xác định tính chất và đưa vào ứng
dụng, các hiểu biết về hệ enzyme tiêu hóa từ tụy tạng cá vẫn còn khá hạn
chế. Nghiên cứu về protease tụy tạng cá cho thấy đây là các protease kiềm,
có hai loại protease là trypsin và chymotrypsin. Trypsin và các enzyme
giống trypsin có hoạt độ protease đã được tinh sạch và định tính ở một số
4 loài cá như: cá mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết đảo băng, cá tuyết Đại Tây
Dương, cá hồi trứng, cá hồi Đại Tây Dương, cá hồi bạc, cá trồng. Ngoài
trypsin và chymotrypsin, các nghiên cứu cũng đặc biệt quan tâm đến
protease kiềm từ nội tạng cá. Nghiên cứu về các enzyme protease trong hệ
tiêu hoá của các loài cá khác nhau đã cho thấy rằng các serine protease từ
cá cũng tương tự với các enzyme này ở động vật máu nóng về kích thước
phân tử, thành phần acid amin và sự nhạy cảm với các chất có tác động ức
chế các serine protease.
Một số lipase từ nội tạng cá khác đã được nghiên cứu như lipase cá mập,
cá tuyết, cá tráp, cá đối, cá rô. Jonh S. Patton tìm thấy hai loại lipase gan tuỵ
ở dạng hoạt hoá ở cá mập, một loại lipase được hoạt hoá bởi muối mật có thể
đặc hiệu cho các acid béo không bão hoà bất kể vị trí cũng như tính đặc hiệu
nhóm cho các ester. Lie và Lambertsen cho thấy các enzyme lipase thu được
từ cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) thuỷ phân chủ yếu các PUFA và
cho thấy chúng có tính đặc hiệu acid béo hoàn toàn đối lập với các enzyme
lipase vi sinh vật. Alberta N.A. Aryee đã thu nhận phân đoạn lipase từ nội
tạng cá đối (Mugil cephalus). Poonsuk Prasertsan đã khảo sát hoạt độ của
lipase trên đối tương nghiên cứu là nội tạng của 3 loại cá ngừ.
Nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng từ nội tạng cá tra
Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có giá trị kinh tế cao ở Việt
Nam. Riêng phần nội tạng, là phế liệu của ngành chế biến cá tra, ước tính
khoảng 100.000 tấn/ năm. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào, nhiều tiềm
năng để thu nhận các enzyme tiêu hóa như lipase, protease ứng dụng trong y
học, công nghệ thực phẩm. Việc thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra
được đánh giá là mang tính khả thi cao do có những điểm mạnh như: (1) nội
tạng cá tra là nguồn nguyên liệu giàu enzyme; (2) trữ lượng nguồn nguyên
liệu này ở nước ta rất lớn; (3) có cơ sở lý thuyết về enzyme tiêu hóa, có thể
ứng dụng các kỹ thuật hiện đại trong nghiên cứu và thu nhận enzyme từ nội
tạng cá tra; (4) giá trị sản phẩm cao; (5) dự đoán nhu cầu sử dụng enzyme
5 tiêu hóa tăng cao trong tương lai; (6) khác với tụy tạng lợn, bò hay gia cầm,
sử dụng chế phẩm enzyme từ cá không gặp cản trở về tôn giáo hay dịch bệnh.
1.2. Phƣơng pháp thu nhận và tinh sạch enzyme từ nội tạng cá
Cho đến nay các chế phẩm enzyme tiêu hóa chủ yếu được thu nhận và
tinh sạch theo phương pháp truyền thống qua các công đoạn trích ly, kết tủa
và tinh sạch. Nhưng xu hướng mới để thu nhận enzyme công nghiệp hiện
nay là phương pháp lọc màng (membrane). Ưu điểm của phương pháp lọc
màng là ít gây ô nhiễm môi trường hơn phương pháp kết tủa truyền thống
vì không sử dụng hóa chất là muối trung tính hay dung môi hữu cơ như
aceton, ethanol, hoặc isopropanol (thể tích gấp 3 - 4 lần thể tích dịch
enzyme) để kết tủa enzyme. Nhược điểm của phương pháp lọc màng là
kích thước phân tử phân riêng giao động trong khoảng lớn, do đó phương
pháp lọc màng không tách riêng hoàn toàn được các protein. Kỹ thuật lọc
màng vì vậy được ứng dụng hiệu quả trong công nghiệp thu nhận chế phẩm
thô, nhưng kém hiệu quả trong việc thu nhận chế phẩm tinh khiết.
1.3. Ứng dụng của các enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá Các enzyme tiêu hóa thu nhận từ nội tạng cá được nghiên cứu ứng dụng trong xử lý thịt, trích ly dầu cá từ nguyên liệu thô, sản xuất acid béo ω-3
dạng concentrate, dùng làm enzyme chống oxy hóa, tách loại da cá, tinh sạch
trứng cá, tách bỏ vỏ của động vật có vỏ, sản xuất nước chấm từ cá, sản xuất
thức ăn gia súc từ cá, sản xuất protein thủy phân từ cá, tận thu các hợp chất
màu từ phế phẩm của động vật có vỏ, khử mùi ôi do oxy hoá ở sữa.
CHÖÔNG 2 ĐỐI TƢỢNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) do công ty chế biến thủy
sản ở Vĩnh Long cung cấp. Ngay sau khi giết mổ, nội tạng được bảo quản ở -200C để hạn chế sự biến tính enzyme. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp xác định đặc điểm phân bố các enzyme trong nội tạng
6 Nguyên liệu nội tạng được chia thành 3 loại sau: (1) gan tụy, (2) ruột,
(3) nội tạng hỗn hợp. pH trích ly từ 6-11. Các enzyme khảo sát: lipase,
protease và amylase. Mục tiêu: chọn thành phần nội tạng, pH trích ly tối ưu
để hoạt độ protease, lipase, amylase tính trong 1g chất khô nguyên liệu cao
nhất.
Phương pháp trích ly enzyme từ nội tạng cá tra
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự hòa tan enzyme: (1) tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/1 – 1/5; (2) nhiệt độ từ 5 - 450C; (3) thời gian từ 0,5 – 2,5 giờ. Hàm mục tiêu: hoạt độ, hoạt độ riêng protease, lipase/g chất khô
nguyên liệu cao nhất.
Phương pháp lọc màng trong thu nhận protein enzyme
Trong dịch trích ly enzyme thô, ngoài enzyme còn có các chất hòa tan,
protein tạp, các hạt lipid…Để thu nhận enzyme, chúng tôi sử dụng kết hợp
02 kỹ thuật lọc màng là: (I) vi lọc (MF) với màng 1 và 0,1 μm và (II) siêu lọc (UF). Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc UF: (1) nồng độ chất tan trong dòng nhập liệu với tỷ lệ pha loãng dịch enzyme từ 1/1 -1/3;
(2) áp suất lọc từ 4 -8 psi; (3) thời gian lọc từ 90 -150 phút. Hàm mục tiêu:
hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch củ
sau lọc UF đạt giá trị cao nhất.
Phương pháp kết tủa trong thu nhận protein enzyme
Từ dịch trích ly enzyme thô, sử dụng tác nhân dung môi hữu cơ (aceton,
ethanol, isopropanol) hoặc muối amoni sulfate bổ sung vào dịch enzyme để
kết tủa protein. Ứng với mỗi tác nhân kết tủa, khảo sát (1) các tỷ lệ dung môi
và dịch trích enzyme từ 1/1 – 5/1 (v/v) hoặc (2) nồng độ bão hòa muối amoni
sulfate từ 40 – 80% bổ sung vào dịch enzyme. Hàm mục tiêu: chọn tác nhân
cho hiệu suất thu hồi cao để thu nhận chế phẩm enzyme; chọn tác nhân cho độ
tinh sạch cao để tiếp tục tách riêng các enzyme tinh sạch.
Phương pháp tinh sạch enzyme
Chế phẩm enzyme thô gồm hỗn hợp nhiều enzyme, thông thường phải
7 kết hợp 2-3 phương pháp tinh sạch mới tách riêng được các enzyme. Sử
dụng kết hợp các phương pháp như: (1) Thẩm tích để loại muối và các chất
có phân tử lượng nhỏ; (2) Sắc ký trao đổi ion; (3) Sắc ký lọc gel Sephadex.
Trong nghiên cứu này, enzyme được chọn tinh sạch bằng thẩm tích; sắc ký
trao đổi ion DEAE-cellulose; sắc ký lọc gel Sephadex G-75/ G-100. Mục
tiêu: thu nhận protease/ lipase tinh sạch từ hỗn hợp enzym ban đầu.
Phương pháp xác định tính chất các enzyme tinh sạch
Các enzyme tinh sạch được xác định thành phần cấu tạo, phân tử
lượng; xác định các thông số động học như pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, độ
bền pH, độ bền nhiệt theo thời gian, các chất làm tăng hoặc làm giảm hoạt
độ enzyme; xác định giá trị Km và Vmax.
Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme
Chế phẩm enzyme được ứng dụng trong sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa.
2.3 Công thức tính toán
Hoạt độ riêng là số đơn vị hoạt độ enzyme được tính trên 1mg protein
của chế phẩm. Hoạt độ tương đối là tỷ lệ phần trăm giữa hoạt độ enzyme
còn lại và hoạt độ enzyme ban đầu. Hiệu suất thu hồi là tỷ lệ giữa tổng hoạt
độ enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và tổng hoạt độ enzyme trong
mẫu trước khi đem tinh sạch. Độ tinh sạch được tính theo tỷ lệ giữa hoạt độ
riêng của enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và hoạt độ riêng của mẫu
enzyme trước khi đem tinh sạch.
Sử dụng phần mềm Stargaphic Plus 4.0 để xử lý thống kê.
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra
3.1.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phần trong nội tạng cá tra
Nội tạng cá tra theo kết quả nghiên cứu, chiếm tỷ lệ khối lượng 5,83%,
cao hơn so với cá ngừ (5,44%) nhưng thấp hơn so với cá thu (8%) ở các
nghiên cứu khác, nội tạng các loại cá này là phế liệu ngành chế biến thủy
sản và cũng đang được nghiên cứu tận thu enzyme.
8 3.1.2 Sự phân bố lipase, protease và amylase trong các cơ quan nội tạng
Hoạt độ của các enzyme tiêu hóa phụ thuộc vào bản chất của nguyên
liệu nội tạng, do mỗi enzyme tập trung ở một số cơ quan nhất định. pH
trích ly thì ảnh hưởng lên sự hòa tan của enzyme. Trong nghiên cứu này đã
khảo sát ảnh hưởng của loại nguyên liệu nội tạng (nội tạng hỗn hợp, gan
tụy, ruột) và pH dung môi (6-11) đến hoạt độ của các enzyme lipase,
protease, amylase. Kết quả tổng hợp thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1: Hoạt độ lipase, protease và amylase tại pH trích ly tối ưu
pH Lipase Thành phần trích ly Hoạt độ riêng Hoạt độ tối ưu
8 Nội tạng
8 Gan tụy
8 Ruột (U/mg pr) 13,44b 18,44a 12,02b (U/g ck) 491,33b 674,02a 364,61c
Protease
Hoạt độ riêng Hoạt độ
8 Nội tạng
8 Gan tụy
10 Ruột (U/mg pr) 0,80b 2,30a 0,37c (U/g ck) 29,43b 84,28a 9,86c
Amylase
Hoạt độ riêng Hoạt độ
8 Nội tạng
8 Gan tụy
8 Ruột (U/mg pr) 6,89b 11,47a 5,03c (U/g ck) 252,25b 419,69a 152,62c
Các chữ số khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê ở mức p < 0,05; ck: chất khô nguyên liệu
9
Theo kết quả bảng 1, tại giá trị pH trích ly tối ưu, cho thấy trong các
thành phần nội tạng, mẫu gan tụy có hoạt độ enzyme lipase, protease và
amylase cao hơn mẫu nội tạng hỗn hợp và mẫu ruột, khác biệt có ý nghĩa
về mặt thống kê ở mức p < 0,05, có thể do tụy tạng là cơ quan chính sản
sinh các enzyme tiêu hóa. Hoạt độ riêng của các enzyme tiêu hóa từ gan tụy
cá tra là khá cao khi so sánh với các loài cá khác.
Trong nghiên cứu này chúng tôi quan tâm chủ yếu đến hai loại enzyme
chính là lipase và protease. Từ kết quả thí nghiệm này chọn nguyên liệu là
gan tụy, pH trích ly là pH8 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2 Khảo sát quá trình trích ly enzyme
Kết quả nghiên cứu đã xác định điều kiện tốt nhất để trích ly enzyme
protease và lipase từ gan tụy cá tra như sau: với dung môi là đệm Tris-HCl
(0,05N) pH 8, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly là 1/2, nhiệt độ trích ly 50C, thời gian trích ly là 1 giờ. 3.3 Khảo sát quá trình thu nhận enzyme bằng công nghệ lọc màng
Kết quả khảo sát cho thấy công nghệ lọc màng chỉ đạt hiệu quả cao
trong thu nhận lipase và không hiệu quả đối với protease. Nên từ dịch trích
enzyme, tiến hành các bước sau: (1) lọc thô; (2) ly tâm; (3) lọc MF với 2
màng kích thước lần lượt 1 và 0,1 µm; (4) lọc UF, phân đoạn 10 KDa, vật
liệu màng polysunfone, mô hình lọc cross-flow. Đánh giá hiệu suất thu hồi
và độ tinh sạch lipase trong dòng retentate sau lọc UF.
Nồng độ
Hoạt độ
Hoạt độ
Tổng hoạt
Hiệu suất
Độ tinh
Giai
protein
lipase
riêng lipase
độ lipase
thu hồi
sạch
đoạn
xử lý
(mg pr/ml)
(U/ml)
(U/mg pr)
(U)
(%)
(lần)
Pha
Bảng 2: Kết quả thu lipase sau quá trình lọc MF
loãng
1 µm
1,09a - 20,76b 43424 100 1
0,1 µm
39056 89,94 1,05
1,06a 0,79b 23,11a 20,15b 21,83b 25,47a 31636 72,85 1,23
10
Từ kết quả bảng 2 cho thấy độ tinh sạch lipase tăng sau khi lọc MF qua
2 màng kích thước 1 và 0,1 µm chứng tỏ quá trình lọc MF hiệu quả.
3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu
hồi và độ tinh sạch lipase sau lọc UF
Hoạt độ
Tỷ lệ
Tổng hoạt độ lipase (U)
Bảng 3: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo tỷ lệ pha loãng
1:2 7040
Nồng độ protein (mg pr/ml) 0,90a 0,73b 0,52c
1:3 7516
Hoạt độ lipase (U/ml) 32,59a 24,89b 14,52c
riêng lipase (U/mg pr) 36,19a 34,07a 27,94b
Hiệu suất thu hồi (%) 87,34ab 93,26a 63,95c
Độ tinh sạch (lần) 1,42b 1,57a 1,19c
1:4 5159
Kết quả bảng 3 chọn tỷ lệ pha loãng 1/3 cho nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu suất thu hồi và
Tổng hoạt độ lipase (U)
độ tinh sạch lipase sau lọc UF
6364 4
7216 6
Nồng độ protein (mg pr/ml) 0,37b 0,41ab 0,44a
Hiệu suất thu hồi (%) 78,97b 89,52a 73,36b
riêng lipase (U/mg pr) 48,44ab 51,31a 43,70b
Hoạt độ lipase (U/ml) 17,78b 21,04a 19,26ab
Bảng 4: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo áp suất vận hành Độ tinh Hoạt độ Áp sạch suất (lần) (psi) 1,90ab 2,01a 1,72bc 5913 8
Kết quả bảng 4 chọn áp suất 6 psi cho nghiên cứu tiếp theo.
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lọc đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase sau lọc UF
Thời gian (phút)
Tổng hoạt độ lipase (U)
Bảng 5: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo thời gian lọc Hoạt độ
90 6888
120 7466
Nồng độ protein (mg pr/ml) 0,40bc 0,42ab 0,45a
Hoạt độ lipase (U/ml) 18,67bc 22,22a 20,15b
riêng lipase (U/mg pr) 46,86c 52,70a 44,55bc
Hiệu suất thu hồi (%) 85,46ab 92,64a 78,24b
Độ tinh sạch (lần) 1,84b 2,07a 1,75b
150 6306
11
Kết quả bảng 5 chọn thời gian lọc 120 phút.
Hiệu quả của quá trình lọc UF trong tinh sạch lipase thể hiện ở bảng 6.
Công
Nồng độ
Hoạt độ
Hoạt độ
Tổng
Hiệu suất
Độ tinh
đoạn
protein
lipase
riêng lipase
hoạt độ
thu hồi
sạch
(mg pr/ml)
lipase (U)
(%)
(lần)
Bảng 6: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của lipase sau lọc UF
Xử lý 0,1 µm 0,79a 0,42b UF
(U/ml) 20,15b 22,22a
(U/mg pr) 25,47b 52,70a
8060 100 1
7466 92,6 2,07
Trên mỗi bảng 2, 3, 4, 5, 6, các chữ số khác nhau trong cùng một cột thể
hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05
Kết quả chọn thông số quá trình lọc UF phân đoạn 10 KDa là tỷ lệ pha
loãng dịch enzyme/nước cất 1/3, áp suất lọc 6psi, thời gian lọc 120 phút.
Bên cạnh những thế mạnh phương pháp lọc màng vẫn còn những thiếu
sót như: (1) do pha loãng dịch enzyme gây bất lợi cho qua trình tạo chế
phẩm; (2) phương pháp chỉ có hiệu quả cao đối với quá trình tinh sạch
enzyme lipase. Trong khi protease trong dịch enzyme cũng rất đáng được
quan tâm. Do đó, ở nội dung thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu
tinh sạch cả protease và lipase theo phương pháp kết tủa truyền thống.
3.4 Khảo sát quá trình kết tủa enzyme
Khảo sát quá trình kết tủa với 4 loại tác nhân là: amoni sulfate, ethanol,
aceton và isopropanol với các nồng độ và tỷ lệ khác nhau bổ sung vào dịch
enzyme. Đánh giá hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme đối với mỗi tác nhân kết tủa. Kết quả nghiên cứu cho thấy với tác nhân kết tủa là amoni sunfate, chọn nồng độ muối amoni sulfate bão hòa 60% cho hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch protease, lipase cao nhất. Với tác nhân kết tủa là ethanol, chọn tỷ
lệ ethanol/ dịch trích ly là 3/1 (v/v). Với tác nhân kết tủa là aceton, chọn tỷ
lệ aceton/dịch trích ly là 4/1. Với tác nhân kết tủa là isopropanol, chọn tỷ lệ
isopropanol/dịch trích ly là 4/1 cho hiệu quả kết tủa tốt nhất.
12
a
ab
bc
b
So sánh kết quả của các phương pháp kết tủa
a
cd
b
d
bc
c
Hình 1: So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch protease của các tác nhân kết tủa
a
ab
b
bc
a
bc
b
cd
c
d
Hình 2: So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase của các tác nhân kết tủa Trên các hình 1,2, các chữ số khác nhau trong cùng một hệ trục thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05
13
Từ kết quả hình 1-2 chọn phương pháp kết tủa bằng ethanol cho hiệu
suất thu hồi cao để sản xuất chế phẩm enzyme; chọn phương pháp kết tủa
bằng amoni sunfate cho độ tinh sạch cao để nghiên cứu tiếp thu nhận
protease, lipase tinh sạch.
Chế phẩm enzyme có hoạt độ protease: 49,26 U/g chế phẩm; Hoạt độ
riêng protease 1,42 U/mg protein; Hoạt độ lipase: 587,85 U/ g chế phẩm;
Hoạt độ riêng lipase: 16,91 U/mg protein.
3.5 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy
Kết quả khảo sát cho thấy quá trình tinh sạch protease từ dịch trích ly
enzyme bao gồm các bước sau: (1) kết tủa phân đoạn bằng muối amoni
sunfate 60% nồng độ bảo hòa; (2) thẩm tích bằng màng cellophane 12
KDa; (3) tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose; (4) kết hợp
NaCl 0.3 M
sắc ký lọc gel Sephadex G-75. Kết quả sắc ký đồ thể hiện ở hình 3, 4.
Hình 3: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột
DEAE-cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M
Từ kết quả hình 3 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 3 peak lớn và một số peak nhỏ, trong đó peak có diện tích lớn nhất
thể hiện hoạt độ protease gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ
14 protease cao nhất là 4,86 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn này đều có thể hiện
hoạt độ lipase, kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp chạy điện di trên
gel SDS-PAGE cho thấy phân đoạn này chỉ có hai loại protein có phân tử
lượng khác nhau (hình 5). Điều đó chứng tỏ phương pháp rửa giải theo
gradient nồng độ NaCl 0-0,3M đã thu nhận được hỗn hợp gồm một loại
protease và một loại lipase. Các peak còn lại hầu hết chỉ là các protein tạp
thể hiện hoạt độ lipase, protease rất thấp.
Từ kết quả hình 4 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 3 peak, trong đó có một peak diện tích lớn thể hiện hoạt độ protease
gồm 10 phân đoạn (ống 16-26) với hoạt độ protease cao nhất là 2,33 U/ml.
Vậy sau khi qua cột sắc ký lọc gel sephadex G75 đã tách được protease ra
khỏi lipase, kết quả kiểm tra độ tinh sạch và phân tử lượng protease thể
hiện ở hình 5.
Hình 4: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên Sephadex G-75
Hiệu quả quá trình tinh sạch protease thể hiện ở bảng 7. Kết quả bảng
này cho thấy sau quá trình tinh sạch thu nhận protease có hoạt độ riêng
28,59 U/mg, độ tinh sạch cao gấp 22,41 lần so với dịch enzyme thô. Hiệu
suất thu hồi protease đạt 23,67%.
15 Bảng 7: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy cá tra
Công đoạn Protein Tổng hoạt Hoạt độ Độ tinh Hiệu suất
tổng độ (U) riêng sạch thu hồi
(mg) (U/mg pr) (lần) (%)
202,5 258,3 1,28 1,0 100 Enzyme thô*
82,35 223,2 2,71 2,12 86,41 Kết tủa
56,7 201,15 3,55 2,78 77,87 Thẩm tích
DEAE-cellulose
4,59 122,81 47,55 26,78 20,99 Sắc ký ion
Sắc ký lọc gel 2,14 61,14 28,59 22,41 23,67
* Nguyên liệu gan tụy: 50g ** Kết quả trung bình 3 lần thí nghiệm
Sephadex-G75
Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng của protease gan tụy
Kết quả hình 5 xác định protease gan tụy tinh sạch và phân tử lượng 31 KDa
Hình 5: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE
Cột b: thang protein chuẩn, cột a: phân đoạn thu từ sắc ký trao đổi ion
DEAE-cellulose, cột c: phân đoạn thu từ sắc ký lọc gel Sephadex G75
3.5.3 Xác định một số tính chất của protease gan tụy tinh sạch
3.5.3.1 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt theo thời gian của protease
16
Hình 6: Độ bền nhiệt theo thời gian của protease Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu của protease gan tụy cá tra là 550C. Theo kết quả hình 6, ở nhiệt độ thấp 35-500C, protease bền nhiệt hơn ở nhiệt độ cao 55-700C, tại nhiệt độ tối ưu 550C sau thời gian 120 phút hoạt độ protease giảm 43,16%. Khi nhiệt độ cao hơn 550C tốc độ giảm hoạt độ protease nhanh hơn, ở nhiệt độ 600C sau 120 phút hoạt độ protease giảm 60,37%, ở nhiệt độ 700C sau 15 phút hoạt độ protease giảm 86,42%.
3.5.3.2 pH tối ưu và độ bền pH theo thời gian của protease
Hình 7: Độ bền pH theo thời gian của protease
Kết quả nghiên cứu cho thấy protease gan tụy có pH tối ưu là 8,5, ổn
định ở pH 7-9. Theo kết quả hình 7, sau 120 phút hoạt độ tương đối protease
trên 80%. Ở pH 7 sau 120 phút hoạt độ protease giảm 12,84%. Ở pH 9 sau
17 120 phút hoạt độ protease giảm 19,32%. Nhìn chung, protease gan tụy cá tra
khá bền ở pH 7-9 trong khoảng thời gian 2-3 giờ, phù hợp để nghiên cứu
ứng dụng trong y học làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa.
3.5.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ của protease
Kết quả cho thấy hoạt độ của protease gan tụy cá tra bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Zn2+, Cu2+, Mg2+, kích thích khi có mặt ion Ca2+.
3.5.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của protease
Theo đồ thị Lineweaver- Burk, giá trị Km và Vmax của protease tinh sạch khi thủy phân cơ chất BSA được xác định với Km = 897 mg/L và Vmax = 15,7 mg/L.phút.
Từ kết quả cho thấy protease tinh sạch có 14 loại acid amin với tỷ lệ
3.5.3.5 Thành phần acid amin của protease gan tụy khác nhau, trong đó, các amino acid có hàm lượng cao là serine với 0,714
mg/g, aspartic với 0,651 mg/g, tiếp theo là glutamic với 0,416 mg/g,
glysine với 0,355 mg/g và leucine với 0,303 mg/g.
3.6 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra
Khảo sát quá trình tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-
NaCl 0.3 M
cellulose kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G-75
Hình 8: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE- cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M
18
Từ kết quả hình 8 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra thành 3 peak lớn và một số peak nhỏ, trong đó peak có diện tích lớn nhất thể hiện hoạt độ lipase gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ lipase cao nhất là 5,67 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn này đều có thể hiện hoạt độ protease, kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp chạy điện di trên gel SDS-PAGE cho thấy phân đoạn này chỉ có hai loại protein có phân tử lượng khác nhau (hình 10). Điều đó chứng tỏ phương pháp rửa giải theo gradient nồng độ NaCl 0-0,3M đã thu nhận được hỗn hợp gồm một loại lipase và một loại protease. Tiếp tục nghiên cứu tách riêng lipase ra khỏi hỗn hợp bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-75.
Hình 9: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy trên gel Sephadex G75
Từ kết quả hình 9 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 2 peak lớn, trong đó có một peak diện tích lớn thể hiện hoạt độ lipase
gồm 9 phân đoạn (ống 4-12) với hoạt độ lipase cao nhất là 5,17 U/ml. Kết
quả kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng lipase bằng phương
pháp điện di trên gel SDS-PAGE thể hiện ở hình 10. Hiệu quả quá trình tinh sạch lipase thể hiện ở bảng 8. Kết quả bảng này cho thấy sau quá trình tinh sạch thu nhận lipase có hoạt độ riêng 509,71
U/mg, độ tinh sạch cao gấp 37,95 lần so với dịch enzyme thô. Hiệu suất thu
hồi lipase đạt 40,08%.
19 Bảng 8: Tóm tắt quá trình tinh sạch lipase gan tụy cá tra
Công đoạn Protein Tổng hoạt Hoạt độ Độ tinh Hiệu suất
tổng độ riêng sạch thu hồi
(mg) (U) (U/mg pr) (lần) (%)
2719,8 13,43 1,0 100 Enzyme thô* 202,5
2493,45 30,28 2,25 91,68 Kết tủa 82,35
2293,2 40,44 3,01 84,32 Thẩm tích 56,7
DEAE-cellulose
1735 378,29 28,17 63,79 Sắc ký ion 4,59
Sắc ký lọc gel 2,14 1090 509,71 37,95 40,08
* Nguyên liệu gan tụy: 50g ** Kết quả trung bình 3 lần thí nghiệm
SephadexG75
Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng của lipase gan tụy
Kết quả điện di xác định lipase gan tụy tinh sạch và có phân tử lượng
57 KDa
Hình 10: Kết quả điện di trên gel SDS– PAGE Cột c: thang protein chuẩn, cột b: phân đoạn thu từ sắc ký trao đổi ion
DEAE-cellulose, cột a: phân đoạn thu từ sắc ký lọc gel Sephadex G-75
3.6.3 Xác định một số tính chất của lipase tinh sạch
3.6.3.1 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt theo thời gian của lipase
20
Hình 11: Độ bền nhiệt theo thời gian của lipase Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu của lipase gan tụy là 500C. Enzym này bền ở nhiệt độ 35-550C. Theo kết quả hình 11, tại nhiệt độ tối ưu 500C sau thời gian 120 phút hoạt độ lipase giảm 44,7%. Khi nhiệt độ cao hơn 550C tốc độ giảm hoạt độ lipase nhanh hơn, ở nhiệt độ 600C sau 120 phút hoạt độ lipase giảm 70,61%, ở nhiệt độ 700C sau 15 phút hoạt độ lipase giảm 78,68% .
3.6.3.2 pH tối ưu và độ bền pH theo thời gian của lipase
Hình 12: Độ bền pH theo thời gian của lipase
Lipase từ gan tụy cá tra họat động thủy phân ở pH tối ưu là pH 8. Mặt
khác, kết quả nghiên cứu độ bền pH của enzym này cho thấy lipase gan tụy
cá tra bền ở khoảng pH 7-9, trong thời gian 120 phút còn trên 70% hoạt lực,
rất thích hợp để nghiên cứu ứng dụng trong y học làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa.
21
3.6.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ lipase
Kết quả nghiên cứu cho thấy lipase gan tụy cá tra bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Zn2+, Cu2+ và Cd2+. Ngược lại, lipase gan tụy cá tra tăng hoạt độ khi môi trường phản ứng hiện diện ion Ca2+. Đặc tính này giống lipase gan tụy các loài cá khác. Ngoài ra, ion Ca2+ còn đóng vai trò khác trong phản ứng lipase. Vai trò chính của Ca2+ là phản ứng với acid béo tự do sinh ra trong phản ứng để tạo muối.
3.6.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của lipase
Theo đồ thị Lineweaver- Burk, giá trị Km và Vmax của lipase tinh sạch khi thủy phân cơ chất triolein được xác định với Km = 1,381 mg/L và Vmax = 0,063 mg/L.phút.
3.6.3.5 Xác định thành phần acid amin của của lipase gan tụy
Kết quả cho thấy lipase tinh sạch có 14 loại acid amin, trong đó, các
amino acid có hàm lượng cao là aspartic với 0,927 mg/g, glutamic với
0,792 mg/g, tiếp theo là serine với 0,489 mg/g và threonine với 0,453 mg/g.
3.6.3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NaTC đến hoạt độ lipase gan tụy
Kết quả cho thấy tại nồng độ muối mật NaTC 0,015M thì hoạt độ
lipase cao nhất, gấp 3,08 lần so với mẫu đối chứng (không bổ sung).
3.6.3.7 Ảnh hưởng của loại cơ chất đến hoạt độ lipase gan tụy
Kết quả nghiên cứu cho thấy lipase gan tụy cá tra có tính đặc hiệu cơ
chất, thủy phân liên kết ester ở vị trí 1,3 của triolein.
3.7 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme
3.7.1 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất pepton Kết quả khảo sát cho thấy khi sử dụng chế phẩm enzyme thủy phân cơ chất cá tra (phế phẩm), cá thát lát, thịt bò thì thời gian thủy phân thích hợp là 6 giờ. Từ kết quả bảng 9 cho thấy các pepton thu được bằng cách sử dụng chế phẩm enzyme để thủy phân thịt bò và cá thác lác có tỷ lệ Namin/ Ntổng lần lượt là 22,15% và 20,97%. Các sản phẩm pepton này đạt yêu cầu của loại pepton-pancreatic (theo Dược điển Việt Nam).
22 Bảng 9: Hàm lượng nitơ tổng và nitơ amin của các pepton
Namin/ Ntổng (%)
Cơ chất thủy phân Hàm lượng nitơ tổng (g/l) Hàm lượng Nitơ amin (g/l)
Cá tra Cá thác lác 4,57 4,83 0,85 1,01
Thịt bò 5,16 1,14 18,53a 20,97b 22,15c
3.7.2 Khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme trong hỗ trợ tiêu hóa
Hình 17: khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme trên một số protein
Hình 13: khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme trên một số protein
Hình 14: Khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme trên một số loại dầu Kết quả hình 13, 14 cho thấy chế phẩm có khả năng thủy phân tương đương pancreatin từ tụy lợn (Enzyplex) nên có thể ứng dụng để hỗ trợ tiêu hóa như bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, làm dược liệu bào chế thuốc, ứng dụng trong phòng chống suy dinh dưỡng protein năng lượng ở trẻ em.
23 KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu chúng tôi có một số kết luận sau:
1. Kết quả nghiên cứu thành phần enzyme trong các cơ quan nội tạng của
hệ tiêu hóa cá tra (Pangasius hypophthalmus) cho thấy là enzyme tập
trung nhiều nhất ở gan tụy với hoạt độ lipase 337,01 U/g chất khô,
protease 42,14 U/g và amylase 209,85 U/g chất khô. Gan tụy cá chính
là nguyên liệu khai thác enzyme.
2. Điều kiện trích ly enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra là tỷ lệ nguyên
liệu/dung môi 1/2 (w/v), pH8, nhiệt độ 50C, thời gian 1 giờ.
3. Sử dụng phương pháp lọc màng có thể thu nhận chế phẩm lipase từ gan
tụy cá tra theo qui trình: lần lượt lọc dịch trích enzyme qua màng MF
1µm và 0,1µm, lọc màng UF 10 kDa để thu enzyme với tỷ lệ pha loãng
dịch enzyme thô 1/3, áp suất lọc 6 psi, thời gian lọc 120 phút. Hiệu suất
thu hồi lipase sau lọc UF 90,6%, độ tinh sạch 2,07 lần. Chế phẩm có
hoạt độ lipase: 22,22 U/ml, hoạt độ riêng lipase: 52,70 U/mg protein.
4. Để sản xuất chế phẩm enzyme, tốt nhất là sử dụng phương pháp kết tủa
bằng ethanol theo tỷ lệ với dịch trích enzyme là 3/1 (v/v). Chế phẩm có
hoạt độ lipase: 587,85 U/g, hoạt độ riêng lipase: 16,91 U/mg protein,
hoạt độ protease: 49,26 U/g, hoạt độ riêng protease 1,42 U/mg protein.
Hiệu suất thu nhận chế phẩm 8,3% so với nguyên liệu ban đầu (w/w).
5. Để tinh sạch protease và lipase từ gan tụy cá tra là từ dịch trích ly
enzyme thô, kết tủa enzyme bằng muối amoni sunfate 60% bão hòa,
thẩm tích bằng màng cellophane 12kDa loại muối. Dùng cột sắc ký trao
đổi ion DEAE-cellulose thu phân đoạn chứa hai enzyme protease và
lipase. Tách riêng protease và lipase qua sắc ký lọc gel Sephadex G-75.
Protease tinh sạch có hoạt độ riêng 28,59 U/mg protein, độ tinh
sạch 22,41 lần, hiệu suất thu hồi 23,67%. Lipase tinh sạch có hoạt độ
riêng 509,71 U/mg protein, độ tinh sạch 37,95 lần, hiệu suất thu hồi
40,08%.
24 6. Protease từ gan tụy cá tra là một serine protease có phân tử lượng 31
kDa, có tỷ lệ cao của serine, aspartic và glutamic, pH tối ưu 8,5, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 550C, kích thích khi có mặt ion Ca2+ và bị kìm hãm bởi các ion Cu2+, Zn2+ với cơ chất BSA có Km = 897mg/L và Vmax = 15,7 mg/L.min.
7. Lipase từ gan tụy cá tra là một lipase có hoạt độ cao và ổn định, phân tử
lượng 57kDa, có tỷ lệ cao nhất là aspartic và glutamic, pH tối ưu 8, nhiệt độ tối ưu 500C, tăng hoạt độ khi có mặt ion Ca2+ và bị kìm hãm bởi các ion Cd2+, Zn2+, hoạt động tốt nhất ở nồng độ muối mật NaTC 0,015M, thủy phân liên kết ester vị trí 1,3 của glyceride, với cơ chất
triolein có Km = 1,381mg/L và Vmax = 0,063 mg/L.min.
8. Chế phẩm pancreatin từ gan tụy cá tra có khả năng ứng dụng sản xuất
pepton trên cơ chất thịt bò và cá thác lác, đạt tỷ lệ Namin/ Ntổng lần lượt là 22,15% và 20,97%, đạt yêu cầu của loại pepton-pancreatic (theo Dược
điển Việt Nam); chế phẩm enzyme từ gan tụy cá có đặc tính thủy phân
các loại protein và chất béo tương đương pancreatin từ tụy lợn nên có
thể sử dụng làm dược liệu bào chế thuốc hoặc ứng dụng trong phòng
chống suy dinh dưỡng ở trẻ em.
KIẾN NGHỊ
- Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu đã đạt được, chúng tôi đề xuất các
hướng nghiên cứu tiếp theo như sau:
- Về lý thuyết cần nghiên cứu làm rõ cấu trúc phân tử của protease và
lipase gan tụy cá tra (Pangasius hypophthalmus).
- Về thực tiễn cần tiếp tục nghiên cứu sản xuất chế phẩm lipase từ gan
tụy cá tra bằng công nghệ lọc màng trên quy mô công nghiệp.
- Nghiên cứu sản xuất protease, lipase tinh sạch từ gan tụy cá tra trên
quy mô lớn.
- Nghiên cứu bổ sung về tính an toàn, gây dị ứng khi sử dụng chế phẩm
enzyme từ gan tụy cá tra làm dược liệu hỗ trợ tiêu hóa trong y học.
