Nghiên cứu ứng dụng quy trình phát hiện SNP RS9263726 để sàng lọc alen HLA-B58 01 bằng phương pháp PCR RFLP

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN SNP<br /> RS9263726 ĐỂ SÀNG LỌC ALEN HLA-B*58:01 BẰNG<br /> PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP<br /> Ngô Trường Giang*; Trần Văn Khoa*<br /> Nguyễn Minh Tâm*; Trần Thị Thu Huyền*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: ứng dụng quy trình phát hiện SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 bằng<br /> phương pháp PCR-RFLP. Đối tượng và phương pháp: 36 mẫu máu tĩnh mạch chưa biết loại<br /> alen HLA-B được tách ADN tổng số, tiến hành phản ứng PCR-RFLP xác định kiểu gen của<br /> SNP rs9263726, điện di sản phẩm trên gel agarose 2% và phân tích kết quả để kết luận kiểu<br /> gen, giải trình tự gen PSORS1C1 10% số mẫu để kiểm chứng quy trình. Kết quả: trong 36 mẫu<br /> AND, sàng lọc được 5 mẫu dương tính với HLA-B*58:01. Kết luận: đã ứng dụng được quy trình<br /> phát hiện SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 bằng phương pháp PCR-RFLP.<br /> * Từ khóa: HLA-B*58:01; rs9263726; PCR-RFLP.<br /> <br /> Applying a Protocol to Detect SNP RS926726 for Screening HLAB*58:01 Allele Using PCR-RFLP Technique<br /> Summary<br /> Objectives: Applying a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene<br /> using PCR-RFLP technique. Subjects and methods: 36 blind blood samples with unknown<br /> HLA-B allelic types, total DNA was extracted, SNP rs9263726 was detected using PCR-RFLP<br /> technique, electrophoresis PCR products in 2% agarose gel and analysis, sequencing 10%<br /> samples. Result: We were able to detect HLA-B*58:01 in 5 of 36 samples. Conclusion: We<br /> have applied a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene using<br /> PCR-RFLP technique.<br /> * Key words: HLA-B*58:01; PCR-RFLP; rs9263726.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trong thực hành lâm sàng, tỷ lệ phản<br /> ứng thuốc thể nặng ngày càng giảm nhờ<br /> nguyên tắc dùng thuốc được hoàn thiện<br /> theo hướng cá thể hoá. Tuy nhiên, số<br /> lượng các dược chất được đưa vào điều<br /> trị lâm sàng ngày càng tăng. Khi phản<br /> <br /> ứng thuốc nặng xảy ra, tỷ lệ bệnh nhân<br /> (BN) tử vong khá cao (30%). Do đó, dự<br /> phòng phản ứng thuốc thể nặng vẫn còn<br /> là một vấn đề rất đáng quan tâm. Hiện<br /> nay, một số kháng nguyên bạch cầu<br /> người (HLA) được sử dụng như marker<br /> để phát hiện phản ứng thuốc nặng như:<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Ngô Trường Giang (legiangngo@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 14/03/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/05/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 09/06/2018<br /> <br /> 37<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> hội chứng Stevens Johnson hay nhiễm<br /> độc hoại tử. Trong các HLA này, HLAB*58:01 là một marker di truyền có liên<br /> quan chặt chẽ tới phản ứng thuốc thể<br /> nặng khi dùng thuốc allopurinol, đặc biệt<br /> ở cộng đồng người châu<br /> 3 . Do đó,<br /> cần sàng lọc HLA-B*58:01 trước khi dùng<br /> allopurinol để dự phòng phản ứng thuốc<br /> thể nặng do thuốc. Tuy nhiên, việc phát<br /> hiện trực tiếp HLA-B*58:01 đòi hỏi máy<br /> móc hiện đại, tiêu tốn nhiều thời gian và<br /> tiền bạc. Gần đây, các nghiên cứu đã<br /> phát hiện một số SNP liên kết khá chặt<br /> với HLA-B*58:01 [2]. Trong số đó, SNP<br /> rs9263726 (110G>A) trên gen PSORS1C1<br /> liên kết hoàn toàn với HLA-B*58:01. Do<br /> đó, có thể phát hiện HLA-B*58:01 thông<br /> qua SNP này. PCR-RFLP là một kỹ thuật<br /> đơn giản, dễ triển khai, thời gian cho kết<br /> quả nhanh, giá thành rẻ và khá hiệu quả<br /> để phát hiện SNPs.<br /> Trước thực tiễn đó, chúng tôi tiến<br /> hành nghiên cứu này với mục tiêu: Ứng<br /> dụng quy trình sàng lọc alen HLA-B*5801<br /> thông qua marker SNP rs9263726<br /> (110G>A) bằng kỹ thuật PCR-RFLP để<br /> dự phòng phản ứng thuốc thể nặng trên<br /> BN s dụng allopurinol.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 36 mẫu máu chưa biết loại alen HLAB, chống đông bằng EDTA thu thập tại<br /> Học viện Quân y. 2 mẫu ADN đã biết<br /> trước kiểu gen của SNP rs9263726 bằng<br /> phương pháp giải trình tự Sanger sử<br /> dụng làm chứng âm (GG) và chứng<br /> dương (GA).<br /> 38<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Tách chiết ADN tổng số từ 36 mẫu<br /> máu thu thập được: tách chiết bằng kít<br /> tách chiết ADN từ máu toàn phần của<br /> Qiagen.<br /> * PCR-RFLP phát hiện gen HLAB*58:01:<br /> - Khuếch đại gen PSORS1C1: trình tự<br /> các cặp mồi tham khảo theo Kaiko và CS<br /> (2012) [5].<br /> Thành phần phản ứng PCR nhân gen:<br /> master mix: 12,5 μl; primers (10 pmol/μl):<br /> 0,25 μl; nước deion: 7 μl; mẫu: 5 μl, tổng<br /> thể tích 25 μl.<br /> Chu trình nhiệt phản ứng PCR:<br /> trong 5 phút; tiếp theo 30 chu kỳ:<br /> trong 30 giây, 600C trong 60 giây,<br /> trong 30 giây. Cuối cùng 720C<br /> 5 phút.<br /> <br /> 940C<br /> 940C<br /> 720C<br /> trong<br /> <br /> Sản phẩm PCR được điện di trên gel<br /> agarose 2%, phân tích kết quả.<br /> * X lý enzym giới hạn:<br /> - Các mẫu có kết quả nhân gen<br /> PSORS1C1 được xử lý cùng enzym<br /> Fok1.<br /> - Thành phần hỗn hợp xử lý enzym:<br /> sản phẩm nhân gen: 5 μl; enzym Fok1:<br /> 0,4 ui.<br /> - Chu trình nhiệt xử lý enzym: ủ hỗn<br /> hợp ở 37oC trong 2 giờ, bất hoạt enzym ở<br /> 65oC trong 20 phút.<br /> Sản phẩm thu được điện di trên gel<br /> agarose 2%, phân tích kết quả.<br /> * Giải trình tự Sanger: sản phẩm nhân<br /> gen PSORS1C1 được tinh sạch, giải trình<br /> tự Sanger.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả nhân gen PSORS1C1.<br /> Sản phẩm nhân gen được điện di trên gel agarose 2% trong 30 phút:<br /> <br /> Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm nhân gen PSORS1C1.<br /> (-1; -2: Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 00 bp;<br /> các dải còn lại: B ng gen PSORS C có kích thước 260 bp)<br /> Kết quả cho thấy băng xuất hiện khi điện di sản phẩm nhân gen đều rõ ràng, đúng<br /> kích thước thiết kế và không xuất hiện băng phụ. Như vậy, điều kiện cho phản ứng<br /> nhân gen được tối ưu.<br /> Sản phẩm nhân gen xử lý cùng enzym cắt giới hạn.<br /> 2. Kết quả xử lý enzym cắt giới hạn để phát hiện SNP rs9263726.<br /> Sản phẩm nhân gen PSORS1C1 được xử lý cùng enzym cắt giới hạn Fok1.<br /> Sản phẩm xử lý enzym điện di trên gel agarose 2%.<br /> <br /> Hình 2: Kết quả xử lý enzym sản phẩm nhân gen PSORS1C1.<br /> (-1; -2: Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 00 bp; các dải còn lại: Sản phẩm x<br /> lý enzym mẫu nhân gen PSORS1C1)<br /> 39<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> Dựa vào số vạch thu được trên điện di<br /> sản phẩm xử lý enzym Fok1, có thể kết<br /> luận được kiểu gen:<br /> - Những mẫu chỉ xuất hiện 1 băng tại<br /> vị trí 260 bp có kiểu gen SNP rs9263726<br /> dạng đồng hợp tử GG, do đó không mang<br /> gen HLA-B*58:01.<br /> - Những mẫu xuất hiện cả 3 băng 260<br /> bp; 141 bp và 119 bp có kiểu gen SNP<br /> rs9263726 dạng dị hợp tử GA, do đó<br /> mang gen HLA-B*58:01 ở dạng dị hợp tử.<br /> - Những mẫu chỉ xuất hiện 2 băng 141 bp<br /> và 119 bp có kiểu gen SNP rs9263726<br /> dạng đồng hợp tử AA, do đó mang gen<br /> HLA-B*58:01 ở dạng đồng hợp tử.<br /> Như vậy, trong 36 mẫu nghiên cứu,<br /> chúng tôi phát hiện được 5 mẫu: 53; 57;<br /> 59; 70; 82 xuất hiện 3 băng. Đây là<br /> <br /> những mẫu mang kiểu gen HLA-B*58:01<br /> ở dạng dị hợp tử.<br /> Bằng kỹ thuật này, bước đầu đã xác<br /> định được 5/36 mẫu (13,9%) nghiên cứu<br /> có kiểu alen HLA-B*58:01.<br /> 3. Kết quả giải trình tự Sanger.<br /> Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện<br /> trên 36 mẫu máu chưa biết kiểu gen SNP<br /> rs9263726. Để kiểm chứng quy trình, tiến<br /> hành chọn 10% trong tổng số 36 mẫu<br /> nghiên cứu tương ứng với 4 mẫu để giải<br /> trình tự Sanger. Trong 4 mẫu, chọn 2<br /> mẫu âm tính với SNP rs9263726<br /> (110G>A) có kiểu gen GG và 2 mẫu dị<br /> hợp tử SNP rs9263726 (110G>A) có kiểu<br /> gen GA được xác định bằng phương<br /> pháp PCR-RFLP ở trên.<br /> <br /> Hình 3: Kết quả giải trình tự sản phẩm nhân gen PSORS1C1 của 4 mẫu 45; 52; 70 và 82.<br /> Tại vị trí 119 bp của hai mẫu 45, 52 chỉ xuất hiện 1 đỉnh G màu đen. Do đó, kiểu gen<br /> SNP rs9263726 của mẫu 45, 52 là GG.<br /> Tại vị trí 119 bp của hai mẫu 70, 82 xuất hiện 2 đỉnh: 1 đỉnh G màu đen, 1 đỉnh A<br /> màu xanh lá cây. Do đó, kiểu gen SNP rs9263726 của mẫu 70, 82 là GA.<br /> 40<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> BÀN LUẬN<br /> HLA-B*58:01 là một marker khá quan<br /> trọng trong tiên lượng phản ứng thuốc thể<br /> nặng khi dùng thuốc allopurinol. Hung và<br /> CS (2005) báo cáo mối liên hệ rất chặt<br /> chẽ giữa HLA-B*58:01 và dị ứng thể nặng<br /> khi dùng thuốc allopurinol trên người Hán<br /> - Trung Hoa với độ nhạy 100%, độ đặc<br /> hiệu 85% chỉ số OR:580,3 [3]. Các nghiên<br /> cứu tiếp theo trên cộng đồng người Thái,<br /> Hàn Quốc [9, 10] càng chỉ rõ điều này. Do<br /> đó, việc sàng lọc gen này trước khi chỉ<br /> định allopurinol cho BN rất cần thiết. Hiện<br /> nay, có thể trực tiếp sàng lọc HLA-B*5801<br /> bằng các kỹ thuật như giải trình tự gen [2]<br /> hay đếm dòng chảy tế bào [8]. Tuy nhiên,<br /> các kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị máy<br /> móc khá phức tạp, kỹ thật viên có trình độ<br /> cao dẫn tới giá thành xét nghiệm khá cao<br /> nên khó triển khai rộng rãi.<br /> Một số nghiên cứu 2 đã chỉ ra HLAB*58:01 liên kết với một số SNP. Trong<br /> đó, SNP rs9263726 trên gen PSORS1C1<br /> cách gen HLA-B 215 kb, liên kết hoàn<br /> toàn với gen HLA-B*58:01 (r2 = 1; D’ = 1)<br /> 5 . Do đó, có thể gián tiếp sàng lọc HLAB*58:01 thông qua SNP này.<br /> Hiện nay, có thể sử dụng kít TaqMan<br /> SNP Genotype Assays để sàng lọc SNP<br /> rs9263726. Mặc dù sàng lọc khá hiệu<br /> quả, kít có giá thành khá cao, đòi hỏi<br /> trang thiết bị hiện đại nên khó triển khai<br /> trong cộng đồng. Trong nghiên cứu này,<br /> chúng tôi đã hoàn thiện một quy trình<br /> sàng lọc gián tiếp gen HLA-B*58:01 thông<br /> qua SNP rs9263726 bằng phương pháp<br /> PCR-RFLP với nhiều ưu điểm như: không<br /> đòi hỏi máy móc quá hiện đại, đơn giản,<br /> dễ thực hiện, giá thành thấp, từ đó có thể<br /> triển khai rộng rãi.<br /> <br /> Trong quá trình chọn mẫu làm chứng<br /> âm và chứng dương cho PCR-RFLP<br /> bằng phương pháp giải trình tự Sanger,<br /> chúng tôi chỉ phát hiện 2 kiểu gen SNP<br /> rs9263726 là GG và GA. Kiểu gen đồng<br /> hợp tử AA rất hiếm trong cộng đồng,<br /> chưa phát hiện thấy trong 36 mẫu nghiên<br /> cứu, 0/27 mẫu trong nghiên cứu của<br /> Kaiko [5] hay 3/200 mẫu trong nghiên cứu<br /> của Hung 3 . Do đó, trong số các mẫu<br /> dương tính, chỉ có mẫu mang kiểu gen<br /> GA để giải trình tự đối chiếu.<br /> Khi so sánh kết quả nghiên cứu với<br /> các tác giả khác, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ<br /> mang gen là 13,9%, thấp hơn so với<br /> nghiên cứu của Hung và CS trên người<br /> Hán - Trung Hoa (19,5%) 3 , điều này có<br /> thể lý giải do cỡ mẫu của chúng tôi khá<br /> nhỏ, chưa đại diện cho cộng đồng.<br /> Khi kiểm chứng quy trình bằng giải<br /> trình tự Sanger ngẫu nhiên 10% số mẫu<br /> của nghiên cứu, chúng tôi thu được kết<br /> quả hoàn toàn đồng nhất giữa phương<br /> pháp PCR-RFLP và sequencing. Điều đó<br /> chứng tỏ nhân gen PSORS1C1 và hoạt<br /> động cắt của enzym Fok1 hoàn toàn theo<br /> thiết kế.<br /> KẾT LUẬN<br /> Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy<br /> trình phát hiện SNP rs9263726 để sàng<br /> lọc alen HLA-B*58:01 bằng kỹ thuật PCRRFLP, phát hiện được 5/36 mẫu nghiên<br /> cứu mang kiểu alen HLA-B*58:01.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Chung W.H, Hung S.I, Chen Y.T.<br /> Human leukocyte antigens and drug<br /> hypersensitivity. Curr Opin Allergy Clin<br /> Immunol. 2007, 7, pp.317-323.<br /> <br /> 41<br /> <br />