Nghiên cứu trị liệu ung thư tuyến tiền liệt người bằng phối hợp hai oncolytic virut sởi (measle) và quai bị (mump) trên thực nghiệm

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TRỊ LIỆU UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT NGƢỜI<br /> BẰNG PHỐI HỢP HAI ONCOLYTIC VIRUT SỞI (MEASLE)<br /> VÀ QUAI BỊ (MUMP) TRÊN THỰC NGHIỆM<br /> Hồ Anh Sơn*; Bùi Khắc Cường*; Hoàng Văn Lương*<br /> Li Feng Zhang**; Naoki Yamamoto**; Nguyễn Lĩnh Toàn*<br /> TÓM TẮT<br /> Trị liệu virut phân giải tế bào ung thư (TBUT) (Oncolytic virus, OLV) được hiểu là sự nhân lên của<br /> OLV trong khối u đặc hiệu. Kết quả, TBUT bị phân giải và phá hủy, đồng thời giải phóng hàng ngàn<br /> tiểu phần OLV. OLV mới được giải phóng lại lây nhiễm vào TBUT lân cận, do đó, tạo ra một làn<br /> sóng tấn công của OLV vào khối u. Nghiên cứu của chúng tôi tập trung đánh giá tác dụng điều trị<br /> ung thư của phức bộ OLV gồm virut dạng vắcxin sởi (measlse) và quai bị (mump) trên chuột thiếu<br /> hụt miễn dịch mang khối ung thư tiền liệt tuyến người.<br /> * Từ khóa: Ung thư tiền liệt tuyến người; Trị liệu bằng virut; Chuột nude.<br /> <br /> STUDY OF HUMAN PROSTATE CANCER TREATMENT<br /> BY COMBINED TWO ONCOLYTIC VIRUSES MEASLE AND<br /> MUMP ON EXPERIMENT<br /> SUMMARY<br /> Oncolytic virotherapy is tumor-selective viral replication, resulting in lytic tumor cell destruction<br /> and release of thousands of viral particles. Newly released viruses go on to infected neighboring<br /> tumor cells, theoretically causing and maintaining a wave of virus attack throughout the tumor. Our<br /> study will evaluate the effectiveness of cancer treatment by complex of OLV of measlse with mump<br /> on defficient nude mice xenograft human protate cancer cells.<br /> * Key words: Human protate cancer; Oncolytic virotherapy; Nude mice.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Nhiều nghiên cứu cho thấy, mỗi OLV có<br /> tế bào đích khác nhau, một dòng TBUT có<br /> thể bị xâm nhiễm bởi nhiều loài virut khác<br /> nhau tại cùng thời điểm. Để làm sáng tỏ cơ<br /> chế này và tăng hiệu quả của trị liệu liệu<br /> pháp virut, chúng tôi đề xuất một hướng trị<br /> liệu mới gồm phức hợp các vắcxin virut<br /> <br /> trong điều trị ung thư. Vắcxin sởi (Measle<br /> virus, MeV) có thể xâm nhập vào nhiều loại<br /> TBUT thông qua thụ thể CD 46 có mặt<br /> khá dày đặc trên bề mặt của nhiều dòng<br /> ung thư khác nhau. Mặc dù thụ thể của<br /> virut quai bị (Mump virus, MuV) chưa được<br /> làm sáng tỏ, nhiều nghiên cứu cho thấy<br /> loài OLV này có thể xâm nhập vào TBUT.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Đại học Quốc gia Singapore<br /> Người phản hồi: (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 21/12/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/1/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 24/1/2014<br /> <br /> 39<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15<br /> <br /> Hơn nữa, vắcxin của hai loại virut này được<br /> sử dụng an toàn trên khắp thế giới trong<br /> một thời gian dài. Dựa trên hoạt động phân<br /> giải TBUT của các dòng vắcxin khác nhau,<br /> chúng tôi lựa chọn phức hợp MeV và MuV<br /> (MM) cho trị liệu virut. Chúng tôi hy vọng<br /> phức hợp MM/hóa trị liệu có thể áp dụng<br /> trên thử nghiệm lâm sàng trong tương lai.<br /> Tuy nhiên trước đó, cần chứng minh hiệu<br /> quả của phương pháp này trong thử<br /> nghiệm tiền lâm sàng. Để thực hiện nội<br /> dung này, nghiên cứu sẽ tiến hành trên<br /> chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung<br /> thư tiền liệt tuyến người để đánh giá hiệu<br /> quả của phương pháp trị liệu mới.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mice)<br /> (Charles River, Mỹ) được nuôi trong phòng<br /> sạch. Mỗi nhóm 5 chuột được nhốt chung<br /> một lồng và mỗi chuột đánh số theo dõi.<br /> Mỗi lồng chuột có lỗ cấp và thoát khí qua<br /> màng lọc HEPA riêng. Duy trì ánh sáng<br /> theo chu kỳ tự nhiên, tự động điều khiển<br /> bật lúc 7 giờ, tắt lúc 19 giờ. Chuột được<br /> thay lồng và chất lót 2 lần, đồng thời kiểm<br /> tra tình trạng toàn thân, phân, tiêu thụ thức<br /> ăn, nước uống. Thức ăn được nhập khẩu<br /> (Zeigler, Hoa Kỳ), nước uống tinh khiết hấp<br /> tiệt trùng. Nhiệt độ duy trì 26 ± 20C, duy trì<br /> độ ẩm không khí bằng máy hút ẩm. Theo dõi<br /> ẩm kế để duy trì độ ẩm trung bình khoảng<br /> 60 ± 5%. Hàng tuần, môi trường nuôi chuột<br /> được cấy khuẩn kiểm tra mức độ nhiễm<br /> khuẩn. Thực hiện vệ sinh vô khuẩn hàng<br /> tuần [1].<br /> <br /> Phân lập, tăng sinh MeV và MuV nguồn<br /> gốc vắcxin: MeV và MuV tách dòng từ vắcxin<br /> Priorix (GlaxoSmithKline, Anh), thực hiện tại<br /> Đại học Quốc gia Singapore. Sau đó, lựa<br /> chọn dòng virut bằng cách hút 2 μl dung<br /> dịch nuôi trong mỗi đĩa và nhân lên trong<br /> tế bào Vero trên đĩa 24 giếng. Thu thập dịch<br /> nổi của tế bào Vero nhiễm và ly tâm ở<br /> 3.200 g/15 phút/40C và bảo quản ở -800C<br /> (Trung tâm Nghiên cứu Y học Quân sự,<br /> Học viện Quân y).<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Sau khi TBUT tiền liệt tuyến người được<br /> tăng sinh đủ số lượng [1]. Tạo khối u dưới<br /> da đùi phải chuột nude, tiêm TBUT người<br /> với số lượng trung bình 106 tế bào/con.<br /> Theo dõi sự xuất hiện và kích thước u, tính<br /> theo công thức:<br /> V = D x R2 x 0,5. Trong đó, V: thể tích<br /> khối u; D: chiều dài khối u; R: chiều rộng<br /> khối u. Kích thước khối u được đo bằng<br /> thước kẹp. Khi khối u đạt kích thước trung<br /> bình 50 mcl, chia chuột thành 4 nhóm, mỗi<br /> nhóm 10 con:<br /> - Nhóm chứng: mang u, tiêm nước muối<br /> sinh lý 0,9%.<br /> - Nhóm MeV: mang u, điều trị bằng MeV.<br /> - Nhóm MuV: mang u, điều trị bằng MuV.<br /> - Nhóm MM: mang u, điều trị bằng MeV<br /> + MuV.<br /> Chuột được tiêm trực tiếp vào khối u<br /> các loại virut đơn lẻ MeV, MuV hoặc kết<br /> hợp cả hai MM (gồm MeV và MuV có số<br /> lượng tương đương) 6 lần, 2 lần/tuần, liều<br /> 106cfu/lần/con.<br /> Theo dõi kích thước khối u, tỷ lệ sống<br /> chết tới khi kết thúc thí nghiệm.<br /> <br /> 40<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Tác dụng của OLV tới kích thƣớc<br /> khối u.<br /> <br /> 3. Hình ảnh đại thể của chuột mang<br /> khối u tiền liệt tuyến ngƣời.<br /> <br /> 1600<br /> <br /> 1200<br /> Chứng<br /> MeV<br /> <br /> 800<br /> <br /> MuV<br /> MM<br /> <br /> 400<br /> <br /> 0<br /> Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7<br /> <br /> Hình 1: Kích thước khối u tại các tuần điều<br /> trị (mm3).<br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy, kích thước<br /> khối u tiền liệt tuyến nhóm trị liệu bằng MM,<br /> MeV và MuV nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê<br /> so với nhóm chứng (p < 0,01). Nhóm chuột<br /> trị liệu bằng MM có kích thước khối u nhỏ<br /> hơn nhóm MuV có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).<br /> Nhóm chuột MM có kích thước khối u nhỏ<br /> hơn nhóm MeV, nhưng sự khác biệt chưa<br /> có ý nghĩa thống kê.<br /> 2. Trị liệu virut ảnh hƣởng tới thời<br /> gian sống của chuột.<br /> <br /> Nhóm chứng tại thời điểm bắt đầu điều trị.<br /> <br /> Nhóm MeV tại thời điểm bắt đầu điều trị.<br /> <br /> Kaplan-Meier Cum. Survival Plot for Thoi gian song<br /> Censor Variable: Song_chet<br /> Grouping Variable: Nhom<br /> 1<br /> <br /> Cum. Survival<br /> <br /> Cum. Survival (Control)<br /> ,8<br /> <br /> Event Times (Control)<br /> <br /> ,6<br /> <br /> Event Times (MeV)<br /> <br /> Cum. Survival (MeV)<br /> <br /> Nhóm MuV tại thời điểm bắt đầu điều trị<br /> <br /> Cum. Survival (MM)<br /> ,4<br /> <br /> Event Times (MM)<br /> Cum. Survival (MuV)<br /> <br /> ,2<br /> <br /> Event Times (MuV)<br /> <br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 20<br /> <br /> 40<br /> <br /> 60<br /> Time<br /> <br /> 80<br /> <br /> 100<br /> <br /> 120<br /> <br /> Hình 2: Thời gian sống nhóm chuột.<br /> Tại thời điểm 115 ngày sau trị liệu virut,<br /> trong số các chuột mang khối ung thư tiền<br /> liệt tuyến người, nhóm chứng còn 2 chuột<br /> sống. Trong khi đó, nhóm trị liệu bằng MeV,<br /> MuV và MM lần lượt còn 8, 6 và 10 chuột<br /> còn sống.<br /> <br /> Nhóm MM tại thời điểm bắt đầu điều trị<br /> Hình 3: Hình ảnh khối u đồng đều của các<br /> nhóm chuột.<br /> <br /> 41<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15<br /> <br /> Sau khi ghép TBUT tiền liệt tuyến người,<br /> khối u hình thành trên tất cả chuột ghép và<br /> chia đều về các nhóm sao cho kích thước<br /> khối u tương đồng nhau ở tất cả nhóm chuột.<br /> <br /> Nhóm MuV tại thời điểm 7 tuần sau điều trị.<br /> <br /> Nhóm MM tại thời điểm 7 tuần sau điều trị.<br /> <br /> Nhóm chứng tại thời điểm 7 tuần sau<br /> điều trị.<br /> <br /> Hình 4: Hình ảnh khối u kích thước không<br /> đồng đều giữa các nhóm chuột.<br /> Sau 6 lần trị liệu, kích thước khối u có<br /> khác biệt đáng kể tại thời điểm 7 tuần.<br /> Trong đó, kích thước khối u nhỏ nhất ở<br /> nhóm chuột được trị liệu bằng phức hợp<br /> virut MM, tiếp đó là nhóm trị liệu bằng MeV<br /> và MuV. Nhóm chứng có kích thước khối u<br /> lớn nhất.<br /> Bµn luËn<br /> <br /> Nhóm MeV tại thời điểm 7 tuần sau điều trị.<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy trị liệu<br /> bằng virut sởi, quai bị và phức hợp hai loại<br /> virut này có hiệu quả kiềm chế tốc độ phát<br /> triển khối ung thư tiền liệt tuyến người ghép<br /> trên chuột nude và kéo dài thời gian sống<br /> của chuột. Nghiên cứu tiền lâm sàng về khả<br /> năng phân giải TBUT của MeV giảm độc<br /> lực được Peng công bố sớm nhất năm<br /> 2001 [6]. Nghiên cứu này cho thấy khả<br /> năng phân giải TBUT cơ cả in vitro và in<br /> vivo trên mô hình chuột SCID/NOD mang<br /> khối u. Kết quả: khối u giảm phát triển khi<br /> được điều trị bằng tiêm MeV vào khối u<br /> cũng như theo đường tĩnh mạch. Khi tiêm<br /> trực tiếp MeV giảm độc lực vào khối u, gây<br /> hoạt động của gen beta-galactosidase<br /> <br /> 42<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15<br /> <br /> reporter gen gây gảm kích thước khối u<br /> lympho trên chuột ghép. Virut xâm nhập<br /> vào tế bào thông qua thụ thể CD46 có<br /> nhiều trên bề mặt TBUT [7]. Do đó, virut sởi<br /> sống giảm độc lực có khả năng phân giải<br /> TBUT mà trên bề mặt bộc lộ nhiều thụ thể<br /> CD46 [5]. Ong và CS đánh giá khả năng<br /> của MeV trên các dòng TBUT tủy xương<br /> (neoplastic plasma cells, PCs) và không<br /> ung thư (nonplasma cells, NPCs) ở 38 BN<br /> đa u tủy xương. Kết quả cho thấy: PCs bộc<br /> lộ nhiều hơn số lượng thụ thể CD46 so với<br /> tế bào NPCs. Trung bình số thụ thể CD46<br /> trên PCs và NPCs lần lượt là 49.130/tế bào<br /> và 7.340/tế bào. Khả năng phân giải tế bào<br /> của MeV xảy ra trên tế bào PCs, nhưng<br /> không xảy ra trên tế bào thường NPCs [5].<br /> Härfast và CS đã phát hiện độc tế bào<br /> của tế bào lympho trong máu ngoại vi và tế<br /> bào của mô nuôi cấy sau khi tiếp xúc với<br /> MuV. Các tế bào này có thụ thể với phần Fc<br /> của IgG, do đó, hiệu ứng này bị ảnh hưởng<br /> khi loại bỏ thụ thể Fc trên bề mặt và cho tế<br /> bào chạy qua cột chứa phức hợp miễn dịch [4].<br /> Đối với virut quai bị, MuV thủy phân làm<br /> giảm protein nội bào STAT1, đồng nghĩa<br /> với việc virut này có thể thoát khỏi đáp ứng<br /> chống virut bởi interferon. Đây là protein có<br /> vai trò trung gian đáp úng cytokine, yếu tố<br /> phát triển, nonreceptor tyrosine kinases và<br /> một số kích thích gây ung thư. Protein V<br /> của virut có đích ảnh hưởng là STAT1 và<br /> STAT3. Kết quả là protein V chống lại đáp<br /> ứng của tế bào với IL-6 và tín hiệu v-Src có<br /> thể gây chết tế bào theo chương trình ở<br /> TBUT máu [2, 3]. Như vậy, nếu thay đổi cấu<br /> trúc MuV ở dạng vắcxin sống giảm độc lực,<br /> virut này không có khả năng trốn thoát khỏi<br /> hệ miễn dịch. Khi đó các cytokine có thể<br /> gây chết tế bào thông qua con đường<br /> STAT1 và STAT3.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Trị liệu virut vắcxin sởi và quai bị có tác<br /> dụng hạn chế kích thước khối ung thư tiền<br /> liệt tuyến người trên chuột mang khối u và<br /> kéo dài thời gian sống ở nhóm chuột được<br /> trị liệu đơn loại virut hoặc kết hợp hai virut<br /> so với nhóm chứng.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Nguyễn Đình Bảng, Hồ Anh Sơn, Bùi Khắc<br /> Cường, Nguyễn Lĩnh Toàn. Nghiên cứu tạo khối<br /> ung thư tuyến tiền liệt người trên chuột thiếu<br /> hụt miễn dịch “nude mice” bằng kỹ thuật ghép<br /> dị loài. Tạp chí Y-Dược học Quân sự. 2011, 2.<br /> tr.90-95.<br /> 2. Christina M. Ulane, Jason J. Rodriguez, JeanPatrick Parisien, and Curt M. Horvath. STAT3<br /> ubiquitylation and degradation by Mumps virus<br /> suppress cytokine and oncogene signaling.<br /> J Virol. 2003, June, Vol 77, No 11, pp.6385-6393.<br /> 3. Fujii N, Yokota S, Yokosawa N, Okabayashi T.<br /> Molecular mechanisms for suppression of<br /> interferon signal transduction pathways caused<br /> by viral infections. Uirusu. 2004, Dec, 54 (2),<br /> pp.69-78.<br /> 4. Härfast B, Andersson T, Alsheikhly A,<br /> Perlmann P. Effect of Fc-receptor modulation on<br /> mumps-virus-dependent lymphocyte-mediated<br /> cytotoxicity in vitro. Scand J Immunol. 1980, 11 (3),<br /> pp.357-362.<br /> 5. Ong HT, Timm MM, Greipp PR et al.<br /> Oncolytic measles virus targets high CD46<br /> expression on multiple myeloma cells. Experimental<br /> Hematology. 2006, 34 (6), p.713-720.<br /> 6. Peng KW, Ahmann GJ, Pham L, Greipp<br /> PR, Cattaneo R, Russell SJ. Systemic therapy of<br /> myeloma xenografts by an attenuated measles<br /> virus. Blood. 2001, 98 (7), pp.2002-2007.<br /> 7. Tatsuo H, Ono N, Tanaka K, Yanagi Y.<br /> Slam. (CDw150) is a cellular receptor for measles<br /> virus. Nature. 2000, 406 (6798), pp.893-897.<br /> <br /> 43<br /> <br />